專利名稱:用作疫苗和診斷標記的淋病奈瑟氏菌植物凝血素及其制備方法
本發(fā)明有關一種適用于抗淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)的接種物或疫苗的植物凝血素，有關一種含有植物凝血素的疫苗，及有關診斷淋病的方法。具體地說，本發(fā)明有關可從淋球菌得到的淋病奈瑟氏菌植物凝血素，并有關分離凝血素的方法，有關從它們制備的一種接種物和/或疫苗;以及有關生產上述凝血素的方法。
據報導因淋病奈瑟氏菌(N.g)感染，年發(fā)病率估計有200萬例。人體中淋球菌感染通常導致相對未并發(fā)的泌尿生殖系統(tǒng)的感染。又報導了在淋病方面，因淋病菌傳播感染發(fā)病率達1-3%，但是這類疾病癥狀用現(xiàn)行的治療方法效果很差。
另一方面，在婦女中因淋病感染，輸卵管炎的發(fā)病率占10-20%，甚至在適當治療后，可能產生輸卵管炎復發(fā)、子宮外孕和不育癥。估計在美國每年因輸卵管炎導致有180萬職員請私人醫(yī)生治療，有22萬人住院治療。
依靠公共衛(wèi)生措施控制淋病至今還是困難的。Greenburg等在“世界衛(wèi)生組織通報”45531頁1971年發(fā)表文章“開展淋球菌疫苗的初步研究”報導了由全部殺死的淋球菌制成的疫苗毫無療效。
抗淋球菌的青霉素和四環(huán)素菌株也已問世。
淋球菌感染包括由細菌粘膜的移生，一種依靠移生細胞粘合力傳遞至膜表面的過程。術語“粘合力”意指細菌附著于表面比較穩(wěn)定。有如此粘附活性任何可靠結構都稱做粘接物。
淋球菌傘毛是一種具有由相同重復亞單元)傘毛蛋白-pilin)組成的絲狀結構的粘著物。在N.g的MS11菌株中，每個傘毛蛋白的分子量約18，000道爾頓，淋球菌與上皮表面結合可能被抗傘毛抗體封阻。除封阻細胞的結合外，對傘毛蛋白產生的抗體也就是調理素，即它們通過血液中的各噬細胞，殺死侵入細菌。然而，由于缺乏通過不同N.g菌株形成的傘毛的血清交叉反應，因而提出使用傘毛免疫劑作為疫苗是不實際的。
我們發(fā)現(xiàn)，真核生物細胞表面糖〔神經〕鞘脂類，如乳糖基神經酰胺，異球丙糖基神經酰胺(isoglobotri sylcetamide)，神經節(jié)丙糖基神經酰胺(gangliotriocylcoramide)和神經節(jié)丁糖基神經酰胺(gangliotetraosylceramide)，均包括在N.g.的識別和粘合力之中，此外，還發(fā)現(xiàn)糖脂的直接識別可借助于至今未報導過的細菌植物凝血素，一種具有能識別特殊糖類系列(碳水化合物結構)并與之結合的細菌蛋白。這種細菌植物凝血素，當用于接種物、疫苗的組成，或用于診斷鑒定時，沒有上述提到的傘毛免疫劑的缺點。
本發(fā)明企圖分離名為GCL-1的細菌植物凝血素。這種植物凝血素可從淋球菌中得到，并與真核生物糖類相結合，相對分子量約為22400道爾頓。該植物凝血素的等電點pH值約6.1-6.4，它具有與神經節(jié)丁糖基神綠酰胺特殊結合的能力，并用作為抗淋病的接種物和疫苗的組成。這種植物凝血素也用于淋病的診斷方法。這種植物凝血素可以其分離形式或其在藥物上可接受的鹽的形式使用。
另外，本發(fā)明旨在由上述提到的分離的植物凝血素或其在藥物上可接受的鹽及其在藥物上可接受的載體組成的接種物和疫苗。還提出一種抗淋球菌感染的免疫方法，即通過給病人施用有效量的、在藥物上可接受的載體或稀釋劑中含有上述分離的植物凝血素或其鹽。
本發(fā)明進一步提出了分離GCL-1植物凝血素的DNA片段及存在于生物宿主和培養(yǎng)物中同樣的DNA片段，在該培養(yǎng)物中上述生物宿主同適宜于表達GCL-1編碼基因的該GCL-1編碼基因存在于表達載體中，同時包含在合適的表達介質中。
附圖系本發(fā)明的公開部分圖1是涂銀的具有標記蛋白質分子量位置的12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的(SDS-PAGE)凝膠照片，并以其各自的相對分子量以1千道爾頓為單位表示在圖的右面。
帶A含具有相對分子量約18000道爾頓的純傘毛蛋白。
帶B含有本發(fā)明從實例1得到的粗品GCL-1提取物中親合吸收后剩余的蛋白質樣品。在檢測方法的范圍水平內沒有證明GCL-1的存在。然而，在18000分子量的位置上可以看到傘毛蛋白。
帶C含有存在于22400道爾頓位置上親合分離的GCL-1。不存在大量傘毛蛋白或與其相結合的蛋白。
帶D含有按實例1敘述的須經紅細胞糖苷脂親合分離的粗品GCL-1萃取溶液洗脫液。該溶液用作對照檢測與糖脂親合基質的非特異結合。在該帶中不存在顯著量的GCL-1，表明GCL-1與神經節(jié)丁糖基神經酰胺親合基質的結合是一種特殊的植物凝血素-配位體相互體作用。
帶E含有下列分子量標記的蛋白質α-乳白蛋白14;大豆胰蛋白酶抑制劑20;胰蛋白酶原24;碳酸酐酶29;甘油醛-3-磷酸(酯)脫氫酶36;卵白蛋白45;和牛蛋白66，以上都以1千道爾頓單位計。
圖2是GCL-1的Western印跡分析照片，含有用免抗GCL-1抗體增加親合分離GCL-1的溶液。印跡的左面指的是具有相對分子量以數千道爾頓計的蛋白質的期望位置。
帶A含有按實例1產生的粗品GCL-1提取物的樣品。GCL-1是具有相對分子量約為22，400道爾頓的蛋白質主帶。兩個蛋白質次帶是與傘毛蛋白結合的植物凝血素，分別出現(xiàn)在約29000道爾頓位置和36000道爾頓的位置上。
帶B含有按實例1制成的含傘毛蛋白丸的樣品。其中GCL-1大量存在，還大量存在其它傘毛蛋白和與傘毛蛋白相結合的蛋白。
帶C含有親合分離的GCL-1基本不含與傘毛蛋白相結合的其他蛋白。
圖3是Western印跡照片。表示免抗GCL-1抗體與由Morexella牛產生的蛋白質交叉反應，該種蛋白質具有由N.g.(箭頭)產生的GCL-1相同的相對分子量。帶A含有按實施1N.g.菌株MS11無傘毛變異體B2制備的粗品GCL-1提取物。帶B含有從Morexella牛中用類似方法制備的提取物。
圖4是實例1粗品GCL-1提取物，通過從單P聚焦層析柱洗脫純化的表圖，用PH梯度表示。洗脫液通過在吸光率為280毫微米(O.D.280.)處測定光密度以檢測其所含蛋白質，洗脫餾分的PH梯度線性增加。含GCL-1峰值部份是從PH值略高于約6.1至6.4處的聚焦層析柱洗脫得到的，用箭頭表示。
圖5是Western印跡分析GCL的照片，含有通過聚焦層析分離的用兔抗GCL-1抗體增加的GCL-1溶液。印跡左邊表示具有相對分子量蛋白質期望的位置，用千道爾頓表示。
帶A含有按實例5敘述的質粒PHSS6，但是沒有任何淋球菌DNA插入的大腸桿菌(Escherichia coli)培養(yǎng)物的樣品。該樣品是溶解在SDS-PAGE樣品緩沖劑中，通過電泳以及Western印跡法進行如分離實例5敘述。
