專利名稱：抗腫瘤試劑及其制備方法以及含有該試劑的飲料和食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗腫瘤試劑、其制備方法及含有該試劑的飲料和食品。更具體地，本發(fā)明涉及以曲類等微生物使麥胚芽、米胚芽和大豆胚芽等等發(fā)酵所得的抗腫瘤試劑、含有該試劑的飲料和食品及該抗腫瘤試劑的制備方法。本發(fā)明廣泛應(yīng)用于保健食品及疾病治療等。
背景技術(shù)：
一直以來，雖然有許多合成化合物的免疫增強劑，但更優(yōu)選的是即使長時間服用也無毒副作用的天然免疫增強劑。有些天然免疫增強劑及抗腫瘤試劑是已知的(參見專利文獻1至3)。另外，本發(fā)明人曾提出使污濁的血液變純凈的含酶食品(參見專利文獻4)。
專利文獻1特開平6-9421號公報；專利文獻2特開2000-224970號公報；專利文獻3特開2003-335695號公報；專利文獻4特開2001-120203號公報。
然而，現(xiàn)有技術(shù)中未知這樣一類天然的抗腫瘤試劑，其能夠(1)使引起腦血栓、腦梗塞及肺血栓栓塞的紅細胞聚集體彼此分離、且呈正圓形，且(2)短時間內(nèi)修復(fù)異常形狀的紅細胞，使之成為正常形狀，從而治療由這些異常形狀的紅細胞所引起的疾病。本發(fā)明人進行了大量研究，并根據(jù)活血細胞分析法(Live Blood Analysis)進行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)某些發(fā)酵產(chǎn)物使紅細胞聚集體彼此分離、且呈正圓形，并且使白細胞增大并刺激白細胞的活動。因此，所述發(fā)酵產(chǎn)物不僅能預(yù)防腦血栓、腦梗塞及肺血栓栓塞，并且能增強免疫力。在該發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上開發(fā)出了本發(fā)明的抗腫瘤試劑。另外，本發(fā)明的抗腫瘤試劑能在短時間內(nèi)修復(fù)異常形狀的紅細胞，使之成為正常形狀，從而治療各種相關(guān)疾病。
在大鼠體外實驗中發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗腫瘤試劑具有抗腫瘤效果。更特別地，通過活血細胞分析法發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗腫瘤試劑不僅可用于腫瘤免疫，還能提供廣泛的免疫增強作用，從而對多種疾病有效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過使米胚芽、麥胚芽和大豆胚芽發(fā)酵得到的抗腫瘤試劑，含有該試劑的飲料和食品以及該抗腫瘤試劑的制備方法。本發(fā)明的抗腫瘤試劑能夠(1)增強對腫瘤的免疫力，(2)增強白細胞活性，從而增強對腫瘤以外的各種疾病的免疫力，(3)溶解血液中的尿酸結(jié)晶及其類似物，及(4)短時間內(nèi)修復(fù)異常紅細胞，使之成為正常形狀，從而治療由異常形狀的紅細胞引起的各種疾病。
本發(fā)明提供1、通過將含有至少一種選自麥胚芽、大豆胚芽及米胚芽的物質(zhì)的原料用一種或多種選自曲類(leaven)、酵母及乳桿菌的微生物進行發(fā)酵得到的抗腫瘤試劑。
2、如上述第1項所述的抗腫瘤試劑，其中所述試劑使至少一種給藥前已經(jīng)存在的選自紅細胞聚集體、棘紅細胞、靶形紅細胞、紅細胞粘連、鈍鋸齒狀紅細胞、小紅細胞、大紅細胞、溶血紅細胞、鏈狀排列的紅細胞、卵形紅細胞及被自由基損傷的紅細胞的異常紅細胞在使用后變?yōu)檎龍A形，且各紅細胞呈彼此分離的狀態(tài)。
3、如上述第1項或第2項所述的抗腫瘤試劑，其中所述試劑給藥后使血液中的白細胞直徑變?yōu)檎＜t細胞直徑的2.2倍或更高。
4、如上述第1項或第2項所述的抗腫瘤試劑，其能消除血液中的尿酸結(jié)晶。
5、如上述第3項所述的抗腫瘤試劑，其能消除血液中的尿酸結(jié)晶。
6、如上述第1項或第2項所述的抗腫瘤試劑，其還表現(xiàn)出至少一種附加效果，所述效果選自緩解關(guān)節(jié)痛、增強肝臟機能、縮小子宮肌瘤、減少癌細胞、降低膽固醇、降低中性脂肪及治療特應(yīng)性皮炎。
7、如上述第3項所述的抗腫瘤試劑，其還表現(xiàn)出至少一種附加效果，所述效果選自緩解關(guān)節(jié)痛、增強肝臟機能、縮小子宮肌瘤、減少癌細胞、降低膽固醇、降低中性脂肪及治療特應(yīng)性皮炎。
8、如上述第4項所述的抗腫瘤試劑，其還表現(xiàn)出至少一種附加效果，所述效果選自緩解關(guān)節(jié)痛、增強肝臟機能、縮小子宮肌瘤、減少癌細胞、降低膽固醇、降低中性脂肪及治療特應(yīng)性皮炎。
9、如上述第5項所述的抗腫瘤試劑，其還表現(xiàn)出至少一種附加效果，所述效果選自緩解關(guān)節(jié)痛、增強肝臟機能、縮小子宮肌瘤、減少癌細胞、降低膽固醇、降低中性脂肪及治療特應(yīng)性皮炎。
10、含有和使用上述第1項或第2項所述的抗腫瘤試劑的飲料和食品。
11、含有和使用上述第3項所述的抗腫瘤試劑的飲料和食品。
12、含有和使用上述第4項所述的抗腫瘤試劑的飲料和食品。
13、含有和使用上述第5項所述的抗腫瘤試劑的飲料和食品。
14、含有和使用上述第6項所述的抗腫瘤試劑的飲料和食品。
