專利名稱：一種修復(fù)治療臟器損傷的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物藥劑領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種用于修復(fù)人體臟器損傷的蛋白質(zhì)藥劑，涉及蛋白質(zhì)的修飾技術(shù)。
背景技術(shù)：
心臟、肝臟、腎臟、肺及神經(jīng)等人體臟器的病理?yè)p傷，是一類對(duì)生命危害極大而又無(wú)法治愈的疾病，通常的藥物治療主要是緩解病狀，不能修復(fù)損傷組織，功能恢復(fù)的機(jī)率更低。
心臟損傷中又以心肌梗死致命性最高。心肌梗死是指在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上，冠狀動(dòng)脈的血流中斷，使相應(yīng)的心肌出現(xiàn)嚴(yán)重而持久地急性缺血，最終導(dǎo)致心肌的缺血性壞死，發(fā)生急性心肌梗死的病人，在臨床上常有持久的胸骨后劇烈疼痛、發(fā)熱、白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高、血清心肌酶升高以及心電圖反映心肌急性損傷、缺血和壞死的一系列性演變，并可出現(xiàn)心律失常，休克或心力衰竭，屬冠心病的嚴(yán)重類型。心肌梗死的原因，多數(shù)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊或在此基礎(chǔ)上血栓形成，造成血管管腔堵塞所致。按照病因、病理、心電圖和臨床癥狀等不同，心肌梗死可分為各種不同的類型，除上述共有的表現(xiàn)外，各有其特殊性。
臨床研究表明，幾乎所有心肌梗死發(fā)病機(jī)理特別是老年患者，主要是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化所致，偶爾為冠狀動(dòng)脈栓塞、炎癥、先天性畸型引起。約85％～95％急性心肌梗死尸檢病例，在冠狀動(dòng)脈內(nèi)均能發(fā)現(xiàn)閉塞性血栓。在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上，一旦粥樣斑塊內(nèi)或其下發(fā)生出血或血管持續(xù)痙攣、發(fā)生血栓形成，使冠狀動(dòng)脈完全閉塞，導(dǎo)致心肌梗死。梗死的程度取決于病變動(dòng)脈的大小與閉塞的部位和速度，以及側(cè)支循環(huán)及其他冠狀動(dòng)脈暢通的情況。
此外，少數(shù)心肌梗死并無(wú)冠狀動(dòng)脈管腔閉塞，其發(fā)病原因是在原有冠狀動(dòng)脈粥樣硬化致管腔狹窄的基礎(chǔ)上，由于休克、脫水、出血、外科手術(shù)或嚴(yán)重的心律失常，致心排出量驟降，冠狀動(dòng)脈灌流量銳減，或因?yàn)橹伢w力活動(dòng)、情緒過(guò)分激動(dòng)或血壓劇升，致左心室負(fù)荷明顯加重，兒茶酚胺分泌增多，心肌需氧需血量猛增，冠狀動(dòng)脈供血明顯不足，導(dǎo)致心肌缺血而壞死。
心肌梗死往往在飽餐特別是進(jìn)食多量脂肪后，安靜或睡眠時(shí)，用力大便后發(fā)生。這與餐后血脂增高、血液粘稠度增高，血小板粘附性增強(qiáng)，局部血流緩慢，血小板易于集聚而致血栓形成；睡眠時(shí)，迷走神經(jīng)活力增高，易使冠狀動(dòng)脈痙攣；用力大便時(shí)心臟負(fù)荷增加等有關(guān)。另外，心肌梗死后發(fā)生的嚴(yán)重心律失常、休克或心力衰竭，均可使冠狀動(dòng)脈灌流量進(jìn)一步降低，心肌壞死范圍擴(kuò)大。
目前心肌梗死的治療措施大體包括以下幾方面預(yù)防治療長(zhǎng)期小劑量服用阿司匹林或雙嘧達(dá)莫對(duì)抗血小板的凝集和黏附。
再灌注心肌溶栓藥物如尿激酶、鏈激酶、重組組織纖溶原激活劑、單鏈尿激酶型纖溶原激活劑等。傳統(tǒng)的治療方法是采用靜脈溶栓藥物，把血栓溶解，使閉塞的血管再通，減少心肌壞死面積。由于靜脈溶栓方法簡(jiǎn)單，操作方便，不需要大型設(shè)備，在基層醫(yī)院容易開(kāi)展，因此得到廣泛普及。但由于其血管開(kāi)通率較低(為30％～79％)，并發(fā)癥多，甚至出現(xiàn)顱內(nèi)出血而危及患者生命；更為重要的是溶栓藥物僅僅能夠溶解掉新鮮血栓，而對(duì)于陳舊血栓所造成的嚴(yán)重狹窄卻無(wú)能為力，容易再次發(fā)生心絞痛、心肌梗死、心力衰竭甚至猝死。
