專利名稱：HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種能有效控制肝癌等腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等侵襲性疾病的小片段干涉RNA藥物及其用途。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，每年全世界死于癌癥患者約600萬，占全球死亡人數(shù)的12％。我國1995年主要疾病死亡率及死亡原因構(gòu)成中，惡性腫瘤排列第2位，占死亡總?cè)藬?shù)的21.85％。長(zhǎng)期以來，由于腫瘤高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移的惡性特點(diǎn)，一直是腫瘤治療亟待解決的問題。目前國內(nèi)外抗癌治療關(guān)注的熱點(diǎn)之一是抗腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。腫瘤的轉(zhuǎn)移規(guī)律極其復(fù)雜，涉及諸多因素，如(1)蛋白水解酶；(2)血管生成因子；(3)粘附因子，如整合素(integrin)，選擇素(selectin)，鈣粘合素(E-cadherin)等；(4)運(yùn)動(dòng)因子。在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞分泌蛋白水解酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)最為重要，目前已發(fā)現(xiàn)了20余種，它們幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分。MMPs的作用可概括為(1)降解間質(zhì)，破壞膠原限制腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)械屏障作用；(2)破壞基底膜完整性，利于癌細(xì)胞穿過血管壁進(jìn)入血流；(3)通過對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的改建，促進(jìn)腫瘤新生血管或轉(zhuǎn)移灶的形成。由于MMPs在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的重要作用，因而腫瘤組織中MMPs的來源一直是人們研究的重點(diǎn)問題。
近年來本申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)，HAb18G/CD147在肝癌等多種高侵襲轉(zhuǎn)移性腫瘤及炎性滑膜中高度表達(dá)，HAb18G/CD147與其效應(yīng)細(xì)胞(如癌周成纖維細(xì)胞)結(jié)合常常大量誘導(dǎo)產(chǎn)生MMPs或上調(diào)激活MMPs的活性，使腫瘤組織中MMPs含量及活性顯著提高，間質(zhì)成分和血管基底膜的膠原蛋白過度降解，癌細(xì)胞穿過基底膜及結(jié)締組織屏障不斷侵襲擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。目前，抗間質(zhì)降解多采用酶抑制劑，如天然酶抑制劑-組織型金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)，能夠與MMPs結(jié)合并抑制酶活性，但TIMPs在組織中含量極微且難于提取，人工重組TIMPs是大分子蛋白質(zhì)，存在降解和口服吸收不良等問題。人工合成的擬肽類金屬蛋白酶抑制劑，如Batimastat(BB-94)，只能抑制早期腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生的MMPs的活性，幾乎不能抑制晚期腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量MMPs的活性，導(dǎo)致III期臨床實(shí)驗(yàn)的停止。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)在我國成人中的發(fā)病率約0.3％’(患病人數(shù)達(dá)300余萬)。發(fā)病年齡輕，致殘率高。此外，幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也是小兒常見的結(jié)締組織病。其臨床特點(diǎn)為累及到周身關(guān)節(jié)的增殖性和侵蝕性滑膜炎，呈進(jìn)行性病變終生反復(fù)不斷。被認(rèn)為是類似“局限性惡性腫瘤”的增生性和破壞性病變。RA組織病理學(xué)特征是滑膜襯里過度增生和襯里下層大量炎性單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)。成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和滑膜組織巨噬細(xì)胞在關(guān)節(jié)損傷中起最重要的作用。這兩種細(xì)胞均能產(chǎn)生大量MMPs。這些酶以協(xié)同作用方式能夠消化滑膜、關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的所有主要的細(xì)胞外基質(zhì)組分。RA滑膜中EMMPRIN(CD147)的表達(dá)上調(diào)，可誘導(dǎo)局部產(chǎn)生MMPs1、2、3等蛋白水解酶，且可導(dǎo)致MMPs和TIMPs的不平衡最終引起RA關(guān)節(jié)的破壞。此病至今尚無特效治療。