15、含有和使用上述第7項所述的抗腫瘤試劑的飲料和食品。
16、含有和使用上述第8項所述的抗腫瘤試劑的飲料和食品。
17、含有和使用上述第9項所述的抗腫瘤試劑的飲料和食品。
18、上述第1項或第2項中所述的抗腫瘤試劑的制備方法，包括如下步驟(1)將至少一種選自麥胚芽、大豆胚芽及米胚芽的物質(zhì)在50至150℃用蒸汽加熱，或者將所述物質(zhì)在50至150℃烘焙后用蒸汽加熱；及(2)將所得的蒸汽加熱產(chǎn)物用至少一種選自曲類、酵母及乳桿菌的微生物進行發(fā)酵。
19、如上述第18項所述的抗腫瘤試劑的制備方法，還包括用60至100℃的熱水處理所得的發(fā)酵產(chǎn)物的步驟。
20、上述第9項所述的抗腫瘤試劑的制備方法，包括如下步驟(1)將至少一種選自麥胚芽、大豆胚芽及米胚芽的物質(zhì)在50至150℃用蒸汽加熱，或者將所述物質(zhì)在50至150℃烘焙后用蒸汽加熱；及(2)將所得的蒸汽加熱產(chǎn)物用至少一種選自曲類、酵母及乳桿菌的微生物進行發(fā)酵。
21、如上述第20項所述的抗腫瘤試劑的制備方法，還包括用60至100℃的熱水處理所得的發(fā)酵產(chǎn)物的步驟。
附圖的簡要說明

圖1所示為本發(fā)明抗腫瘤試劑對人A4573尤因氏肉瘤(Ewing’ssarcoma)的抗腫瘤效果。
圖2所示為本發(fā)明抗腫瘤試劑對小鼠黑瘤B16細胞的抗腫瘤效果。
圖3所示為用本發(fā)明抗腫瘤試劑接種后的小鼠的體重變化。
圖4所示為在攝取本發(fā)明抗腫瘤試劑的小鼠皮下接種的B16細胞的增殖情況。
圖5所示為攝取本發(fā)明抗腫瘤試劑的小鼠皮下接種B16細胞后的存活天數(shù)。
圖6所示為攝取本發(fā)明抗腫瘤試劑的小鼠尾靜脈接種B16后的體重變化。
圖7所示為尾靜脈接種B16細胞19天后的小鼠肺轉(zhuǎn)移細胞(pulmonary metastasis)數(shù)。
圖8所示為尾靜脈接種B16細胞22天后的小鼠肺轉(zhuǎn)移細胞數(shù)。
圖9所示為存在棘紅細胞的紅細胞聚集體的照片。
圖10所示為各血細胞彼此分離、呈正圓形，且不含棘紅細胞的狀態(tài)的照片。
圖11所示為血液中的紅細胞為棘紅細胞的照片。
圖12所示為血液中各紅細胞彼此分離、呈正圓形，不含棘紅細胞，且白細胞大小為紅細胞的3倍或以上的狀態(tài)的照片。
圖13所示為血液中的紅細胞呈靶形及卵形紅細胞狀態(tài)的照片。
圖14所示為血液中的靶形紅細胞及卵形紅細胞變?yōu)檎＜t細胞狀態(tài)的照片。
圖15所示為紅細胞產(chǎn)生聚集且存在尿酸結(jié)晶及霉菌的狀態(tài)的照片。
圖16所示為血液中的各紅細胞彼此分離、呈正圓形，且尿酸結(jié)晶溶解，霉菌消失，白細胞變大的狀態(tài)的照片。
圖17所示為血液中明顯存在紅細胞聚集體，且白細胞尺寸很小并為紅細胞所包圍的狀態(tài)的照片。
圖18所示為血液中的紅細胞聚集體消失，各血球彼此分離、呈正圓形的正常狀態(tài)的照片。
圖19所示為血液中的紅細胞產(chǎn)生聚集，且一幅畫面中存在3個白細胞(粒細胞)的狀態(tài)的照片。
圖20所示為血液中各紅細胞彼此分離、呈正圓形，淋巴B細胞為變大的活化狀態(tài)的照片。
本發(fā)明優(yōu)選實施方案下面對本發(fā)明進行詳細的描述。
抗腫瘤試劑(發(fā)酵產(chǎn)物)本發(fā)明的抗腫瘤試劑對作為原料的麥胚芽、大豆胚芽及米胚芽的種類并無特別限制。例如，所述麥胚芽可使用大麥、小麥、薏仁(adlay)、裸麥及燕麥等等中任一種的麥胚芽。也可結(jié)合使用其中兩種或更多種類型的麥胚芽?，F(xiàn)在已知的大豆種類約為200種，其中任一種的胚芽都可使用。例如可使用黑豆、丹波黑豆及青豆等等中任一種的大豆胚芽。也可結(jié)合使用其中兩種或更多種類型的大豆胚芽。另外，米胚芽也可為任意種類的米的胚芽。例如，可使用長粒種(long-grain type)、中粒種及短粒種中任一種的米胚芽。另外，也可結(jié)合使用其中兩種或更多種類型的米胚芽。而且，可單獨使用麥胚芽、大豆胚芽或米胚芽，也可結(jié)合使用其中兩種或更多種。另外，可適當選擇上述原料的配合比例。例如麥胚芽∶大豆胚芽∶米胚芽的重量比可為1∶1∶1。上述原料的重量配比優(yōu)選麥胚芽∶大豆胚芽∶米胚芽等于3-6∶3-6∶2-5，更優(yōu)選4-6∶4-6∶3-5，特別優(yōu)選5-6∶5-6∶4-5，最優(yōu)選5∶5∶4。在上述范圍內(nèi)，容易發(fā)酵得到具有優(yōu)異性能的抗腫瘤試劑。
上述原料中，可再添加至少一種選自薏仁、大豆及糙米的物質(zhì)。添加該物質(zhì)時，原料的發(fā)酵效率提高，并且促進了原料分子量的降低，從而使所述抗腫瘤試劑更容易在體內(nèi)吸收。該物質(zhì)可直接添加，也可以破碎狀或粉末狀添加。以添加后的原料總重量為100％，該物質(zhì)的添加比例優(yōu)選為5-60％重量比，更優(yōu)選為5-50％，特別優(yōu)選為10-40％。添加比例在上述范圍內(nèi)時，發(fā)酵效率提高。
使用一種或多種選自曲類、酵母及乳桿菌的微生物對上述原料進行發(fā)酵。所用曲類能使上述原料發(fā)酵即可，并無特別的限制?？墒褂妹浊?Aspergillus oryzae)及醬油曲霉(Aspergillus sojae)等曲類?？蓛H使用一種曲類，也可結(jié)合使用兩種或更多種曲類。其中，優(yōu)選使用米曲霉。
