專利名稱：人溶菌酶在制備治療痤瘡的藥物中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人溶菌酶的新用途，特別是人溶菌酶在治療痤瘡的藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
抗生素創(chuàng)造了許多醫(yī)學(xué)奇跡，使許多疾病消失無蹤，如肺炎、腦膜炎、產(chǎn)褥熱、敗血癥、結(jié)核等。21世紀(jì)的今天，耐藥菌的發(fā)展令人觸目驚心。如耐青霉素的肺炎鏈球菌，過去對青霉素、紅霉素、磺胺等藥品都很敏感，現(xiàn)在幾乎“刀槍不入”。肺炎克雷伯氏菌對西力欣、復(fù)達(dá)欣等16種高檔抗生素的耐藥性高達(dá)51.85％-100％。而耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)除萬古霉素外已經(jīng)無藥可治。從細(xì)菌的耐藥發(fā)展史可以看出，在某種新的抗生素出現(xiàn)以后，就有一批耐藥菌株出現(xiàn)。開發(fā)一種新的抗生素一般需要10年左右的時間，而一代耐藥菌的產(chǎn)生只要2年的時間，抗生素的研制速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上耐藥菌的發(fā)展速度。目前急需開發(fā)一種針對不同耐藥菌株均有效的“超級抗生素”用于臨床治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人溶菌酶在制備治療由金黃色葡萄球菌、表葡菌、丙酸桿菌、螨蟲和耐藥菌引起的痤瘡疾病的新用途。
實際上，本發(fā)明涉及人溶菌酶在制備治療由金黃色葡萄球菌、表葡菌、丙酸桿菌、螨蟲和耐藥菌引起的痤瘡的藥物中的應(yīng)用。
所述人溶菌酶為基因工程表達(dá)的重組人溶菌酶、基因工程表達(dá)人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶或基因工程表達(dá)或化學(xué)合成突變體重組人溶菌酶。
所述藥物中含有人溶菌酶300U～300萬U/mL。藥物為噴霧劑、滴劑、乳膏劑或乳劑。藥物中還可以加入殺螨止癢劑SM-650。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用基因重組人溶菌酶的藥理試驗及結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為準(zhǔn)，用磷酸6毫升、硫酸鎂3克，硫酸鉀4克，氫氧化鉀1克，硫酸鈣1.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時。進行種子罐培養(yǎng)，最后進行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達(dá)完成的培養(yǎng)液進行提取純化，對提取純化的基因重組人溶菌酶濃縮液進行測蛋白、測活性保存。將純度95％基因重組人溶菌酶濃縮液溶于水中制得30000U/mL，磷酸鹽緩沖液20mM(pH7.0)、25％丙三醇、吐溫80，殺螨止癢劑SM-650純度為≥99％，ph6～8(商品)干粉溶于水中制得1％備用。
一、基因重組人溶菌酶(HLZ)體外抗菌作用評價藥品及試劑1、基因重組人溶菌酶濃縮液(Human Lysozyme HLZ)活性單位30000單位/mL，由大連奇龍生物技術(shù)研究所提供，2、對照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)白色粉未，活性單位50000單位/mg，美國SIGMA公司產(chǎn)品，批號L6876。
3、克拉霉素效價948μ/mg，中國藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品，批號4、羅紅霉素效價878μ/mg，中國藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品，批號5、注射用阿莫西林哈爾濱制藥廠產(chǎn)品，批號010504。
6、瓊脂糖(B10WEST AGAROSE)7、三羥甲基氨基甲烷(Tris)成都化學(xué)試驗廠，批號010211試驗菌株所用菌株均為2002.4～2003.9月于四川、北京地區(qū)收集的臨床分離致病菌。經(jīng)本室用API方法重新鑒定后用于試驗。
質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923大腸埃希菌ATCC25922銅綠假單孢菌ATCC27853培養(yǎng)基1、Tris-HCl緩沖液0.1MTris 100ml，0.1MHCl 70ml，HighWater 800ml，測PH值，用HCl溶液調(diào)至PH7.2，加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl脂瓊養(yǎng)基在Tris-Cl緩沖液中加入脂瓊糖116℃無菌后使用。
