專利名稱：一種具有協(xié)同作用的藥用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物組合，具體地說，是一種含有天然植物提取物或單體的藥用組合，用于治療和/或預(yù)防心腦血管疾病、糖尿病及其并發(fā)癥、老年癡呆癥、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、高脂血癥、脂肪肝，以及用于預(yù)防心腦血管疾病的復(fù)發(fā)。
背景技術(shù)：
糖尿病是世界高發(fā)病率疾病之一。根據(jù)WHO研究報道，全球糖尿病患者已超過1.5億。糖尿病不僅因急性并發(fā)癥導(dǎo)致生命危險，更重要的是其各種嚴重慢性并發(fā)癥例如糖尿病性腎病(DN)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)、糖尿病性神經(jīng)病變、糖尿病性脂肪肝及糖尿病合并高血壓、高血脂癥等具有較高的發(fā)病、致殘/死率，因而受到醫(yī)藥工作者的高度關(guān)注。
新開發(fā)的降血糖化學(xué)合成藥物不斷涌現(xiàn)，而且在臨床上獲得了應(yīng)用。然而，遺憾的是，大量不良反應(yīng)報道使人們認識到，化學(xué)藥物在發(fā)揮高效治療作用的同時具有不可避免的副作用。
近年來，眾多學(xué)者在防治糖尿病的藥用植物研究方面做了諸多工作，加強了對植物活性物質(zhì)的分析和研究，以期進一步明確其功效(例如陳秋，單味中藥治療糖尿病腎病研究述略，中醫(yī)藥學(xué)刊2004年，1103-105；關(guān)青寶，單味中藥及其提取物治療糖尿病腎病實驗研究綜述，國醫(yī)論壇2003年，154-56；陳執(zhí)中，天然藥物抗糖尿病活性成分的研究開發(fā)進展，中國民族民間醫(yī)藥雜志2004年，11-3；高玫梅，藥用天然物中降血糖有效單體成分及其藥理作用的研究進展，中藥材1999年，10542-545；郭澄，國外植物藥治療糖尿病的研究進展，國外醫(yī)學(xué)-中醫(yī)中藥分冊1997年，351-52)。然而，取得的成效是有限的，這主要是由于糖尿病的致病機理復(fù)雜，常伴有不同類別的一種或多種并發(fā)癥，已有的單一天然活性成分難以多方位奏效。
人們試圖采用多種天然藥物聯(lián)用的方式，以期通過它們之間的加合、甚至協(xié)同作用來減少用藥量，從而在確保(甚至提高)療效的同時進一步降低不良反應(yīng)。遺憾的是，天然藥物的成分十分復(fù)雜，大多數(shù)天然藥物的藥物動力學(xué)參數(shù)、藥物代謝機制、作用靶點、作用機理均不清楚。因此，與化學(xué)藥品之間的相互作用相比，更難以預(yù)測天然藥物間的相互作用。
因此，本領(lǐng)域?qū)Π踩行У奶烊凰幬?組合)有著迫切的需求。
本發(fā)明人試圖提供一種能克服上述缺陷的產(chǎn)品。通過大量先導(dǎo)性試驗，我們初步確定以丹參和芍藥為基礎(chǔ)的藥物具有這樣的潛質(zhì)。當(dāng)試圖從現(xiàn)有技術(shù)中探尋這種結(jié)合的依據(jù)時，我們發(fā)現(xiàn)針對丹參能否與芍藥聯(lián)合應(yīng)用，二者的作用機制是加合、協(xié)同還是拮抗等基礎(chǔ)問題，迄今為止的已有技術(shù)沒有提供科學(xué)依據(jù)。至于二者是否能聯(lián)合用于其它疾病(例如心血管疾病、老年癡呆癥等)，已有技術(shù)甚至沒有類似的暗示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在這方面進行了大量的探索，并取得了諸多喜人的結(jié)果。
本發(fā)明的一個目的在于提供丹參和芍藥在治療和/或預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥、心腦血管疾病、老年癡呆癥、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、高脂血癥、脂肪肝等疾病中的應(yīng)用。
以下對本發(fā)明作進一步闡述。
糖尿病及其并發(fā)癥本發(fā)明藥物組合的有益作用，首先是在研究治療糖尿病的過程中發(fā)現(xiàn)的。
研究證實，本發(fā)明藥物組合對糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥具有極好的治療效果。
已知，丹參(復(fù)方丹參)可用于治療糖尿病及其并發(fā)癥(例如，北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報-中醫(yī)臨床版2002年，114-17；江蘇中醫(yī)1997年，1225-26)，和芍藥苷具有降血糖作用(例如，Planta Med.，1997年，63(4)323)。然而，鑒于糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生機制非常復(fù)雜，學(xué)術(shù)界和臨床對此也存在爭議(J Am Coll Cardiol 2003年，41(1)1-7；Intern Med 2003年，42(7)554-9；Exp Clin Endocrinol Diabetes 2002，110(5)212-8；BiolPharm Bull 2003年，26(12)1668-73；山東醫(yī)藥2003年，43(1)14-15)，尚無切實可行的治療方案(尤其是采用天然藥物的療法)，已知技術(shù)不足以為本發(fā)明的聯(lián)用方案提供足夠的理論依據(jù)。
在大量實驗的基礎(chǔ)上，我們大膽推測本發(fā)明效果是由于丹參和芍藥作用于不同靶點，尤其是在不同病理階段發(fā)揮治療作用，發(fā)揮了藥物聯(lián)用的整體治療優(yōu)勢。尤其值得注意的是，與單獨使用的丹參或芍藥相比，本發(fā)明組合顯著降低了受試動物胰島素抵抗，及較強的抗組織炎性反應(yīng)。
目前學(xué)術(shù)理論認為，糖尿病引起的腎病、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變等疾病，其基本病理基礎(chǔ)在于長期高血糖造成各種細胞因子產(chǎn)生變化，進而造成組織器官損傷，其中，多種糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機理與血管內(nèi)皮細胞的損傷有關(guān)。我們在后述的實驗基礎(chǔ)上推測，本發(fā)明組合物在抗氧化、抗炎性反應(yīng)等方面的協(xié)同作用，使之可以保護血管內(nèi)皮細胞，而這可能是本發(fā)明組合能有效治療糖尿病性并發(fā)癥疾病的關(guān)鍵點。
所述糖尿病及其并發(fā)癥，例如包括非胰島素依賴型(II型)糖尿病、糖尿病性腎病(DN)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)、糖尿病性神經(jīng)病變、糖尿病合并高血壓、脂肪肝、高血脂癥等。
心腦血管疾病、老年癡呆癥二者聯(lián)用的有益效果并不僅局限于糖尿病及其并發(fā)癥中。在進一步的研究中，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明藥物組合物在心腦血管疾病(尤其是缺血性疾病)、老年癡呆癥的治療和/或預(yù)防中也表現(xiàn)出極好的治療效果。
所述心腦血管疾病例如包括冠心病、腦卒中(也稱腦中風(fēng))、心肌梗塞，和所述老年癡呆癥包括阿爾茨海默病(簡稱AD)或腦血管性癡呆(簡稱VD)。
高脂血癥、脂肪肝在針對上述疾病的研究中，還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明組合具有調(diào)節(jié)血脂的作用。由于高脂血癥是非酒精性脂肪肝患者的重要(特征性)表象，所以我們進一步進行了有關(guān)高脂血癥、脂肪肝方面的研究，結(jié)果，我們驚喜的發(fā)現(xiàn)本發(fā)明組合同樣具有良好的治療效果。
