專利名稱：抗多種腦膜炎球菌血清組的可注射性疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗學(xué)領(lǐng)域，尤其針對(duì)細(xì)菌性腦膜炎。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是導(dǎo)致細(xì)菌性腦膜炎的革蘭氏陰性 人病原體[1]。腦膜炎奈瑟球菌與淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)密切相關(guān)，雖然明確判別 腦膜炎球菌的一個(gè)特征是存在在所有病原性腦膜炎球菌中的多糖莢膜。在生物體莢膜多糖的基礎(chǔ)上，已鑒定到12種腦膜炎奈瑟球菌血清組(A，B，C，H，I， K，L，29E，W135，X，Y和Ζ)。血清組A(MenA)是在亞撒哈拉非洲流行病的最普遍原因。血清 組B和C引起發(fā)達(dá)國(guó)家的大多數(shù)病例，而血清組W135和Y引起發(fā)達(dá)國(guó)家的其余病例。除用于分類之外，莢膜多糖已被用于疫苗。多年來(lái)已知血清組Α，C，Y和W135莢 膜多糖的可注射四價(jià)疫苗[2，3]，并批準(zhǔn)用于人類。盡管它們?cè)谇嗌倌旰统扇酥杏行?，它?誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)差且保護(hù)持續(xù)時(shí)間短，不能用于嬰兒[例如4]。本疫苗中的多糖未綴合， 以1 1 1 1重量比存在[5]。一旦從它們的凍干形式再重建，Mencevax ACWY 和 Menomune 都含有50g純化的各種多糖。也已將血清組A，C，W135和Y的莢膜多糖以綴合 物形式聯(lián)合[6-9]以產(chǎn)生四價(jià)疫苗，例如不含佐劑的Menactra 產(chǎn)品。已批準(zhǔn)將綴合的血清組C寡糖用于人類，包括MenjugateTM[10，11]，Meningitec 和NeisVac-C 。產(chǎn)品Menjugate ，Meningitec 具有與CRM197載體綴合的寡糖抗原，而 NeisVac-C 利用了與破傷風(fēng)毒素載體綴合的完全多糖(0_脫乙?；?。然而，還需要改進(jìn)抗血清組A，W135和Y的綴合疫苗及其制造。參考文獻(xiàn)7中揭示 的產(chǎn)品、方法和應(yīng)用致力于解決這種需求，但是還可以進(jìn)行更多的調(diào)整和改進(jìn)。發(fā)明描述本發(fā)明提供一種含有莢膜糖的可注射免疫原性組合物，莢膜糖來(lái)自腦膜炎奈瑟球 菌血清組A，C，W135和Y中的至少兩種，其中所述莢膜糖與載體蛋白綴合和/或是寡糖，其 中該組合物每劑量含有< 50 μ g腦膜炎球菌糖。本發(fā)明還提供一種含有莢膜糖的可注射免疫原性組合物，莢膜糖來(lái)自腦膜炎奈瑟 球菌血清組A，C，W135和Y中的至少兩種，其中所述莢膜糖與載體蛋白綴合和/或是寡糖， 其中該組合物還含有來(lái)自下列一種或多種的抗原(a)腦膜炎奈瑟球菌血清組B ； (b)流感 嗜血桿菌B型；和/或(c)肺炎鏈球菌。本發(fā)明優(yōu)選的16種組合物中包括的抗原是(1)腦膜炎奈瑟球菌血清組C，W135 和Y ；⑵腦膜炎奈瑟球菌血清組A，C，W135和Y ； (3)腦膜炎奈瑟球菌血清組B，C，W135和 Y ； (4)腦膜炎奈瑟球菌血清組A，B，C，W135和Y ； (5)流感嗜血桿菌B型和腦膜炎奈瑟球菌 血清組C，W135和Y ； (6)流感嗜血桿菌B型和腦膜炎奈瑟球菌血清組A，C，W135和Y ； (7)流感嗜血桿菌B型和腦膜炎奈瑟球菌血清組B，C，W135和Y ； (8)流感嗜血桿菌B型和腦膜 炎奈瑟球菌血清組A，B, C，W135和Y ； (9)肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟球菌血清組C，W135和 Y ； (10)肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟球菌血清組A，C，W135和Y ； (11)肺炎鏈球菌和腦膜炎奈 瑟球菌血清組B，C，W135和Y ； (12)肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟球菌血清組A，B，C，W135和Y ； (13)流感嗜血桿菌B型，肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟球菌血清組C，W135和Y;(14)流感嗜血 桿菌B型，肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟球菌血清組Α，C，W135和Y ； (15)流感嗜血桿菌B型， 肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟球菌血清組B，C，W135和Y ； (16)流感嗜血桿菌B型，肺炎鏈球菌 和腦膜炎奈瑟球菌血清組Α，B, C，W135和Y。本發(fā)明組合物中的糖抗原優(yōu)選與載體綴合。本發(fā)明組合物中的糖抗原優(yōu)選為寡 糖。本發(fā)明組合物中的糖抗原最優(yōu)選與寡糖綴合。腦膜炎球菌糖混合物本發(fā)明組合物含有來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌血清組Α，C，W135和Y中的至少兩種(即 2，3或4種)的莢膜糖。本發(fā)明組合物優(yōu)選包含至少來(lái)自血清組C，W135和Y(即非MenA 糖)的腦膜炎奈瑟球菌糖。優(yōu)選將各糖抗原組合而不消除各自的保護(hù)功效，雖然實(shí)際的免 疫原性(例如ELISA效價(jià))可能降低。優(yōu)選來(lái)自一種以上腦膜炎奈瑟球菌血清組的糖的混合物，例如含有來(lái)自血清組 A+C, A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y, C+W135+Y, A+C+W135+Y 等的糖的 組合物。優(yōu)選的組合物含有來(lái)自血清組C和Y的糖。其它優(yōu)選的組合物含有來(lái)自血清組C， W135和Y的糖。不優(yōu)選含有僅來(lái)自血清組A和僅來(lái)自血清組C的莢膜糖的組合物(參看參 考文獻(xiàn)10，13和14)。當(dāng)混合物含有來(lái)自血清組A和C的莢膜糖時(shí)，MenA糖MenC糖的比例(w/w)可 大于1(例如2 1,3 1,4 1,5 1,10 1或更高)。當(dāng)混合物含有來(lái)自血清組Y及 血清組C和W135兩者中的一種或兩種的莢膜糖時(shí)，MenY糖MenW135糖的比例(w/w)可 大于1(例如2 1,3 1,4 1,5 1,10 1或更高)和/或MenY糖MenC糖的比例 (w/w)可小于1 (例如1 2,1 3,1 4,1 5或更低)。 每劑量各腦膜炎球菌糖抗原的典型含量為1 μ g-20 μ g，例如約1 μ g，約2. 5 μ g， 約4yg，約5yg，或約101^(表示為糖)。來(lái)自血清組A C W135 Y的糖，優(yōu)選的比例(w/w)是1 1 1 1; 1 1 1 2 ；2 1 1 1 ；4 2 1 1 ；8 4 2 1 ；4 2 1 2 ；8 4 1 2 ；
4 2 2 1 ;2 2 1 1 ;4 4 2 1 ;2 2 1 2 ;4 4 1 2 ；禾口 2:2:2: 1。來(lái)自血清組C W135 Y的糖，優(yōu)選的比例(w/w)是1 1 1 ； 1 1 2 ； 1 1 1 ;2 1 1 ;4 2 1 ;2 1 2 ;4 1 2 ;2 2 1 ；禾口 2 1 1。優(yōu) 選采用基本上等量的各種糖。莢膜多糖的純化通常用來(lái)制備腦膜炎球菌莢膜多糖的方法包括以下步驟多糖沉淀(例如利用陽(yáng) 離子去垢劑)，乙醇分級(jí)分離，冷酚抽提(去蛋白質(zhì))和超速離心(去LPS)[例如參考文獻(xiàn) 15]。然而，更優(yōu)選的程序[7]包括多糖沉淀，然后用低級(jí)醇溶解沉淀的多糖?？梢杂藐?yáng) 離子去垢劑進(jìn)行沉淀，例如四丁銨和十六烷基三甲基銨鹽(例如溴鹽)，或海地美溴銨和肉豆蔻基三甲銨鹽。尤其優(yōu)選十六烷基三甲基溴化銨(‘CTAB’)[16]?？梢杂玫图?jí)醇例如甲 醇，I"丙醇，2-丙醇，1- 丁醇，2- 丁醇，2-甲基-1-丙醇，2-甲基-2-丙醇，二醇等來(lái)溶解沉 淀的物質(zhì)，但乙醇尤其適于溶解CTAB-多糖復(fù)合物。優(yōu)選將乙醇加入沉淀的多糖，達(dá)到乙醇 終濃度在50%和95%之間。重新溶解后，可進(jìn)一步處理該多糖以除去污染物。這在較少污染物也不能接受的 情況下(例如人疫苗的生產(chǎn))尤其重要。這一步通常包括一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾步驟例如深度過(guò) 濾，經(jīng)活性碳過(guò)濾，大小過(guò)濾和/或超過(guò)濾。一旦過(guò)濾除去了雜質(zhì)，可將多糖沉淀以進(jìn)行進(jìn)一步處理和/或加工?？捎媒粨Q陽(yáng) 離子(例如加入鈣或鈉鹽)方便地實(shí)現(xiàn)這一目的。作為純化的替代方法，可用全部或部分合成來(lái)獲得本發(fā)明的莢膜糖，例如參考文 獻(xiàn)17描述了 Hib合成，參考文獻(xiàn)18的MenA合成?？苫瘜W(xué)修飾多糖。例如，可修飾多糖以封閉基團(tuán)替代一種或多種羥基。這對(duì)降低 血清組A的水解尤其有用[19](見下)。也可進(jìn)行多糖的0-脫乙?；?。腦膜炎奈瑟球菌血清組B本發(fā)明的一些組合物包含來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌血清組B的抗原。