3、M-H培養(yǎng)基中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品，M-H肉湯培養(yǎng)基稱取25g加1000ml蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌，116℃20分鐘。M-H固體培養(yǎng)基稱取36g，加1000ml蒸餾水，高壓滅菌，116℃20分鐘，用于革蘭陽性、陰性需氧菌的藥敏試驗。
4、血培養(yǎng)基，即在M-H培養(yǎng)基中加5-10％脫纖維兔血配制而成，用于腸球菌、鏈球菌的藥敏試驗。
試驗方法采用瓊脂二倍稀釋法測定受試藥物對試驗菌株的最低抑菌濃度(MIC)。將受試藥物用滅菌蒸餾水溶解，適當(dāng)稀釋。分別取1ml藥液加9ml融化的Tris-HCl瓊脂糖固體培養(yǎng)基混勻，以二倍稀釋，制備系列含藥平皿。每皿所含藥物終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；用多點接種儀(DenleyA400，England)將稀釋至105CFU/ml的試驗菌液接種于各含藥平皿表面，置于37℃培養(yǎng)8-10小時，取出分別吸取6ml融化的M-H培養(yǎng)基(50℃)覆蓋上述系列平皿表面，再置于37℃培養(yǎng)10小時取出，觀察結(jié)果，以無細(xì)菌生長平皿內(nèi)所含最低藥物濃度為該菌的最低抑菌濃度(MIC)。
試驗結(jié)果(1)人溶菌酶對臨床分離菌株的體外抗菌活性見表1。
(2)人溶菌酶對379株臨床分離致病菌的MIC50、MIC90見表2。
根據(jù)以上試驗結(jié)果表明人溶菌酶體外具有一定抗菌作用，對耐藥菌株的抗菌活性也有很好的作用。人溶菌酶是一種小分子蛋白質(zhì)，存在于機體的淚液、痰、鼻涕、白細(xì)胞和血清中，對多種革蘭氏陽性菌和少數(shù)革蘭氏陰性菌有殺菌作用，基因重組人溶菌酶(HumanLysozyme)主要切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1、4糖苷鍵之間的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，引起細(xì)菌裂解。
表1人溶菌酶、雞溶菌酶、克拉霉素和羅紅霉素體外抗菌活性MIC細(xì)菌 HLZ CLZ CLAROXmg/ml(萬μ/ml)mg/ml(萬μ/ml) mg/ml mg/ml金葡MRSA02-22 0.025(0.03) 0.008(0.04) ＞1＞1金葡MRSA02-23 0.025(0.03) 0.008(0.04) ＞1＞1金葡MRSA02-26 0.025(0.03) 0.004(0.02) ＞1＞1金葡MRSA02-28 0.5(1.5) 0.016(0.08) ＞1＞1金葡02-19-50.03(0.1) ＜0.002(0.001) ＞1＞1表葡MssE25 0.016(0.05) 0.004(0.02) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-29 0.063(0.2)0.5(2.5) 0.03 0.5表葡MRSE 02-5 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.003) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-6 ＜0.001(0.005)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20-2 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＞11表葡MRSE 02-20-3 ＜0.001(0.003)0.004(0.02) ＞11表葡MRSE 02-20-4 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡MRSE 02-20-5 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡MRSE 02-20-6 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡MRSE 02-20-7 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) 1 1表葡MRSE 02-20-8 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20-9 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20-1 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-3 1(3) 0.015(0.08) ＞1＞1表葡MRSE 02-4 0.004(0.012) 0.008(0.04) 0.5＞1