心腦血管疾病復(fù)發(fā)本發(fā)明的另一個重要發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明藥物組合在預(yù)防心腦血管疾病復(fù)發(fā)方面的有益效果。
心腦血管疾病是危害現(xiàn)代人健康的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率、病死率和致殘率均很高。例如，尤為不利的是，復(fù)發(fā)性腦梗死的病死率、致殘率均顯著高于首次發(fā)病(梁玉宏，國外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊1993年，1155)。
當(dāng)前，心腦血管疾病發(fā)病后的治療研究結(jié)果尚無法令人滿意，但已公認這類疾病是可以預(yù)防的疾病(Sacco RL，Cerebrovasc Dis 1999年，增刊337-44)。按照干預(yù)措施介入的時間，預(yù)防可通常分為兩個階段“一級預(yù)防”，即對健康人群或存在心腦血管疾病危險因素、但尚未發(fā)生心腦血管疾病的人群開展預(yù)防，通常主要強調(diào)生活(行為)方式干預(yù)，而不倡導(dǎo)使用藥物干預(yù)；和“二級預(yù)防”，即對已出現(xiàn)心腦血管疾病癥狀，如短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)或已有缺血性卒中后癡呆發(fā)作史的病人開展預(yù)防，防止其再次發(fā)生同種疾病而采取的措施。在此，本發(fā)明中使用的術(shù)語“預(yù)防)復(fù)發(fā)”是指“二級預(yù)防”。
雖然常規(guī)化學(xué)藥物例如阿司匹林等可在一定程度上實現(xiàn)有效預(yù)防，但是有相當(dāng)?shù)木窒扌?，甚至失敗的案例也很?參見王少華，鐵道醫(yī)學(xué)1999年，27(2)136)，臨床上俗稱為“阿司匹林抵抗”。同時，阿司匹林增加機體出血(尤其是上消化道出血)的危險性，相當(dāng)一部分患者使用受限。并且，最近有報道，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)綜合現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)認為，非甾體抗炎藥存在增加心血管不良事件的可能性，這就使臨床醫(yī)師在使用這類藥物時產(chǎn)生憂慮，即，治療疾病的同時有可能增加被治療疾病的發(fā)病率。目前，在臨床實踐中，還沒有任何一種藥物可以同時具有下述藥理作用(特別是協(xié)同作用)，臨床醫(yī)生被迫選擇多種藥物同時使用。而同時使用種類繁多的藥物，很可能帶來藥物副作用的疊加(盡管報道很少，但臨床醫(yī)生實際應(yīng)用藥物時難以決策，往往是顧及藥物副作用)。尤為不利的是，在眾多復(fù)發(fā)危險因素中，究竟哪一種危險因素對復(fù)發(fā)起著主要作用，也沒有明確結(jié)論，因此目前尚無一種藥物是以“一級預(yù)防”或“二級預(yù)防”作為主要活性/適應(yīng)癥而上市的。
本發(fā)明人在此方面做了有益的嘗試和探索，而且取得了誘人的成果。動物實驗表明，丹參與芍藥的組合在同時控制多個主要的復(fù)發(fā)危險因素方面表現(xiàn)出了出人意料的協(xié)同作用。鑒于時間及醫(yī)學(xué)論理學(xué)因素，我們只進行了有限數(shù)量的缺血性腦卒中“二級預(yù)防”臨床觀察試驗，但是已可以從中預(yù)測出本發(fā)明組合在心腦血管疾病“一級預(yù)防”、尤其是“二級預(yù)防”臨床上的潛在應(yīng)用前景。
根據(jù)試驗結(jié)果，并結(jié)合目前國際公認的心腦血管疾病“一級預(yù)防”、“二級預(yù)防”循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，我們推測，本發(fā)明藥物組合物之所以能有效地防止了心腦血管疾病的復(fù)發(fā)，極有可能是在以下作用中表現(xiàn)出的協(xié)同作用①抗血小板聚集作用抑制血小板聚集與分泌，改變血小板和管內(nèi)皮細胞的前列腺素代謝途徑，使血管內(nèi)環(huán)境趨向于防止血小板聚集、防止血栓形成及血管內(nèi)皮破損；②調(diào)節(jié)血脂作用使甘油三酯和總膽固醇降低，高密度脂蛋白稍增加，肝臟合成極低密度脂蛋白減少，這三種變化都能積極防止動脈硬化的發(fā)生；③調(diào)節(jié)糖代謝作用將糖尿病患者的血糖水平控制在理想范圍內(nèi)，改善脂肪代謝障礙，控制膽固醇的合成；④抗氧化作用激活人體內(nèi)的SOD，抑制自由基的作用，抑制脂質(zhì)過氧化物對體內(nèi)生物膜正常功能的破壞，減少動脈、尤其是小動脈的硬化機會。
⑤調(diào)節(jié)血壓作用降低血管的被動擴張，減少血管壁所受張力、通透性增加，防止血漿成分外滲；降低血管壁厚，使其堅固性增加，防止平滑肌玻璃樣變性和壞死。
⑥血管內(nèi)皮細胞保護作用，降低血栓形成機會。
同時，鑒于心腦血管疾病二級預(yù)防的復(fù)雜性，本發(fā)明人期望不受任何理論的限制，所取得的有益效果皆由藥理藥效實驗證明。有利的是，動物實驗表明，本發(fā)明藥物組合還表現(xiàn)出顯著的抗炎性反應(yīng)作用施用本發(fā)明藥物后，受試動物的動脈粥樣硬化斑塊形成的受抑制程度，與其體內(nèi)炎性標(biāo)志物CRP(或者MCP-1)的降低水平相平行，這明顯提示本發(fā)明藥物組合通過抑制血管發(fā)生炎性反應(yīng)，從而抑制了脂質(zhì)沉著引起動脈硬化的機會，降低了腦卒中復(fù)發(fā)或死亡的重要危險因素。上述發(fā)現(xiàn)結(jié)合臨床試驗結(jié)果，進一步驗證了本發(fā)明組合在缺血性腦卒中“二級預(yù)防”方面的應(yīng)用潛力。
因此，本發(fā)明的另一個目的在于提供于丹參和芍藥在制備用于防止心腦血管疾病復(fù)發(fā)的藥物中的應(yīng)用。在臨床應(yīng)用時，醫(yī)師可以根據(jù)患者的年齡、體制、嚴重程度等因素，制定個體給藥方案，例如給予1/5-1倍治療/預(yù)防有效量的本發(fā)明藥物組合物。眾所周知，就治療依從性而言，長期口服給藥比較適于預(yù)防復(fù)發(fā)治療。
本發(fā)明組合及相應(yīng)制劑本發(fā)明組合是指以單獨含有丹參、芍藥的獨立制劑形式供聯(lián)合給藥，或者以同時含有二者的組合物/產(chǎn)品形式提供。
因此，本發(fā)明的另一個目的在于提供用于含有丹參和芍藥的藥用組合物，其中丹參和芍藥的重量比例為0.01-20∶1，優(yōu)選0.05-10∶1、0.1-5∶1，和更優(yōu)選0.2∶1、0.5∶1、1∶1和2∶1。
本發(fā)明組合中，可以選擇藥味(例如芍藥)直接粉碎成粉入藥，也可以相當(dāng)于上述天然藥物材生藥量的提取物或其它形式入藥。因此，本發(fā)明藥物組合的活性組分包括藥材原粉、脂或水溶性提取物、有效部位、或有效成分，或者采用現(xiàn)有技術(shù)中已有的制品形式。例如，所述活性組分包括a.丹參丹參提取物，主要含有丹酚酸、丹參酮；或丹參水溶性提取物，主要含有以丹酚酸A、丹酚酸B、原兒茶醛、丹參素為代表的酚酸類成分(總酚酸含量40％、優(yōu)選60％以上)，或丹參酚酸單體或其藥用鹽(例如鎂鹽)，或丹參酚酸單體的混合物；或丹參脂溶性提取物，主要含有丹參酮(丹參酮含量50％、優(yōu)選80％以上，例如丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮IIB、隱丹參酮、二氫丹參酮I等)，或丹參酮單體或其藥用鹽(例如磺酸鈉鹽)，或丹參酮單體的混合物；和b.芍藥芍藥(白芍、赤芍、川赤芍)的干燥根粉末，含有苷類化合物(優(yōu)選為芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷)的提取物，或芍藥苷單體。另外，研究表明，同時含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥新苷、丹皮酚、丹皮酚原苷、丹皮酚苷、芍藥苷元等的有效部位也是有益的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明芍藥苷類的來源并不局限于芍藥，含有芍藥苷類的同屬其它植物也可實現(xiàn)本發(fā)明，其提取和制備方法為已知技術(shù)，在此不作贅述。
