專利名稱：四氧化三鐵磁流體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種磁流體，尤其涉及一種具有超順磁性的四氧化三鐵磁流體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磁流體(Magnetic fluid)是磁性納米粒高度分散于液相載體中而構(gòu)成的一種高穩(wěn)定性的膠體溶液。由磁性納米粒、分散劑和基液三部分組成。由于其具有強磁性又具有流動性，具有一系列的優(yōu)異性能，使其得到越來越廣泛的應(yīng)用。
用于制備磁流體的磁性材料通常有鐵氧體類材料，如γ-Fe2O3、MeFe2O4(Me＝Co、Mn、Ni)、Fe3O4等，此類材料是研究開發(fā)最早也是應(yīng)用最廣泛的一類。還有金屬類，如Fe、Co、Ni及其合金等，其磁化強度比一般的鐵氧體要高，但是，穩(wěn)定性較差，容易發(fā)生氧化變質(zhì)，導(dǎo)致磁流體的磁性能下降。為了制備磁性和穩(wěn)定性均好的磁流體，現(xiàn)在人們又開始研究氮化鐵、硼化鐵類磁性材料。
鐵氧體磁流體中，F(xiàn)e3O4是一種磁性強、制備相對簡單、毒性低、生物相容性較好的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用的磁性載體材料。例如，以氧化鐵納米粒為基礎(chǔ)的磁共振成像(MRI)技術(shù)已經(jīng)批準用在人身上。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如在細胞分離、固定化酶、磁靶向給藥系統(tǒng)、核磁共振(NMR)造影劑、腫瘤的診斷與治療等方面應(yīng)用廣泛。例如，2000年，世界第一臺磁流體熱療系統(tǒng)(MFH)在德國柏林夏里特醫(yī)療中心投入應(yīng)用。
分散劑的使用一般按照基液的性質(zhì)來選用，這類活性劑具有特殊的分子結(jié)構(gòu)一端有一個對磁性納米粒高度結(jié)合的功能團，另一端還有一個極易分散到基液中的功能團。如制備油基磁流體，可選用油酸或亞油酸等。如制備水基磁流體，可選用飽和一元羧酸或者一些水溶性高分子。常用的高分子材料如右旋糖苷、淀粉、白蛋白、PEG等。
海藻酸鈉是海藻酸的鈉鹽。海藻酸是海洋植物藻類中所含有的一種以糖醛酸為主鏈的多糖，由D-甘露糖醛酸(M)和L-古洛糖醛酸(G)組成的線型高分子。海藻酸鈉溶于水形成粘稠的膠體溶液，不溶于乙醇和其它有機溶劑。海藻酸鈉膠體溶液遇酸會析出凝膠狀沉淀的海藻酸，遇銅、鈣、鐵、鉛等多價金屬離子(鎂離子除外)則形成凝膠體。含高G基團的海藻酸鈉形成的凝膠強度要比含高M基團的大，因為G基團比M基團對二價離子有更強的親和力。另外海藻酸鈉還可以與聚陽離子如殼聚糖，多肽如聚賴氨酸形成復(fù)合物，這些物質(zhì)在鈣離子的存在下不溶解，同時用來穩(wěn)定凝膠并減少海藻酸鈣的孔隙率。該材料穩(wěn)定、無毒、生物可降解、生物相容性好。在藥學(xué)，化妝品學(xué)和食品方面應(yīng)用廣泛。因為海藻酸鈉和二價離子的交聯(lián)，是在相對比較溫和的條件下進行的，并且，不需要使用有機溶劑。所以，在藥學(xué)方面，經(jīng)常用作DNA、蛋白質(zhì)、多糖和細胞的優(yōu)良載體。
文獻報道利用海藻酸鈉制備γ-Fe2O3超順磁性納米粒。通過海藻酸鈉和亞鐵離子生成海藻酸亞鐵，然后，利用O2或H2O2氧化亞鐵離子成γ-Fe2O3，從而生成海藻酸鈉包裹的γ-Fe2O3超順磁性納米粒。此方法需要循環(huán)多次，并且飽和磁化強度為30emu/g，是塊狀四氧化三鐵(飽和磁化強度92emu/g)的三分之一。
鐵氧體磁流體的制備方法有多種，如機械研磨法、化學(xué)共沉淀法、溶膠—凝膠法、超聲化學(xué)法、微乳法、化學(xué)蒸發(fā)濃縮法等。其中，化學(xué)共沉淀法是最常用的制備方法，此方法的優(yōu)點是制備工藝相對比較簡單，并且磁性納米粒具有好的晶形和良好的磁性性質(zhì)。