介入療法是采用球囊擴(kuò)張和支架植入的方法，消除血管的嚴(yán)重狹窄，使梗死的血管血流恢復(fù)正常，減少心肌嚴(yán)重缺血和心肌梗死面積，迅速緩解病人的癥狀，降低患者的死亡率。其方法是先在病人股動(dòng)脈進(jìn)行穿刺，然后置入動(dòng)脈外鞘管，通過(guò)外鞘管插入導(dǎo)引導(dǎo)管，到達(dá)冠狀動(dòng)脈開(kāi)口處，再根據(jù)血管狹窄的嚴(yán)重程度選擇進(jìn)行球囊擴(kuò)張和支架冠狀動(dòng)脈內(nèi)植入。
溶栓和支架植入術(shù)雖能使梗死血管的再通，挽救缺血的心肌，卻無(wú)法促使已梗死的心肌細(xì)胞的再生。心肌梗死區(qū)的纖維化和瘢痕形成，梗死區(qū)室壁變薄等因素，已成為部分心?；颊吆笃诔霈F(xiàn)心功能不全和死亡的主要原因。
心肌梗死的治療最新研究進(jìn)展——干細(xì)胞移植干細(xì)胞是一類未分化的細(xì)胞或尚未發(fā)育成熟的原始細(xì)胞，廣泛存在于紅骨髓中。干細(xì)胞具有兩大特點(diǎn)較強(qiáng)的可塑性和自我復(fù)制能力。利用它的第一個(gè)特點(diǎn)，根據(jù)需要，人們像捏面人一樣，可將它定向分化成不同功能的組織和器官細(xì)胞，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、角膜細(xì)胞等。
這些分化后的細(xì)胞移植到人體需要的組織器官處后，就開(kāi)始像種子一樣，生根發(fā)芽，展示它的第二大特點(diǎn)——自我復(fù)制增殖能力。借助這一技術(shù)，國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)界用造血干細(xì)胞治療醫(yī)學(xué)頑癥白血病，用自體骨髓干細(xì)胞治療心肌梗死和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、紅斑狼瘡、天皰瘡等，均取得良好成效。在國(guó)外，科學(xué)家們還成功地讓老鼠體內(nèi)長(zhǎng)出了微型人類腎臟。并有望在不久的將來(lái)造出人類心臟、肺臟、肝臟等，從而解決器官移植中供源不足和術(shù)后排異問(wèn)題，故干細(xì)胞被醫(yī)學(xué)界稱為“百變金剛”。臨床研究發(fā)現(xiàn)，自體骨髓干細(xì)胞移植于心臟后可橫向分化為心肌細(xì)胞及心肌血小管，補(bǔ)充心肌細(xì)胞數(shù)量，改善心肌微循環(huán)及終末供血，為冠心病和其他臟器損傷的治療開(kāi)拓了一個(gè)新領(lǐng)域。
在對(duì)急性心肌梗死死亡患者尸檢中，國(guó)外有人發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死發(fā)生以后，有骨髓干細(xì)胞主動(dòng)遷移到受損心肌內(nèi)，生成心肌細(xì)胞和新生血管的現(xiàn)象，這是人體的一種自我修復(fù)功能。但是由于遷移的數(shù)量非常少，不能有效修復(fù)梗死的心肌。
骨髓中的造血干細(xì)胞主要功能是產(chǎn)生血液細(xì)胞，而間質(zhì)干細(xì)胞可以根據(jù)需要轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N類型的細(xì)胞如肝臟細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。骨髓是成體干細(xì)胞的倉(cāng)庫(kù)，用適當(dāng)?shù)姆椒▌?dòng)員其向損傷組織和器官遷移，可以補(bǔ)充損失的細(xì)胞，修復(fù)損傷器官。在需要細(xì)胞移植時(shí)，只需給予適當(dāng)動(dòng)員劑和信號(hào)啟動(dòng)劑、骨髓干細(xì)胞就會(huì)自動(dòng)靶向聚集到操作器官，完成修復(fù)工作，從而免除所有繁瑣的操作及外科手術(shù)。
Orlic等曾使用人粒細(xì)胞刺激因子(G-CSF)和干細(xì)胞因子(SCF)動(dòng)員2月齡小鼠骨髓干細(xì)胞，5天后結(jié)扎小鼠冠狀動(dòng)脈制作小鼠心肌梗死模型，術(shù)后繼續(xù)使用3天，治療組壞死區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)新生的心肌細(xì)胞帶，膠原纖維含量很少，而對(duì)照組壞死區(qū)域內(nèi)未見(jiàn)新生心肌細(xì)胞，可見(jiàn)大量的膠原纖維形成。