在上下文中，“本發(fā)明藥物組合”所涉及的術(shù)語“丹參”、“芍藥”具有上述定義。
下面的試驗將證實按照本發(fā)明描述的具有上述定義之“丹參”與“芍藥”的組合，具有本發(fā)明所述的有益效果。鑒于現(xiàn)有技術(shù)中業(yè)已存在著相當(dāng)成熟且有效的制備/提純上述定義組分的技術(shù)，在此不作重點描述。例如，可以采用現(xiàn)代提取和分離技術(shù)，以提高活性物質(zhì)的純度、盡量除去不需要的雜質(zhì)，例如中國專利申請ZL011103787、ZL02156681X、ZL011301309、ZL2004100413049、ZL00120986、ZL2003101134541、ZL021179239、ZL02149694等。
可針對丹參、芍藥苷的溶解特性和體內(nèi)吸收特點，采用標(biāo)準制劑技術(shù)，加入藥用輔料制成適宜口服或非腸道給藥劑型，類似的技術(shù)也已相當(dāng)成熟有效，例如口腔速崩片(ZL2003101133322)、緩控制劑(ZL011333332、ZL011387106)、環(huán)糊精包合物(ZL01141436、ZL02108778)、固體分散物(ZL001194313)、注射劑(ZL001215329、ZL031399428、ZL031573150、ZL2003101241702、ZL021337241)、粉針劑(ZL200410037717、ZL031323820、ZL021446008、ZL200410002103)、微或納米制劑(ZL021378630、ZL00119579)、磷脂復(fù)合物(ZL001278126、ZL031320627)等。
可以理解的是，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)針對對丹參、芍藥活性成分之藥理活性的教導(dǎo)(例如中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志2004年，435-38、ZL011300868、ZL2003101210263、ZL021378630、ZL011333332、ZL02133915、ZL01819759或ZL200310121058)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)不同的疾病狀況，可選用不同組合形式(下面的實驗將進一步證實這些組合形式的有益效果)。例如，所述組合包括但不限于在以抗動脈粥樣硬化作用為主的治療中，或在以抗老年癡呆作用為主的治療中，可采用0.01-201“丹參酮+芍藥(苷)”的組合；而在以強調(diào)心腦血管活性為主的治療中，可采用“丹酚酸(丹參素)+芍藥(苷)”的組合；當(dāng)然，也可采用“丹參酮+丹酚酸(丹參素)+芍藥(苷)”的組合。本發(fā)明組合物臨床使用中，示例性的每日口服推薦劑量為丹參(以丹參素或丹參酮IIA(C19H18O3)計)1-20mg(優(yōu)選2-8mg、更優(yōu)選2-4mg)、丹參(以丹酚酸B(C36H30O16)計)10-200mg(優(yōu)選20-120mg、更優(yōu)選40-80mg)、芍藥苷10-100mg(優(yōu)選20-40mg、更優(yōu)選20-40mg)。
隨后進行的研究表明，與已有“丹參+芍藥+其它組分”的大處方組合(例如，ZL981107567、ZL001039695、ZL02149694、ZL98100232.3、ZL001327631、ZL011139919等)相比，在減少了一種或更多活性成分的情況下，本發(fā)明藥物組合依然保持了相同、甚至就某些方面而言更為有利的藥理作用(例如避免了某些成分之不需要的藥理作用或不良反應(yīng))，多項指標(biāo)顯著優(yōu)于單獨施用的丹參或芍藥，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員無法根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)推測的。
本發(fā)明的上述藥物組合克服了已有藥物存在的作用單一、服藥量大等缺點，代表了天然藥物治療和預(yù)防上述疾病的新趨勢。
藥理藥效學(xué)試驗研究一.糖尿病方面的藥理作用1.對II型糖尿病大鼠腎臟血管內(nèi)皮生長因子的表達和調(diào)節(jié)作用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)可能成為防治糖尿病性腎病(DN)的特異靶點，阻斷VEGF合成或生物學(xué)作用具有重要意義。
1.1材料與方法雌性大鼠48只，體重155-170g。以隨機血糖≥16.7mmol/L作為II型糖尿病(T2DM)模型建立標(biāo)準。大鼠分為6組，每組8只，建立DM模型后按以下方案給藥①糖尿病腎病組(DN組)生理鹽水灌胃；②高劑量組合物治療組(A+組)芍藥提取物(以芍藥苷計)+丹參提取物(以丹酚酸計)1∶5，60mg/kg灌胃；③低劑量組合物治療組(A-組)芍藥提取物(以芍藥苷計)+丹參提取物(以丹酚酸計)1∶5，20mg/kg灌胃；④B組丹參提取物(含丹酚酸，40mg/kg)灌胃；⑤C組芍藥提取物(含芍藥苷，20mg/kg)灌胃；⑥假手術(shù)組麻醉后從右背部入口分離右腎，并不作任何處理，作關(guān)閉切口，常規(guī)飼料，生理鹽水灌胃。
1.2觀察指標(biāo)及方法尾靜脈采血測空腹血糖和血肌酐(Scr)、血甘油三酯(TG)、血膽固醇(TC)；胰島素檢測采用放射免疫法；用免疫比濁法測尿微量白蛋白；和VEGF、TGF-β1采用S-P法。
1.3結(jié)果造模組(40只)測定血胰島素、血糖濃度均顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05，P＜0.01)，說明模型成功。治療6周后，與DN相比，高、低劑量組合物組的血糖、血胰島素輕度下降均有顯著性差異(均為P＜0.05)，丹參與芍藥組則變化不明顯，結(jié)果見下表1。
血脂、24h尿蛋白、肌酐清除率(Ccr)變化第9、12周，DN組TC、TG、24h尿白蛋白較假手術(shù)組明顯升高，Ccr下降。與DN組相比，高、低劑量組合物組的各項指標(biāo)顯著改善，丹參與芍藥組則變化不明顯，結(jié)果見下表2。
腎臟病理形態(tài)的變化第12周時，DN組腎重/體重、腎小球面積和腎小球體積均較假手術(shù)組明顯升高，高、低劑量組合物組均較DN組降低，丹參與芍藥組則變化不明顯，結(jié)果見下表3。
腎組織VEGF及TGF-β1免疫組化改變假手術(shù)組在腎小球及腎小管均有少量VEGF表達，TGF-β1有微量表達；DN組腎小球內(nèi)可見VEGF和TGF-β1表達增強，VEGF在腎小球、腎小管間質(zhì)均有表達；TGF-β1的表達可見于腎小球及腎小管及腎間質(zhì)。免疫組化半定量分析結(jié)果表明，高、低劑量組合物組的腎臟VEGF與TGF-β1的表達明顯少于DN組，丹參與芍藥組則變化不明顯。
1.4結(jié)論在本試驗制備T2DM的大鼠模型中，具備胰島素抵抗特征，出現(xiàn)了腎臟肥大，蛋白尿、腎臟VEGF及TGF-β1高表達。上述實驗表明，本發(fā)明組合物可降低T2DM模型大鼠尿蛋白，減少腎肥大，減輕腎臟VEGF表達，其保護腎功能的機制可能與抑制VEGF有關(guān)，其效果明顯優(yōu)于單獨使用丹參或芍藥，高、低劑量兩組療效無明顯差別。
表1 血糖、胰島素的比較(X±s，n＝8)