不同于血清組A， C，W135和Y，MenB的莢膜糖因?yàn)榕c人自身抗原有相似性，所以不適用于作為人的免疫原。因 此如果將一種糖抗原用于MenB，需要用一種經(jīng)修飾的糖，例如唾液酸殘基中的N-乙酰基被 N-?；娲奶恰：线m的N-?；荂1-C8的?；鏝-丙?；鵞20]。然而，優(yōu)選采用多 肽抗原而非糖抗原。因此該組合物可包含一種或多種多肽抗原，這些抗原誘導(dǎo)抗MenB感染的保護(hù)性 免疫反應(yīng)或抗MenB的殺菌性免疫反應(yīng)。更一般地，該組合物優(yōu)選在給予對(duì)象后可在該對(duì)象 中誘導(dǎo)抗腦膜炎奈瑟球菌血清組B的兩種或多種(例如2或3)高毒性譜系A(chǔ)4，ET-5和譜 系3的抗體反應(yīng)。已出版了 MC58和MenB菌株的基因組序列[21]，可從編碼的多肽中選擇合適的抗 原[22]。參考文獻(xiàn)22-32描述了優(yōu)選的抗原。優(yōu)選本發(fā)明組合物包含10種或更少的(例 如9，8，7，6，5，4，3，2)純化抗原混合物而非單一抗原，尤其優(yōu)選該組合物不應(yīng)包含復(fù)雜的 或不確定的抗原混合物例如優(yōu)選該組合物中不含有外膜囊泡(OMVs)。優(yōu)選的組合物包含一種或多種以下五種抗原[32] (1) iNadA'蛋白，優(yōu)選寡聚形 式(例如三聚體形式)；(2) ‘741，蛋白；(3) ‘936，蛋白；(4) ‘953，蛋白；和(5) ‘287， 蛋白。優(yōu)選的MenB抗原含有菌株2996，MC58，95N477，和394/98之一中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序 列。蛋白287優(yōu)選來(lái)自菌株2996，或更優(yōu)選來(lái)自菌株394/98。蛋白741優(yōu)選來(lái)自血清組B 菌株MC58、2996、394/98或95N477，或來(lái)自血清組C菌株90/18311。更優(yōu)選菌株MC58。蛋 白936、953和NadA優(yōu)選來(lái)自菌株2996。當(dāng)組合物包括特定蛋白抗原(如741或287)時(shí)， 該組合物可包括大于1種變體形式的抗原，例如來(lái)自相同蛋白，但來(lái)自1種以上菌株。可作 為串聯(lián)或單獨(dú)蛋白加入這些蛋白。來(lái)自MenB的‘NadA，(奈瑟球菌粘附素A)在參考文獻(xiàn)25中示為蛋白‘961，(SEQ IDs 2943和2944)且在參考文獻(xiàn)21中示為‘NMB1994，(也參見GenBank登錄號(hào)11352904 和7227256)。蛋白的詳細(xì)描述可見于參考文獻(xiàn)33。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用時(shí)，NadA可采用多種形式。優(yōu)選的NadA形式是截短或缺失變體，如參考文獻(xiàn)29到31中所示。特別是優(yōu)選沒(méi) 有其C末端膜錨的NadA (如對(duì)于菌株2996，缺失殘基351-405 [SEQ ID NO :1])，在本文中有 時(shí)用‘C’上標(biāo)區(qū)分，例如NadA 。在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)無(wú)其膜錨結(jié)構(gòu)域的NadA使 蛋白分泌到培養(yǎng)物上清中，伴隨去除其23聚體的前導(dǎo)肽(如對(duì)于菌株2996，留下327聚體 [SEQ ID NO :2])。無(wú)前導(dǎo)肽的多肽在本文中有時(shí)用‘NL，上標(biāo)區(qū)分，例如NadAw或NadA(G) (Ν 。優(yōu)選的NadA多肽具有的氨基酸序列(a)與SEQ ID NO :2有50%或更多同一性(例如 60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多)；和/或(b)包括至少η個(gè)來(lái)自SEQ ID NO 1的 連續(xù)氨基酸，其中 η 為 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、 90、100、150、200、250或更多)。對(duì)于(b)優(yōu)選的片段缺乏1個(gè)或多個(gè)(例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25或更多)來(lái)自SEQ ID NO IC末端和/或N末端的氨基酸(如NadAfc)、 NadA(NL\NadA(c)(NL))0其它優(yōu)選的片段包括來(lái)自SEQ ID NO=I的表位，SEQ ID N0:1尤其優(yōu) 選的片段是SEQ ID NO :2。這寫不同的序列包括NadA變體(如等位基因變體、同源物、直 系同源物、側(cè)向同源物、突變體等)。各種NadA序列示于參考文獻(xiàn)34的圖9。來(lái)自MenB的‘741，蛋白示于參考文獻(xiàn)25 (SEQ IDs 2535和2536)且在參考文獻(xiàn) 21中示為‘NMB1870’(也參見GenBank登錄號(hào)GI: 7227128)。血清組A中的對(duì)應(yīng)蛋白[35] 具有GenBank登錄號(hào)7379322。741是天然脂蛋白。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用時(shí)，741蛋白可采用 多種形式。優(yōu)選的741形式是截短或缺失變體，如參考文獻(xiàn)29到31所示。特別741的N末 端可缺失到和包括其聚甘氨酸序列(即對(duì)于菌株MC58，缺失殘基1到72 [SEQ ID NO 3]), 在本文中有時(shí)用‘AG’前綴區(qū)分。此缺失能提高表達(dá)。缺失也去除741的脂化位點(diǎn)。優(yōu)選 的741序列具有氨基酸序列:(a)與SEQ ID NO :3有50%或更多同一性(例如60%、70%、 80%、90%、95%、99%或更多)；和/或(b)包括至少η個(gè)來(lái)自SEQ ID NO :3的連續(xù)氨基酸， 其中 η 為 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、 200、250或更多)。對(duì)于(b)優(yōu)選的片段包括來(lái)自741的抗原表位。其它優(yōu)選的片段缺乏 1 個(gè)或多個(gè)(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更多)來(lái)自 SEQ ID N0:3C 末端和 / 或N末端的氨基酸。這些序列包括741變體(如等位基因變體、同源物、直系同源物、側(cè)向 同源物、突變體等)。各種741序列可見于參考文獻(xiàn)31的SEQ IDs 1-22和參考文獻(xiàn)36的 SEQ IDs 1-23。參考文獻(xiàn) 37 的 SEQ IDs 1-299。蛋白741是引起抗腦膜炎球菌抗體反應(yīng)的極有效抗原，它在所有腦膜炎球菌血清 組中表達(dá)。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示蛋白分裂成2組，這些分裂中之一再次分裂，產(chǎn)生總共3個(gè)變 體[38]，盡管抗特定變體培養(yǎng)的血清在相同變體組中是殺菌性的，它對(duì)表達(dá)另2個(gè)變體之 一的菌株無(wú)活性，即有變體內(nèi)交叉保護(hù)，但沒(méi)有變體間交叉保護(hù)[36，38]。因此，為了最大 交叉菌株效率，組合物優(yōu)選應(yīng)包括大于1個(gè)蛋白741變體。來(lái)自各變體的示范序列在本文 的SEQ IDsIOUl和12中給出，起始是741脂蛋白形式中脂類共價(jià)附著的N末端半胱氨酸 殘基。因而，組合物優(yōu)選應(yīng)包括下列至少兩種⑴第1種蛋白，所含氨基酸序列與SEQ ID NO 10有至少序列同一性和/或所含氨基酸序列由來(lái)自SEQ ID NO 10的至少χ個(gè)連 續(xù)氨基酸片段組成；⑵第2種蛋白，所含氨基酸序列與SEQ ID Ν0:11有至少13%序列同 一性和/或所含氨基酸序列由來(lái)自SEQ ID NO 11的至少y個(gè)連續(xù)氨基酸片段組成；和(3) 第3種蛋白，所含氨基酸序列與SEQ ID N0:12有至少(％序列同一性和/或所含氨基酸序 列由來(lái)自SEQ ID NO :12的至少ζ個(gè)連續(xù)氨基酸片段組成。a值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5 或更多。b 值至少是 85，例如 86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5 或更多。c 值至少是 85，例如 86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、99. 5或更多。a、b和c值彼此內(nèi)在不相關(guān)。χ值至少是7，例如8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、 60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y 值至少是 7，例如 8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、 100、120、140、160、180、200、225、250。ζ 值至少是 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、 160、180、200、225、250。x、y和ζ值彼此內(nèi)在不相關(guān)。任何特定741氨基酸序列優(yōu)選不屬 于一種以上類別(1)、(2)和(3)。因此，任何特定741序列僅屬于類別(1)、(2)和(3)之 一。因而優(yōu)選蛋白⑴與蛋白⑵有小于的序列同一性；蛋白⑴與蛋白(3)有小于 的序列同一性；蛋白(2)與蛋白(3)有小于序列同一性。i值是60或更多(例 如 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90 等)且至多是 a。j 值是 60 或更多(例如 61、62、63、64、65、66、67、68、69、 70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90 等)且至多是 b。 k 值是 60 或更多(例如 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等)且至多是c。i、j和k值彼此內(nèi)在不相關(guān)。