Kollet等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肝臟遇到損害時(shí)，它會(huì)向骨髓干細(xì)胞發(fā)出求救信號(hào)。這些干細(xì)胞會(huì)及時(shí)“趕來(lái)”，幫助修復(fù)受到損害的肝臟細(xì)胞，這些信號(hào)包括肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)。骨髓干細(xì)胞一旦感知SDF-1從肝臟發(fā)出的信號(hào)后，會(huì)不斷產(chǎn)生并釋放出來(lái)，然后再移向肝臟，修復(fù)受損肝臟細(xì)胞。肝臟不同于其他器官移植，肝細(xì)胞移植部位較難選擇，肝組織大部分由血竇組成，直接穿刺移植容易泄漏，經(jīng)門(mén)靜脈移植，可引起門(mén)脈高壓，經(jīng)血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到肺臟、腸系膜、腹腔等部位，而且一次移植數(shù)量不宜過(guò)大，采用動(dòng)員骨髓細(xì)胞向操作肝臟遷移的，修復(fù)受損肝臟細(xì)胞，或許可繞開(kāi)這空虛棘手的問(wèn)題。
以上國(guó)外研究報(bào)道中，提出了將G-CSF應(yīng)用于治療臟器損傷的可行性，而且公開(kāi)了G-CSF應(yīng)用于治療小鼠心肌梗死的動(dòng)物試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
重組人粒細(xì)胞刺激因子(rhG-CSF)是利用基因重組技術(shù)由大腸桿菌高密度表達(dá)的蛋白質(zhì)藥物制劑，生產(chǎn)技術(shù)成熟，可批量生產(chǎn)。
重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)在人體內(nèi)、外的生物活性與天然人粒細(xì)胞刺激因子(G-CSF)基本一致，將其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中制備治療臟器損傷藥物是可行的但是由于rhG-CSF分子量較低，約為19kDa，在代謝過(guò)程中易由腎小球?yàn)V過(guò)，在通過(guò)腎小管時(shí)多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并從尿中排出，因而半衰期過(guò)短。靜脈注射rhG-CSF的清除半衰期為1～2小時(shí)，皮下注射則為2～3小時(shí)，為維持一定的療效需要多次應(yīng)用，不僅增加了病人的痛苦，而且易引發(fā)一系列副反應(yīng)。
因而用rhG-CSF制備治療臟器損傷的藥物雖在理論上可行，并有一定療效，但在臨床應(yīng)用上其半衰期過(guò)短，為了維持體內(nèi)藥物的有效濃度，需要加大注射次數(shù)及劑量，這勢(shì)必增加患者的痛苦及醫(yī)療費(fèi)用，作為治療藥物的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大。
采用聚乙二醇(PEG)對(duì)rhG-CSF進(jìn)行修飾改性，制成聚乙二醇修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)，可以增加其在人體內(nèi)代謝的半衰期，獲得較理想的藥效，但目前在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于將PEG-rhG-CSF應(yīng)用于治療臟器損傷的藥物報(bào)道，也沒(méi)有采用PEG-rhG-CSF制備用于治療臟器損傷的藥物問(wèn)世。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于修復(fù)人體臟器損傷的藥物，它作為一種骨髓干細(xì)胞動(dòng)員劑，可促使骨髓干細(xì)胞自動(dòng)靶向聚集到損傷器官，修復(fù)損傷的臟器，并具有較高的藥效和較長(zhǎng)的穩(wěn)定的持效期，而且能夠方便的實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明所述的治療臟器損傷的藥物的主要有效成分為聚乙二醇修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)。