另外，所述酵母的種類只要能發(fā)酵上述原料即可，并無特別的限制?？墒褂冕劸平湍?Saccharomyces cerevisie)及魯氏酵母(Saccharomycesrouxii)等?？蓛H使用所述酵母中的一種，也可同時使用兩種或以上。這些酵母中，優(yōu)選使用釀酒酵母。
另外，所述乳桿菌的種類能發(fā)酵上述原料即可，并無特別的限制。例如，乳桿菌可使用植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)及糞腸球菌(Enterococcus faecalis)等?？蓛H使用這些乳桿菌中的一種，也可結(jié)合使用兩種或更多種乳桿菌。這些乳桿菌中，優(yōu)選使用植物乳桿菌、唾液乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌及嗜酸乳桿菌。
可同時培養(yǎng)所述曲類、酵母及乳桿菌中的兩種或更多種，或用其進行發(fā)酵。
在50至150℃對所述原料進行蒸汽加熱，優(yōu)選60至140℃，更優(yōu)選70至130℃，最優(yōu)選80至120℃。因為50℃以下時，胚芽中的淀粉或蛋白質(zhì)等沒有充分變性為適合發(fā)酵的形式。而在150℃以上時，胚芽中的后來成為抗腫瘤試劑的有效成分容易分解。
所述蒸汽加熱的方法并無特別限制，雖然可使用常規(guī)裝置，但通常使用高壓滅菌釜。蒸汽加熱的時間并無特別的限制，但優(yōu)選30至500分鐘，更優(yōu)選50至480分鐘，特別優(yōu)選70至460分鐘。如果加熱時間少于30分鐘，則蒸汽加熱可能不充分，而500分鐘以上時則必要成分可能會分解。
在蒸汽加熱前，也可對所述原料進行烘焙。所述烘焙方法并無特別的限制，可使用公知的方法。其中，優(yōu)選使用遠紅外線進行烘焙。烘焙時間為30至500分鐘，優(yōu)選50至480分鐘，更優(yōu)選70至460分鐘。因為30分鐘以下時不能充分烘焙而使發(fā)酵效率降低，而500分鐘以上時則必要成分會分解。
通常，優(yōu)選將蒸汽加熱后或先烘焙再蒸汽加熱后的原料冷卻至20至50℃，更優(yōu)選23至45℃，特別優(yōu)選26至40℃。將冷卻后的原料與上述曲類等混合，在發(fā)酵室中發(fā)酵。發(fā)酵室的溫度優(yōu)選24至42℃，更優(yōu)選25至41℃，特別優(yōu)選26至40℃；發(fā)酵時間優(yōu)選為24至72小時，更優(yōu)選28至68小時，特別優(yōu)選32至64小時。
上述發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間的組合則優(yōu)選在24至42℃發(fā)酵24至72小時，更優(yōu)選在25至41℃發(fā)酵28至68小時，特別優(yōu)選在26至40℃發(fā)酵32至64小時。
此后，將所得物質(zhì)從發(fā)酵室中取出，干燥得到發(fā)酵產(chǎn)物(抗腫瘤試劑)?？墒褂霉姆椒ㄟM行干燥，例如熱風(fēng)干燥法、減壓干燥法及冷凍干燥法。其中優(yōu)選熱風(fēng)干燥法，并且在35至45℃干燥10至20小時。隨后如果需要可進行滅菌。根據(jù)使用目的可將所述抗腫瘤試劑制成粉末、顆粒、片劑或膠囊等。
另外，可用熱水對上述發(fā)酵產(chǎn)物進行處理。所述熱水處理優(yōu)選在60至100℃進行，更優(yōu)選65至98℃，特別優(yōu)選70至96℃，時間優(yōu)選為5至35分鐘，更優(yōu)選10至30分鐘，特別優(yōu)選15至25分鐘。有時，經(jīng)熱水處理過的抗腫瘤試劑與未經(jīng)熱水處理的試劑相比較，具有更優(yōu)異的效果(參見圖1及圖2)。
將本發(fā)明的抗腫瘤試劑以1mg/ml的濃度加入在96孔板中培養(yǎng)的人A4573尤因氏肉瘤的培養(yǎng)液中。24小時后加入活細胞檢測試劑(四唑鹽Nakarai Tesk生產(chǎn))，1小時后使用微板分析儀(microplate leader)(450nm)對顯色反應(yīng)進行檢測，測定活細胞的數(shù)量。與未加本發(fā)明抗腫瘤試劑的情況(以下稱為“對照組””)相比較，使用經(jīng)熱水處理過的抗腫瘤試劑時，活細胞數(shù)優(yōu)選降至對照組活細胞數(shù)的90％或以下，更優(yōu)選88％或以下，最優(yōu)選85％或以下。
類似地，向96孔板中培養(yǎng)的小鼠黑瘤B16細胞培養(yǎng)液中，添加濃度為1mg/ml的本發(fā)明抗腫瘤試劑。24小時后向其中加入活細胞檢測試劑(四唑鹽Nakarai Tesk生產(chǎn))，1小時后使用微板分析儀(450nm)檢測顯色反應(yīng)來測定活細胞數(shù)量。與對照組相比較，使用未經(jīng)熱水處理的本發(fā)明抗腫瘤試劑時，活細胞數(shù)優(yōu)選下降為對照組活細胞數(shù)的90％或以下，更優(yōu)選88％或以下，最優(yōu)選85％或以下。而使用熱水處理過的本發(fā)明抗腫瘤試劑時，活細胞數(shù)優(yōu)選下降為對照組活細胞數(shù)的90％或以下，更優(yōu)選89％或以下，最優(yōu)選88％或以下。