帶B含有按實例1產生的粗品GCL-1提取物樣品，如帶A敘述的分析。GCL-1是具有相對分子量約22400道爾頓的蛋白質主帶。
帶C含有如下分子量標記的蛋白質(美國馬里蘭州蓋瑟堡貝塞斯達研究室);肌凝蛋白200;磷酸化酶b97.4;牛血清白蛋白68;卵白蛋白43;糜蛋白酶原25.7;β-乳球蛋白18.4;和溶菌酶14.3，以上均以1千道爾頓單位表示。
帶D到0含有從大腸桿菌的多個培養(yǎng)物得到一試樣，而該大腸桿菌含有用淋球菌DNA插入的質粒pHdd6，如實例5所述，并按帶A所述進行分析。
術語定義本文所用的術語“抗體”，其各種字面上的含義都涉及免疫球蛋白或含有生物活性抗體結合部位的免疫球蛋白片段，而該結合部位實際上是與抗原結合。
在本文中所用的“復合物”涉及植物凝血素具體與配位體結合時所形成的產品。
在本文中所用的“免疫反應物”涉及免疫反應的產物，例如抗原由抗體免疫結合時所產生的實體。
本文所用的涉及植物凝血素“分離的”一詞是指一種實際上不含其他淋球菌蛋白的植物凝血素。當用該術語描述本發(fā)明的抗體制劑時，是指抗GCL-1抗體，而它實際上是不含其他抗淋球菌蛋白的抗體。
術語“配位體”涉及具有糖類結構的分子，而實際上被植物凝血素結合。
本文所用的術語“藥物上可接受的鹽”是指分離植物凝血素的無毒性的堿金屬鹽，堿土金屬鹽或銨鹽。這樣的鹽通常用于制藥業(yè)中，包括鈉鹽，鉀鹽，鋰鹽，鈣鹽，鎂鹽和銨鹽等，這些鹽類物是用本領域中眾所周知的方法制備的。該術語還包括無毒性的酸加成鹽，通常是將本發(fā)明的植物凝血素與適當的有機酸或無機酸反應取。具有代表性的鹽包括氯化氫、溴化氫、硫酸鹽、硫酸氫鹽、乙酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、棕檬酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、灑石酸鹽等。
由本發(fā)明期望制得的分離的淋球菌糖結合蛋白或植物凝血素，具有其相對分子量約為22，400道爾頓，其測定方法是采用SDS-PAGE，并采用α-乳清蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑，胰蛋白酶原、碳酸酐酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、卵清蛋白和小牛清蛋白作為對比分子量的標準物。即本發(fā)明的植物凝血素(GCL-1)的電泳遷移率是介乎大豆胰蛋白酶抑制劑與胰蛋白酶原的遷移率之間。該領域用SDS-PAGE測定分子量的技術和可靠性業(yè)已眾所周知。韋伯等人，《生物化學雜志》第244卷，第4406～4412頁上(1969年)，茨瓦安，《生物化學分析雜志》，第21卷，155～168頁(1967年)。
GCL-1的進一步特征在于其等電點pH值約為6.1～6.4。蛋白質的等電pH值或等電點(pI)是蛋白質的不再具有凈放電時的pH值。而在該等電點時，蛋白質不再在電場中發(fā)生移動。用聚丙烯酰胺凝膠測定蛋白質的等電點pH值的方法也是現(xiàn)有技術中熟知的方法。艾倫RC和莫勒，H.R，《聚丙烯酰胺凝膠的電泳法和等電聚焦法》瓦爾特，格里特，紐約(1984年);阿巴思諾特，J.P.和比利，J.A.《等電聚焦法》，Butter worths出版，倫敦(1975年)。
GCL-1也具體地與糖〔神經〕鞘脂類，乳糖基神經酰胺、異球丙糖基神經酰胺、神經節(jié)丙糖基神經酰胺和神經節(jié)丁糖基神經酰胺相結合。
測定植物凝血素具體與糖配位體結合的能力的方法在現(xiàn)有技術中也是公知的。這些方法包括通過涉及的植物凝血素，對紅血細胞凝集作用或多糖沉淀作用進行結合抑制性研究的方法。用植物凝血素或用糖配位體作為親合吸收劑進行親合色譜法，也能用于本發(fā)明。
一般是將GCL-1的已知用量與(糖〔神經〕鞘脂類)的預測用量混合。在生物測定條件下，保持該混合物在數分鐘到數小時的預定時間內，例如大約10分鐘到大約16～20小時，即用足夠的時間使GCL-1與(糖〔神經〕鞘脂類)配位體形成復合物。
生物測定條件是指保持本發(fā)明的分離植物凝血素和其標記的配位體的生物活性。這樣的測定條件包括溫度約為4℃到45℃，pH值大約為5到9，離子濃度的變化范圍約從蒸餾水的離子濃度至大約1摩爾氯化鈉的離子濃度。優(yōu)選這些條件的方法在現(xiàn)有技術中也是公知的。
于是，測定含有形成復合物的GCL-1的存在，也能直接或間接地采用在現(xiàn)有技術中公知的測定技術。
將GCL-1具體結合到糖〔神經〕鞘脂類上的方法，也是在現(xiàn)有技術中所公知的。請參閱例如，漢斯生等人的“FEBS”第170期，第15-18頁，(1984年);布賴姆等人，在《生物化學雜志》上發(fā)表的文章，第90期，第589～609頁(1981年);卡爾生和拉生的，《生物化學雜志》第257期，第557-568頁，(1982年);布賴姆等人的，《生物醫(yī)學質譜法》，第6期，第231-241頁(1979年);漢斯生等人的，《生物化學和生物物理學學報》第750期，第214～216頁，(1983年)。
本發(fā)明的另一方面屬于分離GCL-1的方法。這種方法要求利用該植物凝血素的上述各項性質，將含有植物凝血素的溶液進行分離。
尤其是通過從N.g.的表層蛋白萃取，首先得到含有GCL-1的溶液。為此，要從N.g.中切斷表層蛋白，典型地是用等滲的、非變性的緩沖溶液渦動N.g.。再通過離心分離將殘余細胞和碎片從得到的溶液中分離。得到的上清液含有GCL-1蛋白，然后對其進行回收。
各種方法像凝膠過濾、凝膠色譜、色譜聚焦法、超濾法、電泳遷移法、離子交換法等，這些都是蛋白質分離的公知方法，于是能用上述特征的方法將某一蛋白質與現(xiàn)有其他蛋白質進行分離。
例如，在現(xiàn)有技術中已有涉及兩種不同電泳分離技術的雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法(2D-PAGE)，能從復合生物源中重復分離蛋白質。在第一向根據蛋白質各自的等電點，通過等電聚焦法(IEF)，然后在第二向根據其分子量通過SDS-PAGE，來分離溶液中的蛋白質。由于蛋白質離析是根據各向特征，所以得到穿過雙向凝膠，基本上均勻分布的蛋白質離散斑點。具有上述等電點和分子量的相關蛋白質的離散斑點，分離植物凝血素GCL-1，然后再通過常規(guī)技術從該凝膠中進行回收。
另一方面，用液相色譜聚焦層析法從存在于上述上清液的其他蛋白質中分離出GCL-1。這種方法是根據蛋白的質等電點的差別來分離蛋白質。根據流過層析柱的pH梯度，聚焦蛋白質，再按其等電點大小的順序進行洗脫。收集相應于上述等電點的各部份，并從所收集的各部份中用常規(guī)技術回收GCL-1。