聚乙二醇修飾后的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)①半衰期延長(zhǎng)。PEG化后制成的PEG-rhG-CSF分子量增大，腎小球?yàn)V過(guò)減少，PEG分子的空間位阻作用使其在體內(nèi)被蛋白酶降解速度減慢，從而使藥物體內(nèi)半衰期增長(zhǎng)，藥效更持久；②PEG化可以降低蛋白質(zhì)藥物抗原性，擴(kuò)大藥物的應(yīng)用范圍；③PEG化還可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)藥物具有某些新的活性特征。因此PEG修飾后的PEG-rhG-CSF在臨床上具有理想的治療效果。
一般可選用分子量為5000-60000的PEG對(duì)rhG-CSF進(jìn)行修飾。所選用的PEG分子量過(guò)低，在體內(nèi)的半衰期也低，達(dá)不到長(zhǎng)效的目的；所選用的PEG分子量過(guò)高，易被體內(nèi)的內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬。
經(jīng)研究分析本發(fā)明人認(rèn)為，選用分子量為20000-30000的PEG(PEG20000-30000)修飾的分子量為39kD-49kD的PEG20000-30000-rhG-CSF生物活性最佳，藥物持效期長(zhǎng)，穩(wěn)定性好。
本發(fā)明所述的治療臟器損傷的藥物的主要有效成分PEG-rhG-CSF的制備方法，可參照現(xiàn)有技術(shù)所公開(kāi)的蛋白質(zhì)修飾方法。
但是現(xiàn)行的公知方法中，PEG化修飾是隨機(jī)發(fā)生在任何可能反應(yīng)的氨基上的，因此生成的交聯(lián)反應(yīng)物為非均一的PEG-蛋白質(zhì)分子的混合物(分子量不同，分子結(jié)構(gòu)不同，在蛋白質(zhì)分子不同的賴氨酸殘基上交聯(lián)PEG)，即使相同分子量的產(chǎn)物也存在修飾位點(diǎn)的異構(gòu)，而且，某些處于蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)或受體結(jié)合部位的賴氨酸被修飾后大大降低了蛋白質(zhì)的活性。臨床應(yīng)用效果不理想。為開(kāi)發(fā)出可以被制藥工業(yè)和臨床應(yīng)用接受的均一的PEG-rhG-CSF分子，必須尋求一種PEG大分子與蛋白N末端定點(diǎn)交聯(lián)的新的修飾方法。
本發(fā)明人提供的PEG修飾rhG-CSF制備PEG-rhG-CSF的方法是采用氨基保護(hù)劑將處于rhG-CSF蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)及受體結(jié)合部位易于反應(yīng)的賴氨酸氨基封閉和選用具有氮端優(yōu)勢(shì)反應(yīng)的聚乙二醇活化形式相結(jié)合的方式對(duì)rhG-CSF蛋白質(zhì)氮端進(jìn)行特異性修飾，高選擇性地完成rhG-CSF蛋白質(zhì)的氮端特異性PEG化修飾。
上述方法中所說(shuō)的氨基保護(hù)劑可選用二甲基馬來(lái)酸酐(Dimethylmaleic anhydride，簡(jiǎn)稱DMMAn)；所說(shuō)的聚乙二醇活化形式可選用醛基化的單甲氧基聚乙二醇(monomethoxy PEG aldehyde，以下簡(jiǎn)稱mPEG-aldehyde)，其修飾反應(yīng)步驟如下a.將rhG-CSF蛋白質(zhì)的緩沖溶液.更換為0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8.5)，加入8～12倍于可反應(yīng)氨基數(shù)量的DMMAn，在0℃下持續(xù)30分鐘。
b.在上述反應(yīng)混合物中加入3～12倍于可反應(yīng)氨基數(shù)量的mPEG-aldehyde和NaBH3CN，反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)。
c.以0.1M HCl調(diào)節(jié)上述反應(yīng)混合物至pH5.5～6.5，在35～40℃下持續(xù)20～40分鐘。
d.反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換凝膠SP Sepharose Big Beads和分子篩凝膠Superdex 75提純，去除游離的PEG、NaBH3CN和未反應(yīng)蛋白，得到純的單甲氧基聚乙二醇修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(mPEG-rhG-CSF)。
