專利名稱：用于增強cd8的制作方法
關于聯(lián)邦資助研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明部分在政府資助下、由國家健康研究所(National Instituteof Health)提供的資助號RO1 NS41289完成。政府在本發(fā)明中享有一定的權利。
背景技術：
1.發(fā)明領域本發(fā)明總的來講涉及自身免疫病(如多發(fā)性硬化(MS))治療領域。更具體地講，本發(fā)明涉及用髓鞘堿性蛋白(MBP)的免疫原性片段制備的CD8+T細胞疫苗。
2.相關技術的介紹多發(fā)性硬化(MS)是中樞神經系統(tǒng)(CNS)的一種脫髓鞘慢性炎性疾病。這種疾病的組織病理學標志包括白質中CD4+和CD8+T細胞以及其它炎性細胞的病灶性浸潤和脫髓鞘，同時有某些軸索損傷的跡象(Martin等，Annu.Rev.Immunol.1992；1053；Keegan等，Ann.Rev.Med.2002；53285)。長期以來一直推測T細胞對某些髓鞘蛋白(如髓鞘堿性蛋白(MBP))的應答在MS發(fā)病機理中起著重要作用。在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)-一種典型的MS動物模型中，業(yè)已發(fā)現(xiàn)識別MBP的CD4+T細胞誘發(fā)特征為廣泛浸潤和輕度脫髓鞘的CNS病變(Zamvil等，Nature 1985；317355)。直到最近，尚未知曉識別MBP短肽的CD8+T細胞可以誘發(fā)EAE和明顯的CNS病變。這些CD8+T細胞對靶細胞有細胞毒性，識別內源加工的MBP，并且在過繼轉移后誘發(fā)重癥EAE(Huseby等，J.Exp.Med.2001；194669；Steinman，J.Exp.Med.，2001；19427)。重要的是注意到，在EAE中識別MBP的CD8+細胞毒性T細胞誘發(fā)的CNS病變，其特征為廣泛脫髓鞘，非常類似人類的MS病變(Huseby等，出處同上)，提示識別MBP的細胞毒性T細胞能引起表達I類MHC分子和MBP兩者的少突膠質細胞損傷。這些發(fā)現(xiàn)已引起新的有關CD8+細胞毒性MBP反應性T細胞在MS中是否起類似作用的問題。
在MS中，有一些證據表明，CD4+T細胞對MBP和其它候選髓鞘抗原的應答可能在病程中起著重要作用(Ota等，Nature 1990；346183；Martin等，J.Exp.Med.1991；17319；Zhang等，Ann.Neurol.1992；32330；Trotter等，J.Neuroummunol.1998；84172；Markovic-Plese等，J.Immunol.1995；155982；Kerlero de Rosbo等，1997；273059；Bieganowska等，J.Exp.Med.1997；185；1585；Wallstrom等，Eur.J.Immunol.1998；283329；Lindert等，Brain 1999；1222089；Zhang等，J.Exp.Med.1994；179973；Tejada-Simon等，Intern.Immunol.2000；121641)。迄今所積累的這些結果提示與健康對照相比，在MS患者中CD4+MBP反應性T細胞在體內經歷活化和克隆表達(Zhang等，J.Exp.Med.1994；179973，Allegretta等，Science 1990；247718；Chou等，J.Neurosci.Res.1989；23207；Vandervyver等，Eur.J.Immunol.1995；25958；Wucherpfenning等，J.Immunol.1994；1525581)，并且在急性惡化期間出現(xiàn)前體頻率增加(Tejada-Simon等，Inter.Immunol.2000；121641)。與CD4+MBP反應性T細胞相應物相比，并不知曉CD8+細胞毒性MBP反應性T細胞可能參與MS發(fā)病機理。Tsuchida及其同事報道在MS患者和健康個體的血液中鑒定出CD8+細胞毒性T細胞(Tsuchida等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994；9110859)。這些CD8+T細胞系中的某些細胞系看來識別內源加工的髓鞘肽，提示它們可能在組成型表達I類MHC分子(而不是II類分子)和髓鞘抗原的少突膠質細胞的損傷中起作用。