給5周齡的C57BL6小鼠喂食含0.4％的所述抗腫瘤試劑的固體食物，喂食2周后在其尾靜脈接種B16細胞(5×105細胞/小鼠)，接種22天后抗腫瘤試劑接種組的腫瘤體積優(yōu)選縮小為對照組腫瘤體積的65％或以下，更優(yōu)選為60％或以下，最優(yōu)選為55％。
并且，接種22天后測定體重，腫瘤試劑給藥組的平均體重優(yōu)選為對照組的104％或以上，更優(yōu)選為105％或以上，最優(yōu)選為106％或以上。
另外，接種22天后，肺轉(zhuǎn)移細胞數(shù)優(yōu)選降低至對照組的45％或以下，更優(yōu)選40％或以下，最優(yōu)選35％或以下。
用上述抗腫瘤試劑(以上述方法獲得的發(fā)酵產(chǎn)物)給藥后，根據(jù)活血細胞分析法進行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)血液中各紅細胞變?yōu)檎龍A形，且彼此分離。所述活血細胞分析法即LBA(活血分析法)指用顯微鏡對未染色的活血液進行分析，在短時間內(nèi)直接觀察血液中的紅細胞、諸如淋巴細胞、粒細胞及巨噬細胞等等的白細胞的方法。所述“正圓形”指通過顯微鏡觀察時的平面形狀呈基本圓形，如圖10、12、14、16、18及20所示。所述“分離”指各紅細胞未產(chǎn)生聚集的狀態(tài)，如圖10、12、14、16、18及20所示。
所述“血液中各紅細胞呈正圓形”指全部或大部分的紅細胞呈正圓形(優(yōu)選90％或以上)。術(shù)語“分離”包括正圓形的紅細胞平面接觸，從而容易使各紅細胞分離的狀態(tài)。
圖9顯示了非正圓形的紅細胞聚集形成聚集體的狀態(tài)。分離成正圓形的紅細胞尺寸為7至8微米。由于毛細血管的血管腔的直徑約為5微米，因此如圖9所示的紅細胞為非分離狀態(tài)的血液難以通過所述毛細血管。與之相對地，本發(fā)明的多數(shù)紅細胞分離成正圓形的正常血液具有變形能力，可容易地通過所述毛細血管。因此，可預(yù)防因血流障礙引起的動脈硬化、心絞痛、腦血栓、腦梗塞、肺血栓栓塞癥、心肌梗塞及心房內(nèi)出血等。
另外，通過將本發(fā)明的抗腫瘤試劑(發(fā)酵產(chǎn)物)進行給藥，可溶解血液中的尿酸結(jié)晶(參見圖15)、膽固醇結(jié)晶及血小板(plaque)。溶解所述尿酸結(jié)晶等所需的時間優(yōu)選在給藥后90天以內(nèi)，更優(yōu)選60天以內(nèi)，特別優(yōu)選30天以內(nèi)。血液中的這類尿酸結(jié)晶被認為是痛風(fēng)的原因。如果尿酸結(jié)晶接觸毛細血管壁，個體就會感到劇烈疼痛。在較短時間內(nèi)，例如上述期限內(nèi)所述疼痛即可消除。
給藥后，本發(fā)明的抗腫瘤試劑(發(fā)酵產(chǎn)物)可使血液中的棘紅細胞(參見圖9及11)、靶形紅細胞(參見圖13)、鏈狀排列的紅細胞(參見圖17)、卵形紅細胞(參見圖13)及被自由基損傷的紅細胞等恢復(fù)為正圓形，并且通常使各紅細胞彼此分離。正常的紅細胞為正圓形，而棘紅細胞等非正圓形的紅細胞稱為病態(tài)或異常紅細胞。使肝臟機能下降的紅細胞多為棘紅細胞。對缺鐵性貧血，存在許多靶形紅細胞。對甲狀腺異?；蜃訉m肌瘤等引起的內(nèi)分泌失調(diào)，則存在許多卵形紅細胞。
圖10、12、14、16、18及20顯示上述各種變形的異常紅細胞均可變?yōu)檎＜t細胞。所述異常紅細胞如何變?yōu)檎＜t細胞的機理還沒有明確的結(jié)論。但將本發(fā)明的抗腫瘤試劑(或上述方法制造的發(fā)酵產(chǎn)物)給藥時，可產(chǎn)生至少一種有益效果，包括緩解膠原病引起的關(guān)節(jié)痛、增強肝臟機能、縮小子宮肌腫、減少癌細胞、降低膽固醇、降低中性脂肪及治療特應(yīng)性皮炎。
因此，將含有至少一種選自麥胚芽、大豆胚芽及米胚芽的物質(zhì)的原料用至少一種選自曲類、酵母及乳桿菌的微生物進行發(fā)酵所得的發(fā)酵產(chǎn)物除了作為抗腫瘤試劑以外，也可用于治療一種或多種諸如痛風(fēng)、各種癌癥、腦梗塞、心肌梗塞、心絞痛、膠原病、貧血、內(nèi)分泌失調(diào)、高膽固醇、高中性脂肪及特應(yīng)性皮炎的疾病。
使上述諸如棘紅細胞的異常紅細胞成為正常紅細胞所需的時間優(yōu)選為給藥后120分鐘以內(nèi)，更優(yōu)選為60分鐘以內(nèi)，特別優(yōu)選30分鐘以內(nèi)。必須盡快使異常的紅細胞變?yōu)檎！１景l(fā)明的抗腫瘤試劑(發(fā)酵產(chǎn)物)可在較短時間內(nèi)使異常血液變?yōu)檎！?br> 將所述抗腫瘤試劑給藥后，根據(jù)活血細胞分析法進行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)血液中白細胞的直徑優(yōu)選為正常紅細胞的至少2.2倍，更優(yōu)選至少2.5倍，最優(yōu)選至少3.0倍。本文所述的白細胞大小指根據(jù)活血細胞分析法通過顯微鏡觀察到的平面形狀的直徑。
另外，將上述抗腫瘤試劑給藥后，血液中的白細胞直徑與給藥前相比(給藥后的直徑/給藥前的直徑)優(yōu)選為1.5-4倍，更優(yōu)選為2.0-3.0倍。當白細胞直徑處于上述范圍時，白細胞活性上升，從而增強免疫力。
