專利名稱：人溶菌酶在制備治療瘙癢癥的藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及人溶菌酶的新用途，特別是人溶菌酶在醫(yī)藥領域的新用途。
背景技術(shù)：
瘙癢見于多種炎癥性或非炎癥性皮膚病，致病因素較為復雜，可分為內(nèi)因和外因引起的瘙癢癥(pruritus)。
1、內(nèi)因(1)老年性皮膚改變；皮膚隨著年齡增加而發(fā)生相應老化，汗腺和皮膚腺萎縮，分泌功能減退，角質(zhì)層水合能力降低，皮膚表面水脂乳化物減少，缺乏潤澤而變得干燥。
(2)肝臟疾病即膽汁淤積性瘙癢。
(3)腎臟疾病多數(shù)慢性腎功能衰竭患者伴有不同程度的全身性瘙癢。
(4)內(nèi)分泌和代謝性疾病甲狀腺功能亢進患者可伴發(fā)全身性瘙癢。
(5)惡性病變和血液病慢性白血病、肺癌、缺鐵性貧血、血色素沉著亦可發(fā)生不同程度的瘙癢。
(6)神經(jīng)精神疾?。簧贁?shù)多發(fā)硬化患者表現(xiàn)發(fā)作性瘙癢。
(7)其它類風濕性關(guān)節(jié)炎、免疫性疾病等可發(fā)生不同程度的瘙癢。
2、外因(1)藥物、食品及毒品引起瘙癢。
(2)感染旋毛蟲病、絲蟲病感染等引起瘙癢。
(3)生活環(huán)境因素及其它季節(jié)、溫度的變化，風吹、日曬、空氣干燥等引起瘙癢。
瘙癢癥根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為全身性瘙癢癥、局限性瘙癢癥；全身性瘙癢癥最初僅局限于身體某處，主要見于兩小腿身側(cè)，其次為兩大腿身側(cè)，再次為發(fā)展到兩上肢身側(cè)，嚴重者包括前胸、后背、頭面等處，繼而擴展至多個部位直至彌漫全身。局限性瘙癢癥肛門瘙癢、陰囊瘙癢、女陰瘙癢等。瘙癢根據(jù)季節(jié)又分為冬季瘙癢癥(winteritch)。冬季瘙癢癥又稱為皮脂缺乏性濕疹(asteatotic eczema)、裂隙性濕疹(eczema craquele)、冬令瘙癢癥(pruritus hiemalis)、干燥性濕疹(xerotic eczema)，是一種多見于老年人的與冬季氣候干燥有明顯關(guān)系的瘙癢性皮膚病。瘙癢根據(jù)年齡又分為老年瘙癢癥(senilepruritus)。老年瘙癢癥特指高齡老人無系統(tǒng)性疾病、皮膚干燥、萎縮所引起的皮膚瘙癢。瘙癢癥目前一般采用的治療用藥物，如天津天驕制藥有限公司生產(chǎn)的“樂膚液”等，副作用非常大，擦到皮膚上有燒灼、刺痛感，皮膚損傷者更為嚴重，如果大面積長期使用有激素效應，影響身體健康。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對瘙癢癥，提供一種人溶菌酶在制備治療瘙癢癥的藥物中的應用，藥物藥效快，藥效延續(xù)時間長，無刺激、無過敏反映，不產(chǎn)生耐藥性、不產(chǎn)生激素效應、安全無毒副作用。
實際上本發(fā)明是人溶菌酶在制備治療瘙癢癥的藥物中的應用。尤其是人溶菌酶在制備治療由各種炎癥性或非炎癥性引起的瘙癢癥的藥物中的應用。
所述人溶菌酶在制備治療冬季瘙癢癥或老年瘙癢癥的藥物中的應用。
所述人溶菌酶為基因工程表達的重組人溶菌酶或基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶或基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
所述藥物中含有人溶菌酶1500U～30萬U/mL/g。藥物可按常規(guī)制劑方法制成噴霧劑、滴劑或軟膏劑。具體制法為
1、噴霧劑或滴劑將純度95％的基因重組人溶菌酶制得1500U～30萬U/mL，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)75～85％、5～25％丙二醇、1～5％水溶性氮酮、萬分之五吐溫80，在常溫下混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)制成噴霧劑或滴劑。
2、軟膏劑將純度95％～99％的基因重組人溶菌酶制得1500U～30萬U/ml/g備用，分別稱取5～25％丙二醇(或丙三醇)、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、1～5％水溶性氮酮、羊毛脂1～5％、65～75％凡士林，并于120℃高壓滅菌30min，待溫度降至60～70度，分別過慮、除雜、除菌備用，待溫度降至50度時，稱取重組人溶菌酶混合均質(zhì)，最后倒入凡士林中其它原料攪拌、混合均質(zhì)，制成軟膏劑。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用基因重組人溶菌酶的藥效試驗及結(jié)果來說明其在制藥領域中的新用途。