隨后的研究證實識別MBP之110-118肽的HLA-A2限制性CD8+T細胞系可能介導人少突膠質細胞的裂解(Jurewicz等，J.Immunol.1998；1603056)。然而，仍未知曉與健康對照相比，識別MBP的CD8+T細胞在MS患者體內是否被敏化從而經歷活化和擴增，以及是否有與其它I類MHC分子相關的其它表位。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及識別多發(fā)性硬化相關抗原(包括但不限于諸如髓鞘堿性蛋白(MBP)的抗原)和/或其片段的CD8+細胞毒性T細胞的分離。MBP片段可以是包含SEQ ID NO1-4中所示任一序列的8個或更多個氨基酸的肽。MS相關抗原也可以是蛋白脂質蛋白(PLP)或髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG)。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及MBP片段，其以高親和性結合HLA-A2受體和HLA-A24受體。在本發(fā)明所包括的MBP片段中有SEQ ID NO1-4所示的MBP片段。所述片段也可以是在該片段的一個或多個位置上有保守氨基酸、但仍與HCA-A2受體和HCA-A4受體結合的同源物。
在另一實施方案中，本發(fā)明描述了可用于治療或預防MS的疫苗的制備方法，包括獲得外周血單核細胞(PBMC)群體，該細胞群體包含來自待治療患者的T細胞；優(yōu)選通過減少該群體中CD4+細胞數目或消除CD4+細胞，使該群體富集CD8+T細胞；將所述CD8+T細胞富集群體與一種或多種對應于能結合HLA-A2和HLA-A24的MBP片段的肽孵育，以便增強群體中對所述MBP多肽特異性的CD8+T細胞克隆數目。對所述MBP多肽特異性應答的CD8+T細胞群體可通過例如在抗原呈遞細胞(APC)存在下，例如用相應的MBP肽和促分裂原交替刺激所述細胞來進一步加以擴增。
本發(fā)明的再一實施方案公開了測試CD8+T細胞疫苗對接觸過MBP片段的自體細胞的細胞毒性的方法，所述MBP片段包括但不限于具有對應SEQ ID NO1、2、3或4的氨基酸序列的肽。
在又一實施方案中，本發(fā)明涉及一種通過給予需要治療的患者對所述MBP片段應答、優(yōu)選能與HLA-A2和HLA-A24結合的自體CD8+T細胞治療MS的方法。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種通過分離或產生對患者MBP反應性CD8+T細胞有細胞毒活性的CD8+T細胞，制備自體CD8+T細胞疫苗的方法。按照這些方法，根據對患者MBP反應性CD8+T細胞的反應性，對自體CD8+T細胞記憶克隆進行選擇。
本發(fā)明還涉及諸如在下述文獻中所述的T細胞疫苗共同待審的美國專利申請第09/952,532號、PCT/US02/28874、60/402,521、PCT/US03/24548(所有這些文獻全文在此引入作為參考)，所述疫苗通過加入按照本發(fā)明方法制備的對MS相關抗原肽具反應性的CD8+T細胞而進一步加以修飾。
附圖簡述

圖1A和1B描述了T細胞去除前后CD4+T細胞和CD8+T細胞的百分比。分析來源于MS患者(MS-4)的PBMC中在磁珠去除CD4+T細胞前(左圖)后(右圖)CD4+T細胞和CD8+T細胞的百分比。在所有30個實驗中，CD4+T細胞的去除率總是高于98％。在去除了CD4+T細胞的PBMC中，CD8+T細胞的平均百分比為72±8％。
圖2顯示了MS患者和正常受試者(NS)中MBP源性肽反應性CD8+T細胞的估計前體頻率。CD8+T細胞頻率分析通過半有限稀釋法(split-well method)進行，其中將預先去除了CD4+T細胞的應答PBMC級分與經照射的未經分級分離的自體PBMC分別在指定MBP源性肽存在下培養(yǎng)。用對應于破傷風類毒素免疫顯性表位(殘基830-838)的合成肽作為對照。每個空心圓表示各個個體中的CD8+T細胞頻率。數據以PBMC的CD4去除級分中識別所述MBP源性肽的CD8+T細胞的估計頻率來表示。
圖3顯示了MBP源性肽反應性CD8+T細胞的表型表達。用一組抗TCRαβ/TCRγδ、CD4/CD8、CD45RA/CD45RO的單克隆抗體，分析CD8+T細胞系(E11、D10、B9和F12)的表型表達。
圖4所示為用流式細胞術分析I類MHC四聚體與克隆化CD8+T細胞系的結合。通過流式細胞術，用HLA-A2-MBP111-119四聚體，分析識別MBP111-119肽(E11)和MBP87-95肽(D10)的兩種A2限制性CD8+T細胞系?？招那€代表用PE綴合對照抗體對T細胞的染色。實心曲線指示在同一代表性實驗中用該四聚體對T細胞染色。