來(lái)自血清組B的‘936，蛋白示于參考文獻(xiàn)25 (SEQ IDs 2883和2884)且在參考文 獻(xiàn)21中示為‘NMB2091，(也參見GenBank登錄號(hào)GI 7227353)。血清組A中的對(duì)應(yīng)基因具有GenBank登錄號(hào)7379093。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用時(shí)，936蛋白可采用多種形式。優(yōu) 選的936形式是截短或缺失變體，如參考文獻(xiàn)29到31中所示。特別是936的N末端前導(dǎo) 肽可缺失(即對(duì)于菌株MC58，缺失殘基1到23[SEQID NO 4])以產(chǎn)生936(Ν 。優(yōu)選的936 序列具有氨基酸序列(a)與SEQ ID而4有50%或更多同一性(例如60%、70%、80%、 90%、95%、99%或更多)；和/或(b)包括至少η個(gè)來(lái)自SEQ ID NO :4的連續(xù)氨基酸，其中 η 為 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多)。對(duì)于(b)優(yōu)選的片段包括來(lái)自936的抗原表位。其它優(yōu)選的片段缺乏1個(gè) 或多個(gè)(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)來(lái)自SEQ ID N0:4C末端和/或 N末端的氨基酸。這些序列包括936變體(如等位基因變體、同源物、直系同源物、側(cè)向同源 物、突變體等)。來(lái)自血清組B的‘953，蛋白示于參考文獻(xiàn)25 (SEQ IDs 2917和2918)且在參考文 獻(xiàn)21中示為‘NMB1030，(也參見GenBank登錄號(hào)GI 7226269)。血清組A中的對(duì)應(yīng)蛋白 [35]具有GenBank登錄號(hào)7380108。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用時(shí)，953蛋白可采用多種形式。優(yōu) 選的953形式是截短或缺失變體，如參考文獻(xiàn)29到31中所示。特別是953的N末端前導(dǎo) 肽可缺失(即對(duì)于菌株MC58，缺失殘基1到19[SEQID NO 5])以產(chǎn)生953(Ν 。優(yōu)選的953 序列具有氨基酸序列(a)與SEQ ID而5有50%或更多同一性(例如60%、70%、80%、 90%、95%、99%或更多)；和/或(b)包括至少η個(gè)來(lái)自SEQ ID NO :5的連續(xù)氨基酸，其中 η 為 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多)。對(duì)于(b)優(yōu)選的片段包括來(lái)自953的抗原表位。其它優(yōu)選的片段缺乏1個(gè) 或多個(gè)(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)來(lái)自SEQ ID N0:5C末端和/或N末端的氨基酸。這些序列包括953變體(如等位基因變體、同源物、直系同源物、側(cè)向同源 物、突變體等)。953的等位基因形式可見于參考文獻(xiàn)28的

圖19。來(lái)自血清組B的‘287，蛋白示于參考文獻(xiàn)25(SEQ IDs 3103和3104)且在參考 文獻(xiàn)21中示為‘NMB2132’，在參考文獻(xiàn)13中示為‘GNA2132，(也參見GenBank登錄號(hào) GI: 7227388) 0血清組A中的對(duì)應(yīng)蛋白[35]具有GenBank登錄號(hào)7379057。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明 使用時(shí)，287蛋白可采用多種形式。優(yōu)選的287形式是截短或缺失變體，如參考文獻(xiàn)29到 31中所示。特別是287的N末端可缺失到和包括其聚甘氨酸序列(例如對(duì)于菌株MC58，缺 失殘基1到24得到AG287[SEQ ID NO :6])。此缺失能提高表達(dá)。優(yōu)選的287序列具有氨 基酸序列(a)與SEQ ID NO :6有50%或更多同一性(例如60%、70%、80%、90%、95%、 99%或更多)；和/或(b)包括至少η個(gè)來(lái)自SEQ ID NO :6的連續(xù)氨基酸，其中η為7或 更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多)。對(duì)于(b)優(yōu)選的片段包括來(lái)自287的抗原表位。其它優(yōu)選的片段缺乏1個(gè)或多個(gè) (例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更多)來(lái)自 SEQID NO :6C 末端和 / 或 N 末端的 氨基酸。這些序列包括287變體(如等位基因變體、同源物、直系同源物、側(cè)向同源物、突變 體等)。287的等位基因形式可見于參考文獻(xiàn)28的圖5和15、參考文獻(xiàn)25的實(shí)施例13和 圖 21(SEQ IDs 3179 到 3184)。5種基本MenB抗原(NadA，741，953，936和287)可作為5種單獨(dú)蛋白存在于組合 物中，但優(yōu)選至少2種抗原表達(dá)為單一多肽鏈(‘雜合’蛋白[參考文獻(xiàn)29到31])，即5種 抗原形成少于5種多肽。雜合蛋白提供2個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)首先，通過(guò)加入克服問(wèn)題的合適雜合 伴侶來(lái)協(xié)助本身不穩(wěn)定或表達(dá)差的蛋白；第二，簡(jiǎn)化商業(yè)生產(chǎn)，因?yàn)閮H需使用1種表達(dá)和純 化便于生成2個(gè)單獨(dú)有用的蛋白。發(fā)明組合物中包括的雜合蛋白可包含2種或更多(即2、 3、4或5)的5種基本抗原。優(yōu)選由5種基本抗原中的2種組成的雜合體。在5種基本抗原的組合內(nèi)，抗原可存在于大于1種雜合蛋白和/或作為非雜合蛋 白。然而，抗原優(yōu)選作為雜合體或非雜合體存在，但不是兩者，盡管包括蛋白741作為雜合 和非雜合(優(yōu)選脂蛋白)抗原可能有用，特定是當(dāng)使用一種以上741變體時(shí)。雜合蛋白可由公式NH2-A-[-X-L-]n-B-C00H表示，其中X是5個(gè)基本抗原之一的 氨基酸序列；L是任選的接頭氨基酸序列；A是任選的N末端氨基酸序列；B是任選的C末端 氨基酸序列；η是2、3、4或5。如果-X-部分在其野生型形式中有前導(dǎo)肽序列，它可包括或省略于雜合蛋白。在 一些實(shí)施方案中，將缺失前導(dǎo)肽，除了位于雜合蛋白N末端的-X-部分，即保留X1的前導(dǎo)肽， 但省略X^Xn的前導(dǎo)肽。這相等于缺失所有前導(dǎo)肽并使用X1的前導(dǎo)肽作為-A-部分。對(duì)于各n[-X-L_]例子，接頭氨基酸序列_L_可存在或缺乏。例如，當(dāng)n = 2時(shí)， 雜合體可以是 NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH 等。接頭氨基酸序列-L-通常短(例如20個(gè)或更少氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、 11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括促進(jìn)克隆的短肽序列、聚甘氨酸接頭(即包括Glyn, 其中η = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、和組氨酸標(biāo)志(即Hisn,其中η = 3、4、5、6、7、8、 9、10或更多)。其它合適接頭氨基酸序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。有用的接頭 是GSGGGG(SEQ ID NO 9), Gly-Ser 二肽從BamHI限制性位點(diǎn)形成，從而協(xié)助克隆和操作， (Gly4)四肽是典型的聚甘氨酸接頭。如果Χη+1是AG蛋白且Ln是甘氨酸接頭，這可相等于Xn+1不是ΔG蛋白且缺乏Ln。-A-是任選的N末端氨基酸序列。它通常短(例如40個(gè)或更少氨基酸，即39、38、 37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指導(dǎo)蛋白運(yùn)輸?shù)那皩?dǎo)序列或者促進(jìn)克隆或純化 的短肽序列(如組氨酸標(biāo)志，即Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其它合適的 N末端氨基酸序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。