90年代以來，國內(nèi)外學(xué)者采用仿效結(jié)核病和惡性腫瘤的聯(lián)合療法，是此類疾病治療學(xué)上的一大突破，使部分患者病情得到較長(zhǎng)期緩解，生活質(zhì)量得到提高，但并未治愈疾病。抑制軟骨和骨侵蝕仍是此病治療亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本專利申請(qǐng)發(fā)明人在長(zhǎng)期從事肝癌免疫導(dǎo)向藥物研究的基礎(chǔ)上，獲得肝癌高親和力單抗HAb18(第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程中心研制)的相應(yīng)膜抗原HAb18G的cDNA全長(zhǎng)序列，發(fā)現(xiàn)其與CD147的序列高度同源，通過基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)和明膠酶譜實(shí)驗(yàn)分析，證實(shí)HAb18G/CD147分子可大大促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，以及HAb18/CD147在正常肝細(xì)胞中不表達(dá)，在肝癌上為高表達(dá)的特點(diǎn)，可通過在分子水平直接高位阻斷HAb18G/CD147分子的表達(dá)來抑制肝癌轉(zhuǎn)移。所以，本發(fā)明的目的之一就是設(shè)計(jì)有效的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物從分子水平高位阻斷效應(yīng)細(xì)胞分泌MMPs，這對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的治療可能更為直接有效。
鑒于MMPs通過直接降解軟骨、骨組織和間接促進(jìn)血管形成而參與RA關(guān)節(jié)破壞。因此抑制MMPs是治療RA的基本途徑之一。此外，骨關(guān)節(jié)炎與老齡化密切相關(guān)，隨著人類壽命的延長(zhǎng)，發(fā)病率增高，軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMPs，亦在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中起重要作用。但迄今有關(guān)應(yīng)用酶抑制劑抗間質(zhì)降解的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療一樣令人失望。所以，本發(fā)明的另一目的之一就是利用設(shè)計(jì)有效的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物，在分子水平高位阻斷抑制效應(yīng)細(xì)胞分泌MMPs，也是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎治療的新途徑和發(fā)展趨勢(shì)。
本發(fā)明提供一種具有抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、的小片段干涉RNA藥物及其用途。
本發(fā)明是以下述方式實(shí)現(xiàn)的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物，是抗間質(zhì)降解和抗炎的一類干涉RNA藥物，具有抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎的作用，針對(duì)靶抗原HAb18G/CD147分子的小片段干涉RNA藥物的序列如下，5’-GUUCUUCGUGAGUUCCUCdTdT-3’，3’-dTdTCAAGAAGCACUCAAGGAG-5’HAb18G/CD147分子小片段RNA干涉藥物的制備方法，根據(jù)HAb18G/CD147分子的基因序列，我們選擇其mRNA分子起始密碼子后第470-488位共18個(gè)核苷酸為靶向干涉序列，經(jīng)DNA合成儀按上述設(shè)計(jì)的序列大量合成雙鏈互補(bǔ)的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物。此合成的小片段干涉RNA藥物經(jīng)脂質(zhì)體混合轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后，用于腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎的治療。
在HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步加免疫球蛋白Fc段或用納米質(zhì)脂體包裹后的制劑，可用于腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎的治療。
體外實(shí)驗(yàn)表明我們?cè)O(shè)計(jì)合成的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物，經(jīng)細(xì)胞侵襲力抑制實(shí)驗(yàn)證明，該小片段干涉RNA藥物對(duì)肝癌細(xì)胞及其與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞侵襲能力的抑制率分別為82.9％和82.3％。明膠酶譜實(shí)驗(yàn)證明，肝癌細(xì)胞及其與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后MMP-2、9的分泌量分別降低60.1％、73.5％。此外，ELISA證實(shí)，干涉RNA轉(zhuǎn)染后的FHCC-98細(xì)胞分泌VEGF的量下降了25％。