續(xù)表1MIC細(xì)菌HLZ CLZ CLA ROXmg/ml(萬μ·/ml) mg/ml(萬μ/ml) mg/ml mg/ml表葡MRSE 02-100.004(0.012) 0.25(1.25) 1 1表葡MRSE 02-12＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) 0.008 0.125表葡MRSE 02-11＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-150.008(0.024) 0.002(0.01) 1 ＞1表葡MRSE 02-170.004(0.012) ＜0.001(0.005) 0.25 ＞1表葡MRSE 02-18＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-200.008(0.024) ＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡MRSE 02-210.016(0.05)0.25(125) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-220.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001丙酸桿菌02-7-40.008(0.02)4(20) 0.002 0.002丙酸桿菌02-7-50.008(0.02)0.25(0.63) ＜0.001＜0.001丙酸桿菌02-7-60.008(0.02)0.063(0.31) 0.008 0.25丙酸桿菌02-7-90.063(0.2) 0.125(0.63) 0.008 0.016丙酸桿菌02-7-70.125(0.4) 0.016(0.08) 0.032 0.25丙酸桿菌03-2-22 0.032(0.1) 0.5(2.5)1 1丙酸桿菌03-2-30 0.063(0.2) 4(10) ＞1＞1丙酸桿菌03-2-32 0.016(0.05)0.25(1.25) 0.008 0.5丙酸桿菌03-2-33 0.032(0.1) 2(10) ＞1＞1丙酸桿菌03-2-36 0.063(0.2) 4(20) 0.25 0.5丙酸桿菌03-2-37 0.032(0.1) ＞4(20) ＞11丙酸桿菌03-2-39 0.032(0.1) 0.5(2.5)0.51
續(xù)表1MIC細(xì)菌 HLZ CLZCLAROXmg/ml(萬μ/ml) mg/ml(萬μ/ml) mg/mlmg/ml大腸埃希菌03-2-41 0.032(0.1)0.5(2.5) ＞1 ＞1大腸埃希菌03-2-42 0.016(0.05) 0.5(2.5) 0.063 ＞1大腸埃希菌03-2-43 ＜0.001(0.003)＞4(20) 0.016 0.25大腸埃希菌03-2-45 0.032(0.1)2(10)0.250.5大腸埃希菌03-2-51 0.032(0.1)＞4(20) ＞1 ＞1大腸埃希菌03-2-52 0.032(0.1)＞4(20) ＞1 0.25大腸埃希菌03-2-53 0.008(0.024) 4(20)0.030.25大腸埃希菌032-54 0.032(0.1)1(5) ＞1 1大腸埃希菌03-2-56 0.032(0.1)＞4(20) 0.016 0.25大腸埃希菌03-2-57 ＜0.001(0.003)2(10)0.032 0.25大腸埃希菌03-2-58 ＜0.001(0.003)4(20)＞1 0.5大腸埃希菌03-2-59 0.032(0.1)4(20)0.125 0.25沙雷氏菌2-31-8 0.008(0.02) 0.5(0.25)0.008 0.016沙雷氏菌2-31-8 0.008(0.02) 1(5) 0.008 0.016沙雷氏菌2-31-8 0.008(0.02) 0.125(0.63) 0.016 0.016肺炎克雷伯菌02-6-140.25(0.8) 1(5) 0.063 ＞1肺炎克雷伯菌02-6-180.5(1.5) ＞4(20) 0.5 1注HLZ指人溶菌酶，CLZ指對照溶菌酶(雞溶菌酶)，CLA指克拉霉素，ROX指羅紅霉索二、重組人溶菌酶(HLZ)加殺螨止癢劑SM-650體外殺螨作用評價1、基因重組人溶菌酶濃縮液活性單位300單位/mL試驗藥品及試劑