注與假手術(shù)組相比*P＜0.05**P＜0.01；與糖尿病腎病(DN)組相比#P＜0.05表2 TG、TC、24尿白蛋白、Ccr的變化(X±s，n＝8)


與假手術(shù)組相比*P＜0.05**P＜0.01；與糖尿病腎病(DN)組比#P＜0.05表3 喂養(yǎng)第12周時各組大鼠的變化(X±s，n＝8)

與假手術(shù)組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與糖尿病腎病(DN)組比，#P＜0.052.對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜保護作用2.1材料與方法實驗動物選用雄性SD大鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，測空腹血糖均低于7mmol/L，隨機分為正常對照組(E組)10只，實驗組40只。用鏈尿佐菌素(STZ)誘發(fā)糖尿病。凡血糖≥16.7mmol/L作為糖尿病組，再隨機分為3組，各10只，DM組為糖尿病未治療組，每天生理鹽水100mg/kg灌胃；A組為丹參提取物組(含丹參酮)，50mg/kg灌胃；B組為赤芍提取物組(含芍藥苷)，30mg/kg灌胃；C組為本發(fā)明組合物組芍藥提取物(以芍藥苷計)+丹參提取物(以丹參酮計)1∶5，40mg/kg灌胃。各組分2籠喂養(yǎng)，自由進食和飲水。
2.2結(jié)果試驗表明，本發(fā)明組合物對于DM大鼠有促進體重增加、降低血糖的作用，見表4。
與正常組比較，各組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織NOS的活性、AR(醛糖還原酶)的活性顯著增強，NO含量顯著增加。與DM組比較，C組大鼠視網(wǎng)膜組織NOS的活性、AR的活性明顯被抑制，NO的含量也顯著減少，而A、B組的抑制作用不明顯，見表5。
2.3討論①高血糖水平和糖化血紅蛋白比例升高與視網(wǎng)膜病變發(fā)生、發(fā)展之間有密切的關(guān)系。上述實驗表明，本發(fā)明組合物降低血糖的作用，能明顯抑制AR和NOS的活性，減少NO的合成，對糖尿病視網(wǎng)膜病變有明顯防治作用。
同時發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明組合物能顯著降低NO含量，這可能與本發(fā)明組合物能提高糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織SOD的活性有關(guān)，SOD活性增強，及時清除過量生成的NO，對自由基損傷起一定保護作用。
②在另一項試驗中，考察了本發(fā)明組合物對糖尿病型小豬視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長因子表達的影響，研究表明本發(fā)明組合物有明顯的降血糖和減輕胰島素抵抗的作用。
③另外，國內(nèi)外學(xué)者認為可通過抑制VEGF的表達來阻止和延遲增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)的形成。申請人已進行的研究表明，與對照組(高脂高蔗糖飼料+丹參提取物或芍藥提取物)相比，治療組(高脂高蔗糖飼料+本發(fā)明組合物)的動物視網(wǎng)膜組織中的VEGF蛋白表達具有顯著性差異(P＜0.01)。
發(fā)明人希望借上述表述非限定性地解釋本發(fā)明組合物效果明顯優(yōu)于單獨使用丹參或芍藥的機制。
表4各組大鼠體重和血糖比較(n＝10)

與E組比較，*P＜0.01；與DM組比較，#P＜0.01表5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織NO的含量、NOS的活性、AR的活性(n＝10)

二.心腦血管方面的藥理作用1.對不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板凝集的影響1.1材料本發(fā)明藥物組合物(芍藥苷+丹參酮1∶1，簡稱組合物A，8mg/kg注射)，和芍藥提取物(含芍藥苷)+丹參提取物(含丹參酮)(1∶1，簡稱組合物B，20、40、80mg/kg灌胃)；
空白對照組生理鹽水；陽性對照藥相當(dāng)于同樣用藥量的單組分的芍藥提取物(含芍藥苷，20mg/kg)；相當(dāng)于同樣用藥量的單組分的丹參提取物(含丹參酮，80mg/kg)；阿司匹林片；以及ZL00103969.5公開的組合物(即參比組合物，含水蛭、丹參、赤芍等12味中藥)。
1.2實驗方法豚鼠分組，灌胃5天，空白對照用生理鹽水。末次給藥1小時后頸動脈采血，以枸櫞酸鈉抗凝，混勻，離心，合并上清液作為PRP(富血小板血漿)，血小板計數(shù)；余下血漿離心，取上清液作為PPP(貧血小板血漿)；以PPP調(diào)零，取PRP300μl加入比濁管，37℃溫育，加入誘導(dǎo)劑PAF(血小板活化因子)，聚集不同時間，記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果見表6。
表6.對血小板活化因子誘導(dǎo)的豚鼠血小板聚集的影響(X±s)

與空白對照組比較*p＜0.05**p＜0.01以腺苷二磷酸(ADP)為誘導(dǎo)劑的實驗結(jié)果類似。
由上述結(jié)果可知，阿司匹林片、參比組合物、芍藥提取物、丹參提取物和高/中劑量本發(fā)明組合物，均能不同程度地抑制不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)(血小板活化因子、腺苷二磷酸)的血小板聚集(凝集)、降低最大聚集率，其中以阿司匹林片、本發(fā)明組合物高劑量效果最好，中劑量組也表現(xiàn)出抑制血小板聚集作用，優(yōu)于單獨施用的芍藥提取物和丹參提取物(P＜0.05)，也優(yōu)于參比組合物，本發(fā)明組合物高劑量組與參比組合物組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。
本發(fā)明組合物則可提高cAMP含量和抑制不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板凝集，臨床也驗證本發(fā)明的組合物在抑制血小板聚集的作用方面效果等同或者優(yōu)于阿司匹林，更優(yōu)于單純的芍藥苷和丹參酮，且沒有阿司匹林的副作用(有近半數(shù)的阿司匹林組病人因強烈副作用中途退出治療)，兩組副作用經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，具有顯著性差異(P＜0.05)。
2.對大鼠體外血栓形成的影響按照藥理學(xué)公知方法取下分別測定血栓濕重及血栓干重。
結(jié)果表明，在大鼠動脈-靜脈血流旁路術(shù)血栓形成的實驗中，與模型對照組比較，本發(fā)明的組合物(丹參酮-芍藥苷10∶1)及對照組形成的血栓濕重均有減輕，本發(fā)明組合物P＜0.01；在大鼠體外血栓形成過程中，本發(fā)明組合物使血栓濕重較對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，而單組分的丹參酮和芍藥苷組與對照組形成的血栓濕重相比也有減輕，但沒有顯著性差異(P＜0.05)，其效果與陽性對照藥相似。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明組合物組較單獨施用的丹參酮和芍藥苷組間具有顯著性差異(P＜0.05)。
3對小鼠體內(nèi)血栓形成的影響本發(fā)明組合物0.035g/kg以上劑量連續(xù)口服給藥5天，明顯抑制小鼠體內(nèi)血栓，提高小鼠15分鐘內(nèi)的偏癱恢復(fù)數(shù)，表明該藥對體內(nèi)血栓形成具有明顯對抗作用。
4防止血管成形術(shù)后再狹窄血管成形術(shù)后再狹窄(RS)，其發(fā)病率高達30-50％。由于血管平滑肌細胞(VSMCs)的異常增殖，是RS的病理特征，因此抑制VSMCs異常增殖成為世界性心血管研究預(yù)防RS的重要手段。
4.1材料本發(fā)明藥物組合物(芍藥苷+丹參素+丹參酮4∶1∶1，以2、4、8mg/kg注射)；空白對照組生理鹽水；陽性對照藥相當(dāng)于同樣用藥量的單組分的芍藥苷注射，8mg/kg；丹參素注射，8mg/kg；丹參酮注射液，8mg/kg；三七皂苷注射液；4.2方法血管平滑肌細胞分離、培養(yǎng)、鑒定，參照文獻(Piper HM編輯，Cell CultureTechinques in Heart and Vessel Research.Springer-VerlagGermany.1990280)操作。
待90％VSMCs匯合后，經(jīng)胰蛋白酶消化后種于培養(yǎng)碟內(nèi)，加10％FBS+SMWM過夜培養(yǎng)，使細胞貼壁，細胞匯合約80％，再換成無血清DMEM(含青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細胞生長同步，最后換成10％FBS+DMEM，并隨機加入藥物，各濃度用DMEM稀釋至10μl/孔。
3H-TdR摻入實驗置換每孔1ml的DMEM，加入luCi的3H-TdR，用液體閃爍計數(shù)器(1900CA)測定各孔的CPM值。
細胞存活率＝貼壁細胞/總細胞數(shù)(貼壁細胞+不貼壁細胞)4.3結(jié)果結(jié)果見下二表。
對平滑肌細胞3H-TdR摻入量的影響(X±s)