體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)用合成的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物對(duì)荷人肝癌的裸鼠進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝癌成瘤性有明顯抑制作用。當(dāng)對(duì)照組在第12天每只裸鼠都成瘤時(shí)，其試驗(yàn)組裸鼠均成瘤不明顯。此外，治療組的平均生存期比對(duì)照組延長(zhǎng)接近一倍以上。
綜上所述，這此結(jié)果說明該小片段干涉RNA藥物在抗肝癌等腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移上有明確的應(yīng)用效果，其可能在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎等疾病的治療中也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。


圖1是RT-PCR、Western-blot和流式細(xì)胞儀檢測(cè)RNAi干涉細(xì)胞HAb18G/CD147表達(dá)結(jié)果，其中(a)為RT-PCR結(jié)果，泳道“-”為未轉(zhuǎn)染的FHCC-98細(xì)胞中HAb18G/CD147、GAPDH的mRNA的量，泳道“+”為轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中HAb18G/CD147、GAPDH的mRNA的量。(b)為western-blot的結(jié)果，泳道1為未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中HAb18G/CD147，泳道2為轉(zhuǎn)染后的HAb18G/CD147。(C)為流式細(xì)胞儀的檢測(cè)圖，右峰為轉(zhuǎn)染前的HAb18G/CD147，左峰為轉(zhuǎn)染后的HAb18G/CD147。
圖2(a)為明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果，RNA干涉HAb8G/CD147表達(dá)后FHCC-98細(xì)胞及其與HPF-1細(xì)胞共培養(yǎng)后，MMP-2的分泌量分別顯著降低。(b)為細(xì)胞侵襲力抑制結(jié)果，分別為FHCC-98在干涉前后、及與HPF-1共培養(yǎng)后觀察到的侵襲穿膜細(xì)胞?？梢?，在siRNA干涉CD147表達(dá)后，細(xì)胞的侵襲能力顯著降低(2.5)。(C)為ELISA測(cè)定結(jié)果，F(xiàn)HCC-98細(xì)胞在RNA干涉前后VEGF的分泌量顯著下降。
具體實(shí)施例方式
1。HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)HAb18G/CD147分子的基因全長(zhǎng)mRNA序列，經(jīng)BALST在GENEBANK中搜索比對(duì)后，我們選擇了HAb18G/CD147基因mRNA分子起始密碼子后第470-488位共18個(gè)核苷酸為靶向干涉的具體序列，設(shè)計(jì)合成了一段高特異性的雙鏈互補(bǔ)的HAb18G/CD147小片段干涉RNA，經(jīng)DNA合成儀大量合成后用PAGE技術(shù)純化鑒定純度達(dá)99％以上，其序列如下所示。
5’-GUUCUUCGUGAGUUCCUCdTdT-3’，3’-dTdTCAAGAAGCACUCAAGGAG-5’2。脂質(zhì)體介導(dǎo)小片段干涉RNA藥物轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞FHCC-98細(xì)胞經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，將50pmol小片段干涉RNA與10ul脂質(zhì)體lipfectamine2000共溶入1640培養(yǎng)基中，室溫孵育混合20分鐘后，加在接種的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后，提取總RNA作RT-PCR分析HAb18G/CD147mRNA量。提取總蛋白用WESTERN-BLOT檢測(cè)HAb18G/CD147蛋白表達(dá)量。同時(shí)，用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步驗(yàn)證HAb18G/CD147分子表達(dá)量。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小片段干涉RNA藥物轉(zhuǎn)染后，HAb18G/CD147基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量明顯降低，HAb18G/CD147蛋白的表達(dá)量也顯著降低(參見圖1)。