通過用含有該蛋白質的液體進行一種或多種分離具有實際結合配位體能力的蛋白質的公知方法，也能分離GCL-1，其中公知的方法有親合色譜法，親合吸附法以及類似的方法。當采用這種可行的分離方法時，一般將含有GCL-1的液體與像神經節(jié)丁糖基神經酰胺的固體加基體的配位體混合。將得到的該混合物保持在生物測定的條件下，以足夠的時間使GCL-1實際結合到固體加基體的配位體上，以形成固相復合物。然而將從該固相復合物中非具體結合的蛋白質，通常用緩沖液洗滌或漂清。因此，從固相附加的配位體中分離GCL-1，并洗脫成分離的形式。
另外，也能采用免疫化方法，從含有植物凝血素的液體中，用下文所述的抗體分離出GCL-1。這些方法，例如免疫親合法。免疫吸附法以及類似的方法均能采用，按類似于上述的方法，將糖脂配位體基進行親合提純。
用公知的重組體DNA技術也能產生分離形式的GCL-1。主要地是，將N.g.中的DNA分離，并通過切斷或通過核酸內切限制酶消化將其分裂。將這些片段插入質粒載體中，例如pHSS6或入一噬菌體載體。將會有載體的插入物導入相容的宿主中進行繁殖。再接著將含有載體的宿主克隆，測光該克隆中含有GCL-1基團因的質粒的存在。
于是，含有GCL-1基因的克隆載體，可以用作表達載體，以直接表達GCL-1基因產物。在有些情況下，期望用不同的載體或不同的生物宿主，以操作GCL-1基因進一步調節(jié)其表達。
于是，從含有該基因的質粒中分離GCL-1基因，并用適當的核苷酸序列重組，以生成一種轉錄轉譯表達載體。然后，將GCL-1基因表達載體導入適當的轉錄轉譯原核生物的表達介質，例如細菌宿主，其核生物表達例如酵母或哺乳類動物宿主〔例如中國老鼠卵巢細胞〕，或例如由戴維斯和朱伯所介紹的離體介質(美國國家科學院會議錄，第57卷，第267頁，1967年)。
本發(fā)明的另一方面，是將本發(fā)明的植物凝血素或其鹽用于藥物上可接受的稀釋液或載體，以形成接種物或疫苗，并以有效量給病人用藥后，這些物質能與GCL-1在N.g.表面發(fā)生免疫反應，產生的抗體由此消除粘接到表面膜的粘接物。
在本文中以各種字面形式所用的術語“接種物”，是描述含有本發(fā)明植物凝血素作為誘導對GCL-1產生抗體的活性成分的組合物。
接種物能用在哺乳動物內產生抗體，所述哺乳動物例如有小鼠、白兔、山羊、馬等，以用來診斷測定，鑒別用GCL-1表達的N.g.細胞。接種物也能用作含有本發(fā)明有效量的植物凝血素的疫苗，可保護接種的單體免受淋球菌感染，從而防止淋病感染。必要時也可以采用激發(fā)注射或各種注射。
本文采用的術語“疫苗”是指保護人體的疫苗。本文采用的術語“接種物”是指含有本發(fā)明的蛋白質作為活性成分的組合物，用來產生致免疫地結合到淋球菌GCL-1上的抗體。疫苗和接種物可含有相同的成分。然而預期使用的目的是不同的。
單位劑量的分離GCL-1有效量還取決于接種動物的種類，動物的體重以及所選用現(xiàn)有技術中公知的接種方法。每次接種(劑量)的GCL-1濃度一般約為10微克到大約500毫克，每次接種的優(yōu)選濃度約為100微克到100毫克。
術語“單位劑量”指適宜于作為動物單一劑量的軀體的獨立單位，計算每個單位含有活性物質的預定量。其產生的令人滿意的療效與所要求的稀釋劑如載體或賦形劑有關。對于本發(fā)明采用的新的單位劑量的規(guī)格取決于并且直接取決于(1)活性物質的單一特征以及得到特殊的免疫作用;和(2)限制化合這種用于產生人體內免疫的活性物固有性質，正如說明書中詳細公開的，這些均是本發(fā)明的特征。
一般通過將植物凝血素懸浮在生理上能忍受的稀釋液中從本發(fā)明的分離細菌植物凝血素中制備接種物，其中所述的稀釋液為水，生理鹽水或緩沖磷酸鹽生理鹽水(PBS)。如果需要，通常也可將添加物用于疫苗或接種物中。這種添加物的例子是穩(wěn)定劑和佐劑，穩(wěn)定劑例如乳糖或山梨糖醇，佐劑例如氫氧化鋁，硫酸鹽或磷酸鹽，明礬，或藻酸鹽。沉淀的磷酸鋁(AlPO4)是一特別適用于疫苗的佐劑，而弗蘭德(Freund)完全佐劑(CFA)和弗蘭德不完全佐劑(IFA)則更適用于接種物。
本發(fā)明的疫苗和接種物可以用針劑，通常用肌肉注射或皮下注射，口服腸道吸收膠囊或片劑，像栓劑，鼻吸噴霧劑，和其它適合的用藥方式。
由本發(fā)明分離形式的細菌植物凝血素引起的抗體還構成本發(fā)明的另一個實施例。本發(fā)明分離抗體的制劑僅僅基本上顯示對GCL-1的抗淋病球菌的活性。
利用前述接種物，通過免疫方法，可在哺乳動物，例如在兔子、山羊、馬等體內產生分離形式的抗GCL-1抗體，分離的抗體制劑也能夠利用本發(fā)明分離的細菌植物凝血素和先有技術中公知的方法通過免疫親合純化來制取。
分離的抗GCL-1抗體制劑也可以利用在奈門等在1985年美國國家科學院會議錄等82卷7924-7928頁中所介紹的雜種瘤技術制備，該文已列為本文參考文獻。
為了從所產生的單克隆抗體中生成雜種瘤，將骨髓瘤或其它自體惡變細胞系與從用GCL-1超免疫的哺乳動物脾臟獲得的淋巴細胞進行融合。
骨髓瘤細胞系最好來自與淋巴細胞同類的細胞。129G1X+品系的小鼠是一類最佳的哺乳動物。用于本發(fā)明的合適的小鼠骨髓瘤包括對次黃嘌呤-氨基蝶蛉-胸苷敏感的(HAT)細胞系P3X63-Ag8.653(ATCC CRL15080)，和Sp2/O-Ag14(ATCC CRL 1581)。
一般用聚乙烯二醇(PEG)1500，將膚臟細胞與骨髓瘤細胞融合。以對HAT的敏感度挑選出融合的雜種。產生本發(fā)明抗體的雜種瘤，可通過采用本文所述連接抗GCL-1酶的免疫吸收劑(ELISA)測定方法進行鑒定。
單克隆抗體不僅能夠從雜種瘤培養(yǎng)物的上清液里獲得，而且一般也可以從已經引入需雜種瘤的哺乳動物腹水液體里獲得較高濃度的形式。采用腹水液體產生單克隆抗體是公知的技術，這里無需贅述。
本發(fā)明分離的細菌植物凝血素是專門用于測定機體樣品例如血液、血清或血漿中抗GCL-1抗體的存在和含量。
在一個實施例中，本發(fā)明還提出一種測定機體樣品中存在抗GCL-1抗體的方法，包括以下步驟(a)提供一被分析的機體樣品。這種典型樣品是一已知量的血液，最好是血清或血漿。提供血液、血清或血漿樣品的方法是先有技術所熟知的。
(b)接著，提供一預估量的本發(fā)明的分離細菌植物凝血素。
(c)接著，將抗體樣品與分離細菌植物凝血素混合形成免疫反應混合物，(d)將獲得的混合物保持在生物測定條件下從幾分鐘到幾小時的這樣一段預定時間。通常大約10分鐘到大約16～20個小時的一段時間，足以使存在于樣品中的任何抗GCL-1抗體免疫地結合到植物凝血素，以形成免疫反應物。
免疫反應的生物測定條件類似于所描述的用于植物凝血素配位體結合測定的條件。
(e)在生物試驗條件下保存的混合物則用于測定在前述的保存期間所生成的任何免疫反應物的存在。免疫反應物的存在表示，樣品中存在著抗GCL-1抗體。