與空白對照比較，*p＜0.05**p＜0.01；與芍藥/丹參素比較，△P＜0.05，△△P＜0.01對平滑肌細胞計數(shù)的影響(X±s)

與空白對照比較，*p＜0.05**p＜0.01；與芍藥/丹參素比較，△P＜0.05，△△P＜0.01本實驗用細胞計數(shù)法分析，各組藥物對細胞增殖的影響與對平滑肌細胞3H-TdR摻入基本一致，并且測得細胞存活率沒有明顯影響，均在90％以上。
4.4結(jié)論本發(fā)明藥物組合物、丹參酮、三七皂苷注射液、和芍藥苷對血管平滑肌細胞(VSMCs)的異常增殖具有抑制作用，其中本發(fā)明藥物組合物最強，丹參酮、三七皂苷和芍藥苷次之，丹參素最弱，本發(fā)明藥物組合物與芍藥苷和丹參素比較，組間具有顯著性差異(P＜0.05)。
5.對腦缺血的保護作用5.1對實驗性大鼠缺血的影響雌雄大鼠，隨機分為7組，按照《藥理實驗方法學(xué)第二版》(徐叔云主編)描述操作，形成極性不完全性腦缺血模型，按照以下方案給藥三天第1組0.9％NaCl對照組(腦缺血模型組)第2-4組5、10、20mg/kg本發(fā)明組合物；第5組丹參紅花注射液7mg/kg，ip；第6組丹參酮15mg/kg，ip，第7組芍藥苷15mg/kg，ip。
分別測大鼠腦指數(shù)、腦含水量、腦缺血后腦毛細血管通透性以及腦缺血大鼠腦組織形態(tài)觀察。結(jié)果表明，本發(fā)明組合、丹參紅花對腦缺血造成的腦組織水腫有特別明顯的改善作用，丹參酮和芍藥苷組也明顯優(yōu)于對照組。與對照組比較，本發(fā)明組合有顯著或非常顯著的差異，與單獨施用的丹參酮和芍藥苷組間比較，也具有顯著差異。
實驗表明，當(dāng)本發(fā)明的組方中缺少芍藥苷或者丹參酮時，其藥效均達不到本發(fā)明的組合物所能達到的藥效，因此，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，芍藥與丹參的組合，對于單獨施用的芍藥在提高心腦血管疾病方面均有顯著改善和助益效果。
三.老年癡呆方面的藥理作用1.對老年性癡呆動物記憶功能障礙改善的影響本實驗為大鼠避暗箱實驗，參照徐叔云等主編的《藥理實驗方法學(xué)第三版》(人民衛(wèi)生出版社，2002827)。
采用Ibotenic acid(IBO)致大鼠老年性癡呆模型，結(jié)果見下表


與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與芍藥/丹參比較，△P＜0.05，△△P＜0.012.對老年性癡呆動物大腦海馬組織勻漿β-淀粉樣肽的影響上述實驗結(jié)束后，取大鼠大腦海馬超聲勻漿，用放免法測β-AP含量，結(jié)果見下表(x±s，n＝10)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與芍藥/丹參比較，△P＜0.05，△△P＜0.01上述實驗證明，本發(fā)明組合物對老年性癡呆癥和腦缺血引起的記憶功能障礙有明顯的改善作用，減少老年性癡呆大鼠海馬組織β-AP的產(chǎn)生。實驗表明，芍藥、丹參以及復(fù)方丹參膠囊均對老年性癡呆有改善作用。芍藥與丹參的聯(lián)合用藥(重量比例為6∶1)，從不同方面以不同的途徑和作用機理進行干預(yù)，起到了協(xié)同作用。
本發(fā)明也對AD患者(20例)進行了給予本發(fā)明組合物一年以上的臨床觀察，結(jié)果顯示對患者漫游、多動、意識低下等癡呆的周圍癥狀有一定的效果，智力得分的測試中本發(fā)明組合物的全部病例均獲改善或處于穩(wěn)定狀態(tài)，臨床顯示效果好于對照組。
四.抗氧化方面的藥理作用1.對高血脂癥大鼠的抗氧化作用1.1材料本發(fā)明藥物組合物芍藥苷+丹參酮1∶5，50mg/kg灌胃；正常對照組生理鹽水；高血脂組生理鹽水；陽性對照藥丹參提取物(50mg/kg)；芍藥提取物(50mg/kg)；VE(50mg/kg)；復(fù)方丹參片(50mg/kg)；丹芍顆粒(50mg/kg，含水牛角、生地、丹參、赤勺等9味藥)；1.2實驗方法高血脂模型的建立Wistar大鼠給予高脂飼料；正常對照組喂食普通飼料。與正常組比較，高脂模型血清和肝臟的LPO明顯升高，而SOD活性明顯降低。
藥物灌胃，處理動物，測過LPO和SOD，按照試劑盒說明書操作，取1/2肝臟待測LPO和SOD，結(jié)果見下表表7.對高血脂大鼠血清和肝臟LPO和SOD的影響(nmol/L)