圖5描述了識別MBP源性肽的CD8+T細胞的細胞因子分布型。通過ELISA，測量來源于MS患者(MS，n＝25)和正常受試者(NS，n＝14)的所得CD8+MBP反應性T細胞系的細胞因子產生。分別用相應的肽攻擊T細胞系，48小時后測試上清液的指定細胞因子的濃度。條柱指示平均濃度(pg/ml)±SEM。該測定對所有細胞因子的檢測基線皆低于25pg/ml。
圖6A和6B顯示了識別針對自體靶細胞的MBP源性肽的CD8+T細胞系的細胞毒活性。用LDH釋放測定，檢查了對MBP源性肽-E1(代表MBP111-119)、D10(代表MBP87-95)、B9(代表MBP134-142)和F12(代表MBP14-22)有反應性的四種代表性CD8+T細胞系的細胞毒性。圖A以效應物(CD8+T細胞)與靶(自體EBV轉化B細胞)的指定比率，測試了CD8+T細胞系對用相應肽脈沖處理過的自體靶細胞的細胞毒活性。用對應于不相關TCR CDR3序列的合成9聚體肽((STRQGPQET)(SEQ ID NO5)作為對照。圖B分析相同CD8+T細胞系對用不同MBP肽脈沖處理過的自體靶細胞的細胞毒活性。用不相關TCR肽脈沖處理過的相同自體靶細胞作為對照肽。效應物與靶之比為10。
圖7說明CD8+細胞毒性T細胞系的MHC限制。在有和無以20μg/ml濃度使用的針對I類MHC(W6/32)和II類MHC(HB55)的兩種單克隆抗體存在下，測試所選識別MBP源性肽的CD8+細胞毒性T細胞系對自體靶細胞的特異性細胞毒性。在所有實驗中，效應物與靶之比皆為10。數據以特異性細胞毒性的百分比來表示。采用方法與圖5所示方法相同。
圖8所示為MBP源性肽反應性CD8+T細胞系對用人MBP和HLA-A2基因轉染的COS細胞的細胞毒活性。
采用LDH釋放測定，使用以人MBP和HLA-A2基因轉染的COS細胞，測試所選CD8+細胞毒性T細胞系的細胞毒活性。效應物與靶之比為10。用非轉染COS細胞作為對照。
詳細描述在公開和描述本發(fā)明化合物、產物和組合物以及方法之前，應當理解，除非正文中另外明確指出，否則說明書和所附權利要求書中所用的單數形式“a”、“an”和“the”包括復數形式。
自體反應性T細胞中識別髓鞘堿性蛋白(MBP)的CD4和CD8亞群引起多發(fā)性硬化(MS)發(fā)病。與EAE中誘發(fā)廣泛CNS炎癥和輕度脫髓鞘的CD4+MBP反應性T細胞不同，推測識別MBP源性肽的CD8+細胞毒性T細胞在EAE中通過誘發(fā)少突膠質細胞損傷而直接引起重癥CNS脫髓鞘(Huseby等，J.Exp.Med.2001；194669)。這些CD8+細胞毒性T細胞的不同作用與MS尤其相關，在MS中脫髓鞘代表與神經功能缺損相關的最為顯著的CNS病變。文獻中有證據表明，CD4+T細胞對MS中的候選髓鞘抗原應答，初步療法嘗試抑制或消除CD4+髓鞘反應性T細胞(Zhang等，Science 1993；2611451；Vandenbark等，Nat.Med.1996；101109)。相比之下，事實上并不知曉MS中CD8+T細胞在識別髓鞘抗原中的功能特性和潛在作用。該領域無進展的部分原因與髓鞘抗原反應性CD8+T細胞的檢測和產生中的技術難題相關。本發(fā)明公開了一種鑒定MS相關抗原(優(yōu)選MBP和/或其片段)反應性CD8+T細胞和有效產生可用于治療MS、監(jiān)測疾病進程和監(jiān)測治療該疾病的治療反應的CD8+T細胞系的途徑。本發(fā)明的方法還可用于診斷和監(jiān)測MS進程。
該途徑包括從需要治療的MS患者中獲取PBMC；用MS相關抗原預先去除PBMC中的CD4+T細胞群體，得到CD8+細胞富集的PBMC群體，以便增加該群體中的CD8+T細胞數目，任選在有或無抗原呈遞細胞存在下重復刺激循環(huán)。在美國專利申請第09/952,532號和國際申請PCT/US02/02887(公開號為WO 03/024393)和PCT/US03/24548(公開號為WO 04/15070)中，描述了用交替刺激循環(huán)產生T細胞系，上述文獻的內容在此引入作為參考。也包括選擇對特定抗原(包括MBP免疫原性片段)具反應性的CD8+T細胞系的方法。在這方面，免疫原性意指誘導或支持T細胞應答(包括但不限于增殖應答)或例如刺激T細胞產生共毒素(cotoxin)的能力。還公開了鑒定MBP免疫原性片段的方法，并且提供對HLA-A2和HLA-A24具有高結合親和性的四種MBP免疫原性片段的氨基酸序列。