基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為準，用磷酸4-8毫升、硫酸鎂1-5克，硫酸鉀2-6克，氫氧化鉀1-3克，硫酸鈣1-3.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時。進行種子罐培養(yǎng)，最后進行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達完成的培養(yǎng)液進行提取純化，對提取純化的基因重組人溶菌酶濃縮液進行測蛋白、測活性保存。將純度95％基因重組人溶菌酶濃縮液溶于水中制得30000U/mL。
一、人溶菌酶對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響(1)受試藥物人溶菌酶白色粉末，批號020110，3萬單位/毫克，由大連奇龍生物技術(shù)研究所提供。臨用時用無菌雙蒸水配成所需濃度。
(2)對照品雞溶菌酶白色粉末，2萬單位/毫克，Lysozyine Sigma L6878.臨用時用無菌雙蒸水配制。
(3)試劑角叉菜膠，淺黃白色粉末，批號21H0340，Sigam Chemical CO生產(chǎn)。臨用時用無菌生理鹽水配成1％的濃度。
實驗方法選用體重130-150克的健康雄性SD大鼠50只，由四川抗菌素工業(yè)研究所動物中心提供。合格證川實動管第99-32號。每籠5只。動物自由飲水，試驗室溫度控制在22~28℃左右，動物喂飼大鼠標準飼料。隨機分成5組，每組10只。測量各鼠正常左后足跖容積。第1組為空白對照組，外涂等容積無菌雙蒸水；第2、3、4組為人溶菌酶，劑量分別為120、60、30IU/只；第5組為雞溶菌酶，劑量為30IU/只。每鼠外涂各組藥物(20μl/只)一次后1小時，給大鼠左后足跖皮下注射1％的角叉菜膠0.1ml。致炎后半小時再涂一次藥。致炎前和致炎后1、2、4、6小時按微量吸管測量法測定致炎前后大鼠左后足容積。致炎前后足容積差為腫脹度。試驗重復一次。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析對計量資料，把原始數(shù)據(jù)按組分別輸入Microsoft Excel中，各組結(jié)果以算術(shù)平均數(shù)±標準差表示。根據(jù)《新藥西藥臨床前研究指導原則匯編》中的有關(guān)新藥藥效研究中統(tǒng)計處理的指導原則，選擇Student t檢驗進行各用藥組均數(shù)與模型對照組均數(shù)、相同劑量的受試藥組與對照品組的差異顯著性檢驗。
試驗結(jié)果見表1，大鼠外涂人溶菌酶30、60、120IU/只，在致炎后1-4小時內(nèi)，使由1％角叉菜膠誘發(fā)的左后足跖腫脹度明顯減輕。說明人溶菌酶具有抗炎作用，重組人溶菌酶不但有殺菌作用，而且有很好的抗炎作用。
表1(1)人溶菌酶對大鼠由角叉菜膠所致足跖腫脹的影響(第一次試驗結(jié)果)

注經(jīng)統(tǒng)計學處理，與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表1(2)人溶菌酶對大鼠由角叉菜膠所致足跖腫脹的影響(第二次試驗結(jié)果)

注經(jīng)統(tǒng)計學處理，與空白對照組比較，*P＜0.05。
二、人溶菌酶對巴豆油誘發(fā)小鼠耳廓腫脹的影響選用體重27-30克的健康雄性昆明小鼠50只，隨機分成5組，每組10只。動物自由飲水。試驗室溫度控制在22-28℃左右。動物喂飼大鼠標準飼料。第一組為空白對照組；第二、三、四組為人溶菌酶，劑量分別為120、60、30IU/只；第五組為雞溶菌酶(陽性對照)，30IU/只。首先，各組小鼠全部右耳內(nèi)側(cè)涂1％巴豆油30μL致炎，(巴豆油，淺棕色油狀液體，藥用級，批號000309，由江西吉水縣華寶天然藥用廠生產(chǎn)。臨用前用乙醇∶水∶乙醚25∶5∶70混合溶媒配制成1％濃度備用。)半小時后分別用雙蒸水20μl、人溶菌酶(6000IU/ML)20μl、人溶菌酶(3000IU/ML)20μl、人溶菌酶(1500IU/ML)20μl、雞溶菌酶(1500IU/ML)20μl涂抹各組小鼠右耳內(nèi)側(cè)。致炎后4小時將小鼠脫頸椎致死，沿耳廓基線剪下左右兩耳片，用8mm打孔器沖下兩耳片，精確稱重，左右耳片重量之差為腫脹度。經(jīng)T檢驗，比較藥物組與空白對照組的差異，并求出抑制率。試驗重復一次。
試驗結(jié)果見表17-22。小鼠經(jīng)外涂人溶菌酶120、60、30IU/只，使小鼠由巴豆油誘發(fā)耳廓腫脹度明顯減輕，經(jīng)T檢驗，藥物組與空白對照組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果表明人溶菌酶具有抗炎作用。
表17-22 人溶菌酶對巴豆油誘發(fā)小鼠耳廓腫脹的影響