用于測定含有免疫反應物的抗GCL-1抗體的存在，無論是直接的還是間接的，都能被公知的先有技術中的測定技術所完成。例如，可以采用均一測定系統(tǒng)，如同在美國專利號4536479;4233401，4233402和3996345中所述。
在最佳實施例中，測定與植物凝血素結合的抗GCL-1抗體的存在的步驟如下(ⅰ)一機體樣品與標記有生物活性的結合任何人體免疫球蛋白的抗體連結在一起，此免疫球蛋白可能在機體樣品中存在以生成免疫反應物。標記抗體能夠提供免疫反應物中存在抗體的信號。
(ⅱ)如此生成的標記抗/內液樣品混合物在生物測定條件下保持預定的充分時間，使該抗體與作為第一免疫反應物存在的任何抗GCL-1抗體生成免疫反應物。免疫反應也能以上述的步驟(d)中所介紹的類似方法來實現(xiàn)。
在特別優(yōu)擇的測定中，本發(fā)明的植物凝血素和標記抗體即免疫地結合在存在于體液試樣中的任何抗GCL-1抗體上，從而形成一種含有結合成為其組成部分的標記的三明治式(Sandwich)免疫反應劑。也就是說，當抗GCL-1抗體的一個分子1)作為一種抗體與本發(fā)明的植物凝血素進行免疫反應時;和2)作為一種抗原與一種標記抗體進行免疫反應時，即形成一種含有標記的三明治式(Sandwich)免疫反應劑。在優(yōu)擇的實施方案中，在測定是否有標記抗體存在之前，可將任何不能成為免疫反應劑的一部分的標記抗體(即，不能免疫地結合在GCL-1抗體上的標記抗體)，最好是用洗滌的方法，從免疫反應劑中分離出來。
(ⅲ)然后測定是否有結合成為含有抗GCL-1抗體免疫反應劑的組成部分的標記抗體的存在。此法可測定體液試樣中是否有抗GCL-1抗體存在。測出結合成為免疫反應劑的組成部分的標記抗體的數量。此法可用來定量測定試樣中抗GCL-1抗體的數量。當然，該數量可以是零，亦即表示在可測知的范圍內，體液試樣中無抗GCL-1抗體存在。檢驗是否有第二種標記抗體的存在及其數量的方法，取決于所用的標記，此類標記和測定方法在本技術領域：
中是眾所周知的。
將蛋白抗體進行標記也是一種眾所周知的方法。例如，通過代謝參入用作組織培養(yǎng)基組分的含有同位素的氨基酸，可將雜交瘤產生的抗體進行標記。見，例如，Galfre，G.和Milstein，C.Meth.Euzymel.733-46(1981年)。通過活化官能團將蛋白結合或偶聯(lián)的技術是特別適用的。見，例如，Aurameas等人，Scand.J.Immunol.8，Snppl，77-23(1978年)和美國專利第4，493，795號，這兩份資料均已列入本發(fā)明的參考文獻。此外，可進行位取向偶聯(lián)反應，使標記實際上不會干擾第二種抗體與其靶抗原的免疫反應。見，例如，Rodwell等人，Biotech.3889-894(1985年)。
標記劑可以是一種以化學作用與抗體或抗原結合的但了不會使它們變性的熒光標記劑，以形成一種有用的免疫熒光示蹤劑的熒光染料。適用的熒光標記劑是諸如熒光素異氰酸酯(FIC)、熒光素異硫代氰酸酯(FITC)、5-二甲胺-1-萘次甲基磺酰氯(DANSC)、四甲基若丹明異硫代氰酸酯(TRITC)、麗絲胺、若丹明8200磺酰氯(RB200SC)等一類的熒光染料。在Wiley & Sons有限公司紐約N.Y.(1982年)出版的由Marchalonis等人編輯的The Antibody as a Tool書中第189-231頁，由“免疫熒光分析(Immunogluorescence Analysis)”一書中，對免疫熒光分析技術進行了詳細的闡述。該書已列入本文的參考文獻。
在優(yōu)擇的實施方案中，指示基因是諸如辣木過氧化物酶(HRP)、葡糖氧化酶等一類的酶。在主要指示基因是諸如辣木過氧化物酶(HRP)或葡糖氧化酶一類的酶時，還需要附加的試劑來觀測一種抗體配位體配合物(免疫反應劑)已經形成的實際情況。此種在觀察HRP時所用的附加試劑包括，過氧化氫和一種氧化染料前體，例如二氨基聯(lián)苯胺。觀測葡糖氧化酶對適用的附加試劑是2，2′-連氮基-二-(3-乙基-苯基噻唑啉-G-磺酸(ABTS)。
放射性元素也是有用的標記劑。
一種有代表性的放射性標記劑是可產生γ射線的放射性元素。象124Ⅰ、125Ⅰ、128Ⅰ、131Ⅰ、132Ⅰ和51Cr一類本身能發(fā)射γ射線的元素，代表了一類可產生γ射線的指示基團放射性元素。特別優(yōu)擇的是125Ⅰ。另一組有用的指示基團是基本身可發(fā)射正電了的元素，例如11C、18F、15O和13N。所發(fā)射出來的正電子在與動物體內的電子碰撞時即產生γ射線。可發(fā)射β射線的元素也是適用的發(fā)射性元素標記劑，例如111In。
本發(fā)明的測定方法和系統(tǒng)能使用添加于固體基質而形成載體的本發(fā)明植物凝血素或抗植物凝血素抗體。
通過由一種含水介質的吸附，把植物凝血素或抗植物凝血素抗體典型地添加于固體基質上，雖然這也可使用本領域技術人員熟知的一些吸附方法以及其它添加方法。這類方法的例子為植物凝血素或抗植物凝血素抗體同羧基官能度反應，羧基官能度由溴化氰同含葡萄糖基質例如交聯(lián)右旋糖或纖維素反應制得。下文將連同膠乳粒了等一起對作為連接的戊二醛進行討論。
對本領域技術人員所知的有效固體基質包括現(xiàn)有的交聯(lián)的右旋糖酐(Pharmacia Fine Chemicals，Piscataway，NJ所提供為SEPHADEX商標);直徑約1微米至約5毫米的聚苯乙烯粒珠(由北芝加哥AL Abbott實驗室提供)，聚氯乙烯;聚苯乙烯;交聯(lián)聚丙烯酰胺;硝化纖維素，錦綸基質織物如片，條或葉;管，板或微量滴定板的井例如那些由聚苯乙烯或聚氯乙烯所制備的，以及等等。
用于凝集型測定的乳膠粒子也能用作為固體基質，這類物質由日本東京，日本合成橡膠公司商業(yè)性提供，并且是作為分散于陰離子肥皂的羰酸官能團粒子來加以描述。具有代表性的這種粒子的直徑為0.308微米，每羧基平均羧基官能團分布約為15至30平方埃。
在使用前，粒了先用二胺如1，3-二氨基-2-丙醇處理，使得維持處于游離胺基團下，同粒子羧基相連形成多重酰胺鍵。然后游離胺同二醛如戊二醛和抗體或抗原反應得到席夫鹼反應產物。接著，用水溶性還原劑如氫硼化鈉還原席夫鹼反應產物得到有效的載體。
本領域技術人員知道數目眾多的固相免疫測定的方法可以采用。例如，有效固相測定包括增殖酶免疫測定技術(EMIT)和熒光免疫測定(FIA)，以及將具體討論的ELISA。然而，事實上由抗GCL-1抗體同本發(fā)明的植物凝血素反應而傳遞所產生信號的任何方法都是適合的。那些測定方法中的每一個都能采用單或雙抗體技術，該技術中使用指示裝置給出免疫反應信號，從而測定出抗體同本發(fā)明植物凝血素的結合。Maggio《酶免疫測定》，CRC Press，Cheueland，OH(1981)描述了該實驗技術，Goldman《熒光抗體方法》，Academic Press，紐約(1980)上也有描述。