與高血脂組比較*p＜0.05**p＜0.01；與芍藥/丹參比較，△P＜0.05，△△P＜0.011.3結(jié)論上述實驗表明，單獨施用的丹參和芍藥提取物(50mg/kg)表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，低劑量則不明顯。本發(fā)明組合物具有顯著的抗氧化活性，明顯優(yōu)于單獨施用的芍藥、丹參和其它對照藥(P＜0.01)。另有實驗表明，單獨施用臨床有效量的丹參脂溶性成分或者丹參酮，其抗氧化和抗血小板凝集作用優(yōu)于VE和阿司匹林。
本發(fā)明組合物的伍用則沒有發(fā)現(xiàn)毒副作用，因此為了確保活血、抗氧化、抗炎等作用，采用芍藥(苷)和丹參(酮)伍用，既起到協(xié)同作用增加了療效，又克服了丹參或芍藥可能帶來的不良副作用。
另外，還從保護神經(jīng)細胞、減少腦組織丙二醛(MDA)和NO生成等方面，考察了本發(fā)明組合物的抗氧化作用，結(jié)果證明本發(fā)明組合物對腦組織MDA有明顯的抑制作用，降低了腦組織中升高的NO，對神經(jīng)細胞也顯示了保護作用，其中的丹參提取物-芍藥提取物(5∶2，或1∶1)兩者存在明顯的協(xié)同作用，其原因和機理有待進一步探討。
2.清除活性氧自由基的作用采用超氧陰離子、羥自由基體外發(fā)生體系，通過自旋捕集和電子順磁共振技術(shù)對相同量的本發(fā)明組合物、芍藥苷、丹參酮的提取物及其活性部位清除活性氧自由基的活力進行了比較。實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明組合物(丹參酮-芍藥苷3∶1)、芍藥苷、丹參酮對超氧陰離子具有明顯的清除作用，其中本發(fā)明組合物的抗自由基活性作用明顯優(yōu)于單純施用的芍藥苷或丹參酮。
五.抗動脈粥樣硬化的藥理作用1.對兔實驗性動脈粥樣硬化(AS)血管重構(gòu)的影響1.1材料本發(fā)明藥物組合物芍藥苷+丹參酮1∶1，50mg/kg灌胃；正常對照組生理鹽水；模型組生理鹽水；陽性對照藥丹參提取物(50mg/kg)、芍藥提取物(50mg/kg)、普羅布考(25mg/kg)、芎芍膠囊(25mg/kg)；1.2實驗方法將純種雄性新西蘭兔，隨機分組，飼養(yǎng)1周后，采用球囊損傷內(nèi)皮繼喂食高脂飼料的方法復(fù)制家兔實驗性AS模型。觀察12周。
1.3測定項目及結(jié)果組織病理學(xué)光學(xué)顯微鏡下，正常對照組內(nèi)皮細胞完整未見異常改變；模型組動脈內(nèi)皮細胞缺損，內(nèi)膜增生，6周時內(nèi)膜增生嚴重，管腔明顯狹窄而且大小不規(guī)則，細胞胞質(zhì)嗜酸性不明顯，出現(xiàn)大量大小不規(guī)則的泡沫細胞，有的可見脂肪壞死中心，內(nèi)膜下層可見大量梭形增生細胞；各給藥組內(nèi)皮缺損面減少，增厚明顯減輕，泡沫細胞減少，尤其以本發(fā)明組合物組為最優(yōu)。
組織形態(tài)學(xué)最大內(nèi)膜厚度(MIT)、最小管腔直徑(MLD)、管腔面積(LA)、內(nèi)彈力膜圍繞面積(IELa)、外彈力膜圍繞面積(EELa)，并得出內(nèi)膜面積(IA)、中膜面積(MA)、管腔狹窄百分比(LS)，其中，IA＝IELa-LA；MA＝EELa-IELa；LS＝IA/IELa。見下表


與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與芍藥比較，△P＜0.05，△△P＜0.01在減小MIT、IA和LS、增加LA方面，各給藥組表現(xiàn)出不同程度作用。在抑制內(nèi)膜增殖方面，以本發(fā)明組合物和普羅布考組作用尤為明顯，顯著優(yōu)于芍藥組(P＜0.05)。
1.4討論已知芍藥和丹參對AS都有一定治療作用，但其抗AS的側(cè)重點不同，丹參的有效成分主要表現(xiàn)為對膽固醇合成有抑制作用，對丙二醛生成有一定的抑制作用，這些可以通過丹參提取物對血脂和AS斑塊形成的作用研究結(jié)果得以證實。以芍藥苷為主要活性成分的芍藥提取物有利于防止血小板粘附、聚集，并能顯著降低血清總膽固醇低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯水平，并使高密度脂蛋白膽固醇升高，改善脂蛋白組分比值，所以也有較明顯的抗AS作用。芍藥與丹參的合用，其主要活性成分是苷類和酮類的合并應(yīng)用，配伍相對穩(wěn)定，不會產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)而失效或減損藥效，相反，由于治療機理的側(cè)重方向不同，可產(chǎn)生更顯著的協(xié)同作用，優(yōu)于芍藥與其它活性成分(例如川芎)合用的效果。
六.抗炎性方面的藥理作用1.對二甲苯致小鼠皮膚毛細血管通透性的影響1.1材料本發(fā)明藥物組合物芍藥苷+丹參素10∶1，20mg/kg、40mg/kg灌胃；正常對照組生理鹽水；陽性對照藥丹參提取物(50mg/kg)；芍藥提取物(50mg/kg)；復(fù)方丹參片(30mg/kg)；丹芍顆粒(30mg/kg，含有水牛角、生地、丹參、赤勺、雞血藤等9味藥)；1.2實驗方法參照陳奇主編的《中藥藥理研究方法學(xué)》制作動物炎癥模型，結(jié)果見下表


與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與芍藥/丹參組比較，△P＜0.051.3結(jié)果無論是芍藥、丹參還是含有芍藥和/或丹參的復(fù)方藥物，以及本發(fā)明組合物，都可以減輕二甲苯致小鼠皮膚毛細血管通透性，具有抑制炎癥早期毛細血管通透性增高的作用，與對照組相比具有顯著性差異。與同等劑量的單組分提取物組相比，本發(fā)明高劑量組合物組也具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，證明芍藥和丹參在均具有抗炎作用的前提下，二藥合用，效果增強，顯示出協(xié)同作用。
七.其它方面的藥理作用1.治療大鼠脂肪肝的療效觀察1.1材料與方法本發(fā)明組合物(芍藥提取物+丹參提取物2∶1，60mg/kg、20mg/kg)；丹參提取物(含丹酚酸，40mg/kg)；芍藥提取物(含芍藥苷，20mg/kg)。
雄性SD大鼠50只，體重150g±10g。正常喂養(yǎng)1周后，隨機分為2組實驗組(40只)，飼以高脂高膽固醇飼料(10.0％豬油、2.0％膽固醇、0.5％膽酸鈉、87.5％基礎(chǔ)飼料)；和正常對照組(10只)，給予基礎(chǔ)飼料，兩組大鼠均自由進水。
12周后，從實驗組隨機抽取8只，正常對照組隨機抽取2只，處死動物取肝臟做病理切片，驗證脂肪肝造模成功。將余下實驗組大鼠按體重層次再隨機分為組合物高劑量治療組、組合物低劑量治療組、丹參治療組及芍藥苷治療組。正常對照組以同等容積蒸餾水灌胃，各組均予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，給藥4周后取血及肝組織，檢測各項指標(biāo)。
1.2觀察指標(biāo)(1)實驗結(jié)束處死動物時，稱體重及肝重；(2)生物化學(xué)指標(biāo)測定空腹血糖(FBG)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)的含量、空腹血清胰島素(FINS)；(3)胰島素抵抗指數(shù)胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR＝(FBG×FINS)/22.5；和(4)組織病理學(xué)檢查分光光度法測定TG的含量。
1.3結(jié)果實驗進行中各組均無動物死亡。
實驗結(jié)束時，丹參、芍藥苷治療組動物的體重、肝指數(shù)(肝濕重/體重×100％)比正常對照組顯著增高(P＜0.05；P＜0.01)；與丹參、芍藥苷治療組比較，高、低劑量組合物治療組的體重、肝指數(shù)顯著降低(P＜0.01)；與正常對照組相比，高、低劑量組合物治療組體重、肝指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見下表8。
血清和肝組織勻漿脂質(zhì)的變化丹參、芍藥苷治療組血清TG、TC及肝組織TG較正常對照組升高；與丹參、芍藥苷治療組比較，高、低劑量組合物治療組中上述指標(biāo)均明顯改善，見下表9。
FBG和FINS等變化丹參治療組FBG和FINS及HOMA-IR呈增高趨勢；芍藥苷治療組FBG和FINS及HOMA-IR呈下降趨勢；與丹參治療組比較，高、低劑量組合物治療組的FINS及HOMA-IR顯著下降，其余比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見下表10。
病理學(xué)改變(1)肉眼觀察丹參、芍藥治療組大鼠肝外觀呈奶油黃，體積明顯增大，邊緣變鈍，質(zhì)地變軟，切面略帶油膩感；高、低劑量組合物治療組肝外觀接近正常對照組；和(2)光鏡觀察丹參、芍藥苷治療組肝小葉中心帶肝細胞中出現(xiàn)大小不等的脂肪滴，部分肝細胞核則被脂肪滴擠壓而明顯偏位，小葉內(nèi)及匯管區(qū)局灶性炎性細胞浸潤，伴有一定程度的點片狀壞死；高、低劑量組合物治療組肝小葉和肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，細胞內(nèi)見少許小泡性脂肪滴，偶見肝細胞壞死。
1.4結(jié)論上述實驗提示，本發(fā)明組合物用于大鼠脂肪肝模型干預(yù)可以顯著改善脂肪肝病變程度，改善脂肪代謝，優(yōu)于單獨應(yīng)用丹參或芍藥干預(yù)，具有顯著性差異。
由于非酒精性脂肪肝的發(fā)生與胰島素抵抗密切相關(guān)，且患者常合并肥胖、高血糖、高胰島素血癥。我們認為本發(fā)明組合物是通過降低患者胰島素抵抗，改善脂代謝，抗細胞炎性等方面產(chǎn)生改善脂肪肝病變的作用，且這種作用在單獨使用丹參及芍藥的情況下均未呈現(xiàn)，其協(xié)同作用機制值得進一步探討。
表8大鼠體重、肝指數(shù)的變化(X±S，n＝8)


