專利名稱：腺相關病毒載體制劑和含有該制劑的藥物組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種攜帶神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的腺相關病毒(adeno-associatedvirus，AAV)載體制劑，所述的制劑含有3-7％的甘露醇。另外，還涉及含有所述制劑和一種高滲溶液的藥物組合物，所述的高滲溶液誘導血腦屏障開放而使所述的病毒載體進入腦部感染、表達。本發(fā)明還涉及所述的制劑和/或藥物組合物在預防和治療阿爾茨海默氏病、帕金森氏病等中樞神經(jīng)元退行性疾病中的用途，所述的制劑和/或藥物組合物還可用于腦缺血損傷、腦外傷、腦手術創(chuàng)傷后減少神經(jīng)元死亡，促進腦功能恢復；以及用于幼兒宮內(nèi)窒息、難產(chǎn)等腦缺氧損傷后預防腦損傷性智力低下或腦發(fā)育不良。
背景技術：
包括阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(nerve system progressive degeneration diseases)，最主要的臨床表現(xiàn)之一就是學習、記憶能力下降。其原因為前腦基底部膽堿能神經(jīng)元出現(xiàn)萎縮、死亡，有可能是因為缺乏了從海馬和皮層來的營養(yǎng)如神經(jīng)生長因子(Nerve GrowthFactor，NGF)或其它神經(jīng)營養(yǎng)因子所致(Heftei F.，J Neurosci 1986；62155-2162；Tuszynski MH，Roberts J，Senut MC，et al.，Gene therapy 1996；3305-314；Smith DE，Roberts J，Gage FH，et al.，Pro Natl Acad Sci USA1999；9610893-10898.)。而NGF基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達可有效改善這些癥狀。因此，基因治療有可能成為解決以上問題的有效途徑。
人神經(jīng)生長因子(Human Nerve Growth Factorβ，hNGFβ)由于其特殊的生物學功能，自發(fā)現(xiàn)以來就倍受關注。雖然眾多動物研究證明在腦內(nèi)注射NGF蛋白后可保護膽堿能神經(jīng)元，但通過腦內(nèi)注射外源性NGF是極為困難和不方便的。另一方面NGF作為一大分子蛋白質，是無法在血液注射后通過腦血屏障而進入大腦發(fā)揮作用。因此，解決上述困難的一個措施是進行基因治療，即采用合適的載體系統(tǒng)將NGF基因導入至患者腦內(nèi)并表達，使機體本身變成一個生產(chǎn)NGF的“工廠”。
與蛋白治療的方法相比，NGF的基因治療具有明顯的優(yōu)勢第一，由于NGF在體內(nèi)產(chǎn)生，因此保持其高活性，并還可避免內(nèi)毒素等雜質的污染；第二，一次注射NGF的治療基因可使NGF在患者體內(nèi)長期穩(wěn)定表達，使患者容易忍受，并且大大降低了治療成本；第三，基因治療能夠使體內(nèi)NGF保持在一個較為恒定的水平，其藥物動力學和藥效學更加合理?；蛑委煹姆绞角∨c連續(xù)給藥的方式相類似，因此有可能不需要很高的表達量就能達到很好的療效。但由于血腦屏障的存在，在己進行的NGF基因治療研究中，多采用腦室內(nèi)立體定位注射攜帶NGF的病毒載體或體外轉導自體細胞的方式，其共同的缺點就是給藥途徑復雜，易引起腦部水腫等副作用，治療基因不能獲得長久穩(wěn)定的表達，并且使患者深感痛苦，致使臨床應用難以推廣。此外，蛋白載體介導的NGF導入方法，患者需每天給藥，不適合于慢性病的治療；而且目前對小分子所誘導腦內(nèi)生成NGF的藥物研究尚不成熟。
基因治療的成功有賴于治療基因、基因轉移系統(tǒng)和基因表達系統(tǒng)的完美結合。當治療基因確定后，如何選擇合適的基因轉移和表達載體、以及選用何種給藥途徑就顯得尤為重要。大量文獻資料表明促進藥物通過血腦屏障(Blood Brain Barrier，BBB)的無創(chuàng)傷方法主要有皮下植入貯器法、利用鼻腔輸送治療腦部疾病的藥物、血管活性物質、細菌葡萄糖肽、抗菌抗體、高滲透性開放BBB等血腦屏障開放方法(Neuwelt EA，Barnett PA，Hellstrom I，etal.，Cancer Res 1988；484725-4729；Sanovich E，Bartus RT，F(xiàn)riden PM，et al.，Brain Res 1995；705125-135；Spellerberg B，Prasad S，Cabellos C，et al.，J ExpMed 1995；1821037-1046；Tuomamen EI，Prasad SM，George JS，et al.，ProcNatl Acad Sci USA 1993；907824-7828；Pardridge WM.，2002；31753-1757)。其中高滲溶液在以上開放血腦屏障的方法中重現(xiàn)性好，所用BBB開放物質(如甘露醇)可逆安全地開放血腦屏障，并且重現(xiàn)性好，對病毒導入后的表達無潛在干擾，且容易獲得；BBB的開放及藥物轉運的增加主要取決于高滲溶液的濃度、注射時間和速度，相對容易控制，并且這種開放是有時間性和可逆性的。通過該方法可將大小為56±35nm的顆粒透過血腦屏障(Neuwelt EA，Weissleder R，Nilaver G，et al.，Neurosurgery 1994；34776-784)。
由于病毒具有對細胞具有天然的感染能力，其將外源基因導入細胞效率明顯高于其它系統(tǒng)，因此在基因治療采用載體一直占據(jù)主導地位。其中在已進行的約900個臨床方案和6000余個病例中，在已進行的約900余個基因治療臨床方案中，以病毒為載體的方案超過80％。除腺相關病毒載體以外，常用的基因治療用載體主要有逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、單純皰疹病毒載體。AAV作為基因治療載體的優(yōu)點如下(1)安全性好，未發(fā)現(xiàn)野生型AAV對人體致?。?2)宿主范圍廣，可轉導分裂細胞和非分裂細胞；(3)AAV的基因組僅4681bp便于用常規(guī)的重組DNA技術進行操作；(4)物理性質穩(wěn)定好，60℃不能被滅活，并能抵抗多種有機溶劑的處理；(5)能整合致宿主染色體，并長期穩(wěn)定的表達外源基因；(6)免疫原性弱。AAV作為基因治療載體的缺點如下(1)外源基因容量?。?2)病毒滴度較低；(3)建立高效率的包裝細胞體系難度大。
由于AAV是目前公認免疫源性最弱、最安全的病毒載體，對其的應用研究一直是基因治療領域關注的熱點，特別是一些目前沒有較好治療方案的遺傳病、慢性疾病治療領域關注的熱點。而從AAV載體的特性可以看出，在常用的基因治療病毒載體中，腺相關病毒載體是最小的一種，并且是現(xiàn)用載體中唯一的單鏈病毒，因此AAV在感染后必須先復制成雙鏈后才能進行轉錄、表達，而這些特性導致AAV的表達水平相對較低，表達高峰相對滯后。因此，針對相同的適應癥，要達到相同的治療效果，如果采用AAV病毒載體，就必須導入更多的病毒顆粒。