注與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
三、外用基因重組人溶菌酶噴霧劑治療瘙癢癥的療效觀察1、病例選擇；全部病例40人均為門診長期治療不愈患者，年齡50～80歲，性別不限，男性29例，女性11例，平均年齡65歲，明確診斷為皮膚無原發(fā)損害而先有癢感，繼發(fā)抓痕、血痂、苔蘚樣變及色素沉著等(參照王光超主編皮膚病及性病學)，臨床癥狀及體證符合瘙癢癥的診斷。病程6年至13年，平均9年。瘙癢部位主要分布在全身性瘙癢癥；主要見于兩小腿伸側(cè)，其次為兩大腿身側(cè)，再次為發(fā)展到兩上肢身側(cè)，嚴重者可遍布全身，包括前胸、后背等。局部性瘙癢癥；主要見于肛門瘙癢，陰囊瘙癢，女陰瘙癢。排除標準；皮膚原發(fā)有損傷而有瘙癢癥的患者。
2、治療方法；將患者按皮損嚴重程度分輕、中、重度三組，輕度瘙癢癥皮膚無損傷而有瘙癢感為主，中度瘙癢癥皮膚有繼發(fā)抓痕、血痂為主，重度瘙癢癥皮膚有血痂、苔蘚樣變及色素沉著等為主。三組患者各收集10例，均外用大連奇龍生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的基因重組人溶菌酶噴霧劑，2次/天，療程為20天，三組患者均于每次用藥治療后觀察記錄瘙癢感部位止癢時間、止癢程度和皮膚變化情況。對照組選瘙癢癥輕、中、重度混雜的患者10例，用天津天驕制藥有限公司生產(chǎn)的“樂膚液”作對照治療，2次/天，療程為20天。
3、療效判定標準；痊愈為每次用藥后1～10分鐘止癢、療程結(jié)束后皮膚抓痕、血痂、苔蘚樣變及色素沉著等消失，皮膚恢復正常。療程結(jié)束后10天瘙癢部位不癢。有效為每次用藥后1～10分鐘止癢，療程結(jié)束后瘙癢部位還癢。無效為每次用藥后不止癢。
結(jié)果基因重組人溶菌酶噴霧劑治療瘙癢癥療效輕度組痊愈10例，痊愈率100％，總有效率100％。中度組痊愈8例，有效2例，痊愈<p>表2魚類

具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述實施例1基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為準，用磷酸6毫升、硫酸鎂3克，硫酸鉀4克，氫氧化鉀1克，硫酸鈣1.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20℃，在恒溫床上培養(yǎng)36小時。進行種子罐培養(yǎng)，最后進行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達完成的培養(yǎng)液進行提取純化，對提取純化的基因重組人溶菌酶濃縮液冰凍干燥，測定蛋白量、純度和溶菌酶活性保存。
將純度95％的基因重組人溶菌酶制得1500U/mL/g，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、15％丙二醇、1％水溶性氮酮、萬分之五吐溫80，在常溫下混合均質(zhì)，在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程制成噴霧劑。
實施例2按照實施例1所述方法制得基因重組人溶菌醇，將純度97％的基因重組人溶菌酶制得30000U/mL/g，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)84％、13％丙二醇、2％水溶性氮酮、萬分之五吐溫80，在常溫下混合均質(zhì)，在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程制成滴劑。
實施例3按照實施例1所述方法制得基因重組人溶菌酶，將純度98％的基因重組人溶菌酶制得100000U/mL/g，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)78％、21％丙二醇、1％水溶性氮酮、萬分之五吐溫80，在常溫下混合均質(zhì)，在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程制成滴劑。
實施例4按照實施例1所述方法制得基因重組人溶菌酶，將純度96％的基因重組人溶菌酶制得15萬ml/g備用，其他原料為16％(重量百分比)丙二醇、11％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、4％水溶性氮酮、羊毛脂3％、70％凡士林。具體制法為分別稱取羊毛脂、凡士林、水溶性氮酮、吡咯烷酮-5-羧酸鈉、丙二醇，并于120℃高壓滅菌30min，待溫度降至60～70度，分別過慮、除雜、除菌備用。待溫度降至50度時，稱取重組人溶菌酶混合均質(zhì)，最后到入凡士林中其它原料攪拌、混合均質(zhì)，在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程制成軟膏劑。