測定用于抗GCL-1抗體的體液樣品的方法的一個具體實施例是非競爭性ELISA，其中是順序地進行免疫反應的。在這樣的測定中，等分量的本發(fā)明植物凝血素(例如通常為約1至約500微克)被添加在微量滴定井的內壁上，形成一個載體。
然后，存在于所提供的體樣上的抗GCL-1抗體同固相植物凝血素起免疫反應。用等分量(如約10至約200毫升樣品)(可預稀釋)如血漿血清在微量滴定井里同吸附于植物凝血素的固相相混，從而完成得到一個固/液相混合物。維持混合物足夠的預定時間，使存在于樣品里的任何抗GCL-1抗體能同植物凝血素分子進行免疫原學地結合，并且形成一個固相免疫反應物。接著，分離固相和液相，固相進行典型地漂洗來保證除去非特種的結合物質。
然后以固相免疫反應物形式存在的抗GCL-1抗體(也就是結合于固相吸附植物凝血素上的抗GCL-1抗體)同標有酶的第二抗體進行免疫反應。在含水緩沖溶液中，通過混合分量(例如約0.1至約10微克)的標記酶的第二抗體，較好為HRP一標記山羊抗人體Ig抗體，得到第二個固/液混合物。如同上述維持第二混合物，從而形成由植物凝血素、抗GCL-1抗體和標記酶的抗體所組成“三明治式”的固相免疫反應物。
經如前所述步驟，從固相中分離液相后，在用于HRP的過氧化氫存在下，分量的色原作用物如鄰苯二胺(OPD)在含有固相免疫反應物的滴定井中混合，形成第三固/液混合物。維持該混合物足夠的預定時間，使以免疫反應物形式存在的任何酶能夠轉化比例量的作用物成產品。然后測定所得有色溶液的克密度，并使用含有已知量反應試劑的溶液進行比較所得的結果。
有效用于實施本發(fā)明抗GCL-1抗體方法的診斷系統(tǒng)(優(yōu)先用于藥囊形式)包括(是以合并但分離包裝形式)(a)本發(fā)明分離植物凝血素，和(b)用于給出抗GCL-1-抗體同植物凝血素免疫反應信號的標記抗體。標記抗體最好為連接酶的全抗體。
在較佳實例中。該系統(tǒng)還進一步包括一個能添加植物凝血素來形成的固體基質。前面已經描述過有效的固體基質。但是，優(yōu)先的固體基質是微量滴定板的井。
在進一步較佳的實施例中，該系統(tǒng)還包括使本發(fā)明植物凝血素呈E控制的抗體。
提供已知量的植物凝血素和標記抗體，其量至少能進行一次測定。提供植物凝血素和標記抗體的典型形式和配方用量，正如本領域專業(yè)人員所知，用水，鹽水或緩沖劑可稀釋至配方體積。
在該系統(tǒng)中也可以包括另外的包裝。這類包裝可以含有(ⅰ)干或液體形式的緩沖鹽，(ⅱ)酶作用物如鄰苯二胺等。
本文還涉及測定體樣中GCL-1存在的方法，通常所用的提供體樣如需測定的頸或泌尿生殖器的涂片，并且同含有由本發(fā)明植物凝血素誘導的抗體結合部位的抗體混合。在生物測定條件下，維持混合物足夠的預定時間，使抗體分子同存在于體樣里的GCL-1起免疫反應。然后測量該免疫反應量以確定所測體樣中是否存在GCL-1分子。
實例之一是免螢光測定，其中頸或泌尿生殖器的涂片用內酮固定于載物平片上。按照本發(fā)明所取等分量抗體(例如取自兔子)通常約10微克至約5000微克，采用已知技術在載物上進行培養(yǎng)。
移去任何未起免疫反應的抗體并在載物片上，用牛血清蛋白封阻非特種結合部位后，如有需要可在試驗載片上培養(yǎng)。第二抗體如山羊抗兔抗體。再用連接螢光染料如異硫氰酸(FITC)來標記第二抗體。
第二抗體經培養(yǎng)后，去除任何過量的第二抗體，留下FITC標記的山羊抗兔抗體，使其同試驗載片上的第一抗體結合。使用瑩光顯微鏡檢查可檢測出FITC-標記抗體的存在，因此給出存在淋病奈瑟氏菌感染的信號。
當指示物不是直接連于本發(fā)明抗體時，該指示物與抗體分別包裝。當混合體樣如丙酮固定的頸或泌尿生殖器的涂片時，抗體部同GCL-1進行免疫反應形成免疫反應物，指示物便給出免疫反應產物形成的信號。
下面實施例將進一步描述本發(fā)明。
實施例1GCL-1的制備和分離N.g菌株Ms11以及N.g.C9菌株的帶纖毛透明變異體和無纖透明變異體在GCB板〔29克GC培養(yǎng)基，Difco，1克Bacto-agar，Difto，8毫升添加物A(400克葡萄糖，10克L-谷氨酰胺，20毫克輔羧酶/升)，0.8毫升添加物B(每800毫升總體積為12.5克Fe(NO/250毫升)〕上生長。纖毛和透明表型可用James等人在《傳染免疫學》(Infect.Immun)19332-340(1978)，和Swanson，J.在《傳染免疫學》19320-331(1978)上描述的系統(tǒng)進行辨別。
在5%CO2氣氛和35℃下于板上接種并保溫18小時。首先用1.25毫升50毫摩爾三羥甲基氨基甲烷緩沖液〔Sigma化學公司，St，Louis，MO(pH9.5)〕混合到每個板上，采集所得菌苔。然后取出所得菌苔中的細胞，用巴斯德吸管把其移至50毫升的聚碳酸酯離心管中，在0℃下貯藏。
接著，旋轉該貯藏細胞3分鐘，切變/細菌表面蛋白。然后用貝克曼JA-20轉子在40℃和/10000rpm離心所得懸液，得到小片傘毛蛋白和含有GCL-1的上清液。保留上層液并且使用6000至8000分子量的滲析切斷膜(dialysis Cutoff memfrance)(spectropor，F(xiàn)ischer科學公司Springfield，NJ)，在4℃用抗纖毛緩沖液(150毫摩爾三羥甲基氨基甲烷，150毫摩爾Nacl，pH7.5)參析24小時，以便使蛋白質聚集和沉淀。經如前所述離心后，收集沉淀的小片蛋白再懸浮于10毫升的毫麾爾的三羥甲基氨基甲烷(pH9.5)中，從而形成GCL-1提取物粗制品。在-20℃貯藏該粗提取物。
用神經節(jié)丁糖基神經酰胺添加至固體基質來制備用于純化GCL-1親合吸收劑。在聚氯乙烯96井微量滴定板的每個井中，加入含有200毫克微克神經節(jié)四丁糖基神經酰胺(Supelco公司，Bellefonte，PA)的50微升甲醇。然后蒸發(fā)甲醇，在每個井中余下沉淀神經節(jié)丁糖基神經酰胺，在每個井中加入50微升含2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS來封阻井中的非特種結合部位，在室溫下維持所形成的混合物4小時，然后通過轉化井和震搖移去過量封阻溶液。
其首先引入50微升粗提取物到微量滴定井中，井中含有吸附其上的神經節(jié)丁糖基神經酰胺，從上面所得的粗提取物通過親合吸附分離GCL-1。維持所得制品約8小時，因而使粗提取物中的GCL-1結合到神經節(jié)丁糖基神經酰胺上。接著通過轉化井和震搖除去非結合蛋白。再用來微升整份部分的PBS漂洗井5次。
在每個井中加入50微升含有十二烷基磺酸鈉(SDS)的PBS，來洗脫特別結合的GCL-1。室溫再維持按此法所得制品30分鐘，使GCL-1溶解存在其中。然后從井中移去所得含有GCL-1的溶液并在-20℃貯藏。從每微量滴定井中得到分離于GCL-1的親合物近1微克。