目前，已有一部分Fe3O4磁流體進入臨床或已經(jīng)上市，通常采用右旋糖苷包裹氧化鐵，使磁流體穩(wěn)定。在臨床上，主要用做各類肝臟特異性磁共振對比劑。根據(jù)顆粒大小分為兩大類，第一類超順磁性氧化鐵(superparamagneticiron oxide，SPIO)，一般直徑30-1000nm。例如Advanced Magnetics公司的AMI-25(Ferumoxides，商品名feridex)，其平均直徑80nm，氧化鐵晶體核心直徑20nm；Schering公司-的Shu555A(Resovist又名Ferucarbotran)，其平均直徑60nm。第二類超小型超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic ironoxide，USPIO)，最大直徑小于30nm。例如Advanced Magnetics公司的AMI-227(Ferumoxtran)，平均直徑20nm，氧化鐵直徑4-6nm)；Nycomed公司的FeO-BPA等。超順磁性氧化鐵是一種網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對比劑，可用于肝、脾、淋巴結(jié)、骨髓等富含網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞的組織和器官的增強。顆粒大小對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬能力影響很大，一般直徑較大的SPIO主要蓄積在肝和脾，而USPIO因其顆粒小，在淋巴結(jié)和骨髓的蓄積多于肝脾。這些磁共振對比劑要求氧化鐵粒徑比較小，對磁性性質(zhì)要求比較低。
這些Fe3O4磁流體均不同程度的存在著穩(wěn)定性較差，磁性低等缺陷，從而限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的穩(wěn)定性好，磁性高的超順磁性四氧化三鐵磁流體。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種四氧化三鐵磁流體，主要由下述重量份的組分組成粒徑在5nm-15nm的四氧化三鐵2～5份、海藻酸鈉5～8份。
優(yōu)選為粒徑在5nm-10nm的四氧化三鐵3～4份、海藻酸鈉6～7份。
更優(yōu)選為粒徑在5nm-10nm的四氧化三鐵3.5份、海藻酸鈉6.5份。
所述的海藻酸鈉優(yōu)選為濃度為1％～5％的海藻酸鈉。
上述的海藻酸鈉—四氧化三鐵磁流體，還可以含有任一下述重量份的活性組分抗腫瘤藥物、抗血管發(fā)生藥物、抗病毒藥物、抗細菌藥物、抗炎藥物，其中，藥物的載藥量為0.5～4重量份，藥物的包封率為20％～90％，藥物的包封率是指制劑中含有的藥物重量與制備過程中加入的藥物重量的比值。
優(yōu)選為抗腫瘤藥物。
更優(yōu)選為下述抗腫瘤藥物阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、順鉑、環(huán)磷酰胺、長春堿、長春新堿、喜樹堿、紫杉醇或其組合。其中，藥物的載藥量為1～4重量份，藥物的包封率為30％～90％。
本發(fā)明所用到的所有原料均可從普通生物試劑公司或化學(xué)試劑公司購買得到，其中海藻酸鈉為藥用級，其它化學(xué)試劑均為分析純。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供一種載藥超順磁性的四氧化三鐵磁流體的制備方法。
一種載藥超順磁性四氧化三鐵磁流體的制備方法，包括以下步驟1)、在氮氣保護、化學(xué)平衡方法保護或真空條件下把堿液加入到鐵離子與亞鐵離子的摩爾比為2∶1～1∶1的鐵鹽/亞鐵鹽混合溶液中或者把鐵離子與亞鐵離子的摩爾比為2∶1～1∶1的鐵鹽/亞鐵鹽的混合溶液加入到堿液中，使混懸液的pH為5～8，攪拌備用，2)、將海藻酸鈉加入到步驟1)所得的混懸液中，繼續(xù)攪拌、超聲、透析、離心后取上清備用，3)、將步驟2)所得到的上清液用蒸餾水稀釋后加入活性藥物獲得載藥的超順磁性海藻酸鈉—四氧化三鐵磁流體；或者將步驟2)所得到的上清液真空干燥后再用蒸餾水溶解，最后加入活性藥物獲得載藥的超順磁性海藻酸鈉—四氧化三鐵磁流體，5)、將未結(jié)合的藥物與載藥海藻酸鈉—四氧化三鐵磁流體分離，最后將載藥海藻酸鈉—四氧化三鐵磁流體干燥即得。