實施例5按照實施例1所述方法制得基因重組人溶菌酶，將純度96％的基因重組人溶菌酶制得22萬ml/g備用，分別稱取2％羊毛脂、65％凡士林、3％水溶性氮酮、8％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、22％丙三醇，并于120℃高壓滅菌30min，待溫度降至60～70度，分別過慮、除雜、除菌備用。待溫度降至50度時，稱取重組人溶菌酶混合均質(zhì)，最后到入凡士林中其它原料攪拌、混合均質(zhì)，在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程制成軟膏劑。
實施例6按照實施例1所述方法制得基因重組人溶菌酶，將純度96％的基因重組人溶菌酶制得30萬ml/g備用，分別稱取4％羊毛脂、70％凡士林、2％水溶性氮酮、14％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、10％丙二醇，并于120℃高壓滅菌30min，待溫度降至60～70度，分別過慮、除雜、除菌備用。待溫度降至50度時，稱取重組人溶菌酶混合均質(zhì)，最后到入凡士林中其它原料攪拌、混合均質(zhì)，在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程制成軟膏劑。
權(quán)利要求
1.人溶菌酶在制備治療瘙癢癥的藥物中的應用。
2.人溶菌酶在制備治療由各種炎癥性或非炎癥性引起的瘙癢癥的藥物中的應用。
3.人溶菌酶在制備治療冬季瘙癢癥或老年瘙癢癥的藥物中的應用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的人溶菌酶在制備治療瘙癢癥的藥物中的應用，其特征是人溶菌酶為基因工程表達的重組人溶菌酶或基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶或基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的人溶菌酶在制備治療瘙癢癥的藥物中的應用，其特征是藥物中含有人溶菌酶1500U～30萬U/mL/g。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的人溶菌酶在制備治療瘙癢癥的藥物中的應用，其特征是藥物可按常規(guī)制劑方法制成噴霧劑、滴劑或軟膏劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人溶菌酶在制備治療瘙癢癥的藥物中的應用，其特征是將純度95％的基因重組人溶菌酶制得1500U～30萬U/mL，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)75～85％、5～25％丙二醇、1～5％水溶性氮酮、萬分之五吐溫80，在常溫下混合均質(zhì)，在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程制成噴霧劑或滴劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人溶菌酶在制備治療瘙癢癥的藥物中的應用，其特征是將純度95％～99％的基因重組人溶菌酶制得1500U～30萬U/ml/g備用，分別稱取5～25％丙二醇或丙三醇、5～15％ 2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、1～5％水溶性氮酮、羊毛脂1～5％、65～75％凡士林，并于120℃高壓滅菌30min，待溫度降至60～70度，分別過慮、除雜、除菌備用，待溫度降至50度時，稱取重組人溶菌酶混合均質(zhì)，最后倒入凡士林中其它原料攪拌、混合均質(zhì)，制成軟膏劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及人溶菌酶的新用途，實際上是人溶菌酶在制備治療瘙癢癥的藥物中的應用。藥物可做成噴霧劑、滴劑、軟膏劑等。本發(fā)明基因重組人溶菌酶發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應用領域?；蛑亟M人溶菌酶它起效快，藥效延續(xù)時間長，無刺激、無過敏反映，不產(chǎn)生耐藥性、不產(chǎn)生激素效應、安全無毒副作用，使用方便，并且基因重組人溶菌酶來源豐富，制備工藝簡單，有很好的藥用前景，是今后治療皮膚瘙癢癥的新選擇。
文檔編號A61K9/06GK1679927SQ200510045709
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月17日
發(fā)明者張華 申請人:張華