如果X1缺乏其自身的N末端甲硫氨 酸，-A-優(yōu)選是提供N末端甲硫氨酸的寡肽(例如有1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸)。-B-是任選的C末端氨基酸序列。它通常短(例如40個(gè)或更少氨基酸，即39、38、 37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指導(dǎo)蛋白運(yùn)輸?shù)那皩?dǎo)序列、促進(jìn)克隆或純化的短 肽序列(如包括組氨酸標(biāo)志，即Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、或提高蛋白穩(wěn) 定性的序列。其它合適的C末端氨基酸序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。最優(yōu)選η為2。用于發(fā)明的二抗原雜合體包括NadA和741 ；NadA和936 ；NadA和 953 ；NadA 和 287 ；741 和 936 ；741 和 953 ；741 和 287 ；936 和 953 ；936 和 287 ；953 和 287。 2種優(yōu)選蛋白是=X1是936且X2是741 ；X1是287且X2是953。發(fā)明的2種尤其優(yōu)選雜合蛋白如下 這2種蛋白可組合NadA(尤其是與SEQ ID NO 2)使用。因此用于本發(fā)明的優(yōu)選 的MenB抗原組合物包含第一多肽，該多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO :2，包含氨基酸序列 SEQ ID NO :7的第二多肽和包含氨基酸序列SEQ ID NO :8的第三多肽。這是用于本發(fā)明的 優(yōu)選的MenB抗原組。如上所述，包含MenB抗原的發(fā)明組合物可優(yōu)選地誘導(dǎo)有效地抗2或3種MenB的 高毒性譜系A(chǔ)4，ET-5和譜系3的血清殺菌抗體反應(yīng)。此外它們可能誘導(dǎo)抗一種或多種高毒 性譜系亞組I，亞組III，亞組IV-I或ET-37復(fù)合物和抗其它譜系例如高侵入性譜系的殺菌 抗體反應(yīng)。這些抗體反應(yīng)可在小鼠中方便地檢測(cè)并且是疫苗功效的標(biāo)準(zhǔn)指示[例如，見參 考文獻(xiàn)22的后記14]。血清殺菌活性(SBA)測(cè)量補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)菌殺死，能用人或幼兔補(bǔ)體 測(cè)定。WHO標(biāo)準(zhǔn)要求疫苗在超過(guò)90%受體中誘導(dǎo)SBA上升至少4倍。該組合物不需誘導(dǎo)殺菌抗體抗這些高毒性譜系內(nèi)各個(gè)和每一個(gè)MenB菌株；而是， 對(duì)于特定高毒性譜系內(nèi)4種或更多血清組B腦膜炎奈瑟球菌菌株的任何特定組，組合物誘 導(dǎo)的抗體是殺菌性的，抗至少50% (例如60%、70%、80%、90%或更多)組。優(yōu)選的菌株組 包括在至少4個(gè)下列國(guó)家中分離的菌株大不列顛、澳大利亞、加拿大、挪威、意大利、美國(guó)、 新西蘭、荷蘭、比利時(shí)和古巴。血清優(yōu)選具有至少1024的殺菌效價(jià)(例如21(1、2"、212、213、214、 215、216、217、218或更多，優(yōu)選至少214)，即當(dāng)稀釋1/1024時(shí)，血清能殺死至少50%的特定菌株的測(cè)試細(xì)菌，如參考文獻(xiàn)22所述。優(yōu)選的組合物可誘導(dǎo)抗下列血清組B腦膜炎球菌菌株的 殺菌反應(yīng)⑴來(lái)自簇A4，菌株961-5945 (B :2b :Ρ1· 21，16)和/或菌株G2136(B -) ； (ii)來(lái) 自 ET-5 復(fù)合體，菌株 MC58(B 15 :P1. 7,16b)和 / 或菌株 44/76 (B 15 =Pl. 7，16) ； (iii)來(lái) 自譜系3，菌株394/98(B:4:P1.4)和/或菌株BZ198 (B :NT :-)。更優(yōu)選的組合物可誘導(dǎo)抗 菌株961-5945、44/76和394/98的殺菌反應(yīng)。菌株961-5945和G2136都是奈瑟球菌MLST 參考菌株[參考文獻(xiàn)39中的ids 638和1002]。菌株MC58廣泛可用(例如ATCC BAA-335) 且是參考文獻(xiàn)21中測(cè)序的菌株。菌株44/76廣泛使用并鑒定(例如參考文獻(xiàn)40)且是奈瑟 球菌MLST參考菌株之一[參考文獻(xiàn)39中的id 237 ；參考文獻(xiàn)41中表2的第32行]。菌 株394/98最初于1998年在新西蘭分離，有一些使用此菌株的發(fā)表研究(例如參考文獻(xiàn)42 和43)。菌株BZ198是另一種奈瑟球菌MLST參考菌株[參考文獻(xiàn)39中的id 409 ；參考文 獻(xiàn)41中表2的第41行]。組合物可另外誘導(dǎo)殺菌反應(yīng)抗血清組W135菌株LNP17592 (W135 2&屮1.5，2)，來(lái)自ET-37復(fù)合體。這是2000年在法國(guó)分離的Haji菌株。發(fā)明組合物中可包括的其它MenB多肽抗原選自下列氨基酸序列之一來(lái)自參考 文獻(xiàn)23的SEQ ID N0:650 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)23的SEQ ID NO :878 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)23的SEQ ID NO :884 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)24的SEQ ID NO :4 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ ID N0:598;來(lái)自參 考文獻(xiàn)25的SEQ ID NO :818;來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQID NO :864 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ ID NO 866 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ IDNO 1196 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ ID NO: 1272;來(lái) 自參考文獻(xiàn)25的SEQ IDNO 1274 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ ID NO 1640 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25 的SEQ IDNO 1788 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ ID NO :2288 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ IDNO 2466 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ ID NO :2554 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ IDNO 2576 ；來(lái)自參考 文獻(xiàn)25的SEQ ID NO 2606 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ IDNO 2608 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ ID NO :2616 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ IDNO :2668 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ ID NO :2780 ；來(lái) 自參考文獻(xiàn)25的SEQ IDNO :2932;來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ ID NO :2958 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25 的SEQ IDNO 2970 ；來(lái)自參考文獻(xiàn)25的SEQ ID NO 2988，或多肽，其包括氨基酸序列(a) 與所述序列有50%或更多同一性(例如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多)；和/或 (b)來(lái)自所述序列至少η個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中η為7或更多(例如8、10、12、14、16、 18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。對(duì)于(b)的優(yōu)選片段包 括來(lái)自相關(guān)序列的抗原表位?？砂ù笥?種(例如2、3、4、5、6)的這些多肽。流感嗜血桿菌b型(Hib)當(dāng)組合物包括流感嗜血桿菌B型抗原時(shí)，它通常是Hib莢膜糖抗原。來(lái)自流感嗜 血桿菌的糖抗原是熟知的。有利的是，Hib糖與載體蛋白共價(jià)綴合以提高其免疫原性，尤其是在兒童中的免疫 原性。一般多糖綴合物制備和特定Hib莢膜多糖制備在文獻(xiàn)中詳細(xì)記載[例如參考文獻(xiàn) 44到52等]。發(fā)明可使用任何合適的Hib綴合物。合適載體蛋白描述于下，用于Hib糖的 優(yōu)選載體是CRM197( ‘HbOC，)、破傷風(fēng)類毒素(‘PRP-T，)和腦膜炎奈瑟球菌的外膜復(fù)合體 (‘PRP-OMP，)。綴合物的糖部分可以是多糖(例如全長(zhǎng)磷酸多核糖基核糖醇(PRP))，但優(yōu)選水解 多糖以形成寡糖(例如麗從 1到 5kDa)。優(yōu)選的綴合物包括Hib寡糖，經(jīng)己二酸接頭共價(jià)連接CRM197 [53，54]。破傷風(fēng)類毒