上述制備過程中，步驟1)中所述的堿液可以是無機物(例如，氫氧化鈉，氫氧化鉀，或氨水)或者是有機物(四甲基氫氧化氨)，其堿液的用量取決于許多因素，包括溶液的pH，分散劑的性質(zhì)，磁響應(yīng)材料的性質(zhì)等，選擇堿液的量最好使混懸液的pH在5～8。
步驟1)中可以把堿液加到鐵鹽/亞鐵鹽的混合溶液中，也可以把鐵鹽/亞鐵鹽的混合溶液加入到堿液中，優(yōu)選為把堿液加到鐵鹽/亞鐵鹽的混合溶液中，上述的鐵鹽/亞鐵鹽的混合溶液中鐵離子與亞鐵離子的摩爾比優(yōu)選4∶3。
步驟1)中需要采取一定的措施來防止亞鐵離子(Fe2+)氧化成鐵離子(Fe3+)，這些措施可以是氮氣保護，化學(xué)平衡方法，抽真空等方法，以降低氧氣含量或者保持無氧環(huán)境。
步驟2)中可以利用物理方法來控制粒子的聚集，例如超聲法。
步驟2)中所述的分散劑包括海藻酸鈉、水溶性多糖[例如葡聚糖類直鏈淀粉，支鏈淀粉(包括大分子糊精)]、糖原、蔗糖、明膠、右旋糖苷，優(yōu)選為海藻酸鈉。海藻酸鈉有化學(xué)純、食品級、藥用級，優(yōu)選為藥用級。海藻酸鈉的重量濃度在1％～5％。海藻酸鈉的分子量可以在10,000～600,000，優(yōu)選為30,000～50,000。若選用其他規(guī)格，處方中海藻酸鈉的濃度和比例進行調(diào)整。
分散劑的用量取決于所選擇的磁響應(yīng)材料，分散劑的臨界膠束濃度(如果形成膠束)，親水親油平衡值(HLB)，分散劑的熔點，水溶性，水溶液的表面張力等。在保證磁流體的穩(wěn)定性較好的條件下，磁流體干燥后，分散劑質(zhì)量百分比在5％～80％較好，20％～70％更好。
步驟3)所述的活性藥物選自抗腫瘤藥物、抗血管發(fā)生藥物、抗病毒藥物、抗細菌藥物或抗炎藥物，其中的抗腫瘤藥物為阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、順鉑、環(huán)磷酰胺、長春堿、長春新堿、喜樹堿、紫杉醇，或其組合。這些藥物大部分結(jié)構(gòu)中都含有氨基，而且，海藻酸鈉是一種高分子電解質(zhì)，含有羧基。海藻酸鈉的羧基和藥物的氨基可以通過正負電荷作用結(jié)合，另外，藥物還可以通過物理吸附，范德華力，黏附力等作用力與海藻酸鈉結(jié)合。所以，藥物的載藥量和包封率相對比較高。藥物的載藥量為1～4重量份，藥物的包封率為30％～90％。
步驟3)所加入的藥物的濃度和用量取決磁流體的稀釋倍數(shù)以及用量。將超順磁性氧化鐵磁流體稀釋5倍～70倍后加入藥物形成載藥的超順磁性海藻酸鈉—氧化鐵磁流體。
步驟3)中將磁流體干燥成固體，這樣可以防止氧化鐵的氧化，防止其磁性降低。另外，海藻酸鈉是水溶性的生物相容性多糖，在其水溶液中，海藻酸鈉容易發(fā)生降解，并且易長菌。所以，將磁流體干燥成固體。
步驟3)中可以將干燥后的磁流體固體，用一定體積的蒸餾水重新分散，然后加入藥物形成載藥的超順磁性海藻酸鈉—氧化鐵磁流體。
步驟4)中可以采用密度梯度離心法、Sephadex G-50柱分離、透析、磁鐵分離、超濾濃縮等分離方法將將未結(jié)合的藥物和結(jié)合的藥物分離開來，優(yōu)選密度梯度離心法和5000Gs的磁鐵進行吸引分離；對載藥磁性納米粒進行干燥的方法優(yōu)選冷凍干燥法。
本發(fā)明所制備的四氧化三鐵磁流體具有超順磁性，且穩(wěn)定性好，磁性高，加入活性藥物后可制備成載藥海藻酸鈉—四氧化三鐵磁流體。本發(fā)明磁流體用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域時，可以保證磁流體的正常代謝和消除。本發(fā)明海藻酸鈉—四氧化三鐵磁流體可應(yīng)用于以下的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域(1)磁靶向給藥系統(tǒng)將本發(fā)明載藥磁性納米粒在外磁場引導(dǎo)下通過靜脈，動脈或口服給藥或直接注射等途徑選擇性到達并定位于腫瘤靶部位，藥物以受控的方式釋放，然后在腫瘤組織細胞或亞細胞水平發(fā)揮藥效作用。而對正常組織無影響或影響較小。載藥磁性納米粒在磁性的導(dǎo)向作用下形成物理靶向，可以避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬。具有減少給藥劑量，延長藥物的作用時間，提高藥效，降低副作用的優(yōu)點。已經(jīng)證實磁靶向過程是血管內(nèi)血流對納米粒產(chǎn)生的力和磁鐵對納米粒產(chǎn)生的磁力之間的競爭過程。