本發(fā)明的抗腫瘤試劑能提高血液中的白細胞活性，從而提高免疫力。已知無活性的白細胞直徑較小而且活動緩慢。根據(jù)活血細胞分析法進行顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，將本發(fā)明的抗腫瘤試劑給藥后，血液中的白細胞變大，輪廓清晰，尤其觀察到巨噬細胞活躍地四處活動(參見圖12左上)。另外，在白細胞中，也可觀察到攻擊病毒或癌細胞的淋巴T細胞及B細胞，其也具有充分的活力。圖12顯示了給藥后白細胞增大為正常紅細胞的2.5倍以上并且輪廓清晰的狀態(tài)。
本發(fā)明的抗腫瘤試劑的劑量并無特別的限制。依體重、年齡及性別等可適當?shù)亟o藥。例如，對成人優(yōu)選1000至5000mg/天，更優(yōu)選2000至4000mg/天，特別優(yōu)選2500至3500mg/天。上述劑量通常每天分3至4次給藥。劑量不足1000mg時，抗腫瘤效果不足。而給藥超過5000mg時，不能得到與用量相符的腫瘤免疫效果。由于本發(fā)明的抗腫瘤試劑來源于天然物質(zhì)，因此無副作用且安全性高。
本發(fā)明的抗腫瘤試劑中，可含有一種或多種諸如小麥胚芽、糙米、海藻礦物質(zhì)、淀粉、維生素和氨基酸的物質(zhì)。另外，本發(fā)明的抗腫瘤試劑可直接飲用或食用?？蛇x擇地，可將其添加入飲料或食品中使用。其也可制成具有特定保健效果的保健食品，或調(diào)控活體機能的功能食品或保健飲品。
抗腫瘤試劑的制造方法上述抗腫瘤試劑的制造方法并無特別的限制，主要依據(jù)以下的方法進行。本發(fā)明的制造方法包括(1)將至少一種選自麥胚芽、大豆胚芽及米胚芽的原料在50至150℃用蒸汽加熱，或?qū)⑵湓?0至150℃烘焙后用蒸汽加熱，以及(2)使用至少一種選自曲類、酵母及乳桿菌的微生物對蒸汽加熱產(chǎn)物進行發(fā)酵。
在蒸汽加熱步驟(1)中，如上所述用于抗腫瘤試劑的麥胚芽、大豆胚芽及米胚芽均可使用。同時，上述的原料配合比例也可使用。上述的蒸汽加熱方法也可使用。另外，蒸汽加熱前也可在上述溫度下對麥胚芽等等進行烘焙?？墒褂蒙鲜龅暮姹悍椒?。另外，在發(fā)酵步驟(2)中，可使用如上所述的曲類、酵母及乳桿菌及發(fā)酵方法。用上述方法制造的發(fā)酵產(chǎn)物不僅可用作抗腫瘤試劑，也可用于治療各種疾病。
此外，所述方法還可包括對所得發(fā)酵產(chǎn)物用熱水處理的步驟。所述熱水處理的溫度優(yōu)選為60至100℃，更優(yōu)選65至98℃，特別優(yōu)選70至96℃。熱水處理的時間優(yōu)選為5至35分鐘，更優(yōu)選10至30分鐘，特別優(yōu)選15至25分鐘。有時，經(jīng)上述熱水處理過的抗腫瘤試劑與未經(jīng)熱水處理的試劑相比較具有更優(yōu)異的效果。
含有所述抗腫瘤試劑的飲料和食品(含所述發(fā)酵產(chǎn)物的飲料和食品)含有本發(fā)明的抗腫瘤試劑的飲料和食品以使用所述的抗腫瘤試劑(發(fā)酵產(chǎn)物)為特征。本發(fā)明的“含所述抗腫瘤試劑的飲料和食品”包含飲料及固體食品等等。飲料和食品類型的例子包括具有特定保健效果的飲料和食品，或調(diào)控活體機能的功能食品。
將本發(fā)明的抗腫瘤試劑用于飲料和食品時，可將所述抗腫瘤試劑直接制成飲料和食品的形式，也可將所需量的抗腫瘤試劑加入飲料和食品原料中，通過常規(guī)制造方法加工成含所述抗腫瘤試劑的飲料和食品。例如，將所述抗腫瘤試劑作為添加劑直接添加入飲料，或諸如餅干等的固體食品中，作為含抗腫瘤試劑的預(yù)防癌癥的飲料或食品、保健食品或功能食品等。
可選擇地，可將上述抗腫瘤試劑溶解于例如油脂、乙醇、丙二醇、甘油、表面活性劑或其混合物中制成液態(tài)或懸浮液，添加于飲料或固體食品中。如果需要，也可將其與諸如阿拉伯膠或糊精等等的膠粘劑混合制成粉末狀或顆粒狀，添加于飲料或固體食品中。添加本發(fā)明的抗腫瘤試劑的飲料和食品的種類并無特別的限制。
將所述抗腫瘤試劑添加入飲料和食品時，對于所述抗腫瘤試劑的添加量并無特別的限制，但因為其被作為保健食品、功能食品攝取來預(yù)防疾病及維持健康，所以需依年齡、體重及性別適當?shù)卣{(diào)整添加量。以添加所述抗腫瘤試劑后的飲料和食品的重量為100％，所述抗腫瘤試劑的添加量優(yōu)選1至30％重量比，更優(yōu)選2至25％，特別優(yōu)選3至20％。
本發(fā)明含抗腫瘤試劑的飲料和食品以傳統(tǒng)的食品為原料，在安全性方面也很優(yōu)異。
另外，也可以所述“發(fā)酵產(chǎn)物”取代本發(fā)明的“抗腫瘤試劑”用于飲料和食品。
實施例以下參照實施例對本發(fā)明進行說明。本發(fā)明實施例中使用如下所述的條件根據(jù)活血細胞分析法進行顯微鏡觀察使用CH40型顯微鏡(Olympus公司制造)，放大倍數(shù)為1000倍。以下實施例中提到的紅細胞圖片顯示的是用顯微鏡觀察到的放大1000倍的狀態(tài)。
實施例1原料的配合比例為250g的麥胚芽、250g的大豆胚芽及200g的米胚芽。將該混合物以110℃的蒸汽加熱3小時，然后冷卻。溫度達到30℃時，將所得混合物與250g的小麥曲霉混合，薄薄地攤開在平盤上。將該平盤和混合物放入發(fā)酵室，在30℃發(fā)酵48小時。然后取出，撤掉平盤，將混合物在40℃干燥48小時而得到抗腫瘤試劑。