10素也是優(yōu)選載體。施用Hib抗原優(yōu)選使抗PRP抗體濃度彡0. 15 μ g/ml，更優(yōu)選彡1 μ g/ml。發(fā)明的組合物可包括一種以上Hib抗原。當(dāng)組合物包括Hib糖抗原時(shí)，它優(yōu)選也不包括氫氧化鋁佐劑。如果組合物包括磷 酸鋁佐劑，則Hib糖抗原可吸附于佐劑[55]或可以不吸收[56]。Hib抗原能凍干，例如與腦膜炎球菌抗原一起。肺炎鏈球菌當(dāng)組合物包括肺炎鏈球菌抗原時(shí)，它通常是莢膜糖抗原，此抗原優(yōu)選與載體蛋白 綴合[例如參考文獻(xiàn)57到59]。優(yōu)選包括來(lái)自1種以上肺炎鏈球菌血清型的糖。例如，廣 泛使用來(lái)自23種不同血清型的多糖混合物，有來(lái)自5到11種不同血清型的多糖的綴合疫 苗也廣泛使用[60]。例如，PrevNar [61]包含來(lái)自7種血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和 23F)的抗原，各糖通過(guò)還原胺化單獨(dú)綴合CRM197，用2yg各糖每0.5ml劑量(4 μ g血清型 6B)，綴合物吸附于磷酸鋁佐劑上。發(fā)明的組合物優(yōu)選包括至少血清型6B、14、19F和23F。 綴合物可吸附于磷酸鋁上。除了使用來(lái)自肺炎球菌的糖抗原外，組合物可包括1種或多種多肽抗原。一些肺 炎球菌菌株的基因組序列是有用的[62，63]并能經(jīng)受反向疫苗學(xué)[64-67]以鑒定合適的多 肽抗原[68-69]。例如，組合物可包括1種或多種下列抗原PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、 LytB, LytC, LytA, Spl25、SplOl、Spl28、Sp 130 和 Spl30,如參考文獻(xiàn) 70 所定義。組合物可 包括1種以上(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14種)的這些抗原。在一些實(shí)施方案中，組合物可包括來(lái)自肺炎球菌的糖和多肽抗原。這些能用于簡(jiǎn) 單混合物，或肺炎球菌糖抗原可綴合肺炎球菌蛋白。這些實(shí)施方案的合適載體蛋白包括前 面段落中所列抗原[70]。肺炎球菌抗原可凍干，例如與腦膜炎球菌和/或Hib抗原一起。修飾的腦膜炎奈瑟球菌血清組A糖當(dāng)發(fā)明的組合物包括MenA糖抗原時(shí)，抗原優(yōu)選是修飾糖，其中天然糖上的1個(gè)或 多個(gè)羥基由阻斷基團(tuán)取代[19]。此修飾改善對(duì)水解的抗性，意味著血清組A抗原可保存于 和用于液體制劑，而不需要凍干。有阻斷基團(tuán)的單糖單位數(shù)可變化。例如，所有或大體所有單糖單位可具有阻斷基 團(tuán)?；蛘?，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%單糖單位可具有阻斷 基團(tuán)。至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29或30個(gè)單糖單位可具有阻斷基團(tuán)。同樣，單糖單位上的阻斷基團(tuán)數(shù)可變化。例如，單糖單位上的阻斷基團(tuán)數(shù)可以是1 或2。阻斷基團(tuán)一般是在單糖單位的4位置和/或3位置。末端單糖單位可以或可沒(méi)有阻斷基團(tuán)來(lái)取代其天然羥基。優(yōu)選在末端單糖單位上 保留游離異頭羥基以提供進(jìn)一步反應(yīng)(例如綴合)的柄。異頭羥基可通過(guò)還原胺化(使用 例如NaBH3CN/NH4Cl)轉(zhuǎn)變成氨基(-NH2-或-NH-E，其中E是氮保護(hù)基團(tuán))，然后可在其它羥 基轉(zhuǎn)變成阻斷基團(tuán)后再生。取代羥基的阻斷基團(tuán)可直接接近，通過(guò)羥基的衍化反應(yīng)，即羥基的氫原子由另一 基團(tuán)取代。作為阻斷基團(tuán)的合適羥基衍生物是例如氨基甲酸鹽、磺酸鹽、碳酸鹽、酯、醚(例
11如硅烷基醚或烷基醚)和縮醛。這種阻斷基團(tuán)的一些特定例子是烯丙基、Aloe、芐基、Β0Μ、 t- 丁基、三苯甲基、TBS、TBDPS, TES、TMS、TIPS、PMB、MEM、MOM、MTM、THP 等。其它不能直接 接近以及完全取代羥基的阻斷基團(tuán)包括Ch2烷基、C3_12烷基、C5_12芳基、C5_12芳基-CV6烷 基、NR1R2 (R1 和 R2 在下列段落中定義)、H、F、Cl、Br、CO2H、CO2 (C1^6 烷基)、CN、CF3、CCl3 等。 優(yōu)選的阻斷基團(tuán)是吸電子基團(tuán)。優(yōu)選的阻斷基團(tuán)具有公式-0-Χ-Υ或-0R3，其中X是C(O)、S(O)或SO2 ；Y是C^12 烷基、Cp12烷氧基、C3_12環(huán)烷基、C5_12芳基或C5_12芳基-CV6烷基，各自可任選用1、2或3個(gè) 獨(dú)立選自F、Cl、Br、CO2H, CO2 (C1^6烷基)、CN、CF3或Cl3的基團(tuán)取代；或Y是NR1R2 ；R1和R2 獨(dú)立選自H、CV12烷基、C3_12環(huán)烷基、C5_12芳基、C5_12芳基-Cp6烷基；或R1和R2可連接以形 成(3_12飽和雜環(huán)基團(tuán)；妒是^…烷基或(3_12環(huán)烷基，各自可任選用1、2或3個(gè)獨(dú)立選自F、 Cl、Br、CO2(C1^6烷基)、CN、CF3或CCl3的基團(tuán)取代；或R3是C5_12芳基或C5_12芳基-(^6烷 基，各自可任選用1、2、3、4或5個(gè)選自F、Cl、Br、CO2H、CO2 (C1^6烷基)、CN、CF3或Cl3的基 團(tuán)取代。當(dāng)鏟是^…烷基或C3_12環(huán)烷基時(shí)，它通常用1、2或3個(gè)上面定義的基團(tuán)取代。當(dāng) R1和R2連接以形成C3_12飽和雜環(huán)基團(tuán)時(shí)，意味著R1和R2與氮原子一起形成飽和雜環(huán)基團(tuán)， 含3到12間任意數(shù)量的碳原子H^i^nC3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C1(1、Cn、C12)。除了氮原子，雜 環(huán)基團(tuán)可包含1或2個(gè)雜原子(如N、0或S)。C3_12飽和雜環(huán)基團(tuán)的例子是吡咯烷基、哌啶 基、嗎啉基、哌嗪基、咪唑烷基、氮雜環(huán)丁烷基和吖丙啶基。阻斷基團(tuán)-O-X-Y和-OR3能制備自-OH基團(tuán)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)衍生程序如羥基與?；u、 烷基鹵、磺酰鹵等反應(yīng)。因此，-O-X-Y中的氧原子優(yōu)選是羥基的氧原子，而-O-X-Y中的-X-Y 基團(tuán)優(yōu)選取代羥基的氫原子?；蛘?，阻斷基團(tuán)可經(jīng)取代反應(yīng)接近，如Mitsonobu-型取代。這些和其它從羥基制 備阻斷基團(tuán)的方法是熟知的。阻斷基團(tuán)更優(yōu)選是-OC (0) CF3 [71 ]，或是氨基甲酸鹽基團(tuán)-OC (0) NR1R2，其中R1和R2 獨(dú)立選自Cp6烷基。R1和R2更優(yōu)選都是甲基，即阻斷基團(tuán)是-OC(O)匪e2。氨基甲酸鹽阻斷 基團(tuán)對(duì)糖苷鍵有穩(wěn)定作用且能在溫和條件下制備。優(yōu)選的修飾MenA糖包含η個(gè)單糖單位，其中至少單糖單位在3位和4位都沒(méi) 有-OH 基團(tuán)。h 值是 24 或更多(例如 25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95、98、99或100)且優(yōu)選是50或更多。缺乏的-OH基團(tuán)優(yōu)選是上面定義的阻斷基團(tuán)。其它優(yōu)選的修飾MenA糖包括單糖單位，其中至少s單糖單位在3位沒(méi)有-OH和在 4位沒(méi)有_0!1。8值至少為1(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90)。缺乏的-OH基團(tuán)優(yōu)選是上
