專利名稱：重水保護(hù)病毒疫苗、提高熱穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用重水保護(hù)病毒疫苗、提高耐熱病毒疫苗的穩(wěn)定性，特別是用于保護(hù)甲肝減毒活疫苗、增強(qiáng)其耐熱性的方法。
背景技術(shù)：
自從人類發(fā)現(xiàn)病毒疫苗可有效地預(yù)防病毒性疾病以來(lái)，活病毒疫苗的不穩(wěn)定性便一直困擾著人們?；钜呙绫仨氃谫A存和運(yùn)輸過(guò)程中一直保持效價(jià)(感染性)，使其接種后能在體內(nèi)復(fù)制，故需冷鏈保存。冷鏈的花費(fèi)不僅包括大量的制冷設(shè)備，還包括維護(hù)保養(yǎng)這套系統(tǒng)所需的費(fèi)用，據(jù)統(tǒng)計(jì)，這筆費(fèi)用約占受用者接種疫苗費(fèi)用的8％，這對(duì)于尚處于發(fā)展中的第三世界是一個(gè)負(fù)擔(dān)。因此迫切需要開(kāi)發(fā)一種穩(wěn)定的耐熱疫苗，對(duì)于穩(wěn)定疫苗開(kāi)發(fā)的基本要求是不能通過(guò)生物工程方法改變疫苗的基因型來(lái)提高穩(wěn)定性，以防止疫苗在應(yīng)用過(guò)程中出現(xiàn)難以預(yù)料的毒力返祖，所以，選擇一種適宜的提高穩(wěn)定性的方法便成為當(dāng)務(wù)之急。
重水(D2O)天然存在于自然界中，但其比例很少，作為一種含穩(wěn)定同位素的化合物，它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛。由于少量D2O進(jìn)入人體并不引起生命活動(dòng)異常，因此被用作生物醫(yī)學(xué)中的標(biāo)記物、示蹤劑，測(cè)量生物體的體液量，檢測(cè)藥物體液濃度或研究化學(xué)物質(zhì)在生物體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)變。目前已有的應(yīng)用表明少量重水進(jìn)入人體并不會(huì)干擾人體代謝，引起人體代謝異常，只有大劑量才對(duì)人體有生物毒性，這是我們選用重水的前提。
重水對(duì)于細(xì)菌、真菌、植物細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的影響也可見(jiàn)報(bào)道。查閱文獻(xiàn)，重水對(duì)病毒作用的研究主要如下Carp報(bào)道Polio病毒CHAT株在含重水的培養(yǎng)基中繁殖，其產(chǎn)量增加；毛江森等對(duì)Polio I型減毒株研究發(fā)現(xiàn)重水能提高其繁殖滴度、增加對(duì)熱極其敏感的日本腦炎病毒(JEV)的熱穩(wěn)定性。二十世紀(jì)九十年代，國(guó)外研究者們發(fā)現(xiàn)將重水作為穩(wěn)定劑加入口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗(OPV)中，可將其穩(wěn)定性提高到37℃保存7天。
雖然，重水(D2O)已應(yīng)用于上述病毒穩(wěn)定性的研究，但是D2O對(duì)于耐溫病毒的作用尚未有人涉及，尤其是它對(duì)于減毒活病毒疫苗低溫下的保護(hù)作用尚無(wú)人提及。由于病毒的生物學(xué)特性不同，對(duì)不同穩(wěn)定劑的反應(yīng)也不同。對(duì)重水而言，它能提高許多相對(duì)不耐溫病毒的穩(wěn)定性，但對(duì)甲肝病毒這種生物學(xué)特性比較耐溫的病毒來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定作用如何并不確定。此外，重水對(duì)不同DNA病毒和RNA病毒的適宜濃度也不同，對(duì)甲肝H2減毒株的適宜濃度也有待確定。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是用重水保護(hù)病毒疫苗、提高熱穩(wěn)定性，特別是用于保護(hù)甲肝減毒活疫苗、增強(qiáng)其耐熱性的方法、提高疫苗質(zhì)量的方法，從而使活疫苗在貯存和運(yùn)輸過(guò)程中能夠保持效價(jià)，延長(zhǎng)有效期。甲肝減毒活疫苗是生物學(xué)特性比較穩(wěn)定的耐熱病毒，重水對(duì)甲肝病毒具有保護(hù)作用，說(shuō)明重水對(duì)于病毒保護(hù)作用具有普遍性，這對(duì)于其他疫苗的研發(fā)具有實(shí)用性和參考意義，可提高疫苗的穩(wěn)定性。
本發(fā)明是一種能提高耐熱病毒疫苗穩(wěn)定性的方法，經(jīng)此方法處理后的甲肝病毒相對(duì)于對(duì)照組耐熱穩(wěn)定性明顯提高，選用一定比例的重水(D2O)濃度，經(jīng)過(guò)一定的方法處理，可對(duì)病毒疫苗起到保護(hù)作用，使病毒活疫苗穩(wěn)定性包括核酸的穩(wěn)定性得到一定程度的提高，尤其在4℃-8℃條件下較長(zhǎng)時(shí)間作用后，重水的保護(hù)作用表現(xiàn)最為明顯。
本發(fā)明包括用含相對(duì)較低濃度重水的培養(yǎng)基培養(yǎng)得到氘化甲肝病毒H2減毒株，可提高病毒穩(wěn)定性；或者直接用較高濃度的重水直接懸浮純化H2株減毒疫苗，放置一段時(shí)間后，也可提高疫苗的熱穩(wěn)定性。甲肝病毒是屬于耐熱病毒，重水對(duì)甲肝病毒H2株具有保護(hù)作用，說(shuō)明D2O對(duì)于病毒保護(hù)作用具有普遍性，這對(duì)于其他疫苗的研發(fā)具有實(shí)用性和參考意義，并且能提高疫苗質(zhì)量。
方法1選用一種合適的相對(duì)較低的重水(D2O)濃度的培養(yǎng)基，先作用于細(xì)胞使其氘化，然后再接種病毒HAV-H2株，維持28天后收獲，經(jīng)提取純化后檢測(cè)其熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定性高于對(duì)照組。
方法2選用一種較高的重水(D2O)濃度，直接將病毒HAV-H2株懸浮其中，經(jīng)一段時(shí)間后考察耐溫性，發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定性提高。
方法1的主要步驟如下1、先用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)KMB17人胚肺二倍體細(xì)胞，37℃培養(yǎng)3天后長(zhǎng)成單層，生長(zhǎng)液以LH為母液，小牛血清終濃度為10％，eagle’s的終濃度為5％，pH7.1；2、棄去原培養(yǎng)液，換成含36％D2O維持液，36℃維持38小時(shí)。其中維持液中D2O濃度36％，小牛血清2％，eagle’s含量5％，pH7.5。
3、棄去細(xì)胞原維持液，加入HAV-H2毒種1ml，37℃吸附2小時(shí)后加入含D2O的維持液，35℃維持28天，期間每周換維持液一次。
4、收獲，凍超三天，氯仿抽提純化，加入PBS-EDTA，分裝成1ml/支，-30℃凍存待用。
5、制備對(duì)照甲肝H2減毒株同上述方法2.1-2.2，所有培養(yǎng)液中均不含D2O，用普通KMB17細(xì)胞培養(yǎng)得到，收獲后凍超，提取，分裝，-30℃凍存待用。
6、不同溫度下加溫，檢測(cè)滴度變化，與對(duì)照組比較，觀察穩(wěn)定性有無(wú)提高。
7、常規(guī)組織培養(yǎng)感染法測(cè)滴度(CCID50/ml)分裝好的毒種進(jìn)行10倍系列稀釋，取相應(yīng)稀釋度的病毒液1ml接種于長(zhǎng)成單層的KMB17細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種5瓶；37℃吸附兩小時(shí)，補(bǔ)充9ml維持液，35℃恒溫培養(yǎng)，每周換液一次，維持28天收獲；低速離心后用0.5ml PBS-EDTA縣浮細(xì)胞，經(jīng)凍超離心后用雙抗夾心法測(cè)定抗-IgM，用BIO-RAD 2550酶標(biāo)儀讀記OD492吸光值，按Reed-Muench氏法計(jì)算CCID50/ml。
方法2的主要步驟如下1、疫苗超離純化后加入含85％D2O的等量液體作為病毒稀釋液，然后分裝成1ml/支。
2、樣品放置于5-10℃冰箱中保存5月，每隔一月取樣檢測(cè)其滴度變化，觀察其穩(wěn)定性有無(wú)增加；另一批樣品在4℃放置10周后，再分別置于4℃，24℃，37℃，用RT-PCR方法，與對(duì)照組相比，觀察核酸穩(wěn)定性有無(wú)變化。
本發(fā)明的是通過(guò)一定濃度重水(D2O)處理甲肝減毒活疫苗H2減毒株，來(lái)提高其熱穩(wěn)定性，。特別是對(duì)生物學(xué)特性比較穩(wěn)定的耐熱病毒--甲肝減毒活疫苗具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用在低溫(4℃-8℃)時(shí)表現(xiàn)更明顯。使活疫苗在貯存和運(yùn)輸過(guò)程中能夠保持效價(jià)，延長(zhǎng)有效期。本發(fā)明是一種能提高耐熱病毒疫苗的穩(wěn)定性，特別是用于保護(hù)甲肝減毒活疫苗、增強(qiáng)其耐熱性的方法。本方法選用一定比例的重水(D2O)濃度，經(jīng)過(guò)相應(yīng)的處理方法，用重水氘化細(xì)胞，制備得到病毒疫苗，或直接用較高濃度重水(D2O)懸浮病毒疫苗，均可對(duì)病毒疫苗起到保護(hù)作用，使病毒活疫苗穩(wěn)定性包括核酸的穩(wěn)定性得到不同程度的提高，尤其是4℃-8℃保存的疫苗，保護(hù)作用更明顯。從而提高疫苗質(zhì)量，使甲肝減毒活疫苗在貯存和運(yùn)輸過(guò)程中能夠保持效價(jià)，延長(zhǎng)有效期。甲肝病毒是屬于耐熱病毒之一，D2O對(duì)HAV-H2株具有保護(hù)作用，說(shuō)明D2O對(duì)于病毒保護(hù)作用具有普遍性，這對(duì)于其他疫苗的研發(fā)具有實(shí)用性和參考意義，可提高疫苗的穩(wěn)定性。特別是對(duì)生物學(xué)特性比較穩(wěn)定的耐熱病毒--甲肝減毒活疫苗具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用在低溫(4℃)時(shí)表現(xiàn)更明顯。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1經(jīng)D2O處理氘化-HAV-H2株對(duì)高溫(70℃，80℃)穩(wěn)定性提高的證實(shí)1、制備D2O化的KMB17細(xì)胞將KMB17細(xì)胞接種于面積為38cm2的小方瓶中，用普通生長(zhǎng)液培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天后長(zhǎng)成單層，棄去原培養(yǎng)液，換成含36％D2O維持液，36℃維持48小時(shí)。其中普通生長(zhǎng)液以LH為母液，小牛血清終濃度為10％，eagle’s的終濃度為5％，pH7.1；維持液中D2O濃度36％，小牛血清2％，eagle’s含量5％，pH7.5。
2、制備氘化的甲肝-H2減毒株，棄去細(xì)胞原維持液，加入1∶20稀釋的毒種1ml，37℃吸附2小時(shí)，加入含36％D2O的維持液，35℃培養(yǎng)28天，期間每周換維持液一次。收獲后凍超三次，氯仿抽提，加入PBS-EDTA，分裝成1ml/支，-30℃凍存待用。
3、制備對(duì)照甲肝H2減毒株同上述方法2.1-2.2，所有培養(yǎng)液中均不含D2O，用普通KMB17細(xì)胞培養(yǎng)得到，收獲后凍超，提取，分裝，-30℃凍存待用。
4、加溫實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)得到的D2O-HAV株按一定比例稀釋后分裝成1ml/支進(jìn)行不同溫度(70℃和80℃)下的加溫，分別加溫不同時(shí)間(分)，用常規(guī)組織培養(yǎng)感染法(CCID50)檢測(cè)滴度。對(duì)照組H2O-HAV株，比較兩者穩(wěn)定性差異。
結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 D2O-H2株70℃和80℃加溫不同時(shí)間(分)后的滴度(CCID50/ml)
表1結(jié)果表明，70℃、80℃加溫情況下要以看出氘氣H2株穩(wěn)定性高于對(duì)照組。
實(shí)施例2經(jīng)D2O處理的氘化-HAV-H2株在37℃條件下穩(wěn)定性提高的證實(shí)1、制備D2O化的KMB17細(xì)胞將KMB17細(xì)胞接種于面積為37cm2的小方瓶中，用普通生長(zhǎng)液培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天后長(zhǎng)成單層，棄去原培養(yǎng)液，換成含36％D2O維持液，36℃維持48小時(shí)。其中普通生長(zhǎng)液以LH為母液，小牛血清終濃度為10％，eagle’s的終濃度為5％，pH7.1；維持液D2O濃度36％，小牛血清2％，eagle’s含量5％，pH7.5。
2、制備D2O化的甲肝-H2減毒株棄去細(xì)胞原維持液，加入1∶20稀釋的毒種1ml，37℃吸附2小時(shí)，加入含36％D2O維持液，35℃培養(yǎng)28天，期間每周換維持液一次。收獲后凍超三次，氯仿抽提，加入PBS-EDTA，分裝成1ml/支，-30℃凍存待用。
3、制備對(duì)照甲肝H2減毒株同上述方法2.1-2.2所有培養(yǎng)液中均不含D2O，用普通KMB17細(xì)胞培養(yǎng)得到，收獲后凍超，提取，分裝，-30℃凍存待用。
4、37℃儲(chǔ)存條件下氘化-H2株的滴度變化制備得到的氘化-H2株分裝成1ml/支(毒種稀釋度1∶50)，在37℃溫度孵育一月，每周取樣檢測(cè)其滴度并與對(duì)照組相比較，發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)，D組滴度下降值明顯低于對(duì)照組。表明環(huán)境溫度為37℃時(shí)，氘化H2株穩(wěn)定性高于對(duì)照組。見(jiàn)表2。