實施例2-使用小鼠的體外腫瘤免疫(1)將上述抗腫瘤試劑制成干粉，溶解于磷酸緩沖溶液。由此制備未經(jīng)熱水處理的抗腫瘤試劑，以及用90℃的熱水(沸騰后的)處理20分鐘。將各溶液添加入96孔板中的人腫瘤細胞A4573及小鼠黑瘤B16細胞培養(yǎng)液中，使最終濃度為1mg/ml。添加6及24小時后，加入活細胞檢測試劑(四唑鹽Nakarai Tesk生產(chǎn))，1小時后使用微板分析儀(450nm)，測定顯色反應(yīng)。對未添加抗腫瘤試劑的對照組(以下簡稱為“對照組”)也進行了同樣的測定。并重復(fù)測定4次。
結(jié)果如圖1及圖2所示。其證明與對照組相比，經(jīng)熱水處理過的抗腫瘤試劑可明顯降低存活的人腫瘤細胞A4573的數(shù)量。對小鼠黑瘤B16細胞，也證明存活細胞數(shù)明顯降低。
(2)制備含0.4％所述抗腫瘤試劑的固體飼料，將其對5周齡的C57BL6小鼠給食。估計自由取食的小鼠每日所攝取的抗腫瘤試劑量為人類的10倍。另外，以給予普通固體飼料的小鼠為對照組。為評估所述抗腫瘤試劑(1)對皮下移植腫瘤的抗腫瘤效果，在喂食2周后，對7只小鼠皮下接種B16細胞(5×105細胞/小鼠)。一段時間后檢測腫瘤體積，并且計算接種腫瘤后的存活率。
結(jié)果如圖3、4及5所示。對自由取食的小鼠，與給予普通固體飼料的對照組相比，未發(fā)現(xiàn)明顯的體重變化(圖3)。由此證明小鼠攝食與普通飼料等量的含抗腫瘤試劑的飼料。在給食2周后，對各組的7只小鼠皮下接種B16細胞(5×105細胞/小鼠)。接種22天后，抗腫瘤試劑接種組的腫瘤體積為對照組體積的55％，因此表明其具有顯著的抗腫瘤效果(圖4)。至于腫瘤接種組的存活天數(shù)，對皮下接種B16細胞(5×105細胞/小鼠)的抗腫瘤試劑給藥組，接種28天后7只小鼠中有4只存活，而對照組的存活數(shù)為0(圖5)。
(3)制備含0.4％所述抗腫瘤試劑的固體飼料，將其對5周齡的C57BL6小鼠給食。
以給予普通固體飼料的小鼠為對照組。為評估所述抗腫瘤試劑對轉(zhuǎn)移瘤的抗腫瘤效果，在給食2周后，對各組的10只小鼠尾靜脈接種B16細胞(5×105細胞/小鼠)。一段時間后測定其體重，并且在接種19天及22天后，摘除各組中半數(shù)(5只)小鼠的肺，測定轉(zhuǎn)移細胞數(shù)。
結(jié)果如圖6、7及8所示。一段時間后測定小鼠體重，相對于對照組的平均體重18.6g，本發(fā)明抗腫瘤試劑給藥組的平均體重為19.9g。本發(fā)明抗腫瘤試劑給藥組的平均體重為對照組體重的107％(圖6)。
接種19天及22天后，各組各摘除5只小鼠的肺，測定轉(zhuǎn)移細胞數(shù)。結(jié)果如圖7及8所示。接種19天后，對照組的平均轉(zhuǎn)移數(shù)為12，而本發(fā)明抗腫瘤試劑給藥組的平均轉(zhuǎn)移數(shù)為8，為對照組平均轉(zhuǎn)移數(shù)的66％，表明轉(zhuǎn)移數(shù)減少。接種22天后，對照組的平均轉(zhuǎn)移數(shù)39，而本發(fā)明抗腫瘤試劑給藥組的平均轉(zhuǎn)移數(shù)為17，為對照組平均轉(zhuǎn)移數(shù)的44％，表明轉(zhuǎn)移數(shù)明顯減少。
由上述可知，用所述抗腫瘤試劑接種小鼠可抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。
實施例3-根據(jù)活血細胞分析法進行顯微鏡觀察(1)采取患有膠原病的成人女子的血液，根據(jù)活血細胞分析法進行顯微鏡觀察。發(fā)現(xiàn)其中紅細胞以異常形狀產(chǎn)生聚集(圖9)。肝臟機能較差，并發(fā)現(xiàn)棘紅細胞(突起狀)。糖酵解能力變差，還發(fā)現(xiàn)許多霉菌形式。給藥1170mg所述抗腫瘤試劑30分鐘后，再次進行活血細胞分析，結(jié)果顯示各紅細胞分離成正圓形，未發(fā)現(xiàn)棘紅細胞(突起狀)(圖10)。
對所述患者，1日4次用上述劑量連續(xù)給藥90天，結(jié)果膠原病特有的關(guān)節(jié)疼痛消失了。
(2)采取患有肝臟機能障礙的成人女子的血液，根據(jù)活血細胞分析法進行顯微鏡觀察。發(fā)現(xiàn)許多棘紅細胞(突起狀)(圖11)。該患者的HCV抗體的數(shù)值為88.9S/CO(對照HCV抗體為1.0S/CO)。給藥1170mg所述抗腫瘤試劑30分鐘后，再次進行活血細胞分析。結(jié)果顯示各紅細胞分離成正圓形，且未發(fā)現(xiàn)棘紅細胞(突起狀)(圖12)。并且，如圖12所示，所有白細胞的直徑均為紅細胞直徑的至少2.7倍，從而增強了免疫力。對所述患者1日3次，用上述劑量連續(xù)給藥90天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCV抗體的數(shù)值為10.4S/CO，為給藥前的1/8以下，因而改善了肝臟機能障礙。
(3)采取患有子宮肌瘤的成人女子的血液，根據(jù)活血細胞分析法進行顯微鏡觀察。顯示紅細胞為卵形，且內(nèi)分泌失調(diào)(圖13)。觀察到環(huán)狀的靶形紅細胞，由此可知為缺鐵性貧血。該患者的血紅蛋白值為8.4g/dl(正常值為11.5至15.5g/dl)。給藥1170mg的抗腫瘤試劑30分鐘后，再次進行活血細胞分析法的顯微鏡觀察，結(jié)果顯示各紅細胞分離成正圓形并變?yōu)檎顟B(tài)(圖14)。對所述患者1日3次，用上述劑量連續(xù)給藥90天，結(jié)果顯示3cm的子宮瘤縮小至1cm。另外，貧血癥狀也得到改善，血紅蛋白恢復(fù)正常值。