此外，也可用蛋白質快速液相色譜法(FPLC)色譜聚速，從上面所得粗提取物中分離出GCL-1。為了制備用于色譜聚焦的GCL-1提取物，使用前面提取的滲析膜。經FPLC飽和緩沖液(25毫摩爾咪唑，PH7.4)滲析由無纖毛N.g.菌珠MS11異變體B2產生的粗GCL-1提取物。然后把滲析的GCL-1提取物注入一個單P色譜聚焦柱(FPLC系統(tǒng)，藥物公司，Piscatarway，NJ)，用FPLC飽和緩沖液預飽和，再用聚緩沖液74(Sigma化學公司，St.Louis，MO)洗脫，該緩沖液是用無菌水1∶8稀釋和調節(jié)PH至4.0。
圖4中顯示了在類色譜聚焦柱上，粗GCL-1提取物典型流動的洗脫分布情況。通過在280毫微米(O.D 280)測量洗脫劑的光密度來控制蛋白質的洗脫部分，并且測定其PH。含有蛋白質的部分用約PH6.1至6.4的洗脫，回收并在-20℃貯藏。
實施例2由SDS-PAGE測定分離細菌的植物凝血素的分子量按Laemmli，U.K.，Nature 227680-684(1970)的方法，用SDS-PAGE測定實施例1中所得經純化細菌的植物凝血素的相對分子量。為此目的，12%和15%聚丙烯酰胺凝膠呈管狀并每個區(qū)帶用約25至200微克總量蛋白質流過。以下為在對照區(qū)帶或標準區(qū)帶內的分子量標記蛋白質及其近似分子量(以道爾頓為單位)α-乳白蛋白14，200;大豆胰蛋白酶抑制劑20，100，胰蛋白酶原24，000;碳酸酐酶29，000;3-磷酸甘油醛脫氫酶36，000;卵白蛋白45，000;牛白蛋白66，000;這些蛋白質金系從Sigma化學公司，St.Louis，MO獲得。
經電泳后，用考馬斯亮蘭(Sigma)著色，或者按Merril等人在生物化學分析105361(1980)一文中介紹的銀著色技術，使用由Bio-Rad。得到的銀著色劑(Richmond，CA)檢查蛋白質區(qū)帶。
凝膠分析揭示了樣品區(qū)帶里的一個主帶，其相對電泳遷移率高于胰蛋白酶原但低于大豆胰蛋白酶抑制劑，相對分子量約為22，400道爾頓。圖1所示該主帶為親合純化的細菌植物凝血素GCL-1。
在一些例子中，蛋白質區(qū)帶在著色前，經電泳吸附到硝化纖維素(Schleicher和Shuell，Keene，NH，產品目錄號BA85)上形成Western印跡，為Towbin等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 764350-4354(1979)一文中所述。首先通過印跡同兔抗GCL-1抗體免疫反應測定吸附于硝化纖維素的GCL-1蛋白質，其中免疫GCL-1抗體的制備是按實施例1所述用粗GCL-1提取物使兔產生免疫得到的。然后將通過免疫方法結合到吸附著硝化纖維素的GCF-1上的兔抗GCL-1抗體，同鹼性磷酸酶標記山羊抗兔免疫球蛋白進行免疫反應。使用原印跡免疫印跡系統(tǒng)〔Promega Biotech，Madison)WI(產品目錄號P3930)〕觀測標記的，由此觀測GCL-1的存在。
圖2給出由實例1所述的親合方法中各種分離步驟獲得的產物的Western印跡。對那些印跡分析，揭示出新合分離的GCL-基本上不含有同蛋白質結合的其它淋球菌纖毛。
圖3顯示了牛(Morexella bovis)粗蛋白質提取物的Western印跡，該提取物是用類似于實施例1所述制備N.g.粗提取物的方法制備的。對印跡分析顯示出，Morexellla bovis產生一種蛋白質，該種蛋白質同抗GCL-1抗體起免疫反應，其表觀相對分子量約為22，400道爾頓。
實施例3分離及雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)的特征進一步分離含有由例1制成的GCL-1非親和純化的細菌表面蛋白粗提取物，其特征是采用雙向凝膠系統(tǒng)的2D-PAGE，該系統(tǒng)是由Hoefer Scientific Instruments，Sem Francisco，CA獲得。等電聚焦(IEF)凝膠包括6.5%的聚丙烯酰胺和兩組二性電解質(LKB Instruments，Inc，Gaithersburg MD)，其中一組可以產生梯度為3～10的pH值，另一組是可以產生梯度為4～6.5的pH值，凝膠在130×3毫米經酸洗過的玻璃管中制備。該凝膠或涂以含約25微克蛋白溶液的GCL-1或涂以含例2所述分子量標記蛋白的對照溶液。然后將樣品涂復溶液〔9摩爾尿素、上述兩組二性電能質各2%和10%聚乙烯(9)辛基苯基醚(Nonidet p40)〕涂敷在該凝膠上。使蛋白質先后在400伏3恒壓下電泳12小時及在800伏恒壓下電泳1小時。
由玻璃管中去除聚焦凝膠，用處理緩沖劑(0.0625摩爾tris，HCI，pH6.8;2%SDS;10%甘油;5%2-巰基乙醇)沖洗兩次約30分鐘，從而產生含按其等電點pH值分離的蛋白質的IEF凝膠。
然后通過SDS-PAGE將等電聚焦蛋白按其相對分子量進行分離。IEF凝膠固定于15%SDS-PAGE凝膠的頂部，并用0.1%的醛紅作為徑跡染料在約30毫安恒定電流下移動。當徑跡染料達到凝膠底部時，則電泳終止。隨后，凝膠用考馬斯亮蘭或銀著色劑著色，如例2所述;或者將蛋白質由凝膠轉移到硝化纖維素上，如Towbin等人在以上文獻中所述。
對凝膠的分析揭示了單個蛋白質斑點相當于具有約22400道爾頓相對分子量的蛋白質即GCL-1的相對分子量。該22400道爾頓蛋白質的等電點pH值約為6.1～約6.4。
實施例4由老鼠小腸制備純神經節(jié)丁糖基神經酰胺為了從老鼠小腸制備純神經節(jié)丁糖基神經酰胺采用如下一系列萃取和色譜分離方法。所用溶劑在使用前先經脫水和重蒸餾。
萃取從老鼠腹中手術取出小腸，切成碎片，冰凍干燥。然后用本領域熟知的索格利特抽提器分兩步將約130克的冰凍材料進行萃取。首先，將約1000毫升的三氯甲烷/甲醇(體積比2∶1)在一個2000毫升的圓底燒瓶中與冰凍材料混合，并在石棉絕熱的電加熱裝置中在70℃下加熱約24小時。在去溶劑以后，采用1500毫升的三氯甲烷/甲醇(體積比1∶9)，用相同方法第二次萃取該材料，然后去溶劑，將其加入第一溶劑中。將合并的溶劑提取物在氮氣流下蒸發(fā)干燥。
堿解將干燥的小腸提取物溶解在500毫升的0.2M KOH的甲醇溶液中進行堿解，溶解的提取物的在玻璃瓶中和室溫下保持3小時，該玻璃瓶中有5個玻璃珠，通過間隙搖動分碎干燥提取物。所得的混合物與10毫升冰醋酸中和，再與1000毫升的三氯甲烷/水(體積比3∶2)混合，流水透析4天。首先將堿解提取物與大約500毫升的甲苯混合，然后用旋轉蒸發(fā)器干燥所得混合物，在70℃下蒸發(fā)堿解提取物再將干樣品重新溶解在大約500毫升的三氯甲烷/甲醇(體積比2∶1)中，濾去不溶物質。用大約500毫升甲醇沖洗過濾裝置，檢查殘留的提取物。然后將濾液合并，在氮氣流下蒸發(fā)，再溶于大約50毫升的三氯甲烷中。