目前基于生物倫理學和生物安全性的角度考慮，基因治療一般多采用局部給藥，而非系統(tǒng)給藥，但由于組織結構及生物利用度等因素導致注射體積的限制，即使對是目前公認免疫源性最弱、最安全的AAV病毒載體，在給藥體積上同樣受到限制。因此，采用AAV載體進行基因治療的理想方式就是提高病毒滴度，或者是說提高單位體積內(nèi)的病毒顆粒數(shù)、病毒載體濃度。而在常用的基因治療病毒載體中，腺相關病毒載體是最小的一種。目前，已進入臨床實驗的腺相關病毒載體制劑(AAV)病毒顆粒數(shù)通常要高出腺病毒載體制劑(Adv)2-3個數(shù)量級，即單位體積中的腺相關病毒載體(AAV)數(shù)量遠遠高于腺病毒載體(Adv)，從而導致高濃度的腺相關病毒載體制劑(AAV)在制備、濃縮過程中出現(xiàn)病毒顆粒聚集、沉淀，而導致病毒穩(wěn)定性與感染能力的下降，因此，如何提高高濃度腺相關病毒載體(AAV)制劑的穩(wěn)定性，并研究其在基因治療領域的進一步應用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的一是提供一種攜帶神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的腺相關病毒載體制劑，所述的制劑含有3-7％(W/V)的甘露醇，優(yōu)選含有5％(W/V)的甘露醇。其中所述的3-7％(W/V)的甘露醇可以提高高濃度的重組腺相關病毒載體在制劑中的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的另一目的是提供含有攜帶神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的腺相關病毒載體制劑(I)和一種高滲溶液(II)的藥物組合物，所述的高滲溶液(II)誘導血腦屏障開放而使所述的病毒載體進入腦部感染、表達。其中所述的高滲物質選自甘露醇、阿拉伯糖、尿素、果糖、乳酰胺或甘油，優(yōu)選為甘露醇。所述的藥物組合物作為聯(lián)合制劑分別或順序給藥用于預防和/或治療中樞神經(jīng)元退行性病變，腦缺血損傷、腦外傷、腦手術創(chuàng)傷后減少神經(jīng)元死亡或促進腦功能恢復，以及用于幼兒宮內(nèi)窒息、難產(chǎn)時腦缺氧損傷后預防腦損傷性智力低下或腦發(fā)育不良。
在上述的制劑或藥物組合物中，所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子選自神經(jīng)生長因子(NGF)，腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，胰島素樣生長因子1(IGF1)，神經(jīng)營養(yǎng)素3(NT-3)，神經(jīng)營養(yǎng)素(NT4/5)或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)，優(yōu)選為人神經(jīng)生長因子hNGF。所述的腺相關病毒載體為腺相關病毒1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型或8型，優(yōu)選為腺相關病毒2型(rAAV-2)。
在血腦屏障(BBB)穩(wěn)定開放后，治療藥物或病毒載體能否導入，主要取決于導入病毒載體或藥物分子的結構是否小于腦部星型膠質細胞網(wǎng)層出現(xiàn)的56±35nm空隙。腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)屬細小病毒科(Parvoviridae)，目前公認已發(fā)現(xiàn)的AAV血清型有1-8種，各型AAV病毒的基因結構相同，雖然不同載體在衣殼蛋白氨基酸水平存在一定差異(這些差異主要由于同源重組造成，這也是造成不同血清型病毒在不同組織的感染效率上出現(xiàn)差異的主要原因)，但各型AAV病毒顆粒在大小上差異不大，仍維持在20-26nm左右，因此，本發(fā)明的技術方案能在實施BBB開放后，能夠保證不同血清型的AAV病毒載體有效導入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并進行感染、表達。
雖然各血清型的AAV病毒在基因結構、病毒顆粒大小上差異不大，但不同載體在衣殼蛋白氨基酸水平存在一定差異，這也是造成不同血清型的AAV組織或細胞嗜性不同的主要原因。動物實驗發(fā)現(xiàn)，與AAV2載體相比，AAV1比AAV2能更好地轉導肌肉組織，AAV1對肌肉組織的感染效率比AAV2高100-1000倍；而AAV1在除神經(jīng)組織外的其他組織，比如肌肉組織和肝臟中的轉導效率都普遍高于其他血清型；AAV在肝臟和肌肉組織中感染效率由高到低的順序是1、5、3、2、4；在大鼠視網(wǎng)膜中的感染順序是5、4、1、2、3。AAV3比其它血清型的AAV能更好地轉導巨核細胞。相較AAV2而言，AAV5和AAV6能更有效地轉導上呼吸道細胞，特別是AAV5在視網(wǎng)膜、大腦、呼吸道上皮和胰島中有更好的感染效率。AAV2、AAV4和AAV5都能較好地轉導中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞，但在其中的分布和靶向的細胞類型存在著差異。AAV7在肌肉組織中的轉導效率很高，與AAV1差不多，而AAV8在肝臟中的轉基因表達水平比其它血清型AAV要高10到100倍以上。故本發(fā)明所涉及的腺相關病毒載體為腺相關病毒1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型或8型，優(yōu)選為腺相關病毒2型(rAAV-2)。
腺相關病毒載體是一種具有良好應用前景的基因治療載體。研究中往往需要高滴度的重組AAV病毒(＞1011v.g/ml)。但部分給藥體積、給藥時間受到限制的研究則需要更高濃度的病毒，即在一定體積或規(guī)定時間內(nèi)能夠導入盡可能多的重組病毒。雖然利用完整的腺相關病毒顆粒具有耐受有機溶劑的特點，采用乙醇沉淀重組AAV病毒的方法，可以達到濃縮AAV載體的目的(1013v.g/ml)，但由于病毒顆粒濃度高，經(jīng)常在存放過程中出現(xiàn)病毒顆粒聚集、沉淀以致影響實驗效果。本發(fā)明經(jīng)過研究采用在常規(guī)病毒保存液中添加一定濃度(3-7w/v％)甘露醇的方法，使得病毒顆粒在保存過程中保持分散、非聚集狀態(tài)，可有效解決病毒制劑在保存過程中病毒顆粒的聚集、沉淀問題。該方法不僅提高了病毒載體制劑的穩(wěn)定性，而且在以高濃度的高滲溶液開放血腦屏障后，可將高近一個數(shù)量級的重組病毒(AAV/hNGFβ)導入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并可預期在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達量、以及在相關動物模型的治療效果會明顯優(yōu)于不含甘露醇的普通制劑。