面定義的阻斷基團(tuán)。用于發(fā)明的合適修飾MenA糖具有公式 其中η是1到100的整數(shù)(優(yōu)選15到25的整數(shù))；T具有公式(A)或(B) 各Z基團(tuán)獨(dú)立選自O(shè)H或上面定義的阻斷基團(tuán)；和各Q基團(tuán)獨(dú)立選自O(shè)H或上面定義的阻斷基團(tuán)；Y選自O(shè)H或上面定義的阻斷基團(tuán)；E是H或氮保護(hù)基團(tuán)；其中大于約7% (例如8%、9%、10%或更多)的Q基團(tuán)是阻斷基團(tuán)。各η+2Ζ基團(tuán)彼此可相同或不同。同樣，各n+2Q基團(tuán)彼此可相同或不同。所有Z 基團(tuán)可以是0H。另夕卜，至少10%、20%、30%、40%、50%或60% Z基團(tuán)可以是OAc。優(yōu)選約 70% Z基團(tuán)是OAc，剩余Z基團(tuán)是OH或上面定義的阻斷基團(tuán)。至少約7% Q基團(tuán)是阻斷基 團(tuán)。優(yōu)選至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至 100% Q 基團(tuán)是阻 斷基團(tuán)。優(yōu)選的發(fā)明組合物可在37°C保存28天，此階段后，小于€%初始總量的綴合MenA 糖將非綴合，其中 f 是 20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5 或更低。寡糖
莢膜糖一般以寡糖形式應(yīng)用。它們易形成，通過(guò)純化的莢膜多糖的斷裂(如水 解)，通常接著是純化所需大小的片段。優(yōu)選進(jìn)行多糖斷裂以產(chǎn)生小于30的寡糖中最終平均聚合度(DP)(如對(duì)于血清組 A在10和20間，優(yōu)選約10 ；對(duì)于血清組W135和Y在15和25間，優(yōu)選約15-20 ；對(duì)于血清 組C在12和22間；等等)。DP易通過(guò)離子交換層析或比色測(cè)定來(lái)測(cè)量[72]。優(yōu)選的MenC糖抗原如參考文獻(xiàn)10所示，如Menjugate 所用。如果進(jìn)行水解，水解產(chǎn)物一般是進(jìn)行尺寸定位以取出長(zhǎng)度短的寡糖[73]。這能用 多種方式完成，如超濾，接著是離子交換層析。對(duì)于血清組A，優(yōu)選取出聚合度小于或等于約 6的寡糖，對(duì)于血清組W135和Y，優(yōu)選取出小于約4的寡糖。共價(jià)綴合發(fā)明組合物中的莢膜糖通常綴合載體蛋白。一般，綴合提高糖的免疫原性，因?yàn)樗?使它們從T-不依賴性抗原轉(zhuǎn)變成T-依賴性抗原，因而能刺激免疫記憶。綴合對(duì)于兒科疫 苗尤其有用且是熟知的技術(shù)[如參考文獻(xiàn)44和52所綜述]。優(yōu)選的載體蛋白是細(xì)菌毒素或類毒素，如白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。特別優(yōu)選 CRM197白喉類毒素[75-77]。其它合適的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[78]、合成 肽[79-80]、熱激蛋白[81-82]、百日咳蛋白[83-84]、細(xì)胞因子[85]、淋巴因子[85]、激素、生長(zhǎng)因子[85]、人工蛋白，含多個(gè)來(lái)自不同病原體衍生抗原的人CD4+T細(xì)胞抗原表位、來(lái)自流感嗜血桿菌的蛋白D[87，88]、肺炎球菌表面蛋白PspA[89]、鐵吸收蛋白[90]、 來(lái)自艱難梭菌(C. difficile)的毒素A或B[91]等。優(yōu)選的載體是白喉類毒素、破傷風(fēng)類 毒素、流感嗜血桿菌蛋白D和CRM197。在發(fā)明的組合物內(nèi)，可能使用1種以上載體蛋白，例如用于降低載體抑制風(fēng)險(xiǎn)。因 此，不同載體蛋白可用于不同血清組，例如血清組A糖可能綴合CRM197，而血清組C糖可能綴 合破傷風(fēng)類毒素。也可能使用多于1種的載體蛋白用于特定糖抗原，例如血清組A糖可能 在2組中，一些綴合CRM197，其它的綴合破傷風(fēng)類毒素。然而，一般優(yōu)選對(duì)所有糖使用相同載 體蛋白。單一載體蛋白可攜帶多于1種的糖抗原[92]。例如，單一載體蛋白可綴合其來(lái)自 血清組A和C的糖。為達(dá)到此目標(biāo)，可在綴合反應(yīng)前混合糖。然而，一般優(yōu)選各血清組有單 獨(dú)綴合物。優(yōu)選糖蛋白比例(w/w)在1 5 (即過(guò)量蛋白)和5 1 (即過(guò)量糖)間的綴合 物。優(yōu)選1 2和5 1間的比例，更優(yōu)選1 1.25和1 2. 5間的比例。過(guò)量載體蛋白 優(yōu)選用于MenA和MenC。綴合物可用于綴合游離載體蛋白[93]。當(dāng)特定載體蛋白在游離和綴合形式的發(fā)明 組合物中都存在時(shí)，未綴合形式優(yōu)選大體上不超過(guò)5%的組合物中載體蛋白總量，更優(yōu)選以 小于2%重量存在?？墒褂萌魏魏线m的綴合反應(yīng)，必要時(shí)可有任意合適的接頭。糖一般在綴合前活化或功能化?；罨砂ɡ缜杌瘎?cyanylating)如 CDAP(如1-氰基-4-二甲氨基吡啶鐺四氟硼酸鹽[94，95等])。其它合適技術(shù)使用碳化 二亞胺、酰胼、活性酯、去甲硼烷(norborane)、ρ-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、 EDC、TSTU ；也參見參考文獻(xiàn)50的導(dǎo)言)。
經(jīng)接頭基團(tuán)連接可用任何已知方法進(jìn)行，例如參見參考文獻(xiàn)96和97所述方法。 一類連接包括還原胺化多肽，偶聯(lián)所得氨基與己二酸接頭基團(tuán)的一末端，然后偶聯(lián)蛋白到 己二酸接頭基團(tuán)的另一末端[48，98，99]。其它接頭包括B-丙酰胺基[100]、硝基苯基-乙 胺[101]、鹵?；u化物(haloacyl halides) [102]、糖苷鍵[103]、6_ 氨基己酸[104]、 八0機(jī)105]、(；到(12部分[106]等。除了使用接頭外，可使用直接連接。直接連接蛋白可包 括氧化多糖，接著與蛋白還原胺化，如參考文獻(xiàn)107和108所述。優(yōu)選的方法包括引入氨基到糖(如通過(guò)用-NH2取代末端=0基團(tuán))中，接著用己 二酸二酯(例如己二酸N-羥基琥珀酰亞胺基二酯)衍生。優(yōu)選與載體蛋白反應(yīng)。另一種 優(yōu)選反應(yīng)使用具有蛋白D載體的CDAP活化，例如用于MenA或MenC。綴合后，可分離游離和綴合的糖。有許多合適的方法，包括疏水層析、切向超濾、滲 濾等[也參見參考文獻(xiàn)109和110等]。當(dāng)發(fā)明的組合物包括綴合寡糖時(shí)，優(yōu)選寡糖制備先于綴合。本發(fā)明組合物的制備本發(fā)明的組合物包括來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌血清組A，C，W135和Y中的至少2種的 莢膜糖。糖優(yōu)選單獨(dú)制備(包括任何斷裂、綴合等)然后混合以產(chǎn)生發(fā)明的組合物。然而，當(dāng)組合物包括來(lái)自血清組A的莢膜糖時(shí)，血清組A糖優(yōu)選不結(jié)合其它糖直到 使用之前不久，用于將水解可能降到最低。這易完成，通過(guò)使血清組A成分(通常與適當(dāng)賦 形劑一起)處于凍干形式和使其它血清組成分處于液體形式(也有適當(dāng)賦形劑)，準(zhǔn)備使用 時(shí)液體成分用于重建MenA成分。當(dāng)使用鋁鹽佐劑時(shí)，優(yōu)選包括佐劑于含液體疫苗的小瓶中 并凍干無(wú)佐劑的MenA成分。因此，發(fā)明的組合物可從試劑盒制備，試劑盒包括(a)來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌血清 組A的莢膜糖，以凍干形式；(b)來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌血清組C，W135和Y中的一種或多種 (例如1，2，3種)的莢膜糖，以液體形式。發(fā)明也提供制備發(fā)明組合物的方法，包括混合來(lái) 自腦膜炎奈瑟球菌血清組A的莢膜糖與來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌血清組C，W135和Y中的一種 或多種(例如1，2，3種)的莢膜糖，其中一種或多種糖是以液體形式。本發(fā)明還提供發(fā)明組合物，包括來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌血清組C，W135和Y的莢膜 糖，其中糖是以液體形式。該組合物可與凍干的血清組A糖抗原一起包裝用于重建，或該組 合物可單獨(dú)作為組合物使用，例如當(dāng)不需要抗血清組A的免疫接種時(shí)。發(fā)明也提供一種試劑盒，試劑盒包括(a)第1個(gè)容器，含來(lái)自2個(gè)或多個(gè)腦膜炎 奈瑟球菌血清組C、W135和Y的莢膜糖，都以凍干形式；(b)第2個(gè)容器，含液體形式的⑴ 來(lái)自非或1個(gè)腦膜炎奈瑟球菌血清組C、W135和Y的莢膜糖，和任選(ii)更多不包括腦膜 炎奈瑟球菌莢膜糖的抗原(見下)，其中通過(guò)容器(b)的內(nèi)含物重建容器(a)的內(nèi)含物來(lái)提 供發(fā)明組合物。本發(fā)明組合物的外觀本發(fā)明組合物可以不同的方式存在和包裝。組合物可存在于小瓶中，或它們可存在于易充滿的注射器中。提供的注射器可有 或沒(méi)有針。注射器包括單劑量組合物，而小瓶包括單劑量或多劑量?？勺⑸浣M合物通常是 液體溶液或懸浮液。另外，它們可以固體形式存在(例如冷凍干燥)用于液體載體中的溶 液或懸浮液，然后注射。