與正常對照組比較*P＜0.05；#P＜0.01；與正常對照組比較□P＞0.05；與丹參、芍藥治療組比較▲P＜0.01表9大鼠血清及肝勻漿脂質(zhì)的變化(X±S)

與正常對照組比較*p＜0.05；#p＜0.01；與模型對照組比較□P＞0.05；與丹參、芍藥治療組比較▲p＜0.05表10大鼠空腹血糖、血清胰島素及胰島素抵抗指數(shù)水平的變化(X±S)

與丹參治療組比較*p＜0.052.治療兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞的實驗研究2.1材料和方法純種雄性新西蘭白兔36只，體重2.1-2.4kg，造成視網(wǎng)膜靜脈阻塞模型。
分為6組，每組6只，即空白對照組、本發(fā)明組合物治療組(芍藥苷+丹參素1∶15，分高、中、低三個劑量組)、丹參(丹參素)治療組、芍藥苷治療組，造模后第3天開始連續(xù)給藥10天，空白對照組給予等容量飲用水。
2.2結(jié)果眼底情況造模第2天可見眼底出血，第6天本發(fā)明組合物高劑量組眼底出血明顯開始吸收，而空白對照組眼底出血20天后才明顯開始吸收，差別有顯著性差異。丹參治療組和芍藥苷治療組分別與第11、18天開始眼底出血明顯開始吸收，這與空白對照組相比無顯著性差異。血液完全吸收后，空白對照組與芍藥苷治療組的眼底血管細而迂曲，而本發(fā)明組合物3個劑量組的眼底血管均接近正常情況，丹參治療組的眼底血管改變介于空白對照組和本發(fā)明組合物低劑量組之間。結(jié)果見表11。
眼底照相及熒光素眼底血管造影檢查本發(fā)明組合物3個劑量組、丹參治療組眼底血管形態(tài)接近正常，未見熒光素滲漏，亦未見新生血管，而空白對照組、芍藥苷組雖然眼底出血已經(jīng)吸收，但仍可見熒光素滲漏，并可見新生血管。眼底照相見6個組出血均已完全吸收，但血管形態(tài)不同，情況與直接檢眼鏡的檢查一致。
2.3結(jié)論實驗表明，本發(fā)明組合物對兔實驗性視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞有非常顯著的治療作用。尤其值得注意的是，單獨施用的丹參或芍藥均無法達到本發(fā)明組合物的治療效果。我們認為，這與組合物中丹參和芍藥苷在下述作用機制中產(chǎn)生明顯協(xié)同作用有關(guān)擴張血管，減少血管阻力；改善微循環(huán)，提高耐缺氧能力；抑制纖維蛋白合成，抗凝血和組織增生；抑制過敏介質(zhì)的釋放，抗過敏反應(yīng)。
表11對兔眼底出血完全吸收時間的影響(x±s，n＝6)

與生理鹽水組比較，*P＜0.05**P＜0.01毒理學(xué)1.小鼠急性毒性小鼠一次性口服本發(fā)明的組合物50g/kg后，連續(xù)觀察，未見動物毒性反應(yīng)，更無死亡發(fā)生。本發(fā)明藥物組合物的小鼠LD50＞50g/kg。
2.大鼠長期毒性本發(fā)明的組合物1.00、0.75、0.35g/kg三個劑量連續(xù)口服給藥12周、26周和停藥4周，各給藥組雌雄大鼠一般體征與對照組無明顯差異；尿常規(guī)檢查中，各項指標(biāo)與對照組無顯著差別；其它各項生化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)；本發(fā)明的組合物在給藥26周時，給藥組各臟器系數(shù)與對照組相比均無顯著差異；病理形態(tài)學(xué)觀察，大鼠主要臟器均未見與受試藥物毒性相關(guān)的病理改變。
臨床觀察1.心腦血管方面的臨床試驗采用隨機雙盲對照的方法考察其療效和不良反應(yīng)，共觀察冠心病病人170例，其中治療組100例，療效愈顯率39.87％，總有效率88.33％；對照組70例，愈顯率26.46％，總有效率74.93％，兩組冠心病療效經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異，治療組優(yōu)于對照組。治療組未見明顯的不良反應(yīng)。
2.治療高脂血癥的臨床觀察2.1材料和方法病例入選條件(1)空腹血漿TC≥5.8mmol/L、TG≥1.8mmol/L；(2)無肝、腎、甲狀腺功能異常；(3)無糖尿病病史，可伴有高血壓病。
血脂水平達到入選標(biāo)準的初治病人共93例，其中高膽固醇血癥60例(男18例，女42例，57.9±11.4歲)，高甘油三酯血癥64例(男36例，女48例，56.1±9.5歲)，病人再隨機平均分為三組。同期血脂康治療為對照組共37例(男21例，女16例，齡52±9歲)，四組病例年齡及性別經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理無顯著差別。
藥品(1)陽性對照藥血脂康膠囊(口服，1.2g/日)；(2)本發(fā)明組合(含芍藥苷+丹酚酸B 1∶2，口服，60mg/日)；(3)丹參片(口服，相當(dāng)于丹酚酸B 66mg/日)；(4)芍藥提取物(口服，相當(dāng)于芍藥苷30mg/日)。
2.2觀察指標(biāo)及結(jié)果血清TC，TG和GDL-C以酶學(xué)方法測定。血清LDL-C由Friedwald公式LDL-C＝TC-HDL-C-TG/2.2計算獲得，結(jié)果見表12。
結(jié)果表明，服藥8周后，本發(fā)明組合和血脂康組患者的血清TC、TG水平均較服藥前顯著降低，丹參及芍藥組則治療前后指標(biāo)均無顯著性差異。這表明，經(jīng)本發(fā)明組合治療后，高脂血癥血清TC、TG均能降低，效果與每日服1.2g血脂康膠囊相同，且明顯優(yōu)于單獨應(yīng)用丹參及芍藥的治療方案。
表12臨床觀察結(jié)果x±s(n)，mmol/L