能形成高滲透壓開放BBB的物質有甘露醇、阿拉伯糖、尿素、果糖、乳酰胺、甘油等。特別是以甘露醇為代表的高滲溶液可逆開放血腦屏障的重現(xiàn)性好，并且所用物質安全、對病毒導入后的表達無潛在干擾。BBB的開放及藥物轉運的增加主要取決于高滲溶液的濃度、注射時間和速度，并且這種開放是有時間性和可逆性的。在眾多可逆開放BBB的高滲溶液中，本發(fā)明優(yōu)選甘露醇進行高濃度腺相關病毒載體(AAV)的穩(wěn)定性研究的主要原因在于(1)在部分國家重組蛋白藥物理化、生物學活性標準品的研究中，在配方中添加一定的甘露醇可以提高蛋白的穩(wěn)定性；(2)目前甘露醇是一種較為常用的減輕顱壓、血壓、和利尿的制劑，其安全性已得到長期的臨床驗證，在后續(xù)的產(chǎn)業(yè)化進程中其對整體制劑的安全性不會帶來負面影響；(3)甘露醇對病毒顆粒的感染能力沒有影響。所用甘露醇的濃度為22-28％(w/v)，優(yōu)選為25％(w/v)；在使用時，輸入甘露醇后保留1-6分鐘，BBB開放程度均大于50％，其中以輸入甘露醇2分鐘時BBB的開放程度最好。
申請人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，在病毒載體制劑中加入3-7％(w/v)的甘露醇不僅可以提高高濃度的重組腺相關病毒載體的穩(wěn)定性，而且在以高濃度的高滲溶液開放血腦屏障后，可將高近一個數(shù)量級的重組病毒(AAV/hNGFβ)導入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并可預期在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達量、以及在相關動物模型的治療效果會明顯優(yōu)于不含甘露醇的普通制劑。該制劑優(yōu)于不含甘露醇配方的普通制劑的原因如下血腦屏障的形成主要是由于眾多腦部星型膠質細胞的致密排列構成的細胞網(wǎng)層，濃度為22-28％(w/v)甘露醇可以使腦部星型膠質細胞網(wǎng)層出現(xiàn)56±35nm的空隙，優(yōu)選甘露醇的濃度為25％(w/v)。雖然在注射高濃度的甘露醇后等待2min，BBB可以得到最好程度的開放，但由于甘露醇本身的利尿作用，使得注射高濃度的甘露醇后會因導致的動物體液代謝而造成部分甘露醇的損失，以致影響其對BBB開放的效果。因此，在病毒制劑儲存液中添加3-7％(w/v)的甘露醇不僅可以提高病毒顆粒的穩(wěn)定性，而且可以預測在病毒儲存液中的甘露醇可以在一定程度上及時補充由于體液代謝所致的甘露醇流失部分，幫助維持己形成的腦部星型膠質細胞間隙，進而促進BBB的穩(wěn)定開放；并且根據(jù)相似相溶、系統(tǒng)類似的一般實驗原則，在注射25％甘露醇，等待2min開放BBB后，所導入的含有3-7％(w/v)甘露醇的病毒載體制劑在管路中與先前導入的溶劑應具有更好的溶解特性，因而，可促進重組病毒的有效導入。在本發(fā)明的技術方案中，采用在1min內(nèi)將高滲溶液注射完畢，然后等待2min，再將病毒載體制劑導入，以有效的導入重組病毒。
神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類由神經(jīng)元、神經(jīng)支配的靶組織或膠質細胞產(chǎn)生的的活性蛋白，該家族因子主要包括神經(jīng)生長因子(NGF)，腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，胰島素樣生長因子1(IGF1)，神經(jīng)營養(yǎng)素3(NT-3)，神經(jīng)營養(yǎng)素(NT4/5)，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)等。該家族的因子分別對黑質多巴胺能神經(jīng)元，基底前腦和紋狀體膽堿能神經(jīng)元，運動神經(jīng)元，感覺神經(jīng)元，交感神經(jīng)元，背根節(jié)神經(jīng)元，結狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元等均有一定作用和生理活性，諸如能促進中樞和外周神經(jīng)元分化、生長、維持各類神經(jīng)元的存活，以及神經(jīng)元損傷后的修復，使培養(yǎng)的運動神經(jīng)元存活數(shù)目增多，防止發(fā)育期運動神經(jīng)元的程序化死亡，以及軸突切斷引起的運動神經(jīng)元死亡或萎縮等作用，因而，它們在眾多靶神經(jīng)元的系統(tǒng)發(fā)育和生理功能維持中具有重要作用。這些神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員在神經(jīng)系統(tǒng)疾病，尤其是在以治療運動神經(jīng)元病變，脊髓損傷，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變等為目的動物模型、臨床中雖然開展了廣泛研究，并已取得令人鼓舞的結果、進展，但由于BBB的存在，神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的治療應用研究一直進展緩慢。因此，本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，通過采用甘露醇高滲溶液可逆開放BBB的技術方案，可用腺相關病毒作為載體攜帶上述各種神經(jīng)營養(yǎng)因子家族，獲得重組腺相關病毒載體通過基因治療導入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而有效的預防和/或治療中樞神經(jīng)元退行性病變，腦缺血損傷、腦外傷、腦手術創(chuàng)傷后減少神經(jīng)元死亡或促進腦功能恢復，以及用于幼兒宮內(nèi)窒息、難產(chǎn)時腦缺氧損傷后預防腦損傷性智力低下或腦發(fā)育不良。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述的藥物組合物在預防和治療阿爾茨海默氏病、帕金森氏病等中樞神經(jīng)元退行性疾病中的用途；且所述的藥物組合物還可用于腦缺血損傷、腦外傷、腦手術創(chuàng)傷后減少神經(jīng)元死亡，促進腦功能恢復；以及用于幼兒宮內(nèi)窒息、難產(chǎn)等腦缺氧損傷后預防腦損傷性智力低下或腦發(fā)育不良。
本發(fā)明還涉及一種高效而又對腦無創(chuàng)傷的在腦內(nèi)直接導入rAAV-NGF基因的方法，特別是利用對人腦無害的高滲溶液將rAAV-NGF基因直接導入腦內(nèi)的方法。
通常的基因治療都是將表達基因的載體，如AAV-NGF通過顱內(nèi)立體定位方式導入大腦。本發(fā)明在國際上首次通過短暫開放血腦屏障的方法，將AAV-NGF導入大鼠的大腦，并獲得了外源基因的腦內(nèi)、特別是膽堿能神經(jīng)元區(qū)的高表達。該方法的優(yōu)勢在于不必開顱和立體定位，因而更易被患者和家屬接受。