本文所述數據提供了重要的證據，證明識別MBP源性肽的CD8+細胞毒性T細胞參與MS發(fā)病機理，因此表明需要開發(fā)可在MS患者中降低這些CD8+細胞毒性T細胞數目的治療。
識別MBP的已鑒定I類MHC肽的CD8+細胞毒性T細胞的估計頻率，在來源于MS患者的PBMC中為3.4-5.4×10-7，而在對照組中為1.1-2.0×10-7。與此發(fā)現(xiàn)相關的有幾個問題。首先，在同樣實驗條件下，PBMC中識別MBP已鑒定區(qū)域的CD8+細胞毒性T細胞的觀測頻率相對低于MS患者中識別MBP免疫顯性肽的CD4+T細胞的觀測頻率(PBMC中為1-2×10-6)(Ota等，Nature 1990；346183；Zhang等，J.Exp.Med.1994；179973；Tejada-Simon等，Intern.Immunol.2000；12；1641)。同CD4+MBP反應性T細胞一樣，這些CD8+細胞毒性MBP反應性T細胞也可在健康個體中檢測到(Ota等，Nature 1990；346183；Martin等，J.Exp.Med.17319；Zhang等，J.Exp.Med.1994；179973；Tejada-Simon等，2000；121641)。然而，MS患者中估計的T細胞頻率顯著高于對照中的這一頻率。與在MS患者和對照中觀測到的CD4+MBP反應性T細胞相比，上述差異似乎更為顯著。還應當注意到，與作為表達CD45RA和CD45RO兩者的原初T細胞的CD4+MBP反應性T細胞(Muraro等，J.Immunol.2000；1645474)不同，所鑒定的這些CD8+細胞毒性T細胞屬于表達CD45RO但不表達CD45RA表型的接觸過抗原的(antigen-experienced)記憶T細胞亞群。其次，該發(fā)現(xiàn)提示識別MBP源性肽的這些CD8+細胞毒性T細胞在MS患者體內可能經歷活化。
在這方面，越來越多的證據表明，MBP反應性T細胞可為多種微生物抗原、通過被稱為分子模擬的機制所活化(Oldstone，Curr.Topics Microbiol.Immunol.1989；145127；Oldstone，F(xiàn)ASEB J.1998；121255；Hafler，J.Clin.Invest.1999；104527；Tejada-Simon等，Annalsof Neurology 2003；53189)。最近，我們鑒定出疑為MS病原體的HHV-6和MBP之間的序列同源性，并且證明與健康個體相反，與兩種抗原有交叉反應性的CD4+T細胞在MS患者中被敏化(Tejada-Simon等，Annals of Neurology 2003；53189)。雖然在此鑒定的MBP區(qū)與髓鞘蛋白沒有完全的序列同源性，但確立了在MBP反應性T細胞中存在TCR簡并性，這使其能識別不完全序列匹配的微生物抗原肽，只要T細胞識別所需的TCR接觸殘基保守即可(Wucherpfennig等，Cell 1995；80695；Hemmer等，J.Exp.Med.1997；1851651；Kozovska等，Eur.J.Immunol.1998；281894)。最后，可論證的是，盡管業(yè)已證明基于細胞培養(yǎng)物的半有限稀釋法可用于比較一致使用的個體樣品間的T細胞頻率(Ota等，Nature 1990；346183；Zhang等，J.Exp.Med.1994；179973；Tejada-Simon等，Intern.Immunol.2000；121641；Zhang等，Science 1993；2611451；Tejada-Simon等，J.Virol.2002；766147)，但用該方法可能低估了CD8+細胞毒性T細胞真正的前體頻率。對CD4+特異性T細胞的前體頻率分析進行的多項研究已經提供了一些指示。已有報道，通過基于響應抗原刺激的細胞因子離體分泌的ELISPOT測定，MS中CD4+MBP反應性T細胞的頻率范圍為4×10-5，這高于通過本文所用半有限稀釋法測定的1-2×10-6。然而，在該項研究中，EILSPOT并不適用于定量檢測CD8+T細胞，因為即使CD8+T細胞和CD4+T細胞經過照射，γ-IFN離體分泌源也不能區(qū)別CD8+T細胞和CD4+T細胞。在該項研究中，進一步的表征已證明識別MBP源性肽的這些CD8+T細胞本質上是細胞毒性的。如涉及用HLA-A2和人MBP基因雙重轉染的COS細胞的一系列實驗所證明，它們識別經所述MBP肽脈沖處理和在I類MHC分子環(huán)境中內源加工MBP的兩種自體靶細胞，并且對其有細胞毒性。從CD8+細胞毒性T細胞在表達I類分子和MBP兩者的少突膠質細胞損傷中的可能作用來看，這一發(fā)現(xiàn)尤其重要。這些發(fā)現(xiàn)與Jurewicz及其同事的早期研究相一致，Jurewicz及其同事報道了CD8+MBP110- 118反應性T細胞對A2+人少突膠質細胞有特異性細胞毒性(Jurewicz等，J.Immunol.1998；160；3056)。本文所述的MBP源性肽反應性CD8+細胞毒性T細胞使人聯(lián)想到在EAE中具有相似功能特性、可能通過特異性識別少突膠質細胞及對其細胞毒活性能誘發(fā)廣泛CNS脫髓鞘的CD8+T細胞(Huseby等，J.Exp.Med.2001；194669)。