3。小片段干涉RNA藥物的體外功能實(shí)驗(yàn)(1)細(xì)胞侵襲力抑制實(shí)驗(yàn)，即在底層鋪有Matrigel膠Millicell小室中，將轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的FHCC-98細(xì)胞單培養(yǎng)，或?qū)⑵渑cHPF-1細(xì)胞共培養(yǎng)后，檢測(cè)穿過Matrigel膠的肝癌細(xì)胞較對(duì)照是否有減少，并計(jì)算HAb18G/CD147小片段干涉RNA分子對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制率。計(jì)算公式[(干涉前細(xì)胞均數(shù)-干涉后細(xì)胞均數(shù))/干涉前細(xì)胞均數(shù)]×100％。(2)明膠酶譜實(shí)驗(yàn)，即將轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的FHCC-98細(xì)胞單培養(yǎng)，或?qū)⑵渑cHPF-1細(xì)胞共培養(yǎng)后，收集無血清培養(yǎng)細(xì)胞上清，經(jīng)分離膠中含0.1％明膠粉的凝膠電泳后，加入明膠酶孵育、染色進(jìn)行灰度掃描比較。(3)ELISA檢測(cè)人VEGF的分泌表達(dá)實(shí)驗(yàn)，即將轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞FHCC-98無血清培養(yǎng)上清，分別加至包被人VEGF單抗的酶標(biāo)板上，進(jìn)行常規(guī)夾心ELISA，置492nm處測(cè)吸光值，檢測(cè)HAb18G/CD147小片段RNA干涉對(duì)人VEGF分子分泌表達(dá)量的影響。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小片段干涉RNA藥物轉(zhuǎn)染，其對(duì)肝癌細(xì)胞及其與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞侵襲能力的抑制率分別為82.9％和82.3％，其對(duì)肝癌細(xì)胞及其與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后MMP-2、9的分泌量分別抑制降低60.1％、73.5％，其對(duì)FHCC-98細(xì)胞分泌VEGF的量下降了25％(參見圖2)。
4。小片段干涉RNA藥物的體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)采用皮下接種人肝癌細(xì)胞系FHCC-98形成瘤塊的BALB/C裸鼠模型，尾靜脈加壓注射脂體包裹的HAb18G/CD147小片段干涉RNA藥物(125μg/kg/day)，同時(shí)設(shè)立對(duì)照。皮下組隔日1次，共12次；皮下組觀察接種FHCC-98細(xì)胞后皮下腫瘤生長(zhǎng)情況，從d10開始，每4d測(cè)定1次腫瘤體積；觀察150d裸鼠生存情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在d 30 RNA干涉治療組的抑瘤率為61.3％，與對(duì)照組比顯著縮小(P＜0.05)(見表1)，其150d生命延長(zhǎng)率比對(duì)照組延長(zhǎng)40.9％(P＜0.01)(見表2)。
表1荷人肝癌FHCC-98裸鼠經(jīng)小片段干涉RNA治療后的抑瘤率

*與對(duì)照組相比較，P＜0.05表2荷人肝癌FHCC-98裸鼠經(jīng)小片段干涉RNA治療后150天內(nèi)平均生存情況

**與對(duì)照組相比較，P＜0.0權(quán)利要求
1.HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物，其特征在于該針對(duì)靶分子HAb18G/CD147的小片段RNA具有互補(bǔ)的雙鏈核苷酸序列5’-GUUCUUCGUGAGUUCCUCdTdT-3’，3’-dTdTCAAGAAGCACUCAAGGAG-5’。
2.如權(quán)利要求1所述的HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物作為制備抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎治療劑的應(yīng)用。
全文摘要
HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA藥物涉及生物技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明是一種能抗腫瘤間質(zhì)降解、抗炎感染的雙鏈互補(bǔ)小片段RNA類物質(zhì)。其以肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子HAb18G/CD147為靶向分子，設(shè)計(jì)并合成它的小片段干涉RNA抑制劑；阻斷效應(yīng)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞)誘導(dǎo)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的功能；減少腫瘤組織間質(zhì)的降解、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、新生血管(血管翳)的形成；達(dá)到治療肝癌等腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的目的。經(jīng)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證明，這類特異性靶向HAb18G/CD147分子的小片段RNA干涉藥物對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有明確的抑制效果。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1720999SQ20051004275
公開日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
發(fā)明者續(xù)惠云, 張思河, 徐靜, 朱平, 陳志南 申請(qǐng)人:陳志南