*p＜0.01與服藥前同組比較3.缺血性腦卒中二級預(yù)防的臨床觀察3.1對象入選標(biāo)準年齡＜75歲；缺血性腦卒中；首發(fā)或二次復(fù)發(fā)病例；急性期3月后；有CT/MRI診斷，并與臨床表現(xiàn)相符合。
排除標(biāo)準各種出血性卒中；三次及以上腦卒中發(fā)作；影像學(xué)檢查為缺血性腦卒中，而無臨床癥狀或體征的病人；無CT/MRI確診的腦卒中患者；缺血性腦卒中急性期3個月內(nèi)；瘤卒中；血液??；嚴重肝腎功能損傷；靜息卒中。
3.2方法與結(jié)果本發(fā)明組合丹參提取物(以丹參酮IIA計)，口服2mg/天，和芍藥提取物(含芍藥苷)口服15mg/天，400例；藥物對照阿司匹林，口服75mg/天，480例；空白對照不提供阿司匹林或本發(fā)明組合，470例。
于實驗開始的第30、60、90、120天，觀察是否有卒中復(fù)發(fā)、副反應(yīng)(出現(xiàn)胃腸不適、腹痛、惡心、噯氣等癥狀)和嚴重副反應(yīng)(以出現(xiàn)黑便，大便潛血檢查陽性，經(jīng)停藥抗酸治療后黑便、潛血消失為判定上消化道出血副反應(yīng)依據(jù))，評定復(fù)發(fā)必須有CT/MRI確診。結(jié)果見表13。
3.3結(jié)論本發(fā)明組合及阿司匹林均可以降低缺血性腦卒中的復(fù)發(fā)率，兩者效果相當(dāng)。與空白對照組相比，本發(fā)明組合和藥物對照組均有著顯著性差異。
服用阿司匹林的480例中，出現(xiàn)37例副作用和11例嚴重副反應(yīng)；而服用本發(fā)明組合的400例中，只有8例副反應(yīng)，1例嚴重副反應(yīng)產(chǎn)生，兩組對比有顯著性差異。
表13二級預(yù)防的臨床觀察結(jié)果

實施例實施例1 片劑取丹參2000g，加95％乙醇回流1.5小時，濾過，濾液回收乙醇至稠膏；藥渣加水煎煮1小時，濾過，濾液與上述稠膏合并，減壓濃縮至適量，加輔料適量，混勻。取赤芍1000g，粉碎成粗粉，加75％乙醇回流提取三次，第一、二次各2小時，第三次1小時，合并提取液，減壓濃縮至約400ml，用正丁醇提取三次，每次300ml，合并正丁醇提取液，減壓濃縮至無正丁醇味，加水200ml，加熱溶解，濾過，濾液噴霧干燥，與上述丹參提取物均勻混合，常規(guī)壓片，制得1000片，包衣即得。經(jīng)檢測，每片中含有丹參(以丹酚酸B(C36H30O16))計為40mg、和芍藥(以芍藥苷計)20mg。
實施例2 膠囊劑取丹參5000g，加90％乙醇回流1.5小時，提取液濾過，濾液回收乙醇并濃縮至適量，備用；藥渣加50％乙醇加熱回流1.5小時，提取液濾過，濾液回收乙醇并濃縮至適量，備用。另取芍藥苷5g與上述丹參提取物均勻混合，再加入淀粉、硬脂酸鎂，混勻，裝入硬膠囊中，壓制成1000粒軟膠囊。經(jīng)檢測，每膠囊中含有丹參(以丹酚酸B(C36H30O16)計)為100mg、和芍藥苷5mg。
實施例3 軟膠囊劑取丹參2000g，加90％乙醇回流1.5小時，提取液濾過，濾液回收乙醇并濃縮至適量，備用；藥渣加50％乙醇加熱回流1.5小時，提取液濾過，濾液回收乙醇并濃縮至適量，備用。另取芍藥苷20g與上述丹參提取物均勻混合，再加入植物油混勻，用明膠作囊殼材料，壓制成1000粒軟膠囊。經(jīng)檢測，每膠囊中含有丹參(以丹參酮IIA(C19H18O3)計)為2mg、和芍藥苷20mg。
實施例4 緩釋片劑取丹參4000g，加水煎煮，煎液濾過，濾液濃縮，加入乙醇，靜置使沉淀，取上清液，回收乙醇，濃縮成稠膏，備用。另取芍藥苷5g與上述丹參提取物均勻混合，加入乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基基纖維素、聚乙烯吡咯、硬質(zhì)酸鎂，按照標(biāo)準制粒和壓片工藝制備1000片。經(jīng)檢測，每片含丹參(以丹參素(C9H10O5)計)為20mg、和芍藥苷5mg。
實施例5 凍干針劑取25g丹參酮IIA磺酸鈉、2g聚乙烯吡咯酮，加入注射用水800ml使溶解，調(diào)節(jié)pH值后，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾；濾液在5℃下放置48小時，用注射用水稀釋至1000ml，0.1μm微孔濾膜過濾，超濾(截留分子量為5000)，濾液加入芍藥苷25g至溶解，混合均勻、微孔濾膜過濾，加注射用水至2000ml。然后，加配制量的0.02％活性炭攪拌5-10min，用無菌抽濾漏斗過濾，再用滅菌垂熔漏斗精濾或超濾，濾液檢驗合格后分裝灌封1000支，冷凍干燥，輻射滅菌，包裝，即可。經(jīng)檢測，每支含丹參(丹參酮IIA(C19H18O3)計)為25mg、和芍藥苷25mg。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，包括活性組分和藥用輔料，所述活性組分為a.含有丹酚酸、丹參酮的丹參提取物；或含有丹酚酸、丹參素的丹參水溶性提取物；或丹參酚酸單體或其藥用鹽；或丹參酚酸單體的混合物；或含有丹參酮的丹參脂溶性提取物；或丹參酮單體或其藥用鹽，或丹參酮單體的混合物；和b.芍藥的干燥根粉末，或含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥新苷的芍藥提取物，或芍藥苷單體，其中組分a中丹酚酸或丹參酮與組分b中芍藥苷的重量比例為0.01-20∶1。
2.如權(quán)利要求1的藥物組合物，包括以下組分a.含有丹酚酸、丹參素的丹參水溶性提取物；和b.含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的芍藥提取物，其中丹酚酸與芍藥苷的重量比例為0.05-10∶1。
3.如權(quán)利要求1的藥物組合物，包括以下組分a.丹參酚酸單體或其藥用鹽；或丹參酚酸單體的混合物；和b.含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的芍藥提取物，其中丹酚酸與芍藥苷的重量比例為0.05-10∶1。
4.如權(quán)利要求1的藥物組合物，包括以下組分a.含有丹參酮的丹參脂溶性提取物；和b.芍藥苷單體，其中丹參酮與芍藥苷的重量比例為0.05-10∶1。
5.如權(quán)利要求1的藥物組合物，包括以下組分a.丹參酮單體或其藥用鹽，或丹參酮單體的混合物；和b.芍藥苷單體，其中丹參酮與芍藥苷的重量比例為0.05-10∶1。
6.如權(quán)利要求1、3或5之一的藥物組合物，其中丹酚酸或丹參酮與芍藥苷的重量比例為0.05-1∶1。
7.如權(quán)利要求1-6之一的藥物組合物，為口服或非腸道給藥制劑形式。
8.權(quán)利要求1-7之一的藥物組合物在制備用于治療和/或預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥、老年癡呆癥、心腦血管疾病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、高脂血癥、脂肪肝的藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1-8之一的藥物組合物在制備用于預(yù)防心腦血管疾病復(fù)發(fā)的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥物組合、制備方法及其應(yīng)用，所述藥物組合含有丹參和芍藥。本發(fā)明藥物組合可用于治療和預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥、老年癡呆癥、心腦血管疾病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、高脂血癥、脂肪肝，以及用于預(yù)防心腦血管疾病的復(fù)發(fā)。
文檔編號A61P1/16GK1742808SQ200510105268
公開日2006年3月8日 申請日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者詹宇亮, 毛成文 申請人:詹宇亮