(2)熱療將腫瘤部位加熱到41度-46度以上，治療惡性腫瘤的方法稱熱療。磁介導(dǎo)熱療具有靶向性，在外加磁場或植入內(nèi)部誘導(dǎo)磁場(如刺入人體內(nèi)的小磁針)把磁粒子吸引聚集到病灶部位，然后外加交變電磁場，納米粒在交變磁場的作用下吸收電磁波能量，發(fā)生振動運動，產(chǎn)生熱量，磁性納米粒的熱傳導(dǎo)到腫瘤細胞以達到治療目的，并且對非病灶部位的細胞沒有損傷。另外可以重復(fù)熱療，只要磁性納米粒在靶部位停留，就可以反復(fù)熱療。
(3)栓塞本發(fā)明磁性納米粒還具有栓塞的作用?？梢允褂么帕黧w進行動脈栓塞，磁流體直接注射到病人的血液中或者直接注射到腫瘤部位，在外加磁場控制下，磁性納米粒很快將毛細血管阻斷，從而阻斷血液供應(yīng)，引起腫瘤細胞的死亡。而在撤走外加磁場后栓塞迅速消除，整個治療過程沒有抗癌藥物的介入。已經(jīng)證實，磁流體的這種栓塞能夠有效阻止血紅細胞的傳輸，從而達到“斷氧”的目的，這是一種純物理的治療方法。
(4)核磁共振(NMR)造影劑核磁共振成像時，需要將順磁性造影劑注入患者體內(nèi)，以便強化正常組織與病灶組織的影像對照。目前使用的造影劑都是一些順磁性或高順磁性的鹽(如硫酸亞鐵等)。而磁流體具有超順磁性，其磁化率是順磁性物質(zhì)的磁化率的1000倍以上，這些磁性材料累積在靶器官或組織，這些超順磁流體通過降低T2導(dǎo)致在圖象中增強對比度而使NMR圖像清晰。例如，不正常的肝組織，腫瘤缺乏吸收這些磁性材料的能力，與使用造影劑的正常組織背景相比顯得較亮。本發(fā)明的海藻酸鈉—氧化鐵磁流體具有超順磁性，并且磁化強度較高，因此，可以作為核磁共振造影劑。
(5)X-射線造影劑目前廣泛應(yīng)用的X-射線硫酸鋇造影劑有一些缺點，如引入重金屬鋇，不易于排泄；服用量大，不易在病灶部位定向粘附；不易于長時間反復(fù)診斷同一病灶；生物相容性差。而本發(fā)明磁流體可以克服這些缺點。本發(fā)明鐵氧體磁流體不但磁性性質(zhì)好，X-射線吸收性也好，并且在胃液中極少溶解。無毒，生物相容性好，用量少，磁性納米粒表面包裹的生物相容的海藻酸鈉易于附著在生物組織上又易于洗脫，且生物降解，同時，在外磁場引導(dǎo)下可以進行精密觀測。


圖1本發(fā)明四氧化三鐵磁流體的X-RD。
圖2本發(fā)明四氧化三鐵磁流體的TEM照片。
圖3本發(fā)明四氧化三鐵磁流體的紅外光譜。
圖4本發(fā)明四氧化三鐵磁流體在0-10,000Oe的磁滯回線。
圖5本發(fā)明四氧化三鐵磁流體在0-30,000Oe的磁化曲線。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例和試驗例具體說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例和試驗例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并非限定本發(fā)明的實質(zhì)。
四氧化三鐵超順磁性磁流體的制備在N2保護的條件下，分別精密量取0.8mol/L的的FeCl3水溶液和0.4mol/L的的FeCl2水溶液各25ml混合均勻，水浴60℃，將15ml 6mol/L的NaOH加入到上述鐵鹽混合溶液中，攪拌；將重量濃度為1％的海藻酸鈉溶液(海藻酸鈉的分子量100,000，購自ISP公司，藥用級)150ml加入到上述混懸液中繼續(xù)攪拌30min；將混合溶液置于80℃水浴中繼續(xù)攪拌1小時；將上述混懸液冷卻，超聲；將超聲后的混懸液進行透析，除去未反應(yīng)的離子；將透析后的混懸液進行離心，10,000rpm離心20min，取上清，即得海藻酸鈉—氧化鐵超順磁性磁流體。此磁流體比較穩(wěn)定，氧化鐵粒徑為10nm，并且被海藻酸鈉包裹，最大磁化強度為50emu/g，四氧化三鐵1.2g，海藻酸鈉1.2g。
四氧化三鐵的含量按照鄰二氮菲法進行測定。即將磁流體真空干燥得到磁流體固體，精密稱取一定量的磁流體固體用濃HCL進行酸化，然后按照鄰二氮菲法進行測定得出鐵離子的含量，根據(jù)鐵離子的含量轉(zhuǎn)換成四氧化三鐵的含量。海藻酸鈉的含量測定，因為該磁流體固體只含有四氧化三鐵和海藻酸鈉兩種成分，所以，用精密稱取的磁流體固體重量減去四氧化三鐵的重量即海藻酸鈉的重量。或用苯酚硫酸法測定海藻酸鈉的濃度。
四氧化三鐵超順磁性磁流體的制備在N2保護的條件下，分別精密量取0.8mol/L的的FeCl3水溶液和0.6mol/L的的FeCl2水溶液各25ml混合均勻，水浴60℃，將15ml 6mol/L的NaOH加入到上述鐵鹽混合溶液中，攪拌；將重量濃度為3％的海藻酸鈉溶液(海藻酸鈉分子量50,000)150ml加入到上述混懸液中繼續(xù)攪拌30min；將混合溶液置于80℃水浴中繼續(xù)攪拌1小時；將上述混懸液冷卻，超聲；將超聲后的混懸液進行透析，除去未反應(yīng)的離子；將透析后的混懸液進行離心，10,000rpm離心20min，取上清，即得海藻酸鈉—氧化鐵超順磁性磁流體。此磁流體比較穩(wěn)定，氧化鐵粒徑為8nm，并且被海藻酸鈉包裹，最大磁化強度為55emu/g。四氧化三鐵2g，海藻酸鈉3.6g。四氧化三鐵的含量和海藻酸鈉的含量測定方法同實施例1的方法。
四氧化三鐵超順磁性磁流體的制備在N2保護的條件下，分別精密量取0.8mol/L的的FeCl3水溶液和0.8mol/L的的FeCl2水溶液各25ml混合均勻，水浴60℃，將15ml 6mol/L的NaOH加入到上述鐵鹽混合溶液中，攪拌；將重量濃度為5％的海藻酸鈉溶液(海藻酸鈉分子量50,000)150ml加入到上述混懸液中繼續(xù)攪拌30min；將混合溶液置于80℃水浴中繼續(xù)攪拌1小時；將上述混懸液冷卻，超聲；將超聲后的混懸液進行透析，除去未反應(yīng)的離子；將透析后的混懸液進行離心，10,000rpm離心20min，取上清，即得海藻酸鈉—氧化鐵超順磁性磁流體。此磁流體比較穩(wěn)定，氧化鐵粒徑為5nm，并且被海藻酸鈉包裹，最大磁化強度為47emu/g。四氧化三鐵1.5g，海藻酸鈉6g。四氧化三鐵的含量和海藻酸鈉的含量測定方法同實施例1的方法。
載藥四氧化三鐵超順磁性磁流體的制備將實施例2所制備的海藻酸鈉—氧化鐵超順磁性磁流體稀釋25倍即取出1ml磁流體，用蒸餾水稀釋到25ml；向上述稀釋后的25ml磁流體中加入2ml4mg/ml的阿霉素水溶液，繼續(xù)攪拌30min；利用密度梯度法進行離心或5000Gs的磁鐵吸引分離，分離出載藥磁性納米粒，最后將載藥磁性納米粒進行凍干即得。阿霉素的載藥量為30％，含阿霉素6.72g，包封率為84％。阿霉素的含量測定采用高效液相色譜法(HPLC)色譜條件為色譜柱ODS C18(5μm，250mm×4.6mm)；流動相乙腈-水-三乙胺-磷酸＝28∶72∶1∶0.9(v/v/v/v)；流速1.0ml/min；檢測波長233nm；柱溫25℃[實施例5]載藥四氧化三鐵超順磁性磁流體的制備將實施例2所制備的海藻酸鈉—氧化鐵超順磁性磁流體進行真空干燥，得到磁流體的固體。精密稱取磁流體固體10mg，用蒸餾水分散并定容至25ml；向上述重新分散的磁流體中加入3ml 2mg/ml的甲氨喋呤水溶液，繼續(xù)攪拌30min；利用密度梯度法進行離心或5000Gs的磁鐵吸引分離，分離出載藥磁性納米粒，最后將載藥磁性納米粒進行凍干即得。甲氨喋呤的載藥量為25％，含甲氨喋呤2.5g，包封率為42％。甲氨喋呤的含量測定采用高效液相色譜法(HPLC)色譜條件為色譜柱ODS Hypersil(5μm，250mm×4.6mm)；流動相甲醇—乙腈—7％磷酸二氫鈉和1％枸櫞酸緩沖液＝2∶7∶91(v/v/v/v)；流速0.8mL/min；檢測波長313nm；柱溫25℃ 載藥四氧化三鐵超順磁性磁流體的制備將實施例2所制備的海藻酸鈉—氧化鐵超順磁性磁流體稀釋25倍即取出1ml磁流體，用蒸餾水稀釋到25ml；向上述稀釋后的25ml磁流體中加入3ml3mg/ml的喜樹堿水溶液，繼續(xù)攪拌30min；利用密度梯度法進行離心或5000Gs的磁鐵吸引分離，分離出載藥磁性納米粒，最后將載藥磁性納米粒進行凍干即得。喜樹堿的載藥量為35％，含喜樹堿7.84g，包封率為87％。喜樹堿的含量測定采用高效液相色譜法(HPLC)色譜條件為色譜柱YWG C18柱(10μm，250mm×4.6mm)；流動相甲醇-水＝45∶55(v/v)；流速1.0mL/min；檢測波長266nm；柱溫25℃。
本發(fā)明所制備的四氧化三鐵磁流體的性質(zhì)分析供試材料本發(fā)明實施例1所制備的樣品分析內(nèi)容1、粒子晶體結(jié)構(gòu)上述制備的樣品60℃真空干燥6小時。粒子的晶體結(jié)構(gòu)利用Philips APD-10型X射線衍射儀(X-RD)來表征。
粒徑和粒子形態(tài)使用JEM-1230型高分辨率透射電鏡(TEM)來測定粒子大小和粒子形態(tài)。樣品制備時，制備的磁流體用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)后，滴到銅網(wǎng)上，紅外烘干，透射電鏡進行觀察。
傅立葉紅外(FT-IR)分析采用溴化鉀壓片法測定Fe3O4和海藻酸鈉的作用。掃描范圍400cm-1-4000cm-1。樣品1，海藻酸鈉粉末(Alg)；樣品2，磁流體干燥后的片狀固體研磨成粉末(Fe3O4-Alg)；樣品3，純氧化鐵粉末(Fe3O4)。把3個樣品的IR光譜進行疊加。
磁性性質(zhì)精密稱取一定量的干燥粒子，室溫，利用Quantum DesignMPMSXL-7型超導(dǎo)量子干涉儀磁強計(SQUID)來測定粒子的磁化曲線。
圖1是磁性納米粒的X-RD。如圖1所示，2θ＝30.120、35.281、35.621、43.101、43.277、57.178、62.519、62.981、66.622和73.995的峰，其相對應(yīng)的強度分別為23.2、63.2、100.0、23.2、27.9、34.6、40.4、55.9、19.9和17.3，它們與FeFe2O4最相近。因此，該磁流體的組成為尖晶石型的磁鐵礦。用Scherrer公式D＝κλ/βcosθ計算，單個粒子的平均粒徑為4.4nm。
圖2是磁性納米粒的TEM照片。圖2所示，氧化鐵呈均勻且分散的顆粒，粒徑約為10nm。這比用X-RD得到的粒徑大。因為做X-RD時，由于小粒子的寬化效應(yīng)，另外樣品含有海藻酸鈉，X-RD衍射峰比較寬，所以用Scherrer公式計算時，β值增大。所以，計算出的值相對較小。
圖3是磁性納米粒，海藻酸鈉和磁鐵礦的紅外光譜。如圖3所示，在Fe3O4的IR譜圖中，572.75cm-1處有一個強的吸收峰，為其特征峰，3365cm-1和1620.92cm-1是因為存在微量水的原因而出現(xiàn)的0-H峰。但是，在Fe3O4-Alg IR譜圖中，在572.75cm-1處的特征峰消失。而且，F(xiàn)e3O4-Alg和Alg的IR譜圖的吸收峰很相近。Alg的IR譜圖中，1615.70cm-1是羧基負離子對稱伸縮振動峰，1418.20cm-1是羧基負離子不對稱伸縮振動峰。因此，F(xiàn)e3O4表面被海藻酸鈉包裹，從而掩蓋了Fe3O4的特征峰，而主要顯示出海藻酸鈉的吸收峰。
圖4是磁性納米粒在0-10,000Oe的磁滯回線。圖4所示，由磁滯回線可以看出，在磁場強度0Oe-10,000Oe，加磁場和退磁場的磁化曲線基本重合，剩磁(Mr)和磁矯頑力(Hc)均為零，因此，F(xiàn)e3O4具有超順磁性。因為對于Fe3O4磁性粒子，其在磁流體中的超順磁性臨界尺寸是10nm。磁滯回線所示，F(xiàn)e3O4具有超順磁性，所以，F(xiàn)e3O4的粒徑在10nm左右，這與TEM測得的粒徑大小是一致的。
圖5是磁性納米粒在0-30,000Oe的磁化曲線。圖5所示，隨著磁場強度的增加，磁化強度增加的幅度變小，當(dāng)磁場強度增加到30,000Oe時，F(xiàn)e3O4仍然沒有達到飽和，可能是因為氧化鐵被海藻酸鈉包裹。磁性納米粒作為一個單磁疇進行轉(zhuǎn)向時，受到海藻酸鈉的阻力，因此，雖然磁場強度已經(jīng)很大，所有磁疇也會因為阻力不能全部轉(zhuǎn)到一個方向，所以，即使在高場，磁性納米粒也沒有達到飽和。在10,000Oe時，F(xiàn)e3O4的磁化強度為50emu/g，可見，本方法制備出來的氧化鐵的磁性還是比較強的。