本申請包括以下實施例，以證明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領域技術人員應當認識到，以下實施例中所公開的技術代表了發(fā)明人所公開的、在本發(fā)明實施中有效的技術，因此可被認為構成了其優(yōu)選實施方式。然而，根據本申請公開的內容，本領域技術人員應當認識到，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，在所公開的具體實施方案中可作出許多改變，但仍可獲得同樣或類似的結果。
本發(fā)明有多個方面，可通過以下非限制性實施例來加以闡明。
實施例實施例1對HLA-A2和HLA-A24受體具有高結合親和性的MBP片段的鑒定采用TEPITOPE(Vaccinome website)-一項允許鑒定I類HLA配體結合表位的應用(Schroers等，Cancer Res.2002；622600；Engelhard Annu.Rev.Immunol.1994；12181；Manici等，J.Exp.Med.1999；189871)，篩選人髓鞘堿性蛋白(MBP)中能與HLA-A2和HLA-A24結合的片段的氨基酸序列。鑒定出具有預測HLA-A2結合序列(1％閾值)的兩個片段和具有預測HLA-A24結合序列(1％閾值)的兩個片段。這些片段的氨基酸序列如下
然后用Mayfield法合成具有SEQ ID NO1-4的肽，并且用HPLC純化(MD Anderson Cancer Center Peptide Core，Houston，TX)。所述肽的純度高于90％。
實施例2MS患者和健康對照中識別MBP源性肽的CD8+T細胞的前體頻率分析本項研究中包括15位復發(fā)緩解性或繼發(fā)進行性MS(Poser等，Ann Neurol.，13(3)227-31，1983)患者?；颊咴谶M入本項研究之前至少有3個月未用免疫抑制藥或免疫調節(jié)藥(如硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、β干擾素或醋酸格拉默)治療。該方案得到Baylor College of Medicine的Institutional Review Board批準。包括一組15位年齡和性別與MS組匹配的健康受試者作為對照。MS患者和對照受試者的臨床特征/人口統(tǒng)計數據以及HLA-A2和HLA-A24表型示于表1。
用半有限稀釋法(Ota等，Nature 1990；346183；Zhang等，J.Exp.Med.1994；179973)估計MS患者和對照中識別具有SEQ ID NO；1-4的所選MBP肽的T細胞前體頻率。檢測未分級分離外周血單核細胞中對MBP肽的CD8+T細胞應答的初步嘗試，得到低頻率的混合CD4+和CD8+表型的特異性T細胞分離物。隨后通過預先去除CD4+T細胞，對檢測MBP源性肽反應性CD8+T細胞的方法加以改進。用下述方法達到了所述去除。
通過Ficoll分離，從MS患者和健康個體的外周血分離出外周血單核細胞(PBMC)。用與抗CD4抗體偶聯(lián)的磁珠(Dynal ASA，Oslo，Norway)，預先去除CD4+T細胞。簡言之，以10的磁珠與細胞之比，將PBMC與包被有抗體的磁珠一起在溫和振搖下孵育30分鐘。通過磁分離，收集未結合的PBMC級分。在所有情況下CD4+T細胞的去除率皆高于98％。經流式細胞術分析測定，所得的CD4去除級分通常含有72±8％的CD8+T細胞。圖1展示了一個代表性實驗。