由于血腦屏障的影響，神經(jīng)營養(yǎng)因子的應用受到了一定限制，外周給以神經(jīng)營養(yǎng)因子難以透過血腦屏障，影響療效；而中樞給藥技術復雜、損傷大，病人難以接受，而且難以施行。微泵灌注、微囊化緩釋生物多聚體或產(chǎn)神經(jīng)營養(yǎng)因子細胞腦內(nèi)植入或病毒載體介導的神經(jīng)營養(yǎng)因子基因腦內(nèi)直接注射，均為創(chuàng)傷性方法，存在著腦損傷和感染的危險性，病人難以接受；蛋白載體介導的神經(jīng)營養(yǎng)因子導入方法，需每天給藥，不適合于慢性病的治療；小分子誘導腦內(nèi)生成神經(jīng)營養(yǎng)因子的藥物的研究尚不成熟。本發(fā)明在臨床上可通過經(jīng)橈動脈插管，進入頸總動脈后直接導入載體，無須手術，基本無創(chuàng)，而且數(shù)月一次，是臨床上病人可接受的方法。這種介入治療方法是心血管系統(tǒng)疾病的成熟的治療手段，其安全性已有大量臨床資料證明。導入過程簡單，可反復進行，對腦無創(chuàng)傷，無危險，病人易于接受；導入后神經(jīng)營養(yǎng)因子基因在腦神經(jīng)細胞內(nèi)高效表達且可持續(xù)9個月以上，給藥次數(shù)少，從而降低了治療成本。是對阿爾茨海默氏病等中樞神經(jīng)元退性形病變基因治療的一大貢獻。
本發(fā)明的方法是經(jīng)頸動脈用高滲法誘導血腦屏障開放，并將神經(jīng)營養(yǎng)因子基因經(jīng)頸動脈注射入血液后令其直接進入腦組織，在腦神經(jīng)細胞中獲高效表達。
本發(fā)明的rAAV-神經(jīng)營養(yǎng)因子基因導入腦內(nèi)的過程如下1、頸動脈插管大鼠，雄性，18月齡以上，戊巴比妥鈉33mg/kg ip麻醉，頸部剪毛。碘伏消毒皮膚。沿頸正中線切開皮膚。鈍性分離左頸總動脈和左頸外動脈。左頸總動脈近心端用絲線結扎，遠心端夾一動脈夾。
切開頸頸外動脈，經(jīng)頸外動脈插一塑料導管(此導管用100U/ml肝素抗凝)，結扎固定導管。
2、高滲溶液灌注打開頸動脈夾，用微量輸液泵輸入高滲溶液，如25％甘露醇(預熱至37℃)，0.12ml/s，共30s，使血腦屏障開放。
3、經(jīng)頸動脈導入治療基因高滲溶液如甘露醇灌注后即刻或2-4min之間，取rAAV-神經(jīng)營養(yǎng)因子基因1ml(1×1012PV)，經(jīng)大鼠頸動脈緩慢注入(共1min)。
結扎頸外動脈，開放頸外動脈令大腦恢復血流灌注?？p合皮膚。動物常規(guī)飼養(yǎng)。
老年大鼠(18月齡)，戊巴比妥鈉麻醉↓分離頸外動脈、頸總動脈、頸內(nèi)動脈↓經(jīng)頸外動脈插管，進入頸內(nèi)動脈↓阻斷頸總動脈血流↓經(jīng)插管輸入高滲溶液，如25％甘露醇3ml(35s)↓輸入高滲溶液如甘露醇后2min時開始輸入rAAV-神經(jīng)營養(yǎng)因子1ml(1min)↓開放頸總動脈血流，結扎頸外動脈↓縫合皮膚，導入完畢本發(fā)明的rAAV-神經(jīng)營養(yǎng)因子基因導入腦內(nèi)的方法可用于(1)，將神經(jīng)營養(yǎng)因子基因導入腦組織內(nèi)，用于預防和治療阿爾茨海默氏病、帕金森氏病等中樞神經(jīng)元退性形病變；(2)在腦缺血損傷、腦外傷、腦手術創(chuàng)傷后減少神經(jīng)元死亡，促進腦功能恢復；(3)用于幼兒宮內(nèi)窒息、難產(chǎn)等腦缺氧損傷后預防腦損傷性智力低下或腦發(fā)育不良。
除非另有說明，本發(fā)明所涉及的組分的濃度百分比均為重量體積百分比(w/v％)。


圖1SDS-PAGE電泳所測定的重組病毒rAAV-2/hNGFβ外殼蛋白分子量及純度第1泳道分子量標準；第2泳道重組病毒rAAV-2/hNGFβ外殼蛋白圖2離子交換色譜(TSK gel SP-NPR strong cation-exchange column)所測定的重組病毒rAAV-2/hNGFβ顆粒的純度?？梢?，病毒顆粒單一峰，無其他雜質峰出現(xiàn)。
圖3重組病毒rAAV-2/hNGFβ體外感染BHK-21細胞后，細胞上清中hNGFβ的含量測定結果。其中*P＜0.01vs對照組p，ΔP＜0.05vs MOI 2.5×104。
圖4重組病毒rAAV-2/hNGFβ體外感染BHK-21細胞后，雞胚背根神經(jīng)節(jié)法測定上清中hNGFβ生物學活性(×400)結果。
A陰性對照，可見神經(jīng)節(jié)附著在培養(yǎng)基質上，但并無神經(jīng)纖維生長；B與重組病毒rAAV-2/hNGFβ以MOI 1.0×106vg/cell感染的BHK-21細胞后上清共培養(yǎng)的雞胚背根神經(jīng)節(jié)，可見神經(jīng)纖維生長(×400)。
圖5甘露醇誘導血腦屏障開放后導入重組病毒rAAV-2/GFP(綠色熒光蛋白)表達60天，以激光共聚焦顯微鏡檢測導入組大鼠腦切片中的綠色熒光蛋白表達(×100)結果。
A血腦屏障開放后病毒導入側左側大腦切片，可見較多綠色熒光蛋白表達；B血腦屏障開放后非病毒導入側右側大腦切片，可見一些綠色熒光蛋白表達；C血腦屏障開放陰性對照。
圖6甘露醇誘導血腦屏障開放后導入重組病毒rAAV-2/GFP表達60天，以激光共聚焦顯微鏡掃描檢測病毒導入側單個神經(jīng)細胞，可見綠色熒光蛋白于神經(jīng)細胞胞漿表達(×400)結果。
A甘露醇誘導血腦屏障開放后，導入側單個神經(jīng)細胞；B表示陰性對照。
圖7甘露醇誘導血腦屏障開放后導入重組病毒rAAV-2/GFP表達60天，以激光共聚焦顯微鏡檢測病毒導入組肝臟切片(×100)結果。
A病毒導入組肝臟切片中綠色熒光蛋白表達；
B陰性對照。
具體實施例方式
以下將結合實施例具體說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于說明本發(fā)明的技術方案，并非限定本發(fā)明的實質。并且在如下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。
實施例1 載體構建首先抽提人肝組織總RNA，RT-PCR擴增得到人hNGFβcDNA(mRNA純化及RT-PCR試劑盒購自美國Promega公司)，PCR引物為5’-ACGCGTCGACAGAGAGCGCTGGGA GCCGGA-3’，5’-ACGCGTCGACGCTTCCAAAAATTTAATAAAT-3’，擴增片段長度為1067bp，與質粒pUC18連接得到重組克隆質粒pUC18/hNGFβ，DNA序列測定證實其核苷酸序列與文獻記載相一致。hNGFβ基因與rAAV-2通用載體質粒pSNAV-1(Wu ZJ，Wu XB，HOU YD，Chin J virol 2000；161-6.)連接得到重組載體質粒pSNAV-l/hNGFβ，并以該質粒轉染BHK-21細胞，在G418(新霉素)壓力下篩選得到攜帶載體質粒pSNAV-1/hNGFβ3的載體細胞株SN，擴大培養(yǎng)后在輔助病毒HSV1-rc/AUL2(含有編碼病毒復制、包裝必需蛋白的rep、cap基因)的參與下包裝病毒，最終純化(Wu XB，Dong XY，Wu ZJ，et al.，Chin Sci Bull 2000；452071-2075.)得到具有感染性的成熟病毒rAAV-2/hNGFβ。
攜帶綠色熒光蛋白(GFP)報告基因的重組腺相關病毒rAAV-2/GFP構建及純化方法同上。