發(fā)明的組合物可以單位劑型或多劑型包裝。對(duì)于多劑型，小瓶?jī)?yōu)選是預(yù)充滿的注 射器。有效劑量體積能常規(guī)確定，但用于注射的典型人劑量的組合物體積為0. 5ml。當(dāng)發(fā)明的組合物在使用前臨時(shí)制備(如血清組A糖以凍干形式存在)和作為試劑 盒存在時(shí)，試劑盒可包括2個(gè)小瓶，或可包括1個(gè)易充滿的注射器和1個(gè)小瓶，注射器的內(nèi) 含物用于在注射前再活化小瓶的內(nèi)含物。在各劑量?jī)?nèi)，單獨(dú)糖抗原量一般在l_50yg間(作為糖質(zhì)量測(cè)量)，各優(yōu)選約為 2. 5μ g、5y g 或 10μ g。A C W135 Y 重量比例為 1 1 1 1 ;1 1 1 2 ； 2 1 1 1 ；4 2 1 1 ；8 4 2 1 ；4 2 1 2 ；8 4 1 2 ；4 2 2 1 ； 2:2:1:1 ;4:4:2:1;2:2:1:2;4:4:1:2 和 2:2:2: 1，因此，圖 1所示量?jī)?yōu)選約為2. 5yg、5yg或10yg。因而，對(duì)于1 1 1 1比例的A !CiffiY 組合物和IOyg每糖，施用40 μ g糖每劑量。優(yōu)選的組合物具有大約下列μ g糖每劑量 優(yōu)選的發(fā)明組合物包括小于50 μ g的腦膜炎球菌糖每劑量。其它優(yōu)選組合物包括 <40 μ g腦膜炎球菌糖每劑量。另外的優(yōu)選組合物包括<30 μ g腦膜炎球菌糖每劑量。其 它優(yōu)選組合物包括< 25 μ g腦膜炎球菌糖每劑量。另外的優(yōu)選組合物包括< 20 μ g腦膜炎 球菌糖每劑量。其它優(yōu)選組合物包括< IOyg腦膜炎球菌糖每劑量，但發(fā)明的組合物理想 上包括至少10 μ g腦膜炎球菌糖每劑量。本發(fā)明組合物優(yōu)選是無(wú)菌的，優(yōu)選不含熱源，優(yōu)選緩沖例如PH和pH8間，一般約7。 當(dāng)組合物包含氫氧化鋁鹽時(shí)，優(yōu)選使用組氨酸緩沖液[111]。發(fā)明組合物可相對(duì)人等滲。佐劑該組合物一般包含一種或多種佐劑?？稍谧魟┖吞腔旌闲纬杀景l(fā)明組合物之前和 /或之后將佐劑加入糖，但優(yōu)選在將各種糖混合前將佐劑與糖抗原組合。然而，不一定每種糖在混合前都必須加入佐劑。在一種糖的制備中可包括過(guò)量的 佐劑，例如當(dāng)加入更多的未加佐劑的糖抗原時(shí)，過(guò)量的佐劑被稀釋到所需終濃度。在一個(gè)具 體實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明組合物從凍干抗原(例如凍干的血清組A組分)制備時(shí)，優(yōu)選該組 合物不包含凍干形式的佐劑。優(yōu)選包含在本發(fā)明組合物中的佐劑是鋁鹽(礬)，例如氫氧化鋁(包括羥基氧化 物)，磷酸鋁(包括堿式磷酸鹽)，硫酸鋁等[參考文獻(xiàn)112第8和9章]。特別優(yōu)選羥磷 酸鋁，尤其在包括流感嗜血桿菌糖抗原的組合物中，典型佐劑是無(wú)定形羥磷酸鋁，PO4Al 摩爾比在0. 84和0. 92間，包括0. 63mg Al3+/ml?？墒褂玫蛣┝苛姿徜X的吸收，例如50到 IOOyg Al3+每綴合物每劑量。當(dāng)組合物中有1種以上綴合物時(shí)，不是所有綴合物都需吸收。 Menjugate 和NeisVac^MenC綴合物采用氫氧化物佐劑，而Meningitec 采用磷酸鹽。
磷酸鈣是另一種優(yōu)選的佐劑。還可采用或替代鋁鹽的其它佐劑包括A.含礦物質(zhì)的組合物含礦物質(zhì)的組合物適合用作發(fā)明佐劑，包括無(wú)機(jī)鹽，如鋁鹽和鈣鹽。發(fā)明包括無(wú)機(jī) 鹽如氫氧化物(例如羥基氧化物)、磷酸鹽(例如羥磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[例如參 見參考文獻(xiàn)112的第8和9章]或不同無(wú)機(jī)化合物的混合物，化合物采用任何合適的形式 (例如凝膠、晶體、無(wú)定形等)，優(yōu)選吸收。含礦物質(zhì)的組合物可制成金屬鹽的顆粒[113]。B.油乳劑適合用作發(fā)明佐劑的油乳劑組合物包括鯊烯-水乳劑，如MF59 [參考文獻(xiàn)112的 第10章；也參見參考文獻(xiàn)114] (5%鯊烯、0.5%吐溫80和0.5% Span 85，用微流化機(jī)制成 亞微米顆粒)。也可使用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。C.皂苷制劑[參考文獻(xiàn)112的第22章]皂苷制劑也能用作發(fā)明的佐劑。皂苷是留醇糖苷和三萜糖苷的異種組，在廣范圍 的植物種類的樹皮、葉、莖干、根和甚至花中發(fā)現(xiàn)。來(lái)自皂樹(Quillaiasaponaria)Molina 樹皮的皂苷作為佐劑已廣泛研究。皂苷也能商業(yè)獲得自麗花菝葜(Smilax ornata)(墨 西哥蔬契)、滿天星(Gypsophilla paniculata) (brides veil)禾口月巴阜草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21以及脂質(zhì)制劑如ISCOMs。QS21 以 Stimulon 出售。皂苷制劑用HPLC和RP-HPLC純化。鑒定了使用這些技術(shù)的特定純化部分，包括 QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B*QH-C。皂苷優(yōu)選是 QS21。生成 QS21 的方法示于參考 文獻(xiàn)42。皂苷制劑也可包括留醇，如膽固醇[116]。皂苷和膽圍醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復(fù)合體(ISCOMs)的獨(dú)特顆粒[參 考文獻(xiàn)112的第23章]。ISCOMs通常也包括磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已 知的皂苷可用于ISCOMs。ISCOM優(yōu)選包括1種或多種QuilA、QHA和QHC。ISCOMs進(jìn)一步描 述于參考文獻(xiàn)116-118。ISCOMs任選可缺乏另外的去垢劑[119]。開發(fā)以皂苷為基礎(chǔ)的佐劑的綜述可發(fā)現(xiàn)于參考文獻(xiàn)120和121。D.病毒體和病毒樣顆粒病毒體和病毒樣顆粒(VLPs)也可用作發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)一般包含1種或多 種來(lái)自病毒的蛋白，病毒任選結(jié)合磷脂或用磷脂制成。它們通常不致病、不復(fù)制且一般不包 含任何天然病毒基因組。病毒蛋白可從完整病毒中重組生成或分離。這些適用于病毒體或 VLPs的病毒蛋白包括獲得自流感病毒(如HA或NA)、乙肝病毒(如核心或衣殼蛋白)、戊型 肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾沃克病毒、人乳 頭瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、Q β -噬菌體(如外被蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205 噬菌體和Ty (如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pi)的蛋白。VLPs進(jìn)一步討論于參考文獻(xiàn)122-127。 病毒體進(jìn)一步討論于例如參考文獻(xiàn)128。E.細(xì)菌或微生物衍生物適合用于發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，如腸細(xì)菌脂多糖(LPS)的非毒性 衍生物、脂質(zhì)A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和其去毒衍生物。LPS的非毒性衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A (MPL)和3_0_脫酰MPL (3d MPL)。3dMPL是3-0-脫酰單磷酰脂質(zhì)A與4、5或6條?；湹幕旌衔铩?-0-脫酰單磷酰脂質(zhì)A的優(yōu)選 “小顆?！毙问绞居趨⒖嘉墨I(xiàn)129。這種“小顆粒” 3dMPL小到足以經(jīng)0. 22 μ m膜無(wú)菌過(guò)濾 [129]。其它非毒性LPS衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A模擬物，如氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物， 例如 RC-529[130,131]。脂質(zhì)A衍生物包括來(lái)自大腸桿菌的脂質(zhì)A衍生物，如0M-174。0M-174描述于例如 參考文獻(xiàn)132和133。適合用作發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序(二核苷酸序列，含通 過(guò)磷酸鍵連接鳥苷的未甲基化胞嘧啶)的核苷酸序列。含回文或聚(dG)序列的雙鏈RNAs 和寡核苷酸也顯示是免疫刺激性的。CpG可包括核苷酸修飾/類似物如硫代磷酸修飾且可以是雙鏈或單鏈。參考文獻(xiàn) 61,62和63揭示可能的類似物取代，如用2’ -脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。CpG寡核苷酸 的佐劑效果進(jìn)一步討論于參考文獻(xiàn)137-142。CpG序列可引向TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT[70]。CpG序列可對(duì)誘導(dǎo)Thl免疫 反應(yīng)特異，如CpG-A 0DN,或它可對(duì)誘導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng)更特異，如CpG-BODN。CpG-A和CpG-B ODN討論于參考文獻(xiàn)144-146。CpG優(yōu)選是CpG-A ODN0優(yōu)選構(gòu)成CpG寡核苷酸，使5’末端易接受受體識(shí)別。