1、基因重組人溶菌酶濃縮液(Human Lysozyme HLZ)活性單位300單位/mL，由大連奇龍生物技術(shù)研究所提供，2、殺螨止癢劑SM-650白色粉未，純度為≥99％，ph6～8，生產(chǎn)單位北京耐特生化技術(shù)研究所試驗螨蟲所用螨蟲標(biāo)本為第四軍醫(yī)大學(xué)臨床門診痤瘡病人。
試驗方法體外殺螨蟲活性測定采用圖片法測定了人溶菌酶(HLZ)加殺螨止癢劑SM-650最低殺螨濃度(MIC)。將螨蟲標(biāo)本分離到玻片上，用人溶菌酶(HLZ)300單位/mL，殺螨止癢劑SM-650 1％/Ml。滴到玻片螨蟲標(biāo)本上，觀察結(jié)果，以最低殺螨濃度(MIC)。
試驗結(jié)果見表3，結(jié)果表明人溶菌酶加殺螨止癢劑SM-650體外殺螨有殺滅作用。
表3

2、基因重組人溶菌酶濃縮液活性單位3000單位/mL試驗藥品及試劑1、基因重組人溶菌酶濃縮液(Human Lysozyme HLZ)活性單位3000單位/mL，由大連奇龍生物技術(shù)研究所提供，2、殺螨止癢劑SM-650白色粉未，純度為≥99％，ph6～8，
生產(chǎn)單位北京耐特生化技術(shù)研究所試驗螨蟲所用螨蟲標(biāo)本為第四軍醫(yī)大學(xué)臨床門診痤瘡病人。
試驗方法體外殺螨蟲活性測定采用圖片法測定了人溶菌酶(HLZ)加殺螨止癢劑SM-650最低殺螨濃度(MIC)。將螨蟲標(biāo)本分離到玻片上，用人溶菌酶(HLZ)3000單位/mL，殺螨止癢劑SM-650 1％/Ml。滴到玻片螨蟲標(biāo)本上，觀察結(jié)果，以半數(shù)殺螨濃度(MBC)。
試驗結(jié)果見表4，結(jié)果表明人溶菌酶加殺螨止癢劑SM-650體外殺螨有殺滅作用。
表4

3、基因重組人溶菌酶濃縮液活性單位30000單位/mL試驗藥品及試劑1、基因重組人溶菌酶濃縮液(Human Lysozyme HLZ)活性單位30000單位/mL，由大連奇龍生物技術(shù)研究所提供，2、殺螨止癢劑SM-650白色粉未，純度為≥99％，ph6～8，生產(chǎn)單位北京耐特生化技術(shù)研究所試驗螨蟲所用螨蟲標(biāo)本為第四軍醫(yī)大學(xué)臨床門診痤瘡病人。
試驗方法體外殺螨蟲活性測定采用圖片法測定了人溶菌酶(HLZ)加殺螨止癢劑SM-650最低殺螨濃度(MIC)。將螨蟲標(biāo)本分離到玻片上，用人溶菌酶(HLZ)30000單位/mL，殺螨止癢劑SM-650 1％/Ml。滴到玻片螨蟲標(biāo)本上，觀察結(jié)果，以無活螨蟲為殺螨濃度。
試驗結(jié)果見表5，結(jié)果表明人溶菌酶加殺螨止癢劑SM-650體外殺螨有殺滅作用。
表5

采用圖片法測定了人溶菌酶(HLZ)加殺螨止癢劑SM-650對臨床分離五人份的螨蟲標(biāo)本體外殺螨作用，結(jié)果表明人溶菌酶加殺螨止癢劑SM-650對螨蟲有殺滅作用。殺螨止癢劑SM-650最低殺螨濃度MICRange為0.2％～2％。人溶菌酶(HLZ)活性單位300單位/ml～30000萬單位/ml。由大連奇龍生物技術(shù)研究所研制的基因重組人溶菌酶(Human Lysozyme)具有其它溶菌酶相同作用機制，主要切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1、4糖苷鍵之間的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，引起細(xì)菌裂解。殺螨止癢劑SM-650產(chǎn)品有很強的殺螨作用。
以上結(jié)果，可以得出本發(fā)明的優(yōu)點在于
(1)本發(fā)明對基因重組人溶菌酶發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。
(2)本發(fā)明基因重組人溶菌酶安全無毒副作用，有很好的藥用前景。
(3)本發(fā)明的基因重組人溶菌酶來源豐富，制備工藝簡單，并可做成噴霧劑、滴劑、奶液、乳劑、乳膏劑等，使用方便，
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述實施例1基因重組人溶菌酶經(jīng)高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20℃，在恒溫床上培養(yǎng)36小時。進行種子罐培養(yǎng)后進行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達(dá)完成的培養(yǎng)液進行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液冰凍干燥，測定蛋白量、純度和溶菌酶活性保存。將純度95％的基因重組人溶菌酶制得300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、萬分之五吐溫80，在常溫下混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)制成噴霧劑、滴劑。