試驗例2本發(fā)明四氧化三鐵磁流體用于熱療一、供試藥物本發(fā)明實施例1所制備的樣品。
二、實驗動物健康成年家兔，2Kg，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物部提供。
三、試驗方法及結(jié)果將VX-2鱗狀癌細胞移植到兔后肢中，將載藥磁性納米粒用生理鹽水重新分散后，動脈注射該載藥磁性納米粒，在腫瘤部位外加磁場，采用高磁能級的稀土永磁鐵，主要是釹鐵硼，磁場強度為0.5-1T，磁性作用時間約為15-45min。在體外通以一定頻率的高頻交變磁場。通過部位組織學(xué)檢測和磁共振成像技術(shù)可以看到磁性納米粒在體內(nèi)的分布情況，以及在腫瘤內(nèi)磁性納米粒的聚集。實驗結(jié)果在外磁場作用下，可以完全消除腫瘤，并且沒有檢測到毒性。通過靶部位的組織學(xué)檢測和磁共振成像技術(shù)能看到腫瘤內(nèi)磁粒的聚集。
試驗例3本發(fā)明四氧化三鐵磁流體用于栓塞一、供試藥物本發(fā)明實施例2所制備的樣品。
二、實驗動物成年雜種犬，14Kg，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物部提供。
三、試驗方法及結(jié)果將雜種犬靜脈麻醉后固定于血管造影機操作臺上，經(jīng)皮穿刺股動脈插管至腎動脈，成功后進行常規(guī)造影，向右腎動脈推注四氧化三鐵磁流體10ml；然后，在外磁場作用下，磁場強度5000Gs，盡量靠近左腎臟，緩慢推注四氧化三鐵磁流體10ml至左腎動脈，保留磁場20min后撤離；栓塞后1小時造影復(fù)查兩側(cè)腎動脈，4小時后處死動物取兩腎做切片檢查。實驗結(jié)果栓塞后1小時造影復(fù)查，右腎動脈(無磁場)未見栓塞；左腎動脈(加磁場)分支明顯減少，小動脈，微動脈以及腎小球內(nèi)大量的氧化鐵顆粒聚集，腎實質(zhì)梗死。說明，在磁場作用下，四氧化三鐵磁流體可以導(dǎo)致明顯的腎動脈栓塞。
試驗例4本發(fā)明載藥四氧化三鐵磁流體用于磁靶向給藥系統(tǒng)一、供試藥物本發(fā)明實施例4所制備的樣品。
二、實驗動物純種Wistar大鼠，雄雌各半，300g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物部提供。
三、試驗方法及結(jié)果建立大鼠移植性肝癌模型，然后，肝動脈注射載藥磁流體，外加磁場，磁性強度為6000Gs，磁場作用時間30min；另外，肝動脈注射相同濃度的阿霉素的水溶液作為對照組。然后將治療前后的正常肝組織，肝癌組織染色切片進行組織結(jié)構(gòu)觀察，并且，采用高效液相色譜法分別測定阿霉素在大鼠肝臟的藥物含量。實驗結(jié)果注射載藥磁流體組，其肝癌周圍以及癌內(nèi)的肝動脈及門靜脈細小分支內(nèi)充滿磁性納米粒，官腔基本阻塞。而且，肝臟部位的阿霉素濃度是對照組濃度的10倍。所以，載藥磁流體可以提高靶部位的藥物濃度，從而，提高藥效，降低毒副反應(yīng)。
試驗例5本發(fā)明四氧化三鐵磁流體用于核磁共振照影劑一、供試藥物本發(fā)明實施例1所制備的樣品二、試驗方法及結(jié)果取一定量的磁性納米粒，經(jīng)100ml 5％葡萄糖注射液稀釋后，通過5μm的過濾管30min勻速靜脈滴注。注射完30min后進行核磁共振檢查，然后進行影像分析。實驗結(jié)果圖像清晰，可以定性的檢測出病變部位。
試驗例6本發(fā)明四氧化三鐵磁流體用于X-射線照影劑一、供試藥物本發(fā)明實施例1所制備的樣品。
二、試驗方法及結(jié)果按照“鋇餐”的操作方法對胃腸道進行造影，只是把硫酸鋇換成磁性納米粒。然后進行圖像分析。實驗結(jié)果通過分析照片，可準確的診斷胃腸道疾病。
上文描述的本發(fā)明的實例只是作為說明，該領(lǐng)域的技術(shù)人員都將認可或能夠確定與本文描述的特定方法等價的多種方法。所以這些等價方法都將被認為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種具有超順磁性的四氧化三鐵磁流體，其特征是主要由以下重量份的組分組成粒徑在5nm-15nm的四氧化三鐵2～5份、海藻酸鈉5～8份。