然后將所得的PBMC級分以50,000細胞/孔的密度，與105自體未分級分離PBMC一起接種于96孔U型底微量滴定板中，所述自體未分級分離PBMC經過照射以便提供“輔助”功能的CD4+T細胞，但其自身不能對所述抗原應答而增殖。將具有SEQ ID NO；1-4的肽以20μg/ml的終濃度加入到培養(yǎng)物中。各種肽建立總共32孔。在前體頻率分析中包括對應于破傷風類毒素免疫顯性肽(殘基830-838)的合成肽作為陰性對照。細胞于37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。7天后，通過氚標胸苷摻入，測試所有培養(yǎng)物對所述對應肽的特異性增殖。簡言之，將各孔分成四個等份(每等份大約104細胞)，以兩份重復與105自體PBMC一起在有和無20μg/ml相應MBP源性肽存在下培養(yǎng)。將培養(yǎng)物保持3天，在培養(yǎng)的最后16小時期間，用1μCi/孔的[3H]-胸苷(Nycomed Amersham，Arlington Heights，IL)進行脈沖處理。然后用自動細胞收集器收集細胞，用betaplate計數器(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)測量[3H]-胸苷摻入。
當CPM高于1,500并超過參比CPM(在無所述肽存在下)至少3倍時，孔/培養(yǎng)物定義對所述肽特異性的。然后通過將陽性孔的數目除以原始培養(yǎng)物中接種的CD4去除PBMC的總數，估計特異性CD8+T細胞的頻率。
如圖2所示，結果揭示在獲自MS患者的CD4+T細胞去除PBMC中，識別MBP源性肽的CD8+T細胞的平均前體頻率估計為3.4-5.4×10-7，這大大高于對照受試者的該頻率(1.1-2.1×10-7)，尤其是對MBP111-119和MBP87-95(p＜0.05)而言。相比之下，識別回憶抗原(recallantigen)-破傷風類毒素免疫顯性表位(殘基830-838)的CD8+T細胞頻率在MS患者和健康對照之間并無顯著差異(圖2)。
實施例3所產生的CD8+T細胞系的表型分析對實施例2中所產生的一組39個CD8+T細胞系的表型表達、細胞因子分布型和對自體靶細胞的特異性細胞毒活性進行表征。該組包括來自MS患者的25個T細胞系和來自健康對照的14個T細胞系，代表對所有四種MBP源性肽的反應性(表2)。
為了分析表型表達，各T細胞系的105細胞在含1％FBS和0.1％疊氮鈉的PBS(FBS-PBS)中洗滌，重懸于100μl含1∶100稀釋的熒光染料標記抗體(Simultest CD4/CD8，CD45RA/CD45RO，TCRα/β/TCRγ/δ，Becton Dikinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)、或者適當Ig同種型對照(γ2aFITC/γ1-PE，Becton DickinsonImmunocytometry Systems)的FBS-PBS中。在冰上孵育30分鐘后，細胞用FBS-PBS洗滌3次，在1％甲醛中固定，以供流式細胞術分析用。
發(fā)現(xiàn)所選CD8+T細胞系表達TCRαβ/CD8(平均＞95％)，但不表達CD4(＜5％)，表達CD45RO，但不表達CD45RA，這與其對各種MBP源性肽的反應性無關。所述發(fā)現(xiàn)表明，所選T細胞系屬于CD8+記憶T細胞亞群。
實施例4CD8+T細胞的細胞因子產生對所得CD8+T細胞系的細胞因子分布型進行分析，以確定它們屬于Th1亞群，還是屬于Th2亞群。首先用經相應MBP肽脈沖處理的自體APC攻擊所選T細胞系(n＝39)。用ELISA試劑盒(PharMingen，San Diego，CA)定量測定細胞因子分布型。微量滴定板(96孔，NUNCMaxisorp)用1μg/孔抗人細胞因子(IL-4、IL-10、TNF-α、γ-IFN)(PharMingen)的純化小鼠捕獲單克隆抗體于4℃包被過夜。洗滌板，非特異性結合部位用10％(w/v)胎牛血清(FBS)飽和1小時，隨后洗滌。用PBS稀釋上清液和細胞因子標準品，一式兩份加入孔中。將板于37℃孵育2小時，隨后用PBS-T洗滌。向各孔中加入匹配的生物素化檢測抗體，于室溫孵育2小時。洗滌后，加入抗生物素蛋白綴合的辣根過氧化物酶，將板孵育1小時。用3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB，Sigma)作為底物進行顯色。用ELISA讀取器(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)測定450nm的光密度，利用雙重8點標準曲線(a double eight-point standard curve)，通過Microplate計算機軟件(Bio-Rad)定量細胞因子的濃度。
如圖5所示，識別所述MBP源性肽的所選CD8+T細胞系主要產生TNF-α和IFN-γ，但不產生IL-4和IL-10，因此屬于Th1表型。在MS源T細胞系和來源于對照受試者的T細胞系之間未見顯著的定量差異。