實施例2將純度95％的基因重組人溶菌酶制得300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩沖液10(pH6.0)80％、20％丙二醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮、萬分之三吐溫80，殺螨止癢劑SM-650純度為≥99％，ph6～8(商品)1％，在常溫下混合均質(zhì)，制成噴霧劑、滴劑。
實施例3將純度95％的基因重組人溶菌酶制得300U～300萬U/ml/g，磷酸鹽緩沖液20mM(pH7.0)85％、20％丙二醇、卡波樹脂1％、香精0.3％殺螨止癢劑SM-650純度為≥99％，ph6～8(商品)1％，在70℃下混合均質(zhì)，重組人溶菌酶在常溫下與其它原料混合均質(zhì)，制成乳膏劑、乳劑。
權(quán)利要求
1.人溶菌酶在制備治療由金黃色葡萄球菌、表葡菌、丙酸桿菌、螨蟲和耐藥菌引起的痤瘡的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人溶菌酶在制備治療痤瘡的藥物中的應(yīng)用，其特征是人溶菌酶為基因工程表達(dá)的重組人溶菌酶、基因工程表達(dá)人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶或基因工程表達(dá)或化學(xué)合成突變體重組人溶菌酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人溶菌酶在制備治療痤瘡的藥物中的應(yīng)用，其特征是藥物中含有活性300U～300萬U/mL人溶菌酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人溶菌酶在制備治療痤瘡的藥物中的應(yīng)用，其特征是藥物為噴霧劑、滴劑、乳膏劑或乳劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的人溶菌酶在制備治療痤瘡和螨蟲的藥物中的應(yīng)用，其特征是藥物中還含有殺螨止癢劑SM-650。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的人溶菌酶在制備治療痤瘡的藥物中的應(yīng)用，其特征是藥物為噴霧劑、滴劑，由基因重組人溶菌酶300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、萬分之五吐溫80制成。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人溶菌酶在制備治療痤瘡和螨蟲的藥物中的應(yīng)用，其特征是藥物為噴霧劑、滴劑，由基因重組人溶菌酶300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩沖液10(pH6.0)80％、20％丙二醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮、萬分之三吐溫80，殺螨止癢劑SM-650純度為≥99％，ph6～8(商品)1％制成。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人溶菌酶在制備治療痤瘡和螨蟲的藥物中的應(yīng)用，其特征是藥物為乳膏劑、乳劑，由基因重組人溶菌酶300U～300萬U/ml/g，磷酸鹽緩沖液20mM(pH7.0)85％、20％丙二醇、卡波樹脂1％、香精0.3％殺螨止癢劑SM-650純度為≥99％，ph6～8(商品)1％制成。
全文摘要
本發(fā)明涉及人溶菌酶的新用途，特別是人溶菌酶在治療痤瘡的藥物中的新用途。本發(fā)明是人溶菌酶在制備治療由金黃色葡萄球菌、表葡菌、丙酸桿菌、螨蟲和耐藥菌引起的痤瘡的藥物中的應(yīng)用。藥物可做成噴霧劑、滴劑、膏劑等。本發(fā)明基因重組人溶菌酶發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。安全無毒副作用，有很好的藥用前景。并且基因重組人溶菌酶來源豐富，制備工藝簡單，使用方便。
文檔編號A61K38/47GK1583169SQ20041002073
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月10日
發(fā)明者安米 申請人:安米