2.按照權(quán)利要求1的四氧化三鐵磁流體，其特征是各組分的重量份配比是粒徑在5nm-10nm的四氧化三鐵3～4份、海藻酸鈉6～7份。
3.按照權(quán)利要求2的四氧化三鐵磁流體，其特征是各組分的重量份是粒徑在5nm-10nm的四氧化三鐵3.5份、海藻酸鈉6.5份。
4.權(quán)利要求1、2或3的四氧化三鐵磁流體，其特征是所述的海藻酸鈉的分子量為10,000～600,000。
5.按照權(quán)利要求4的四氧化三鐵磁流體，其特征是所述的海藻酸鈉的分子量為30,000～50,000。
6.按照權(quán)利要求1的四氧化三鐵磁流體，其特征是還含有0.5～4重量份的抗腫瘤藥物，其中藥物的包封率為20％～90％。
7.按照權(quán)利要求6的四氧化三鐵磁流體，其特征是所述的抗腫瘤藥物為阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、順鉑、環(huán)磷酰胺、長春堿、長春新堿、喜樹堿、紫杉醇或其組合，其中藥物的重量份為1～4份、包封率為30％～90％。
8.一種具有超順磁性的四氧化三鐵磁流體的制備方法，包括以下步驟1)、在氮氣保護、化學(xué)平衡方法保護或真空條件下把堿液加入到鐵離子與亞鐵離子的摩爾比為2∶1～1∶1的鐵鹽/亞鐵鹽混合溶液中或者把鐵離子與亞鐵離子的摩爾比為2∶1～1∶1的鐵鹽/亞鐵鹽的混合溶液加入到堿液中，使混懸液的pH為5～8，攪拌備用，2)、將重量百分比濃度是1％～5％的海藻酸鈉加入到步驟1)所得的混懸液中，繼續(xù)攪拌、超聲、透析、離心后取上清備用，3)、將步驟2)所得到的上清液用蒸餾水稀釋后加入活性藥物獲得載藥的超順磁性海藻酸鈉—四氧化三鐵磁流體；或者將步驟2)所得到的上清液真空干燥后用蒸餾水分散，加入活性藥物獲得載藥的超順磁性海藻酸鈉—四氧化三鐵磁流體，4)、將未結(jié)合的藥物與載藥海藻酸鈉—四氧化三鐵磁流體分離，最后將載藥海藻酸鈉—四氧化三鐵磁流體干燥即得。
9.按照權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征是步驟1)中把堿液加入到鐵離子與亞鐵離子的摩爾比為4∶3的鐵鹽/亞鐵鹽混合溶液中；步驟2)中海藻酸鈉的分子量為10,000-50,000；步驟3)中將上清液稀釋5倍～70倍再加入活性藥物；步驟3)中將上清液在水浴條件下，真空干燥后用蒸餾水溶解后再加入活性藥物；步驟4)中采用密度梯度離心法或者利用5000Gs的磁鐵進行吸引將未結(jié)合的藥物與載藥四氧化三鐵磁流體分離，采用冷凍干燥方法將載藥四氧化三鐵磁流體干燥。
10.權(quán)利要求1～7所述的任一一項四氧化三鐵磁流體在制備磁靶向給藥藥物、熱療藥物、用作栓塞進行阻斷治療藥物、X-射線造影劑或核磁共振造影劑中的用涂。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的超順磁性磁流體，該磁流體由下述重量份組分組成四氧化三鐵2～5份、海藻酸鈉5～8份。該磁流體還可加入活性藥物進一步制備為載藥超順磁性磁流體。本發(fā)明載藥磁流體的制備方法為把堿液加入到鐵鹽/亞鐵鹽混合溶液中，攪拌后將海藻酸鈉加入到上述的混懸液中，繼續(xù)攪拌、超聲、透析、離心后取上清液，上清液即為磁流體，將上清液加入活性藥物，將未結(jié)合的藥物與磁流體分離，最后將載藥磁流體干燥即得；本發(fā)明磁流體可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域，尤其在以下領(lǐng)域磁靶向給藥系統(tǒng)、熱療、用作栓塞進行阻斷治療、X－射線造影、核磁共振造影等。
文檔編號A61K49/06GK1783363SQ20041009649
公開日2006年6月7日 申請日期2004年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月2日
發(fā)明者齊憲榮, 馬會利 申請人:北京大學(xué)