以SDS-PAGE電泳(Bio-rad Mini PROTEAN，USA)和HPLC法(Waters2690，USA，TSK gel SP-NPR陽離子交換柱，Japan)(Debelak D，F(xiàn)isher J，IulianoS，et al.，Journal of Chromatography B 2000；740195-202.)對所獲得的rAAV-2/hNGFβ和rAAV-2/GFP進行純度測定。病毒顆粒數(shù)的測定采用DNA斑點雜交法(Debelak D，F(xiàn)isher J，Iuliano S，et al.，Journal of Chromatography B2000；740195-202.)，以啟動子為模板合成探針，分別以攜帶表達盒的載體質粒作為陽性對照來雜交，用凝膠成相系統(tǒng)及軟件(Amersham pharmacia biotech，ImageMaster VDS，USA)對陽性對照曲線和待測樣品的雜交信號進行了量化，以雜交信號的強度分析判定病毒顆粒數(shù)。
經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，rAAV-2/hNGFβ外殼蛋白VP1、VP2、VP3的分子量分別為87kD、72kD、62kD，三種外殼蛋白總量占總蛋白量百分比大于98％(見圖1)。rAAV-2/hNGFβ病毒顆粒經(jīng)TSK gel SP-NPR強陽離子交換柱分析后，樣品主峰保留時間為12.5min，病毒顆粒HPLC純度大于98％(見圖2)。點雜交后，用凝膠成相系統(tǒng)對雜交信號強度進行量化分析，經(jīng)確定rAAV-2/hNGFβ與rAAV-2/GFP病毒顆粒數(shù)均為1.0×1012vg/ml。
實施例2 rAAV-2/hNGFβ體外表達及生物學活性測定1.體外表達rAAV-2/hNGFβ轉導細胞的能力是通過感染BHK-21細胞后，測定細胞上清中hNGFβ含量和生物學活性來確定的。以含10％小牛血清(小牛血清為HyClone公司產(chǎn)品)的1640培養(yǎng)基(RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司)，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)BHK-21細胞。BHK-21細胞按4×105/孔接入六孔板，8h后按MOI 2.5×104與1.0×106加入重組rAAV-2/hNGFβ病毒顆粒。加入病毒顆粒前細胞先用新鮮無血清的1640洗兩遍。并以無血清的1640調節(jié)好病毒與細胞的比例(MOI)，然后以無血清1640將終體積補足為1ml，加入已清洗備用的6孔板細胞中；并在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，讓病毒吸附于細胞。病毒吸附1h后，加入1ml含10％血清的1640，加毒后每24h吸取培養(yǎng)上清，連續(xù)取樣3天。然后，采用ELISA(美國Chemicon公司)檢測細胞上清中hNGFβ含量，操作方法詳見說明書，并采用t檢驗對表達量測定結果進行統(tǒng)計分析。
2.體外生物學活性測定于25cm2細胞培養(yǎng)瓶中接種BHK-21細胞3.0×106/瓶，24h后細胞先以新鮮無血清的1640洗三遍，并以無血清的1640調節(jié)好病毒與細胞的比例(MOI 1.0×106)，然后以無血清的1640將終體積補足為1ml，將這1ml含有rAAV-2/hNGFβ病毒顆粒的1640培養(yǎng)液充分混勻，加入已清洗備用的細胞培養(yǎng)瓶中；并在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，讓病毒吸附于細胞。1h后加入2ml含10％牛血清的1640。培養(yǎng)過夜后棄去含牛血清的培養(yǎng)液，以新鮮無血清的1640充分清洗三遍后，加入3ml無血清的1640培養(yǎng)72小時，吸取培養(yǎng)上清立即以雞胚背根神經(jīng)節(jié)法(參見WANG JZ eds.Research，development and quality control ofbio-pharmaceutics.1st ed.BeiiingScience press；2002476-478.)進行NGF的生物學活性測定。
結果表明rAAV-2/hNGFβ體外轉導BHK-21細胞后，在連續(xù)3天的表達量測定中，MOI 2.5×104和1.0×106兩組均在第二天達到最高，分別為115.0±31.8pg/ml和188.0±28.6pg/ml(見圖3)；在連續(xù)3天的測定中，不同MOI病毒感染組hNGFβ表達量經(jīng)過T檢驗統(tǒng)計，均比對照組有極顯著提高，P＜0.01；并且在對第2、3天測定結果的進行T檢驗統(tǒng)計中發(fā)現(xiàn)，MOI 1.00E+06組hNGFβ表達量較MOI 2.50E+04組有顯著提高，P＜0.05。此結果提示腺相關病毒載體于體外可以介導基因表達，并且表達在病毒感染第1天后逐漸達到高峰。雞胚背根神經(jīng)節(jié)法測定證明，rAAV-2/hNGFβ以MOI 1.0×106感染BHK-21組無血清表達上清可刺激神經(jīng)節(jié)生長(見圖4)。
實施例3 影響甘露醇誘導BBB開放的因素1、甘露醇濃度的影響甘露醇的適宜濃度為22-28％(w/v)采用Wistar大鼠為實驗動物，體重為250g±20g，♀♂均用。(n＝20，每組5只)4組大鼠以37℃，0.12ml·s-1，30s的速度輸入濃度分別為20％、22％、25％、28％的甘露醇后2min時，給EB組的左側藍染區(qū)灰度分別為181.5±1.41、115.5±1.32、81.1±1.21和80.25±1.46，左腦藍染面積百分比(％)分別為32.42±1.12、49.85±1.70、92.10±1.50、94.31±1.32。但見給予28％甘露醇組大鼠有出血點，且28％甘露醇更易在室溫時析出，說明在以37℃，0.12ml·s-1，30s給予上述不同濃度的甘露醇，可見，注射給予25％甘露醇后等待2min時，對BBB的開放程度最好。
2、輸入甘露醇的速度0.10ml·s-1-0.15ml·s-1，輸入時間為40-25sec，當輸入速度減慢或輸入時間縮短以后，BBB的開放程度降低。
3、輸入甘露醇后的保留時間適宜時間為1-6min采用Wistar大鼠為實驗動物，體重為250g±20g，♀♂均用。(n＝40，每組5只)8組大鼠分別為輸入25％甘露醇(37℃，0.12ml·s-1，30s)后0、1、2、4、5、6、8、10min時給EB(2mg·kg-1，1min內(nèi)推完)，以比較不同保留時間對甘露醇誘導BBB開放作用的影響。結果，6組大鼠大腦均有不同程度的藍染，左側藍染區(qū)灰度分別為120.0±1.39、114.11±1.42、81.1±1.21、100.0±1.36、108.0±1.16、110.0±1.12、106.5±1.40、122.0±1.47。左腦藍染面積百分比(％)分別為24.11±1.46、62.3.11±2.18、96.07±1.90、85.21±1.19、80.16±1.10、79.41±1.40、43.34±1.20、19.13±1.20。以上結果說明輸入25％的甘露醇后1-6min內(nèi)，BBB開放程度均大于50％，且在輸入甘露醇后2min時左腦藍染面積最大，灰度最小，說明在給25％甘露醇(37℃，0.12ml·s-1，30s)后2min時對BBB的開放程度最好。
4、實驗溫度溶液適宜預熱溫度為35℃-39℃，在此溫度范圍內(nèi)實驗動物存活率較好(80-90％)，低于此溫度實驗動物存活率約為60-70％；其中以37℃為最佳。
適宜環(huán)境溫度為22℃-26℃在此溫度范圍內(nèi)濃度為22％-28％(w/v)的甘露醇維持溶液狀態(tài)，不會析出，其中以25℃為最佳。
上述結果表明，影響甘露醇誘導BBB開放的因素有以下四方面因素甘露醇的濃度、輸入甘露醇的速度和時間、輸入甘露醇后的保留時間、實驗溫度。對輸入甘露醇的耐受性與動物的體重有關而和性別無關。甘露醇誘導BBB開放的最佳條件為環(huán)境溫度25℃，25％(w/v)甘露醇溶液預熱溫度37℃，以0.12ml·s-1輸入30sec、等待2min后導入重組病毒或相關治療藥品。
實施例4 高滲溶液開放大鼠血腦屏障后，rAAV-2載體介導基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達成年Wistar大鼠15只，體重275g±25g，♀♂均用(實驗大鼠由國家實驗動物中心提供)。以戊巴比妥鈉麻醉后(27mg/kg ip)，沿頸正中線切開皮膚，鈍性分離左頸總動脈和左頸外動脈(單側)。左頸總動脈近心端用絲線結扎，遠心端夾一動脈夾。切開頸外動脈，經(jīng)頸外動脈插一塑料導管，此導管用1×102U/ml肝素抗凝，結扎固定導管。以流速0.12ml/s，用微量輸液泵輸入預熱至37℃的25％(w/v)的甘露醇水溶液，共30s(Doran SE，Xiao DR，Lorris-BetzA，et al.，Neurosurgery 1995；36965-969；Muldoon LL，Nilaver G，Kroll R.A.，etal.，Am J Pathology 1995；1471840-1851)。甘露醇注入后等待2min，以頸動脈插管的方式將1.5ml含有rAAV-2/hNGFβ(1.5×1012vg，n＝4)或rAAV-2/GFP(1.5×1012vg，n＝5)病毒的生理鹽水導入大鼠腦內(nèi)，并于1min注射完畢。對照組大鼠(n＝6)則以相同速度和時間，頭向于頸動脈內(nèi)注入37℃的生理鹽水。大鼠注射完畢后縫合，并觀察手術后狀態(tài)。術后60天，注射過量戊巴比妥鈉處死動物，取rAAV-2/hNGFβ導入組的大鼠腦沿大腦縱裂切開，左、右腦稱重后分別按重量體積比1∶3加入冰浴勻漿緩沖液(按試劑說明書配制)，以超聲波勻漿，勻漿液于12,000r/min離心30min離心后，用ELISA檢測勻漿液離心上清中的hNGFβ含量，并采用t檢驗對hNGFβ含量測定結果進行統(tǒng)計分析。對rAAV-2/GFP導入組的大鼠腦組織、肝臟以100μm間隔進行連續(xù)冰凍切片，用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP表達情況(Leica TCS NT，German)。
表1.rAAV-2/hNGFβ病毒導入后60天各組大鼠腦組織hNGFβ表達含量比較

備注aP＞0.05，bp＜0.05，cP＜0.01 vs Group 1；dp＞0.05，eP＜0.05，fP＜O.01 vs Group 3；gP＞0.05，hp＜0.05，ip＜0.01 vs Group 2；結果表明，甘露醇誘導血腦屏障開放后，導入重組病毒rAAV-2/hNGFβ的大鼠腦組織中的hNGFβ含量較血腦屏障開放對照組明顯提高，全腦hNGFβ表達可達636.2pg/ml。導入側左腦相對于非導入側右腦的hNGFβ含量有一定提高P＞0.05；右側腦、導入側左腦、全腦的hNGFβ含量較血腦屏障開放對照組均有顯著提高，P＜0.05(見表1)。
激光共聚集熒光顯微鏡掃描(100×，激發(fā)波長465±10nm)觀察rAAV-2/GFP導入組腦組織切片，可見病毒導入組導入側左腦有較多GFP表達，病毒導入組非導入側右腦也有GFP表達，但相對導入側左腦GFP表達量低(見圖5.)。導入側左腦單神經(jīng)細胞核斷層掃描結果可見GFP表達主要位于神經(jīng)細胞胞漿內(nèi)(見圖6.)。以上結果說明，甘露醇誘導血腦屏障開放時，rAAV-2/hNGFβ亦可透過血腦屏障間隙進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達。
此外，rAAV-2/GFP導入組肝臟切片經(jīng)激光共聚集熒光顯微鏡掃描，可觀察到在肝臟有GFP表達(見圖7)。此結果提示頸動脈插管導入rAAV-2/GFP后，有部分病毒會隨血液流經(jīng)至機體其他部分。
rAAV-2/GFP與rAAV-2/hNGFβ病毒在顆粒大小、病毒外殼蛋白組成及結構、病毒顆粒帶電性、病毒重組基因結構等理化特性指標上完全一致，只是所含表達盒不同。將rAAV-2/GFP與rAAV-2/hNGFβ以相同方法開放血腦屏障后導入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，GFP在腦組織中的表達位置及分布情況，可以更加直觀的從另一角度證明rAAV-2/hNGFβ可在甘露醇開放血腦屏障后在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布和表達。
實施例5 開放大鼠血腦屏障后rAAV-2/hNGFβ病毒導入組安全性評價病毒導入后第60天，稱大鼠體重、采血進行血液生化、血液學檢測后，將大鼠處死分離各組大鼠臟器進行病理檢查。并以PCR(ASTEC PC-801，Japan)方法初步測定rAAV-2病毒載體在大鼠腦、心、肝、性腺中的生物分布，所用引物為針對rAAV-2病毒載體的特征序列ITR-CMV，引物序列為(正向引物r5-CTCCATCACTAGGGGTTCCT-3’，反向引物5-CTTATATAGACCTCCCACC-3’)，擴增條件為(1)94℃5min；(2)94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；30cycles(3)72℃，5min。
結果表明，rAAV-2/hNGFβ頸動脈插管導入大鼠腦內(nèi)60天后，經(jīng)體重變化、血液生化學(包括丙氨酸氨基轉移酶、堿性磷酸酶、血尿氮等)、血液學指標(包括紅細胞、白細胞、血紅蛋白單核細胞分化等)和臟器病檢，病毒導入組與對照組檢測結果無顯著差異(P＞0.05，數(shù)據(jù)略)，初步證明rAAV-2/hNGFβ導入大鼠腦內(nèi)表達后沒有引起異常。在甘露醇誘導血腦屏障開放后，PCR方法檢測rAAV-2病毒載體是否可被遞送至非靶器官(即生物分布)的結果發(fā)現(xiàn)，該組的4只動物中的腦、心臟、肝臟、性腺中載體陽性檢出的數(shù)量分別為4，3，2，1。
實施例6 5％的甘露醇對高濃度重組病毒AAV-2/hNGFβ注射液穩(wěn)定性的影響1、長期性試驗考察重組病毒分別在2-8℃和-20℃條件下的穩(wěn)定性將經(jīng)濃縮和初步純化了的AAV-2/hNGFβ病毒通過親和層析、陰離子交換層析和分子篩層析進行純化獲得重組AAV-2/hNGFβ病毒。用-20℃預冷無水乙醇與所需濃縮的樣品AAV-2/hNGFβ的量以3∶1的體積比混合，-20℃放置1-2h，15000rpm/min，4℃離心20min，棄上清，待殘余乙醇基本揮發(fā)后，加入相應體積的保存液(即含有5％甘露醇的保存液2，或不含有甘露醇的保存液1)溶解沉淀，0.22μml濾膜過濾除菌儲存。
供試品保存液1(NaCl8g；Na2HPO4·12H2O29g；KCl0.2g；KH2PO40.2g；加適量注射用水溶解，定容至1000ml。)、保存液2(甘露醇50g，NaCl8g，Na2HPO4·12H2O29g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，加適量注射用水溶解，定容至1000ml)，配方各3批。
存放溫度分別在2-8℃和-20℃下存放存放時間2年檢測時間0-3個月每月檢測一次；第4-12月每3個月檢測一次；第12-24月每6個月檢測一次。
檢測項目外觀性狀、pH值、無菌試驗、滴度測定、BCA測蛋白、電泳純度、體外表達、高效液相、電鏡。
(1)外觀性狀參照中華人民共和國藥典2000版附錄IXB，附錄68的方法進行。
(2)pH值儀器瑞士Metrohm pH計方法按儀器操作說明書進行。
(3)BCA測蛋白材料PIERCE公司的BCA蛋白檢測試劑盒(NO.23225)酶標儀Wellscan MK3型酶標儀方法以PIERCE公司BCA蛋白檢測試劑盒(No.23225)的方法進行。將標準蛋白稀釋配制成標準濃度系列，與樣品同時顯色30分鐘，酶標儀讀數(shù)(λ＝570nm)，據(jù)標準曲線和樣品的吸光值求出樣品的蛋白濃度。
(4)無菌檢查按照《生物制品的無菌試驗檢定規(guī)程》進行。
(5)電泳純度材料電泳儀DYY-III-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀凝膠成像系統(tǒng)Alphalmager型成像系統(tǒng)分子量標準蛋白華美(MG0041)方法采用SDS-PAGE法。分離膠12％，濃縮膠5％(配制方法見《分子克隆》第二版)。恒流8mA，電泳約2小時。電泳后用考馬斯亮藍染色，應見AAV-2外殼蛋白VP1、VP2、VP3(87KD、72KD、62KD)三條主帶。用凝膠成像系統(tǒng)分析掃描后計算VP1、VP2、VP3蛋白總量占總蛋白量的百分比。
(6)滴度測定材料Roche公司地高辛DNA標記和檢測試劑盒(Cat.No.1093657)Roche公司正電荷標記尼龍膜方法以Roche公司地高辛DNA標記和檢測試劑盒(Cat.No.1093657)的方法進行，以系列稀釋的質粒pSNAV-1/hNGFβ為標準對照，將樣品的雜交信號與標準對照進行比較、定量。
(7)體外表達材料細胞培養(yǎng)用小牛血清，購自Gibco公司。
ELISA檢測試劑ELISA(美國Chemicon公司)檢測細胞上清中hNGFβ含量，操作方法詳見說明書。
方法BHK-21細胞按2×105/孔接入六孔板，加含10％小牛血清的1640培養(yǎng)24小時后計數(shù)，按1×105MOI加入重組AAV-2/hNGFβ病毒顆粒。加毒前先用新鮮無血清的1640洗兩遍，然后加入1ml無血清1640，病毒吸附5小時后，加入1ml含10％小牛血清的1640，加毒后48小時吸取培養(yǎng)上清作ELISA檢測hNGFβ表達。
(8)電鏡方法用鎢酸鹽進行負染，滴于200目銅網(wǎng)上，在電子顯微鏡下觀察，照相(本項目委托預科院病毒研究所檢查)。
(9)高效液相儀器HPLC Agilent 1100，0.58mlTSKgel SP-NPR(Tosohaas)離子交換柱。
試劑BufferA50mM Hepes，1mM EDTA，5Mm MgCl2，100mM NaCl，pH 7.5。
Buffer B50mM Hepes，1mM EDTA，5Mm MgCl2，500mM NaCl，pH 7.5。
方法流速1ml/min，Buffer A充分對柱平衡，上樣100ul。記錄病毒峰的面積占總面積的百分率。
注無菌試驗于整個試驗的開始和結束時檢測，體外表達在第1、2個月，電鏡和高效液相在第1、2、3個月不考察。
在2-8℃的溫度條件下放置6個月，20010908-M、20010909-M、20010910-M(5％甘露醇保存液)三批樣品在外觀性狀均為無色透明液體，無異物，未見明顯沉淀，該制劑在2-8℃條件下肉眼觀察沒有明顯病毒聚集。pH值在一個很小的變化范圍內(nèi)波動，制劑的內(nèi)部酸堿度沒有發(fā)生明顯改變。制劑蛋白含量無明顯變化，SDS-PAGE電泳純度、HPLC純度均在95.0％以上，證明了病毒外殼蛋白無降解，且6個月內(nèi)電鏡觀察觀察病毒顆粒的結構完整。制劑活性檢測結果(體外表達)沒有明顯降低，均在20ng/ml以上，在2-8℃的溫度條件下放置6個月的rAAV-2/hNGFβ注射液的穩(wěn)定性良好。而沒有加入5％甘露醇由常規(guī)保存液的三批樣品20010908、20010909、20010910在2-8℃的溫度條件下放置6個月，在三批樣品的外觀檢測中，每批均有部分樣品出現(xiàn)有微量絮狀沉淀，除pH值、蛋白含量外，該3批HPLC純度、活性(體外表達)等方面均有不同程度降低，以此初步推斷，甘露醇具有一定阻止高濃度病毒顆粒聚集、沉淀的作用，并且其在保存液中的存在不影響病毒的理化、感染特性。
在-20℃的溫度條件下放置6個月，20010908-M、20010909-M、20010910-M(5％甘露醇保存液)三批樣品在外觀性狀均為無色透明液體，無異物，未見明顯沉淀，該制劑其他特性與在2-8℃的溫度條件下放置6個月后的結果基本相當。而沒有加入5％甘露醇由常規(guī)保存液的三批樣品20010908、20010909、20010910在-20℃的溫度條件下放置6個月時肉眼觀察可見有微量絮狀沉淀，可能是在-20℃、一定時間條件下病毒顆粒有微量聚集所致，但其pH值在一個很小的變化范圍內(nèi)波動，該條件下該制劑的內(nèi)部酸堿度穩(wěn)定。該三批樣品的HPLC純度、活性(體外表達)等方面均有不同程度降低，以此初步推斷，甘露醇具有一定阻止高濃度病毒顆粒聚集、沉淀的作用，并且其在保存液中的存在不影響病毒的理化、感染特性。
2、加速試驗供試品保存液1、2配方(配方同上)各3批，存放溫度25±2℃存放時間6個月檢測時間每月檢測一次檢測項目外觀性狀、pH值、無菌試驗、滴度測定、BCA測蛋白、電泳純度、體外表達、高效液相、電鏡(檢測方法同上)。
注無菌試驗于整個試驗的開始和結束時檢測，高效液相在第0、6月考察，電鏡在第0、3、6月考察。
加速試驗穩(wěn)定性結果表明，在25±2℃的溫度條件下放置6個月，不同儲存液的各三批樣品pH值在一個很小的變化范圍內(nèi)波動，該條件對其pH無影響，該制劑的內(nèi)部酸堿度穩(wěn)定。
外觀性狀上，在0-3個月均為無色透明液體，無異物。20010909、20010910-M在第4個月開始肉眼觀察可見微量的絮狀沉淀，20010908、20010910、20010908-M、20010909-M在第5個月開始有肉眼觀察微量絮狀沉淀，其原因可能是在該條件下病毒顆粒有聚集，該聚集情況與蛋白的濃度有一定關系，濃度越高，越容易聚集。
無菌試驗在整個加速試驗的開始和結束時均無菌生長，說明該條件下保證了樣品的無菌，也保證了其他項目實驗數(shù)據(jù)的可靠性。
蛋白濃度、電泳純度、體外表達等項目隨時間的延長，有一個逐步下降的趨勢。可能是因為25±2℃條件下病毒顆粒有微量聚集，或有少量病毒外殼破裂，蛋白發(fā)生降解，蛋白濃度有一個緩慢的下降趨勢，病毒基因拷貝數(shù)并無減少，故滴度下降不明顯，但表達活性受病毒聚集的影響，病毒顆粒外殼蛋白降解的影響，所以活性降低，但總的說來，活性下降速度緩慢。
通過對批號為20010908、20010909、20010910、20010908-M、20010909-M、20010910-M的6批樣品在不同溫度條件下穩(wěn)定性的考察，可以得出如下結論本發(fā)明純化制備的高濃度rAAV-2/hNGFβ重組病毒(1013v.g/ml)制劑中，在其儲存液中加入5％(w/v)甘露醇，可使重組病毒制劑在2～8℃和-20℃條件下長期保存，且穩(wěn)定性良好。并且，含有5％(w/v)甘露醇的rAAV-2/hNGFβ注射液在25±2℃條件下，表現(xiàn)熱穩(wěn)定性較好，支持rAAV-2/hNGFβ注射液的有效期定為2年。貯存及運輸條件在2～8℃或-20℃。
權利要求
1.一種攜帶神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的腺相關病毒載體制劑，其特征在于，所述的腺相關病毒載體制劑含有3-7％的甘露醇。
2.根據(jù)權利要求1的制劑，其中所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子選自神經(jīng)生長因子(NGF)，腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，胰島素樣生長因子1(IGF1)，神經(jīng)營養(yǎng)素3(NT-3)，神經(jīng)營養(yǎng)素(NT4/5)或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)。
3.根據(jù)權利要求2的制劑，其中所述的神經(jīng)生長因子是人神經(jīng)生長因子hNGF。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的制劑，其中所述的腺相關病毒載體選自腺相關病毒1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型或8型。
5.根據(jù)權利要求4所述的制劑，其中所述的腺相關病毒載體是腺相關病毒2型。
6.根據(jù)權利要求1-3中任一項或權利要求5所述的制劑，其含有5％的甘露醇。
7.根據(jù)權利要求4的制劑，其含有5％的甘露醇。
8.一種藥物組合物，包括(I)一種高滲溶液；和(II)含有3-7％甘露醇的病毒載體制劑，所述的病毒載體是攜帶神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的腺相關病毒載體。
9.根據(jù)權利要求8的藥物組合物，其作為聯(lián)合制劑分別或順序用于預防和/或治療中樞神經(jīng)元退行性病變。
10.根據(jù)權利要求8或9的藥物組合物，其中所述的高滲溶液誘導血腦屏障開放而使所述的病毒載體進入腦部感染、表達。
11.根據(jù)權利要求8的藥物組合物，其中所述的高滲溶液選自甘露醇、阿拉伯糖、尿素、果糖、乳酰胺或甘油。
12.根據(jù)權利要求11的藥物組合物，其中所述的高滲溶液是甘露醇。
13.根據(jù)權利要求12的藥物組合物，其中所述的甘露醇的重量體積比濃度為22-28％。
14.根據(jù)權利要求13的藥物組合物，其中所述的甘露醇的重量體積比濃度為25％。
15.根據(jù)權利要求8或9的藥物組合物，其中所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子選自神經(jīng)生長因子(NGF)，腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，胰島素樣生長因子1(IGF1)，神經(jīng)營養(yǎng)素3(NT-3)，神經(jīng)營養(yǎng)素(NT4/5)或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)。
16.根據(jù)權利要求15的藥物組合物，其中所述的神經(jīng)生長因子是人神經(jīng)生長因子hNGF。
17.根據(jù)權利要求8或9的藥物組合物，其中所述的腺相關病毒載體選自腺相關病毒1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型或8型。
18.根據(jù)權利要求17的藥物組合物，其中所述的腺相關病毒載體是腺相關病毒2型。
19.根據(jù)權利要求8或9的藥物組合物，其中所述的病毒載體制劑含有5％的甘露醇。
20.根據(jù)權利要求8或9的藥物組合物，以高效而又對腦無創(chuàng)傷的腦內(nèi)直接導入方式用于預防和治療中樞神經(jīng)元退行性病變、腦缺血損傷、腦外傷、腦手術創(chuàng)傷后減少神經(jīng)元死亡或促進腦功能恢復或幼兒宮內(nèi)窒息、難產(chǎn)時腦缺氧損傷后預防腦損傷性智力低下或腦發(fā)育不良。
21.權利要求1-7中任一項的制劑或權利要求8-20中任一項的藥物組合物在制備用于預防和/或治療中樞神經(jīng)元退行性病變的藥物中的應用。
22.根據(jù)權利要求21的應用，其中所述的中樞神經(jīng)元退行性病變是阿爾茨海默氏病或帕金森氏病。
23.權利要求1-7中任一項的制劑或權利要求8-20中任一項的藥物組合物在制備用于預防和/或治療腦缺血損傷、腦外傷、腦手術創(chuàng)傷后減少神經(jīng)元死亡，促進腦功能恢復的藥物中的應用。
24.權利要求1-7中任一項的制劑或權利要求8-20中任一項的藥物組合物在制備幼兒宮內(nèi)窒息、難產(chǎn)時腦缺氧損傷后預防腦損傷性智力低下或腦發(fā)育不良的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包括攜帶神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的腺相關病毒載體制劑，該制劑中含有3－7％(w/v)的甘露醇，所述的甘露醇可以提高高濃度的重組腺相關病毒載體制劑的穩(wěn)定性。另外，本發(fā)明還涉及含有上述制劑和一種高滲溶液的藥物組合物，其中所述的高滲溶液選自甘露醇、阿拉伯糖、尿素、果糖、乳酰胺或甘油。所述的藥物組合物作為聯(lián)合制劑分別或順序給藥用于預防和/或治療中樞神經(jīng)元退行性病變。本發(fā)明的制劑或藥物組合物可用于預防和治療阿爾茨海默氏病、帕金森氏病等中樞神經(jīng)元退行性病變；并可用于腦缺血損傷、腦外傷、腦手術創(chuàng)傷后減少神經(jīng)元死亡，促進腦功能恢復；以及用于幼兒宮內(nèi)窒息、難產(chǎn)等腦缺氧損傷后預防腦損傷性智力低下或腦發(fā)育不良。
文檔編號A61P43/00GK1781549SQ20041009649
公開日2006年6月7日 申請日期2004年12月2日 優(yōu)先權日2004年12月2日
發(fā)明者王軍志, 吳勇杰, 高凱, 時小燕, 吳小兵, 饒春明 申請人:中國藥品生物制品檢定所, 蘭州大學, 本元正陽基因技術股份有限公司