實施例5從代表性T細胞系建立克隆根據對所示四種MBP肽的識別選擇四個代表性T細胞系(E11、D10、B9和F12)，進一步通過有限稀釋來克隆。簡言之，將T細胞以1個細胞/孔在有限稀釋條件下，在經照射PBMC(100,000細胞/孔)和2μg/ml植物凝集素-蛋白(PHA-P)存在下，接種于96孔U型底板中。細胞在含IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-12天，每3-4天更換培養(yǎng)基。根據CD8的表型表達和對對應肽的反應性證實生長陽性孔。所得T細胞克隆通過用相應的MBP肽和PHA-P在自體APC存在下交替刺激進行進一步擴增。
兩個這樣克隆的CD8+T細胞系在HLA-A2環(huán)境下分別識別MBP111-119肽(E11)(SEQ ID NO2)和MBP87-95肽(SEQ ID NO1)，而其它兩個CD8+T細胞系為A24限制性的，與MBP134-142肽(B9)(SEQID NO3)和MBP14-22肽(F12)(SEQ ID NO4)反應。圖3描述了上述四個克隆T細胞系的代表性表型表達。
然后檢查HLA-A2四聚體與所選CD8+T細胞系的特異性結合。HLA-A2-MBP111-119四聚體得自Immunomics(San Diego，CA)。如圖4所示，HLA-A2/MBP111-119四聚體對識別MBP111-119肽的CD8+T細胞系(E11)顯示出高于90％的特異性結合，但不結合識別MBP87-95肽的A2+CD8+T細胞系(D10)。
實施例6MBP反應性CD8+T細胞克隆對自體細胞的細胞毒性分析所有39個所選CD8+T細胞系對自體靶細胞的細胞毒活性。為此，用先前已有描述的方法(Zhang等，J.Neuroimmunol.1989；23；249；Tejada-Simon等，Immunology 2002；107；403)，周EBV轉化從患者和對照中產生一組自體B細胞系。所產生的細胞系用相應的MBP肽脈沖處理，用作自體靶細胞。通過將細胞分別與MBP源性肽或對照T細胞受體肽(40μg/ml)一起孵育2小時，然后洗滌以除去游離肽，進行B細胞的脈沖處理。
用乳酸脫氫酶(LDH)釋放測定(Promega Madison，WI)進行細胞毒性試驗。用酶測定法，按照生產商的說明，測定LDH的釋放。簡言之，將CD8+T細胞(50,000效應細胞/孔)與自體細胞一起孵育，效應物與靶之比為10，以250×g離心一次。未經脈沖處理的自體B細胞和非轉染體用作對照。在整個測定中使用無酚紅的RPMI1640，以避免背景吸附。于37℃、5％CO2孵育4小時后，將板再次離心。將50μl上清液轉移到另一塊板上，與測試試劑盒中所提供的Substrate Mix混合。30分鐘后終止反應，讀取490nm吸光度。按下述公式計算特異性細胞毒性％細胞毒性＝(實驗釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)×100。
結果表明21/25(84％)的MS源CD8+T細胞系和11/15(73％)的對照源CD8+T細胞系顯示出對對應肽脈沖處理的自體靶細胞有特異性細胞毒性效應，但對未經脈沖處理或用不相關肽脈沖處理的相同自體靶細胞沒有特異性細胞毒性效應，特異性細胞毒性效應定義為特異性裂解高于30％。然而，在MS源CD8+T細胞系和對照CD8+T細胞系之間未見特異性裂解百分比有顯著性差異。用來源于三位MS患者的四個所選T細胞系進行的代表性實驗示于圖6。
此外，所觀測到的細胞毒性效應受I類MHC分子限制，因為加入抗I類MHC分子的單克隆抗體(W6/32)可抑制該細胞毒性，而抗II類MHC分子的抗體(HB55)沒有效應(圖7)。對于這些MHC限制實驗，在上述細胞毒性測定中效應細胞與靶細胞的孵育中，加入(20μg/ml)的純化抗I類MHC單克隆抗體(W6/32)或抗II類MHC單克隆抗體(HB55)。
實施例7MBP反應性CD8+T細胞克隆對表達加工MBP和I類MHC分子的細胞的細胞毒性重要的是鑒別所選CD8+T細胞對表達I類MHC分子和內源加工MBP兩者的少突膠質細胞是否有細胞毒性效應。為了解決這一問題，開發(fā)了以下試驗。按照該試驗，用HLA-A2*01基因和人MBP基因轉染COS細胞。具體而言，將編碼人MBP和人HLA-A2的cDNA構建到含有兩個啟動子(PCMV啟動子和PEF-α1啟動子)的pBud CE4.1載體中。用LipoAfectAMINE 2000(Invitrogen，San Diego，CA)將重組DNA轉染到COS-7細胞中。用含有400μg/ml Zeocin(Invitrogen，San Diego，CA)的選擇性培養(yǎng)基選擇穩(wěn)定轉染體。通過將細胞與抗MBP(Sigma，St.Louise，MO)或HLA-A2(BD Pharmingen，San Diego，CA)的綴合單克隆抗體一起孵育，評估MBP和HLA-A2的穩(wěn)定表達，隨后通過流式細胞術進行分析。