(4)采取患有子宮癌的成人女子的血液，根據(jù)活血細胞分析法進行顯微鏡觀察。發(fā)現(xiàn)紅細胞產(chǎn)生聚集，并觀察到尿酸結(jié)晶及糖不能分解時出現(xiàn)的霉菌(圖15)。給藥1170mg所述抗腫瘤試劑30分鐘后，再次進行活血細胞分析法的顯微鏡觀察，結(jié)果顯示各紅細胞分離成正圓形，且尿酸結(jié)晶消失(圖16)。1日3次，對所述患者用上述劑量連續(xù)給藥90天。MRI(核磁共振成像)檢查和在體檢測(活組織檢查)的結(jié)果診斷癌癥已消除。
(5)采取患有高血脂、高膽固醇(261mg/dl)及高中性脂肪(1714mg/dl)的成人男子的血液，根據(jù)活血細胞分析法進行顯微鏡觀察。發(fā)現(xiàn)紅細胞呈鏈狀排列且聚集狀態(tài)很嚴重，而白細胞很小、被包圍在紅細胞中間而無法自行移動。并且，血液的流動非常差，在中醫(yī)學(xué)上稱為“瘀血”(圖17)。給藥1170mg所述抗腫瘤試劑30分鐘后，再次進行活血細胞分析法的顯微鏡觀察，結(jié)果顯示各紅細胞分離成正圓形，并認為是正常狀態(tài)(圖18)。1日3次，對所述患者用上述劑量連續(xù)給藥120天并進行血液檢查。結(jié)果顯示膽固醇值為227mg/dl，而中性脂肪值大幅降低至169mg/dl接近正常值。
(6)采取患有特應(yīng)性皮炎的成人女子的血液，根據(jù)活血細胞分析法進行顯微鏡觀察。發(fā)現(xiàn)紅細胞產(chǎn)生聚集，且一幅畫面中觀察到3個白細胞(粒細胞)(圖19)。當一幅畫面中存在2個以上的粒細胞時，即認為患有過敏性疾病(哮喘、鼻炎及花粉癥等)，且患處具有炎癥。給藥1170mg所述抗腫瘤試劑30分鐘后，再次進行活血細胞分析法的顯微鏡觀察。結(jié)果顯示各紅細胞分離成正圓形，且淋巴B細胞大小為紅細胞的2.3倍并活化(圖20)。由于淋巴細胞呈活化狀態(tài)，因此使免疫力增強。1日3次，對所述患者用上述劑量連續(xù)給藥90天，結(jié)果顯示特應(yīng)性皮炎完全治愈。
由以上描述可知，本發(fā)明的抗腫瘤試劑對于腫瘤具有免疫效果。
另外，將含有至少一種選自麥胚芽、大豆胚芽及米胚芽的物質(zhì)的原料，用至少一種選自曲類、酵母及乳桿菌的微生物進行發(fā)酵所得的發(fā)酵產(chǎn)物，也可用于治療一種或多種諸如痛風(fēng)、各種癌癥、腦梗塞、心肌梗塞、心絞痛、膠原病、貧血、內(nèi)分泌失調(diào)、高膽固醇、高中性脂肪及特應(yīng)性皮炎等的疾病。
本發(fā)明的抗腫瘤試劑除對腫瘤具有免疫效果外，對許多腫瘤以外的疾病也具有免疫效果。
本發(fā)明不局限于上述的具體實施例，根據(jù)目的及用途不同，可在本發(fā)明的范圍內(nèi)對其作出各種改變。例如，可用由含有至少一種選自麥胚芽、大豆胚芽及米胚芽的物質(zhì)的原料，用至少一種選自曲類、酵母及乳桿菌的微生物發(fā)酵所得的發(fā)酵產(chǎn)物來取代上述的抗腫瘤試劑，直接用于各實施例。因此，所述發(fā)酵產(chǎn)物也可用于改善一種或多種諸如痛風(fēng)、各種癌癥、腦梗塞、心肌梗塞、心絞痛、膠原病、貧血、內(nèi)分泌失調(diào)、高膽固醇、高中性脂肪及特應(yīng)性皮炎等的疾病。
本發(fā)明廣泛地用于保健飲料、保健食品、保健輔助食品、特定保健食品及醫(yī)藥品等等。例如，將本發(fā)明的抗腫瘤試劑直接制成或添加入飲料和食品。另外，可將所述抗腫瘤試劑制成膠囊、片劑、藥囊、糖漿劑、栓劑及注射劑等作為藥物。
本發(fā)明的抗腫瘤試劑具有優(yōu)異的抗腫瘤效果。并且，因為本發(fā)明的抗腫瘤試劑以天然物質(zhì)為原料，所以安全性高。
另外，本發(fā)明的抗腫瘤試劑使給藥前血液中已有的紅細胞聚集體、棘紅細胞、靶形紅細胞、紅細胞粘連、鈍鋸齒狀紅細胞、小紅細胞、大紅細胞、溶血紅細胞、鏈狀排列的紅細胞、卵形紅細胞及/或自由基損傷的紅細胞在給藥后變?yōu)檎龍A形，而且使各紅細胞呈分離狀態(tài)。其不僅具有優(yōu)良的抗腫瘤效果，而且對由上述異常形狀的紅細胞所引起的疾病也具有治療效果。
本發(fā)明的抗腫瘤試劑使給藥后血液中的白細胞直徑變?yōu)檎＜t細胞直徑的2.2倍或以上，并且粒細胞活動旺盛，抗腫瘤效果更強。
本發(fā)明的抗腫瘤試劑可消除血液中的尿酸結(jié)晶，進而消除因痛風(fēng)引起的疼痛。
另外，本發(fā)明的抗腫瘤試劑具有至少一種如下效果緩解關(guān)節(jié)痛、提高肝臟機能、縮小子宮肌瘤、減少癌細胞、降低膽固醇、降低中性脂肪及改善特應(yīng)性皮炎，可廣泛用于保健食品等等。
本發(fā)明的飲料和食品在預(yù)防腫瘤、增強免疫力、增進人體健康方面具有良好效果，并且其源自天然物質(zhì)，因此無副作用且安全性高。
根據(jù)本發(fā)明的制造方法可簡單且有效地制造所述抗腫瘤試劑。