硅酸層析將堿解小腸提取物在硅酸柱上進行層析，以從糖脂及穩(wěn)定堿磷酯中去除膽甾醇及脂肪酸甲基脂。
100目試劑的硅酸(Malinckrodt化工廠，St.Louis，MO)篩分成三個粒度小于約44um約44-74um，以及約大于76um。小于約44um的部分用甲醇(3升1公斤)懸浮液沖洗，30分鐘后抽去甲醇層，以去除通過下述方法所用的在層析柱底部的燒結玻璃過濾器的極小顆粒。
分餾成大約44～74um大小的硅酸顆粒，用三氯甲烷裝填成50克的柱子，再將預先已溶于三氯甲烷中的堿解提取物裝在層析柱1上。相繼將500毫升三氯甲烷，和500毫升三氯甲烷/甲醇(體積比98∶2)加入層析柱并讓其流過。再先后加入500毫升三氯甲烷/甲醇(體積比1∶3)和500毫升甲醇，收集并合并這兩種洗脫液，然后將洗脫液及其液體部分在氮氣流下蒸發(fā)，產生干提取物。
離子交換層析將硅酸柱中的干提取物再溶于大約10毫升的三氯甲烷/甲醇(體積比2∶1)，并裝載到20克采用三氯甲烷/甲醇裝成乙酸鹽形式的二乙氨乙基纖維素(DE-23，Whatrovn Inc，Clifton，NJ)的層析柱上。室溫下，經在層析柱上的平衡約1～2天后，樣品先后用400毫升三氯甲烷/甲醇(體積比2∶1)和400毫升甲醇洗脫。合并兩種洗脫液，其液體部分在氮氣流下蒸發(fā)，得到干提取物。
乙酰化進行乙?；菍⒍野币一w維素層析柱上洗脫及干燥的提取物溶于10毫升三氯甲烷，再與10毫升的吡啶及10毫升的醋酸酐混合，該混合物在室溫下保持在黑暗中約12～18小時。在乙?；磻螅瑢?5毫升的甲醇及25毫升的甲苯混合，樣品先在氮氣流下蒸發(fā)，同時保持在大約60℃。接著用旋轉蒸發(fā)器蒸發(fā)干燥，得到乙?；c萃取液。
乙?；腿∥锏墓杷釋游鰧⒁阴；c的萃取物溶解在大約50毫升的三氯甲烷并裝到含50克硅酸粒子的層析柱上，該硅酸粒子約小于44um，并裝在三氯甲烷/甲醇內(體積比98∶2)。相繼將500毫升三氯甲烷/甲醇(體積比90∶10)加到層析柱中，收集洗脫液并將其合并，其液體部分在氮氣流下蒸發(fā)，得到乙?；奢腿∥?。
脫乙?；浌杷釋游龊鸵阴；妮腿∥锶芙庥诖蠹s20毫升的甲苯/甲醇0.2M KOH(體積比為1∶1∶2)的甲醇溶液，在室溫下間隙搖動30分鐘進行脫乙?；７磻?，與2毫升冰醋酸混合，把生成的混合物移入80毫升的三氯甲烷/水中(體積比為1∶1)并用流水滲析4天。該脫乙?；腿∥锏恼舭l(fā)是在70℃的溫度下，先與約100毫升甲苯混合，然后再用旋轉蒸發(fā)器蒸發(fā)干燥，得到脫乙?；奢腿∥?。
二乙氨乙基纖維素柱層析將脫乙酰化干萃取物溶解在大約10毫升的三氯甲烷/甲醇(體積比為2∶1)中并裝載到10克的二乙氨乙基纖維素層析柱上，達到如上所述的平衡。再先后把250毫升的三氯甲烷/甲醇(體積比為2∶1)和250毫升甲醇加入層析柱中，合并得洗脫液，其液體部分在氮氣流下蒸發(fā)，得到含有殘余物的糖脂。
硅酸層析將上述所得殘余物的整部分溶于500毫升的三氯甲烷/甲醇(體積比為98∶2)并裝載到顆粒約小于44um的25克硅酸層析柱上，該硅酸顆粒用適當溶劑包裝。將500毫升的三氯甲烷/甲醇(體積比為98∶2)加到該層析柱上使其流過。然后相繼將250毫升的三氯甲烷/甲醇(體積比為1∶3)和250毫升甲醇加到層析柱上，收集這兩部分洗脫液體并將其合并，其液體部分在氮氣流下蒸發(fā)。得到的干燥物質基本上是純神經節(jié)丁糖基神經酰胺。[Hansson et al.，F(xiàn)EBS Letter，139291(1982)]。
例5通過克隆編碼GCL-1基因制取分離GCL-1及在重組DNA載體中的表達。
采用本技術領域：
中熟知的以及在Maniatis等人的著作(《分子克隆I.實驗室手冊》，冷泉港實驗室，1982年)中較詳細地介紹過的方法對包含在由N.g.MS11菌珠無纖毛變異體B2的淋球菌DNA中的GCL-1編碼基因進行克隆并操作使其進入表達載體。
為此從上述N.g異體分離出DNA用酶MboⅠ限制性地進行部分消化并插入到Seifert等人所描述的克隆載體pHSS6(Proc.Natl.Acad.Sci.USA83735(1986))的BamHⅠ限制部位中所得的重組質粒在作為生物宿主的大腸桿菌(E.coli)菌珠HB101(Bethesda Research Laboratories，Gaithersberg，MD)中進行繁殖。然后將含有大量不同質粒的大腸桿菌進行篩選作為含有插入GCL-1基因的質粒的那些細菌的基因庫。
鑒定含有插入GCL-1基因的質粒的細菌篩選試驗是通過利用GCL-1基因產物可借助GCL-1基因本身自然產生的表達啟動子在大腸桿菌內表達的能力來完成的。表達的GCL-1是在含有插入GCL-1基因的質粒的那些細菌菌落中進行檢查的，檢查的方法是用兔子中產生抗GCL-1的抗血清對細菌菌落的基因庫進行免疫篩選，該GCL-1是按實施例1所述的色譜聚焦法分離得到的。
為制取這種抗血清，可將大約10至20微克分離的GCL-1通過皮下注射接種入兔子的頸部。第一次接種是在弗氏完全佐劑中進行接著每隔兩周在弗氏不完全佐劑中進行一次接種，共同接種兩次。陽性反應的抗血清可憑借其識別例2中所述的Western印刷跡的粗提取物中的GCL-1的能力來鑒定。
鑒定基因庫中表達GCL-1的那些大腸桿菌的免疫篩選方法可按照Helfman等人在Focus 6∶1-5(1984)一文中所述的方法進行。該文已經列為本文的參考文獻，但下列幾點除外，即用脫脂奶粉代替牛血清白蛋白(BSA)作為封阻劑，如Johnson等人在Gene Anal.Techn.1∶3-8(1984)文字中的所述，該文也列為本文的參考文獻。這些例外還包括用標記山羊抗兔子免疫球蛋白的堿性磷酸酶代替125I標記第二抗體作為指示物。利用Promega Biotech，Madison，WI(Catalog No.P3930)中原印跡免疫印跡(Protoblot Immunoblotling)系統(tǒng)可觀察到標記的存在，亦即說明GCL-1的存在。
分別回收按前述免疫篩選方法測定的含有GCL-1的各個陽性反應細菌菌落，并至少對按各菌落進行一次純化，以確保其均勻性。接著采用例1中所述的Westen印跡法進一步分析各分離菌的GCL-1表達。為此將各細菌分離物的最小培養(yǎng)物直接溶解于SDS-PAGE緩沖液中，然后再溶解在Western印跡上，用前述產生的由色譜聚焦分離得到的抗GCL-1抗血清進行顯色。這樣分析得到的并表達GCL-1的典型細菌培養(yǎng)物如圖5所示。
表達在大腸桿菌中的GCL-1明顯的活動力與略大于直接由N.g.培養(yǎng)物的提取物中分離得到的植物凝血素的相對分子量一致。可以認為在大腸桿菌宿主內的表達介質并不是從表達蛋白質中產生和分裂出主序列的，因此產生相當大的蛋白產物，如同在原始宿主，即N.g.中所發(fā)現(xiàn)的蛋白質產物。