應(yīng)用本發(fā)明所述的修飾方法制備的聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)的分子量，可由使用的PEG分子量(聚合度)來(lái)控制，使用PEG20000可制備分子量為39kD的PEG20000-rhG-CSF使用PEG30000可制備分子量為49kD的PEG30000-rhG-CSF本發(fā)明所述的修飾方法具有以下優(yōu)點(diǎn)①反應(yīng)率高，90％～95％；②分子量與結(jié)構(gòu)均一，均為蛋白質(zhì)α-氨基N末端連接一個(gè)PEG分子，沒(méi)有一個(gè)蛋白分子連接幾個(gè)PEG的產(chǎn)物，也沒(méi)有其他位點(diǎn)連接PEG的異構(gòu)現(xiàn)象；③體外比活性降低很少，基本保持不變；④體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)明顯長(zhǎng)效，在正常小鼠體內(nèi)藥效中較rhG-CSF的ANC升高延長(zhǎng)約2.5倍，ANC升高幅度明顯。
應(yīng)用本發(fā)明所述修飾方法制備的PEG-rhG-CSF，分子量增加了幾倍，其在體內(nèi)的半衰期大大延長(zhǎng)，可增加幾十倍甚至上百倍，藥效更加持久，其體外活性幾乎未降低。
本發(fā)明PEG-rhG-CSF和市售rhG-CSF比較


*病人24小時(shí)按100μg/kg劑量單次皮下注射本發(fā)明所述的治療人體臟器損傷的藥物的主要有效成分PEG化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子治療心肌梗死的作用有以下三方面(1)PEG-rhG-CSF可刺激骨髓造血功能，動(dòng)員造血干細(xì)胞釋放入血，自體移植到病變心肌處橫向分化為心肌細(xì)胞和心肌小血管，進(jìn)而修復(fù)病變心肌，改善心肌供血，治療冠心??；(2)PEG-rhG-CSF直接作用于心血管系統(tǒng)，改善心血管功能及心肌代謝，減少心肌梗死范圍，達(dá)到治療心肌梗死目的；(3)PEG-rhG-CSF直接刺激心肌干細(xì)胞增值分化，修復(fù)病變心肌和血液供應(yīng)。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所述的治療臟器損傷的藥物對(duì)心肌梗死有明顯的治療作用經(jīng)大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎心肌梗死治療實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該藥可減小心肌梗死范圍，增加心肌小血管密度，治療作用優(yōu)于治療藥物硫氮唑酮和rhG-CSF對(duì)照組。
PEG化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子治療肝臟損傷的作用為PEG-rhG-CSF可刺激骨髓造血功能，動(dòng)員造血干細(xì)胞釋放入血，自體移植到病變肝臟處橫向分化，進(jìn)而修復(fù)病變肝臟，治療肝臟損傷；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所述的治療臟器損傷的藥物對(duì)干肝臟損傷炎癥區(qū)的控制和對(duì)肝細(xì)胞增值指數(shù)的提高有明顯作用。
本發(fā)明所述的治療臟器損傷的藥物主要成分PEG-rhG-CSF的有效量為10-100μg/kg其使用方法為皮下注射、靜脈注射或心導(dǎo)管注射本發(fā)明所述的治療臟器損傷的藥物的制劑，可參照常規(guī)注射制劑的制備方法，以PEG-rhG-CSF為有效成分，添加常規(guī)助劑、溶劑等輔助成分，將其加工為注射制劑，以方便使用。也可與常規(guī)藥物聯(lián)合使用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.含有PEG20000-rhG-CSF的藥物(1)制備PEG20000-rhG-CSF①超濾濃縮GC溶液，更換緩沖體系為0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8.5)，得到濃度5mg/ml的GC溶液1000ml。
②加入1.66gDMMAn，冰浴保持反應(yīng)體系溫度為0℃，維持反應(yīng)30min。
③在反應(yīng)體系中加入52.6g mPEG20000-acetaldehyde，攪拌溶解，升溫至37℃，加入0.16g NaBH3CN，反應(yīng)1小時(shí)。以0.1M HCl調(diào)節(jié)上述反應(yīng)混合物至pH6.0，37℃持續(xù)30分鐘。
④將反應(yīng)產(chǎn)物上樣，經(jīng)10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)平衡過(guò)的SPSepharose Big Beads離子柱，以10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)、0～0.45M氯化鈉線性梯度洗脫6柱體積，收集主峰為mPEG20000-rhG-CSF。經(jīng)過(guò)Superdex 75柱去鹽，并更換緩沖液為10mM乙酸鈉(pH4.0)，即得到所需PEG20000-rhG-CSF原液。
(2)劑型加工取PEG20000-rhG-CSF原液將其配制成濃度為3mg/ml的半成品，采用低溫、無(wú)菌、無(wú)熱源的制劑灌裝工藝生產(chǎn)出無(wú)色透明的無(wú)菌注射液。分子量39kD半衰期45.7小時(shí) 體外活性5×107U/mg。
(3)治療大鼠心肌梗死的試驗(yàn)結(jié)果表.對(duì)大鼠心肌梗死范圍的影響n＝10，％，x±s

與生理鹽水組比較aP＜0.05，bP＜0.01；與常規(guī)藥物治療組比較cP＜0.05；與rhG-CSF組比較dP＜0.05；與生理鹽水對(duì)照組相比，PEG-rhG-CSF各劑量組心肌梗死范圍明顯減少。本發(fā)明藥劑治療的作用優(yōu)于常規(guī)心肌梗死治療藥物組和rhG-CSF組。
實(shí)施例2.含有PEG30000-rhG-CSF的藥物(1)制備PEG30000-rhG-CSF①超濾濃縮GC溶液，更換緩沖體系為0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8.5)，得到濃度5mg/ml的GC溶液1000ml。
②加入1.83gDMMAn，冰浴保持反應(yīng)體系溫度為0℃，維持反應(yīng)30min。
③在反應(yīng)體系中加入86.8gmPEG330000-acetaldehyde，攪拌溶解，升溫至39℃，加入0.176g NaBH3CN，反應(yīng)1.5小時(shí)。以0.1M HCl調(diào)節(jié)上述反應(yīng)混合物至pH6.2，35℃持續(xù)40分鐘。
④將反應(yīng)產(chǎn)物上樣，經(jīng)10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)平衡過(guò)的SP Sepharose Big Beads離子柱，以10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)、0～0.6M氯化鈉線性梯度洗脫10柱體積，收集主峰為mPEG30000-rhG-CSF。經(jīng)過(guò)Superdex 75柱去鹽，并更換緩沖液為10mM乙酸鈉(pH4.0)，即得到PEG30000-rhG-CSF原液。
分子量49kD半衰期58小時(shí)體外活性1×107U/mg。
(2)劑型加工取PEG30000-rhG-CSF原液將其配制成濃度為3mg/ml的半成品，采用低溫、無(wú)菌、無(wú)熱源的制劑灌裝工藝生產(chǎn)出無(wú)色透明的無(wú)菌注射液。
(3)用本發(fā)明藥劑治療心肌梗死的中國(guó)小型豬5例的結(jié)果心肌梗死面積的比較n＝10，％，x±s

與生理鹽水組比較aP＜0.05，bP＜0.01；與rhG-CSF組比較cP＜0.05；本發(fā)明藥劑治療組心肌小血管密度(15.46±3.45)明顯增加，與生理鹽水組(6.34±1.58)比較有顯著性差異。
實(shí)施例3.
按實(shí)施例1所述方法制備的PEG20000-rhG-CSF制劑對(duì)麻醉犬心臟血流動(dòng)力學(xué)和心肌耗氧量的影響PEG20000-rhG-CSF制劑在15和30μg/kg兩個(gè)劑量時(shí)對(duì)麻醉雜種犬的心臟血流動(dòng)力學(xué)及心肌耗氧量等各項(xiàng)指標(biāo)沒(méi)有直接、即可的影響，說(shuō)明PEG-rhG-CSF治療冠心病、減小心肌梗死范圍，并改善心臟功能等作用不是通過(guò)直接、即可影響心臟血流動(dòng)力學(xué)和心肌耗氧量等作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而是通過(guò)促進(jìn)自體骨髓干細(xì)胞的釋放、靶向移植于心臟，促進(jìn)心肌細(xì)胞及心肌小血管新生，修復(fù)病變而起到治療心肌梗死的作用。其作用機(jī)制是自體骨髓干細(xì)胞移植的結(jié)果，而非藥物對(duì)心血管系統(tǒng)的直接作用。
實(shí)施例4.
按實(shí)施例1所述方法制備的PEG20000-rhG-CSF制劑與心肌梗死常規(guī)藥物聯(lián)合應(yīng)用的效果在用心肌梗死常規(guī)治療藥物的基礎(chǔ)上加用PEG20000-rhG-CSF治療心肌梗死小鼠10例，小鼠心肌梗死面積從治療前占心室肌面積的(30.23±4.70)％減少至(12.16±4.65)％(P＜0.05)；而只用心肌梗死常規(guī)治療藥物治療心肌梗死小鼠10例，治療前心肌梗死面積占心室肌總面積的(32.84±5.21)％，治療后為(31.34±6.43)％，前后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
實(shí)施例5按實(shí)施例1所述方法制備的PEG20000-rhG-CSF制劑抗肝臟損傷的作用用乙醇局部注射兔子25只，誘發(fā)急性、局限性損傷模型，利用本發(fā)明藥劑治療肝損傷效果如下①對(duì)兔肝功能的影響實(shí)驗(yàn)組能明顯降低血清GST，與模型組比較差別顯著；②對(duì)兔肝壞死區(qū)域大小的影響壞死區(qū)肝組織呈灰白色，邊界不規(guī)則。對(duì)照組壞死區(qū)域達(dá)(13.1±1.8)mm，實(shí)驗(yàn)組僅為(6.6±2.6)mm，與對(duì)照組有明顯差別；③對(duì)肝組織炎癥區(qū)的影響對(duì)照組壞死灶范圍大，炎性充血帶也較寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度、肝細(xì)胞變性程度高。實(shí)驗(yàn)組的炎性程度有不同程度的減輕，與對(duì)照組有顯著性差別；④對(duì)肝細(xì)胞增值指數(shù)的影響對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組肝組織BrdU標(biāo)記指數(shù)分別為(1.5±0.8)％，(2.3±0.4)％，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)記指數(shù)顯著增加。
附動(dòng)物試驗(yàn)及測(cè)定方法鼠心肌梗死造模仿法3.5％水合氯醛按10ml·kg-1體重麻醉，接呼吸機(jī)，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支根部，關(guān)閉胸腔，縫合匹夫，局部應(yīng)用青霉素8萬(wàn)單位以預(yù)防感染。
鼠心肌梗死范圍測(cè)定(N-BT染色法)動(dòng)物處死后，立即取下心臟，NS沖洗，用濾紙吸去水分，秤重，在結(jié)扎線以下，從心尖前平行切成等厚5片，分別稱重，置于硝基四氮唑藍(lán)染液中，常溫避光2MIN，用多媒體色彩病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量每個(gè)切片的面積和心肌梗死面積(N-BT非染色區(qū))，計(jì)算心室肌總面積、心室肌梗死總面積和心室肌梗死總重量，分別算心肌梗死面積/心室面積(％)、心肌梗死重量/心臟重量(％)。
鼠心肌小血管密度測(cè)定取梗死心肌與正常心肌的交接區(qū)心肌，10％甲醛固定液固定，石蠟包埋，5μm病理切片，HE染色，于光鏡下計(jì)算心肌小血管密度等。
中國(guó)小型豬心肌梗死范圍測(cè)定(N-BT染色法)用圖像分析儀觀測(cè)梗死區(qū)面積及心室肌面積，計(jì)算梗死區(qū)面積占左心室肌面積百分比(梗死區(qū)面積/左心室肌面積×100％)，及梗死區(qū)面積占全心面積百分比(梗死區(qū)面積/全心面積×100％)。
兔血清生化指標(biāo)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束，兔禁食24h，從兔耳中動(dòng)脈采血5mL，2500r·min-1離心10min，分離血清，-70℃冷凍保存，用于檢測(cè)GST。
兔肝臟指數(shù)檢測(cè)兔采血后，耳緣靜脈流向空氣處死，稱體重，立即剖腹，取肝臟，稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)＝(肝臟重量/體重)×100，重量單位按g計(jì)。
兔肝臟壞死區(qū)域檢測(cè)觀察肝臟外觀變化，拍照。切下壞死部分(含正常區(qū)、炎癥區(qū)和壞死區(qū))，用作圖直盡測(cè)量壞死區(qū)的長(zhǎng)徑和短徑，從短徑平行等厚切成4片，將每片腳下組織兩切面分別用掃描儀掃描，用多媒體彩色圖像分析系統(tǒng)計(jì)算醒死區(qū)面積，計(jì)算壞死體積， 然后將4片的何種相加，開(kāi)立方即為壞死區(qū)域大小。
免疫組化取固定好的肝組織，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。經(jīng)固定、脫水、包埋、切片，脫蠟，PBS液沖洗先后加第一抗體(小鼠抗5-溴脫氧尿嘧啶-抗)，4℃冰箱過(guò)夜后再加生物素標(biāo)記的第二抗體50μl孵育，37℃孵育1h，沖洗干凈，加SABC復(fù)合液37℃孵育1h，沖洗干凈，加DAB溶液，水洗，脫水，中性樹(shù)膠封固。顯微鏡計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野Br-dU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，每視野肝細(xì)胞數(shù)超過(guò)100個(gè)。