表2 D2O-H2株37℃放置1個(gè)月，每隔1周檢測(cè)滴度下降(CCID50/ml)滴度下降時(shí)間D組 H組D組 H組(周)(CCID50/ml)(CCID50/ml)0 6.17 6.38 //1 5.83 5.83 0.34 0.552 5.63 5.38 0.54 1.003 4.63 4.38 1.54 2.004 3.50 3.17 2.67 3.21實(shí)施例31、同一批號(hào)(批號(hào)20000909)甲肝減毒活疫苗數(shù)支混合經(jīng)40000rpm超離4小時(shí)后倒去原MEM液，加入等量85％D2O放置于8-10℃5個(gè)月，每月取樣檢測(cè)CCID50/ml值，對(duì)照組用H2O，結(jié)果見(jiàn)下表表3 疫苗用85％D2O作懸浮液8-10℃放置1-5(月)后的滴度(CCID50/ml)值時(shí)間(月)D H 滴度下降 D H0 6.17 6.38 / /1 6.17 6.17 0.00 0.212 5.83 5.63 0.34 0.753 5.63 5.17 0.54 1.214 5.50 4.83 0.67 1.555 5.50 4.63 0.67 1.75(t檢驗(yàn)，t＝-1.31，0.5＞P＞0.2)由表3可知，隨時(shí)間延長(zhǎng)，D組滴度下降明顯小于H組，說(shuō)明D組疫苗穩(wěn)定性高于對(duì)照組。
實(shí)施例42、同一批號(hào)(批號(hào)20000909)甲肝減毒活疫苗混合經(jīng)40000rpm超速離心后倒去原母液(MEM)，加入等量85％D2O(對(duì)照組加入等量H2O)分裝成1ml/支，放置于4℃10周后分成三組繼續(xù)放置于4℃，24℃，37℃，每隔一周，三周，五周取出樣品，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)RT-PCR值，結(jié)果見(jiàn)表4表4 疫苗超離后用85％D2O作稀釋液不同溫度放置(周)后的RT-PCR值超離溫度 4℃ 24℃ 37℃次數(shù)時(shí)間 D組 H組 D組 H組 D組 H組第一次 0周 5.335.001周 5.334.675.004.334.674.002周 5.334.504.674.004.503.673周 5.334.674.503.674.003.33第二次 0周 5.505.503周 5.675.334.673.674.333.505周 5.505.333.672.332.671.67(t檢驗(yàn)，t＝1.31，0.5＞P＞0.2)
表4可知，D組RT-PCR值下降小于H組，說(shuō)明在＜37℃溫和溫度條件下85％D2O對(duì)疫苗核酸有一定的保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明是一種用重水保護(hù)病毒疫苗、提高熱穩(wěn)定性的方法，其特征在于選用一定比例的重水(D2O)濃度，對(duì)培養(yǎng)病毒用細(xì)胞進(jìn)行氘化，然后培養(yǎng)病毒疫苗；或者直接用重水(D2O)氘化純化病毒疫苗，可對(duì)病毒疫苗起到保護(hù)作用，使病毒疫苗穩(wěn)定性包括核酸的穩(wěn)定性得到一定程度的提高。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于重水(D2O)比例為36％--85％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于重水(D2O)處理后疫苗在4℃-8℃儲(chǔ)藏條件下保護(hù)作用最為明顯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于用RT-PCR方法檢測(cè)核酸穩(wěn)定性，證實(shí)了重水(D2O)在較低溫條件下可通過(guò)提高核酸穩(wěn)定性起到保護(hù)作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于重水(D2O)對(duì)較耐溫病毒穩(wěn)定性的提高有保護(hù)作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于重水(D2O)的保護(hù)對(duì)象是病毒疫苗，可用于病毒疫苗穩(wěn)定性的提高。
全文摘要
本發(fā)明是一種用重水保護(hù)病毒疫苗、提高耐熱病毒穩(wěn)定性，特別是用于保護(hù)甲肝減毒活疫苗、增強(qiáng)其耐熱性的方法。本方法選用一定比例的重水(D
文檔編號(hào)A61K47/02GK1704122SQ200410024940
公開(kāi)日2005年12月7日 申請(qǐng)日期2004年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月2日
發(fā)明者陳悅青, 毛江森, 莊昉成, 唐彩華, 柴少愛(ài), 錢汶 申請(qǐng)人:浙江普康生物技術(shù)股份有限公司, 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院