在細胞毒性實驗中，用轉染的COS細胞分析對肽脈沖處理自體靶細胞有細胞毒性的所選MS源CD8+T細胞系。兩個HLA-A2+CD8+T細胞系(E11和D10)對A2-MBP轉染的COS細胞表現(xiàn)出特異性細胞毒性，但對非轉染體無特異性細胞毒性，而其它A24限制的CD8+細胞毒性T細胞系(B9和F12)對轉染COS細胞無細胞毒性效應。有關四個代表性CD8+T細胞系的結果示于圖8，其表明了對表達人MBP和HLA-A2兩者的靶細胞的特異性識別和細胞毒性。
表1.MS患者和健康個體的臨床特征和HLA-A2和A-24表型
RR，復發(fā)緩解性MS；SP，繼發(fā)進行性MS；EDSS，擴展殘疾狀態(tài)等級評分(expanded disability scale score)。通過RT-PCR，用A*0201和A*2402特異性引物確定HLA分型。
表2.用于進一步表征用的所選CD8+T細胞系的特征
序列表<110>貝勒醫(yī)學院(Baylor College of Medicine)<120>用于增強CD8+細胞毒性T細胞應答和用于治療多發(fā)性硬化的方法<130>05627.0010.00PC00<140>尚未得到<141>
<150>US 60/512,212<151>2003-10-17<160>5<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>9<212>PRT<213>合成序列<400>1Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>合成序列<400>2Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>合成序列<400>3
Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>合成序列<400>4Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>合成序列<400>5Ser Thr Arg Gln Gly Pro Gln Glu Thr1 權利要求
1.用于治療多發(fā)性硬化的自體T細胞疫苗的制備方法，包括(a)提供外周血單核細胞群體，其包含來自待用該疫苗治療的患者的T細胞；(b)減少CD4+T細胞群體；(c)加入MS相關抗原，任選加入抗原呈遞細胞；和(d)重復步驟(c)一次或多次。
2.權利要求1的方法，其中所述MS相關抗原選自髓鞘堿性蛋白、蛋白脂質蛋白、髓鞘少突膠質細胞糖蛋白及其組合。
3.權利要求1的方法，其中所述MS相關抗原含有SEQ ID NO1-4所示的任一序列。
4.權利要求1的方法，其中所述MS相關抗原含有MBP的氨基酸83-99或151-170。
5.權利要求1的方法，其中步驟(c)還包括加入IL-2。
6.權利要求1的方法，其中步驟(c)還包括加入促分裂原。
7.權利要求6的方法，其中所述促分裂原選自植物凝集素、伴刀豆球蛋白A、美洲商陸促分裂原和抗CD3的單克隆抗體。
8.一種自體T細胞疫苗，其用權利要求1-7任一項的方法制備。
9.治療多發(fā)性硬化的方法，包括給予有需要的患者權利要求8的自體T細胞疫苗。
10.一種自體T細胞疫苗，其包含經富集的MS相關抗原反應性CD8+T細胞群體。
11.權利要求10的疫苗，其中CD4+T細胞群體被減少。
12.權利要求10的疫苗，其中所述MS相關抗原選自髓鞘堿性蛋白、蛋白脂質蛋白和髓鞘少突膠質細胞糖蛋白。
13.權利要求10的疫苗，其中所述MS相關抗原含有SEQ ID NO1-4所示的任一序列。
14.權利要求10的疫苗，其中所述MS相關抗原含有MBP的氨基酸83-99或151-170。
全文摘要
本發(fā)明總的來講涉及自身免疫和自體疫苗開發(fā)領域。更具體而言，本發(fā)明涉及通過用髓鞘堿性蛋白(MBP)片段活化的自體CD8
文檔編號A61K39/00GK1893971SQ200480037232
公開日2007年1月10日 申請日期2004年10月18日 優(yōu)先權日2003年10月17日
發(fā)明者Y·C·Q·臧 申請人:貝勒醫(yī)學院