增殖指數(shù)＝(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù))×100％兔肝壞死周邊區(qū)的炎癥分級(jí)取掃描后的肝組織切片(含正常區(qū)、炎癥區(qū)和壞死區(qū))用10％甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片HE染色，光鏡下觀察炎癥區(qū)和壞死區(qū)細(xì)胞變性、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度。參照Knodell系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分[5]地貌形成作用組織無(wú)腫脹、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，記為0級(jí)；輕度肝細(xì)胞腫脹，單個(gè)肝細(xì)胞壞死，或匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)＜1/3，記為I級(jí)；中度肝細(xì)胞腫脹，或肝細(xì)胞灶性壞死，或匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)1/3-2/3，記為II級(jí)；重度肝細(xì)胞腫脹，或肝組織片狀壞死或橋狀壞死，或匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)＞2/3，記為III級(jí)。
權(quán)利要求
1.一種修復(fù)治療臟器損傷的藥物其特征在于主要有效成分為聚乙二醇修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種修復(fù)治療臟器損傷的藥物其特征在于所說(shuō)的PEG-rhG-CSF為選用分子量為5000-60000的PEG對(duì)rhG-CSF進(jìn)行修飾制得的PEG-rhG-CSF。
3.如權(quán)利要求1所述的一種修復(fù)治療臟器損傷的藥物其特征在于所說(shuō)的PEG-rhG-CSF為選用分子量為20000-30000的PEG對(duì)rhG-CSF進(jìn)行修飾制得的PEG20000-30000-rhG-CSF。
4.如權(quán)利要求1所述的一種修復(fù)治療臟器損傷的藥物，其特征在于主要有效成分PEG-rhG-CSF的制備方法為采用氨基保護(hù)劑將處于rhG-CSF蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)及受體結(jié)合部位易于反應(yīng)的賴氨酸氨基封閉和選用具有氮端優(yōu)勢(shì)反應(yīng)的聚乙二醇活化形式相結(jié)合的方式對(duì)rhG-CSF蛋白質(zhì)氮端進(jìn)行特異性修飾，高選擇性地完成rhG-CSF蛋白質(zhì)的氮端特異性PEG化修飾。
5.如權(quán)利要求4所述的一種修復(fù)治療臟器損傷的藥物的主要有效成分PEG-rhG-CSF的制備方法，其特征在于所說(shuō)的氨基保護(hù)劑選用二甲基馬來(lái)酸酐；所說(shuō)的聚乙二醇活化形式可選用醛基化的單甲氧基聚乙二醇。
6.如權(quán)利要求1所述的一種修復(fù)治療臟器損傷的藥物，其特征在于主要有效成分PEG-rhG-CSF的有效量為10-100μg/kg。
7.如權(quán)利要求1所述的一種修復(fù)治療臟器損傷的藥物，其特征在于使用方法為皮下注射、靜脈注射或心導(dǎo)管注射。
8.如權(quán)利要求1所述的一種修復(fù)治療臟器損傷的藥物，其特征在于主要有效成分PEG-rhG-CSF制劑可與心肌梗死和其它臟器損傷常規(guī)藥物聯(lián)合應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1-8所述的一種修復(fù)治療臟器損傷的藥物的應(yīng)用，其特征在于用于心臟、肝臟損傷修復(fù)治療。
全文摘要
本發(fā)明為一種修復(fù)治療臟器損傷的蛋白質(zhì)藥物，其采用聚乙二醇修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG－rhG－CSF)為主要有效成分，具有較高的藥效和較長(zhǎng)的穩(wěn)定的持效期，并能夠方便的實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。PEG化rhG－CSF半衰期延長(zhǎng)，藥效更持久；PEG化可以降低蛋白質(zhì)藥物抗原性，擴(kuò)大藥物的應(yīng)用范圍；PEG化還可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)藥物具有某些新的活性特征。本發(fā)明PEG－rhG－CSF對(duì)心臟、肝臟等病理?yè)p傷的修復(fù)有較好的效果。該藥可減小心肌梗死范圍，增加心肌小血管密度，治療作用優(yōu)于治療藥物硫氮唑酮和rhG－CSF對(duì)照組，在臨床上具有理想的治療效果。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1824324SQ200510045369
公開(kāi)日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日
發(fā)明者張雪山, 徐宜鐵, 趙風(fēng) 申請(qǐng)人:山東格蘭百克生物制藥有限公司