另外，根據(jù)本發(fā)明方法制備的抗腫瘤試劑，再經(jīng)過60至100℃的熱水處理步驟，其抗腫瘤效果更佳。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤試劑，其特征在于，通過將含有麥胚芽、大豆胚芽及米胚芽中至少一種的原料用一種或多種選自曲類、酵母及乳桿菌的微生物進行發(fā)酵得到。
2.如權(quán)利要求1所述的抗腫瘤試劑，其中在用所述試劑給藥前已存在的至少一種類型的異常紅細胞在所述試劑給藥后變?yōu)檎龍A形，而且各紅細胞呈相互分離狀態(tài)，其中所述異常紅細胞選自紅細胞聚集體、棘紅細胞、靶形紅細胞、紅細胞粘連、鈍鋸齒狀紅細胞、小紅細胞、大紅細胞、溶血紅細胞、鏈狀排列的紅細胞、卵形紅細胞及被自由基損傷的紅細胞。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤試劑，其使給藥后血液中的白細胞直徑變?yōu)檎＜t細胞直徑的2.2倍或以上。
4.如權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤試劑，其能消除血液中的尿酸結(jié)晶。
5.如權(quán)利要求3所述的抗腫瘤試劑，其能消除血液中的尿酸結(jié)晶。
6.如權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤試劑，其還表現(xiàn)出一種或多種附加效果，所述效果選自緩解關(guān)節(jié)痛、增強肝臟機能、縮小子宮肌瘤、減少癌細胞、降低膽固醇、降低中性脂肪及治療特應(yīng)性皮炎。
7.如權(quán)利要求3所述的抗腫瘤試劑，其還表現(xiàn)出一種或多種附加效果，所述效果選自緩解關(guān)節(jié)痛、增強肝臟機能、縮小子宮肌瘤、減少癌細胞、降低膽固醇、降低中性脂肪及治療特應(yīng)性皮炎。
8.如權(quán)利要求4所述的抗腫瘤試劑，其還表現(xiàn)出一種或多種附加效果，所述效果選自緩解關(guān)節(jié)痛、增強肝臟機能、縮小子宮肌瘤、減少癌細胞、降低膽固醇、降低中性脂肪及治療特應(yīng)性皮炎。
9.如權(quán)利要求5所述的抗腫瘤試劑，其還表現(xiàn)出一種或多種附加效果，所述效果選自緩解關(guān)節(jié)痛、增強肝臟機能、縮小子宮肌瘤、減少癌細胞、降低膽固醇、降低中性脂肪及治療特應(yīng)性皮炎。
10.含有權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤試劑的飲料或食品。
11.含有權(quán)利要求3所述的抗腫瘤試劑的飲料或食品。
12.含有權(quán)利要求4所述的抗腫瘤試劑的飲料或食品。
13.含有權(quán)利要求5所述的抗腫瘤試劑的飲料或食品。
14.含有權(quán)利要求6所述的抗腫瘤試劑的飲料或食品。
15.含有權(quán)利要求7所述的抗腫瘤試劑的飲料或食品。
16.含有權(quán)利要求8所述的抗腫瘤試劑的飲料或食品。
17.含有權(quán)利要求9所述的抗腫瘤試劑的飲料或食品。
18.權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤試劑的制備方法，包括如下步驟(1)將含有麥胚芽、大豆胚芽及米胚芽中至少一種的原料在50°-150℃用蒸汽加熱，或者將所述原料在50°-150℃烘焙后用蒸汽加熱；及(2)將所得的蒸汽加熱產(chǎn)物用至少一種選自曲類、酵母及乳桿菌的微生物進行發(fā)酵。
19.如權(quán)利要求18所述的制備方法，還包括將所得的發(fā)酵產(chǎn)物用60°-100℃的熱水進行處理的步驟。
20.權(quán)利要求9所述的抗腫瘤試劑的制備方法，包括如下步驟(1)將含有麥胚芽、大豆胚芽及米胚芽中至少一種的原料在50°-150℃用蒸汽加熱，或者將所述原料在50°-150℃烘焙后用蒸汽加熱；及(2)將所得的蒸汽加熱產(chǎn)物用至少一種選自曲類、酵母及乳桿菌的微生物進行發(fā)酵。
21.如權(quán)利要求20所述的制備方法，還包括將所得的發(fā)酵產(chǎn)物用60°-100℃的熱水進行處理的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗腫瘤試劑、使用該試劑的飲料和食品及該抗腫瘤試劑的制造方法。本發(fā)明的抗腫瘤試劑對人腫瘤細胞A4573及小鼠黑瘤B16細胞表現(xiàn)出特異作用。另外，根據(jù)活血細胞分析法進行顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其使血液中各紅細胞分離且呈正圓形，并使棘紅細胞等異常形狀的紅細胞變?yōu)檎＃拱准毎闹睆阶優(yōu)榧t細胞的2.5倍以上。該抗腫瘤試劑除對腫瘤具有免疫活性外，還表現(xiàn)出多種免疫活性。含有所述抗腫瘤試劑的飲料和食品可作為保健食品等等。所述抗腫瘤試劑的制造方法包括將麥胚芽等在110℃用蒸汽加熱3小時后，在30℃下用曲類等微生物發(fā)酵48小時。
文檔編號A61K36/48GK1709409SQ20051006939
公開日2005年12月21日 申請日期2005年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月18日
發(fā)明者杉山剛, 松尾龍彥, 二口和之 申請人:歐德有限公司, 瓦利達克斯有限公司