對這些典型的培養(yǎng)物用已知方法作進一步分析，以測定殘留質粒載體中所含的GCL-1表達DNA插入物的近似大小，其方法包括用酶NotI.進行限制酶的消化作用。已經檢測到插入物的大小約為2.8至約4.0仟堿基。
從所觀察到的數據看，可以推斷所制得的非染色體，質粒載體存在多種結構序列特征，這是因為這種結構序列的通性在本技術領域：
中是眾所周知的例如，可以參閱Lewin的Genes，John Wiley&Sons有限公司，紐約，N.Y.(1983)。更具體地說，原核細菌蛋白質與其同源核苷酸序列是線性對應的，而在真核生物中，例如插入的非編碼序列(即基因內區(qū)-intioks)中沒有發(fā)現(xiàn)任何中斷現(xiàn)象。因此，采用的每個氨基酸殘基110道爾頓和每個氨基殘基3個核苷酸堿基對的轉換因子，可直接從用SDS-PAGE溶解的植物凝血素的表觀分子量中粗略估算編碼GCL-1的核苷酸堿基對的數量。通過這種轉換，具有約22，400道爾頓的GCL-1含有約204個氨基酸，并約有612個核苷酸堿基可用來編碼。
細菌中基因的表達取決于轉錄轉譯的起始信號和終止信號。這些信號也稱為表達調節(jié)信號，因為他們是包含在調節(jié)蛋白質編碼序列表達的序列中的信號。由于這些信號不出現(xiàn)在質粒載體pHSS6的BamHⅠ克隆部位的周圍，所以這些序列是由GCL-1編碼部分的兩端或兩端附近的通常位置中的DNA插入物提供的。于是，插入的DNA片段包括編碼區(qū)及與適宜于細菌植物凝血素表達編碼區(qū)的上游和下游(側面)操縱連接的表達調節(jié)信號主對DNA插入物的生物宿主來說是異體的。
通常用于與膜聯(lián)系的或待分泌的蛋白質的主肽的存在可由表觀分子量稍大的GCL-1得到證實，只是在大腸桿菌中的表達，而不是其天然生物宿主。
此外，表達調節(jié)信號的特殊組分是需要使GCL-1基因開始轉錄的啟動子。這個啟動子序列通常位于相當于編碼序列起始端的5′端上。因為啟動子序列的特征用其它細菌基因的特征表示，所以GCL-1啟動子也被認為是與從編碼的序列的5′端上的前導序列(leades Aequence)所得到的100個核苷酸堿基于緊密相關并位于其中。
因此，具有上述典型的GCL-1基因插入物含有大約2.8至4.0仟堿基對，并且包含有一個編碼約22，400道爾頓植物凝血素蛋白質的編碼序列時，這種插入物就可以更大些，例如達到約10仟堿基對量級，較好為6仟堿基對。前導系列適合的起始和終止信號包括啟動子以及位于基因任一端或兩端的附加多余的側序列數量的改變除了可以出現(xiàn)在GCL-1基因本身外，也可以出現(xiàn)在其本發(fā)明所期望的克隆并分離的DNA片段中。
典型的大腸桿菌分離物含有作為表達載體，并在其中插入了GCL-1基因的pHSS6質粒，這種表達GCL-1在圖5所示，為參考起見，給這種大腸桿菌標記為PGCL-1。這種細菌培養(yǎng)已保存在美國標準菌庫(ATCC)，地址在馬里蘭州，Rockville市登記號為ATCC67，198。
保藏符合布佩斯條約要求，保存期從保存日算起30年或最后請求在保藏中心保存或美國專利可實施期限之后5年，從本申請獲準專利起，無論那個保存期都是比較長的。如果含有重組質粒的細胞在保藏室失話，就要重新保存。
因此本發(fā)明一方面期望DNA片段，不管是分離還是在異體生物宿主中復制的都能為細菌植物凝血素編碼，其特征如上所述。這種DNA片段可包括調節(jié)信號CV用以表達所期望的細菌植物凝血素，通過操作連接到存在于DNA片段中那種植物凝血素的編碼區(qū)。當表達調節(jié)信號與生物宿主來說是異體時，這些信號由宿主識別。本發(fā)明之一特殊方面的較好例子中，編碼區(qū)是存在于植物凝血素的N.g.中天然產生的這種植物凝血素的編碼區(qū)。更好的是，表達調節(jié)信號或存在于DNA片段中的信號堿基對序列是天然產生的N.g.表達調節(jié)信號，這種信號與植物凝血素N.g.編碼區(qū)有關。
這里所期望的細菌植物凝血素的編碼含有不大于約650堿基對并且在兩端與之連接的兩側區(qū)有關。兩側區(qū)連同編碼區(qū)共含不多于約10仟堿基對，較好的是不多于約6仟堿基對。
本發(fā)明另一個方法是在適合的條件下利用培養(yǎng)方法的各個步驟來制取細菌植物凝血素，這種細菌培養(yǎng)物包括含有非染色體質粒載體的細菌，這種質粒載體如上所述用來遺傳轉錄轉譯介質中的DNA并在其后采用熟知的蛋白質收獲技術從培養(yǎng)物中收獲表達的細菌植物凝血素。
以上說明書，包括具體的實施例用來說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。其它各種改變與改進可以實現(xiàn)，而不偏離本發(fā)明的真實精神與范圍。
權利要求
1.一種可從淋球菌中獲得的離體細菌植物凝血素，經十二烷基磺酸鈉和聚丙烯酰胺凝膠電泳測定，其相對分子量約為22400道爾頓，等電點pH值約為6.1～6.4，該植物凝血素具有與神經節(jié)丁糖基神經酰胺特殊的結合能力。
2.按權利要求
1所述的細菌植物凝血素是以藥物上可接受鹽的形式存在。
3.一種接種物，包括按權利要求
1所述分離細菌植物凝血素與其在藥物上可接受的載體。
4.按權利要求
3所述的接種物，其單位劑量中，植物凝血素的含量約為10微克至500毫克。
5.按權利要求
3所述接種物，其單位劑量中植物凝血素的含量約為100微克至500毫克。
6.一種使人對淋球菌感染產生免疫的方法，其中包括給人施用在按權利要求
1所述的植物凝血素的有效劑量。
7.按權利要求
6所述方法，其中人用植物凝血素的有效劑量約為100微克至100毫克。
8.一種測定人體樣品中存在植物凝血素GCL-1的方法，包括如下步驟(a)人體采樣品;(b)將取得的人體樣品與抗GCL-1抗體相結合，形成免疫反應混合物;(c)將形成的免疫反應混合物在生物測定條件下，保持充分的時間，使抗GCL-1抗體與存在于所述人體樣品中的所有GCL-1結合，從而形成免疫反應物;以及(d)測定保存的混合物中免疫反應物的存在。
專利摘要
本發(fā)明揭示了可從淋病奈瑟菌中分離出細菌植物凝血素。此植物凝血素可與諸如神經節(jié)丁糖基神經酰胺的淋球菌碳水化合物結合。其相對分子量約為22400道爾頓，等電點pH值約為6.1至6.4。該凝血素可用作抗淋病疫苗的組分并可作為診斷淋病的方法。本發(fā)明還揭示了分離和產生這種植物凝血素的方法。
文檔編號C07K19/00GK87104828SQ87104828
公開日1988年5月4日 申請日期1987年6月18日
發(fā)明者卡羅林·D·迪爾, 馬達琳·Y·H·蘇, H·史蒂文·塞弗特 申請人:斯克里普斯臨床學與研究基金會導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan