專利名稱：重組人vegf腺病毒載體的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有VEGF基因的質(zhì)粒型腺病毒載體，該質(zhì)粒型腺病毒載體的構(gòu)建以及它們作為冠心病和外周動(dòng)脈缺血性血管疾病等的治療劑的應(yīng)用。
近年來，國外學(xué)者采用VEGF165的真核表達(dá)載體的裸露質(zhì)粒phVEGF165下肢肌肉中注射治療PAD，取得了令人鼓舞的效果，部分患者避免了截肢(參見所列文獻(xiàn)5和6)。CAD的基因治療近年來已有報(bào)道，可在CABG時(shí)，在病變血管供血區(qū)心肌內(nèi)注射或采用左側(cè)胸壁微切口將裸露質(zhì)粒phVEGF165或bFGF注射到缺血心肌內(nèi)(參見所列文獻(xiàn)3和4)，使難治性CAD患者的心絞痛發(fā)作次數(shù)明顯減少，硝酸甘油日用量明顯減少，運(yùn)動(dòng)耐量明顯增加，基因治療后1-2月，冠狀動(dòng)脈造影顯示，心肌缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)開通，心肌供血改善。Rosengart等采用腺病毒介導(dǎo)的VEGF121經(jīng)左側(cè)胸壁微切口缺血心肌內(nèi)注射治療CAD，治療后心絞痛發(fā)作次數(shù)明顯改善，室壁運(yùn)動(dòng)好轉(zhuǎn)(參見文獻(xiàn)7)。說明了CAD和PAD基因治療的臨床應(yīng)用價(jià)值。直接心肌內(nèi)注射DNA或通過脂質(zhì)體冠脈內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率低，不足1％，在豬慢性心肌缺血模型中證實(shí)了在注射點(diǎn)周圍0-15mm的范圍內(nèi)有較高的基因表達(dá)，離注射點(diǎn)較遠(yuǎn)的心肌，基因表達(dá)較低。Barr報(bào)道通過導(dǎo)管經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)導(dǎo)入含有細(xì)菌lacZ基因的復(fù)制缺損型腺病毒(AdCMV.lacZ)1010pfu/ml，心肌轉(zhuǎn)染效率高達(dá)32％(參見所列文獻(xiàn)13)。導(dǎo)入基因在外周器官表達(dá)少，Giordano報(bào)道僅有1.3％腺病毒到達(dá)冠脈循環(huán)以外(參見所列文獻(xiàn)14)。另外，心肌內(nèi)注射DNA常導(dǎo)致細(xì)胞的炎癥反義和心肌纖維化(參見所列文獻(xiàn)15)。相對(duì)開胸手術(shù)而言，冠脈內(nèi)導(dǎo)入基因是無創(chuàng)傷的，并且經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)導(dǎo)入重組腺病毒載體，檢測(cè)不出伴隨的炎癥反應(yīng)和心肌纖維化。目前國內(nèi)外尚未見到腺病毒介導(dǎo)的VEGF165基因治療上述疾病的報(bào)道，通過心導(dǎo)管經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)導(dǎo)入腺病毒介導(dǎo)的基因治療，可能是一種安全有效的方法，具有重大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
VEGF是最重要的促血管生成的細(xì)胞因子，是內(nèi)皮細(xì)胞特異性最強(qiáng)的絲裂原，VEGF有四種單體存在形式，分別稱為VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206。其中VEGF165的生物活性占VEGF的60％，通過內(nèi)皮細(xì)胞上其特異性受體KDR/flt-1的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移。在缺血組織內(nèi)，血管內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)VEGF mRNA及其受體的表達(dá)，從母血管中通過分裂以芽孢方式生長出新血管(參見所列文獻(xiàn)11)，建立側(cè)支循環(huán)。VEGF是新生的不成熟血管的生存因子(參見所列文獻(xiàn)12)，可促使新生血管的成熟和分化。
基因治療關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一就是如何有效地將外源基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)并使其穩(wěn)定表達(dá)。腺病毒載體被認(rèn)為是高效表達(dá)的基因轉(zhuǎn)移載體(參見文獻(xiàn)10)，由于腺病毒宿主范圍廣，不僅可感染復(fù)制分裂的細(xì)胞，也可感染靜止期細(xì)胞；包裝容量大，可以插入7.5kb的外源性基因片段；不會(huì)整合到宿主細(xì)胞的染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險(xiǎn)；病毒經(jīng)繁殖、純化，可達(dá)到很高滴度，并達(dá)100％的感染率；性質(zhì)比較穩(wěn)定，對(duì)人類相對(duì)安全等諸多優(yōu)點(diǎn)，使其在基因轉(zhuǎn)移中具有較大優(yōu)勢(shì)，成為目前基因治療中最主要的載體。
本發(fā)明構(gòu)建的Ad-hVEGF是E1區(qū)缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒，E1區(qū)基因是腺病毒復(fù)制所必需的基因，這就要求這種完整腺病毒的復(fù)制必須在E1區(qū)基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行，而293細(xì)胞正是為適應(yīng)這一需要而轉(zhuǎn)化了E1區(qū)基因的包裝細(xì)胞，這就決定了復(fù)制缺陷型腺病毒在靶細(xì)胞中只有一次感染機(jī)會(huì)而無復(fù)制能力，從而完成腺病毒載體的功能，避免腺病毒本身對(duì)靶細(xì)胞的損害，達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的，我們構(gòu)建的可表達(dá)人VEGF的Ad-hVEGF是將人VEGF.cDNA正向插入到穿梭質(zhì)粒pHCMVSP1A的CMV啟動(dòng)子之下，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pAd-hVEGF，后者與pJM17通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)同源重組獲得含人VEGF基因的重組腺病毒Ad-hVEGF。經(jīng)EcoRI、NcoI和XhoI酶切鑒定和PCR擴(kuò)增法鑒定，證明構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pAd-hVEGF165和重組腺病毒Ad-hVEGF是正確的，后者在靶細(xì)胞中表達(dá)VEGF。
2、pAd-hVEGF165(Nco I+Xho I)有511 bp片段；3、pAd-ahVEGF165(Nco I+Xho I)有101 bp片段；4、pAd-hVEGF165(EcoR I)576、6797 bp；5、pAd-ahVEGF165(EcoR I)576、6797 bp。
圖2是瓊脂糖凝膠電泳鑒定Ad-hVEGF165的PCR共擴(kuò)增結(jié)果1、PCR marker237、377、515、697、994、1543bp；2、pAd-hVEGF165為模板，擴(kuò)增出576bp的VEGF165片段；3、pHCVSP1A為模板，擴(kuò)增出860bp腺病毒骨架基因片段；4、Ad-hVEGF165病毒基因組DNA為模板，同時(shí)擴(kuò)增出576bp和860bp兩個(gè)片段。
圖3是臨床試驗(yàn)中例2患者治療前和治療后的右冠狀動(dòng)脈造影，圖示治療后右冠狀動(dòng)脈末梢與左冠狀動(dòng)脈之間側(cè)支循環(huán)增加。
在下面的實(shí)施例中，我們選擇了VEGF165為目的基因，用E1區(qū)缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒作為有效的載體，構(gòu)建的重組腺病毒Ad-hVEGF165，病毒滴度為1.94×1012pfu/ml，純度為1.5，說明病毒滴度及純度均較高，可滿足在體基因治療的需要，為治療CAD和PAD奠定了基礎(chǔ)。
以下通過實(shí)施例來描述本發(fā)明，應(yīng)該指出的是，所列舉的實(shí)施例不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
1.2質(zhì)粒和菌株
pHCMVSP1A(帶有腺病毒基因)和pJM17由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所提供；DH5α由北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科提供；pUCCAGGS/hVEGF165由日本九州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系提供。
1.3細(xì)胞系293細(xì)胞為腺病毒E1區(qū)基因轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系，培養(yǎng)條件為20％新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)。
1.4儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(Sanyo，日本)，高速冷凍離心機(jī)(Jouan，意大利)，超速冷凍離心機(jī)(Hitachi，日本)，倒置相差顯微鏡(OlympusIX-70，日本)，紫外分光光度計(jì)(752型，上海)，空氣浴，水浴搖床。
1.5攜帶VEGF165的腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建pHCMVSP1A經(jīng)EcoRI酶切后，70℃滅活15分鐘，用CIAP使載體5’端去磷酸化后，回收6797bp片段。將去磷酸化的6797 bp的載體片段與576bp的VEGF165 cDNA片段用T4DNA Ligase 4℃連接過夜，得到重組穿梭質(zhì)粒，后者轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑選菌落擴(kuò)增，小量提取質(zhì)粒后以EcoRI酶切，若電泳后得到了576bp和6797bp兩個(gè)片段，則證明VEGF165 cDNA已插入到腺病毒穿梭載體。將插入了VEGF165 cDNA的穿梭質(zhì)粒以NcoI、XhoI雙酶切，電泳后有511bp者為正義VEGF165的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd-hVEGF165，有101bp者為反義VEGF165的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd-ahVEGF165。
1.6 Lipofectamine介導(dǎo)的pAd-hVEGF165和pJM17共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(1)將293細(xì)胞接種于9cm的平皿中，37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，使其達(dá)到80％融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；(2)在Eppendorf管中按等摩爾數(shù)配置DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物在1ml無血清DMEM培養(yǎng)液中稀釋質(zhì)粒pAd-hVEGF165和pJM17，旋轉(zhuǎn)1sec，再加入Lipofectamine混懸液，混勻，室溫下放置30min，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上；(3)吸去培養(yǎng)皿中含血清的DMEM培養(yǎng)基，加1ml無血清DMEM培養(yǎng)液洗細(xì)胞1次，吸出無血清的DMEM，加入DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)4h；(4)再于培養(yǎng)皿中加入足量的含血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)8h；(5)吸去DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物，加入0.5％瓊脂糖覆蓋(0.5％瓊脂糖中含1×DMEM，10％FCS)，待其凝固后置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變情況。
1.7重組人VEGF165的腺病毒載體的PCR鑒定從共轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)細(xì)胞病變的293細(xì)胞中取培養(yǎng)上清100ul，離心去除細(xì)胞碎片，收集上清加入裂解液(0.5％SDS，20mmol/L EDTA，50ug/ml Proteinase K)400ul，于55℃作用1h后，加等量酚/氯仿/異戊醇抽提1次，上清加2倍體積無水乙醇和1/10體積的3mol/L NaAc(pH5.2)沉淀DNA。用70％乙醇洗1次，沉淀溶于20ul消毒三蒸水中，并以此DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物1和引物2為擴(kuò)增VEGF165基因的引物，引物3和4為擴(kuò)增腺病毒骨架基因片段的引物。PCR反應(yīng)體系為取模板DNA 10ul，20umol/L引物各5ul，10×PCR Buffer 5ul，2mmo/L dNTP 5ul，Taq酶1ul，加水至PCR反應(yīng)終體積50ul，用礦物油覆蓋，94℃30s，56℃30s，72℃60s循環(huán)30次，最后72℃延伸10min，在1.2％瓊脂糖進(jìn)行電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)擴(kuò)增出576bp的VEGF165基因片段和860bp的腺病毒骨架基因片段者，則為含人VEGF165的重組腺病毒Ad-ahVEGF165。引物序列如下引物15’atg aac ttt ctg ctg tct tgg 3’引物25’tca ccg cct cgg ctt gtc aca 3’引物35’tcg ttt ctc agc agc tgt tg 3’引物45’cat ctg aac tca aag cgt gg 3’1.8重組人VEGF165腺病毒Ad-hVEGF165的擴(kuò)增、純化及滴度測(cè)定取重組腺病毒上清500ul，加入至90％融合的293細(xì)胞中，37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，鏡下觀察到95％～100％細(xì)胞出現(xiàn)病變后，離心收集上清，并將細(xì)胞于-80℃和37℃之間反復(fù)凍融3次，以3000r/min離心收集上清，按Graham的方法(參見所列文獻(xiàn)9)對(duì)腺病毒上清進(jìn)行CsCl密度梯度離心純化，將純化后的腺病毒上清對(duì)透析液(10mmol/LTris-HCl，1mmol/L MgCl2，10％甘油)4℃透析2次，每次24h。將透析后的病毒液進(jìn)行滴度測(cè)定。取純化后的病毒液100ul，10％SDS 20ul，PBS 880ul，測(cè)定病毒基因組DNA的A260和A280的光吸收值，據(jù)此計(jì)算病毒的顆粒及純度，1A260＝1012pfu/ml，A260/A280＞1.3表明純度較高，病毒滴度pfu/ml＝A260×稀釋倍數(shù)×1012。
2結(jié)果2.1重組質(zhì)粒pAd-ahVEGF165的酶切鑒定結(jié)果pAd-hVEGF165以EcoRI酶切后得到了576bp和6767bp兩個(gè)片段，證實(shí)了人VEGF165插入了腺病毒穿梭質(zhì)粒的啟動(dòng)子之下。為了鑒別正向和反向插入VEGF165的腺病毒穿梭質(zhì)粒，以NcoI和XhoI雙酶切，得到511bp片段的正義VEGF165的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-hVEGF165及101bp片段的反義VEGF165的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-ahVEGF165。見

圖1。
2.2 PCR擴(kuò)增法鑒定Ad-hVEGF165的結(jié)果以提取的病毒基因組DNA為模板，同時(shí)加入VEGF165基因的引物和腺病毒骨架基因片段引物，經(jīng)擴(kuò)增后同時(shí)獲得了576bp的VEGF基因片段和860bp的腺病毒基因片段。以pHCMVSP1A為模板擴(kuò)增出860bp片段，以pAd-hVEGF165為模板擴(kuò)增出576bp基因片段。證實(shí)了pAd-hVEGF165和pJM17共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，經(jīng)同源重組產(chǎn)生了含人VEGF的重組腺病毒，見圖2。
2.3重組Ad-hVEGF165的滴度及純度重組腺病毒經(jīng)繁殖、擴(kuò)增、純化后，測(cè)得A260為0.097和A280為0.066，計(jì)算出病毒滴度為1.94×1012pfu/ml，純度為1.5，說明病毒滴度及純度均較高，可滿足在體基因治療的需要。
實(shí)施例2、臨床試驗(yàn)1、資料與方法1.1病例資料例1，男，50歲，心絞痛5年，加重1年，于2001年1月發(fā)生廣泛前壁心肌梗塞，當(dāng)時(shí)未行再灌注治療，此后頻繁發(fā)作嚴(yán)重心絞痛及左心功能不全，冠脈造影示左前降支(LAD)、左回旋支(LCX)及右冠狀動(dòng)脈(RCA)均自近段完全閉塞，僅靠分支血管供血。
例2，男，59歲，胸痛史2年，2000年2月發(fā)生廣泛前壁心肌梗塞，當(dāng)時(shí)血壓降低，明顯呼吸困難，肺部水泡音，不能平臥。冠脈造影示左主干中遠(yuǎn)段狹窄50-90％，LAD、LCX均自起始處閉塞，右冠狀動(dòng)脈近段狹窄50-80％。
1.2經(jīng)皮冠脈內(nèi)腺病毒載體導(dǎo)入經(jīng)病人及家屬的同意，于2000年4月3日行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)腺病毒載體導(dǎo)入，注射過程中未出現(xiàn)不良反應(yīng)，2例病人均在術(shù)后1小時(shí)出現(xiàn)寒戰(zhàn)、發(fā)熱，體溫39℃，靜脈推注地塞米松20mg，異丙嗪25mg及輸液治療后，3小時(shí)后體溫正常，此后未再出現(xiàn)發(fā)熱。2周后出院。術(shù)后每1-2周隨訪一次。
2、結(jié)果2.1臨床癥狀兩例病人在治療后一周開始心絞痛發(fā)作減輕、次數(shù)減少。例1在術(shù)后2周時(shí)自行停服魯南欣康、恬爾心等藥物，但心絞痛持續(xù)減輕，每天僅在夜間發(fā)作2次，持續(xù)時(shí)間短，心絞痛分級(jí)為II級(jí)。例2在術(shù)后2周時(shí)胸痛發(fā)作明顯減輕，活動(dòng)能力增加，停用消心痛、恬爾心、阿斯匹林等藥物，術(shù)后6周可平地行走5km，僅有輕微氣短，無心絞痛發(fā)作，心絞痛分級(jí)為II級(jí)。
2.2冠脈造影結(jié)果例1，術(shù)后6周時(shí)左側(cè)冠脈造影分支和側(cè)支顯影程度同前，而右冠狀動(dòng)脈造影時(shí)圓錐支、銳緣支之間及與左前降支、間隔支之間可見豐富的側(cè)支循環(huán)，使LAD、LCX中遠(yuǎn)段顯影，達(dá)到側(cè)支循環(huán)3+級(jí)。
例2，術(shù)后6周時(shí)左主干遠(yuǎn)段完全閉塞，僅見兩支細(xì)小分支顯影，右冠近段病變同前，遠(yuǎn)端與LAD、LCX及間隔支、對(duì)角支之間側(cè)支循環(huán)豐富，使LAD、LCX及對(duì)角支顯影較充分，達(dá)到側(cè)支循環(huán)3+級(jí)，見圖3。1、Eric E，Lukas K Jean-Jacques G.Stent for intracoronaryplacementCurrent status and future directions.[J].J Am CollCardiol，1996，27757-765。
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權(quán)利要求
1.一種質(zhì)粒型腺病毒載體，其特征在于它含有VEGF基因。
2.權(quán)利要求1的質(zhì)粒型腺病毒載體，其特征在于VEGF基因是VEGF121、VEGF165、VEGF189或VEGF206。
3.權(quán)利要求1的質(zhì)粒型腺病毒載體，其特征在于VEGF基因是VEGF165。
4.權(quán)利要求1的質(zhì)粒型腺病毒載體，其特征在于VEGF基因連接于腺病毒穿梭質(zhì)粒的CMV啟動(dòng)子之下。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的質(zhì)粒型腺病毒載體，其特征在于它能夠強(qiáng)表達(dá)VEGF基因。
6.權(quán)利要求1的質(zhì)粒型腺病毒載體的構(gòu)建，包括將人VEGF.cDNA正向插入到穿梭質(zhì)粒pHCMVSP1A的CMV啟動(dòng)子之下，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pAd-hVEGF，后者與pJM17通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)同源重組獲得含人VEGF基因的重組腺病毒Ad-hVEGF。
7.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的質(zhì)粒型腺病毒載體作為治療冠心病的治療劑的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的質(zhì)粒型腺病毒載體作為治療外周動(dòng)脈缺血性血管疾病的治療劑的應(yīng)用。
全文摘要
構(gòu)建含人血管內(nèi)皮生長因子的重組腺病毒載體,可用于治療嚴(yán)重性冠心病和外周嚴(yán)重性缺血性疾病。方法是將人VEGF.cDNA正向插入到穿梭質(zhì)粒pHCMVSP1A的CMV啟動(dòng)子之下,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pAd－h(huán)VEGF,后者與pJM17通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,經(jīng)同源重組獲得含人VEGF基因的重組腺病毒Ad－h(huán)VEGF。通過PCR共擴(kuò)增法鑒別Ad－h(huán)VEGF的正確與否,根據(jù)260nm的紫外吸光度(A260)計(jì)算病毒滴度。結(jié)果VEGF.cDNA成功地正向插入到pHCMVSP1A載體中,以重組病毒基因組DNA為模板,同時(shí)擴(kuò)增出了576bp的VEGF基因片段和860bp的腺病毒骨架基因片段,證實(shí)了Ad－h(huán)VEGF的正確性。測(cè)A
文檔編號(hào)A61P9/00GK1348006SQ01136779
公開日2002年5月8日 申請(qǐng)日期2001年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月25日
發(fā)明者張群林, 王家寧, 黃永章, 彭建華, 程輝 申請(qǐng)人:山西德元堂藥業(yè)有限公司