2種CpG寡核苷酸序列可任 選在其3’末端附著以形成“免疫聚體” (immunomers)。參見例如參考文獻(xiàn)143和147-149。細(xì)菌ADP-核糖基化毒素和其去毒衍生物可用作發(fā)明的佐劑。蛋白優(yōu)選獲得自大 腸桿菌(大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素“LT”)、霍亂(“CT”)或百日咳(“PT”)。使用去毒 ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑描述于參考文獻(xiàn)150且用作腸胃外佐劑描述于參考文獻(xiàn) 151。毒素或類毒素優(yōu)選以全毒素形式，包括A和B亞基。A亞基優(yōu)選包含去毒突變；B亞基 優(yōu)選不突變。佐劑優(yōu)選是去毒LT突變體，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。使用ADP-核糖基 化毒素和其去毒衍生物特定是LT-K63和LT-R72作為佐劑可發(fā)現(xiàn)于參考文獻(xiàn)152-159。關(guān) 于氨基酸取代的數(shù)字參考優(yōu)選基于參考文獻(xiàn)160所列ADP-核糖基化毒素的A和B亞基排 列，參考文獻(xiàn)160特別全部納入本文供參考。F.人免疫調(diào)節(jié)劑適合用作發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子如白介素(例如IL-1、IL-2、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[161]等)[162]、干擾素(例如干擾素-Y )、巨噬細(xì)胞集落刺 激因子和腫瘤壞死因子。G.生物粘合劑和粘膜粘合劑生物粘合劑和粘膜粘合劑也可用作發(fā)明的佐劑。合適的生物粘合劑包括酯化透明 質(zhì)酸微球體[163]或粘膜粘合劑如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基 纖維素的交聯(lián)衍生物。殼聚糖和其衍生物也可用作發(fā)明的佐劑[164]。H.微粒微粒也可用作發(fā)明的佐劑。優(yōu)選從可生物降解和非毒性物質(zhì)(如聚(α -羥酸)、 聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等)材料形成的微粒(即 IOOnm到 150nm直 徑的顆粒，更優(yōu)選 200nm到 30 μ m直徑，最優(yōu)選 500nm到 10 μ m直徑)，優(yōu)選具有聚 交酯聚乙交酯共聚物，任選處理的以具有帶負(fù)電的表面(例如用SDS)或帶正電的表面(例 如用陽(yáng)離子去垢劑，如CTAB)。
I.脂質(zhì)體(參考文獻(xiàn)112的第13和14章)適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子描述于參考文獻(xiàn)165-167。J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑適用于發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[168]。這種制劑進(jìn)一步包括組 合辛苯昔醇的聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑[169]以及組合至少1種另外非離子表面活 性劑如辛苯昔醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑[170]。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自下列組 聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯_9_硬脂基醚、聚氧乙烯_8_硬脂基醚、聚氧乙 烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。K.聚磷腈(PCPP)PCPP制劑描述于例如參考文獻(xiàn)171和172。L.胞壁酰肽適合用作發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷 氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞 壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’ -2’ - 二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰 氧基)_乙胺(MTP-PE)。M.咪唑喹諾酮(imidazoquinolone)化合物適合用作發(fā)明佐劑的咪唑酮化合物的例子包括咪喹莫特和其同源物(例如“瑞喹 莫德3M” )，它們進(jìn)一步描述于參考文獻(xiàn)173和174。發(fā)明也可包括1種或多種上面鑒定的佐劑的組合。例如，下列佐劑組合物能用 于發(fā)明(1)皂苷和水包油乳劑[175] ； (2)皂苷(例如QS21)+非毒性LPS衍生物(例如 3dMPL) [176] ； (3)皂苷(例如QS21) +非毒性LPS衍生物(例如3dMPL) +膽固醇；(4)皂苷 (例如QS21)+3dMPL+IL-12(任選+甾醇)[177] ； (5) 3dMPL與例如QS21和/或水包油乳 劑的組合[178] ； (6)SAF，含10%鯊烯、0.4%吐溫80 、5% pluronic-嵌段共聚物L(fēng)121和 thr-MDP，微流化成亞微米乳劑或渦旋產(chǎn)生較大粒度乳劑；(7) Ribi 佐劑體系(RAS) (Ribi Immunochem)，含2%鯊烯、0. 2%吐溫80和1種或多種來(lái)自單磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌 酸(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)的細(xì)菌細(xì)胞壁成分，優(yōu)選MPL+CWS (Detox ) ； (8) 1種或多種無(wú) 機(jī)鹽(如鋁鹽)+非毒性LPS衍生物(如3dMPL)。其它用作免疫刺激劑的物質(zhì)示于參考文獻(xiàn)112的第7章。當(dāng)使用硫酸鋁時(shí)，一種或多種糖可能吸附到鋁鹽上，但優(yōu)選不這樣做，這通過(guò)溶液 中包含游離的磷酸離子(例如使用磷酸緩沖液)來(lái)促進(jìn)。當(dāng)使用氫氧化鋁時(shí)，優(yōu)選糖吸附 到鹽上。對(duì)于血清組A的糖優(yōu)選使用氫氧化鋁作為佐劑。在發(fā)明的組合物中，可能一些抗原吸附于氫氧化鋁，但其它抗原與磷酸鋁相聯(lián)。對(duì) 于例如四價(jià)腦膜炎奈瑟球菌血清組組合，可得到下列排列 對(duì)于三價(jià)腦膜炎奈瑟球菌血清組組合，可得到下列排列 組合物的其它組分除上述抗原外，本發(fā)明組合物可包含腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原。也可包含非腦膜炎球菌和非奈瑟球菌抗原，優(yōu)選沒(méi)有減少抗腦膜炎球菌組分的免 疫反應(yīng)的抗原。例如參考文獻(xiàn)179描述了來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌血清組B和C的寡糖與Hib 糖的組合。優(yōu)選來(lái)自肺炎球菌，甲肝病毒，乙肝病毒，百日咳博德特氏菌(B. pertussis)，白 喉，破傷風(fēng)，骨髓灰質(zhì)炎和/或流感嗜血桿菌的抗原。尤其優(yōu)選的抗原包括-白喉抗原，如白喉類毒素[例如參考文獻(xiàn)180的第3章]。-破傷風(fēng)抗原，如破傷風(fēng)類毒素[例如參考文獻(xiàn)180的第4章]。-來(lái)自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，任選也組合 百日咳粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3 [例如參考文獻(xiàn)181和182]。-細(xì)胞百日咳抗原。-來(lái)自甲肝病毒的抗原，如滅活病毒[例如183，184]。-來(lái)自乙肝病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[例如184，185]，表面抗原優(yōu)選吸 附到硫酸鋁上[186]。-來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌血清組B的微泡[187]，‘天然OMVs’[188]，水泡或外膜囊 泡制品[例如參考文獻(xiàn)189-190 191 192 193 194等]。這些制品可從經(jīng)過(guò)遺傳操作的細(xì) 菌制備，例如遺傳操作以增強(qiáng)免疫原性(例如過(guò)表達(dá)免疫原)，減低毒性，抑制莢膜多糖合 成，下調(diào)PorA表達(dá)等。這些制品可從超發(fā)泡菌株[199-200 201 202]制備?？砂瑏?lái)自非 病原性奈瑟球菌的囊泡[203]。制備OMVs可不使用去垢劑[204，205]。這些制品可在其表 面表達(dá)非奈瑟球菌蛋白質(zhì)[206]。這些制品可以是LPS耗竭的。這些制品可與重組抗原混 合[189，207]?？墒褂脕?lái)自具有不同I類外膜蛋白質(zhì)亞型的細(xì)菌的囊泡，例如用各呈現(xiàn)三種 亞型的兩種不同遺傳工程囊泡群的六種不同亞型[208，209]，或用各呈現(xiàn)三種亞型的三種 不同遺傳工程囊泡群的九種亞型等。有用的亞型包括:Ρ1·7，16 ；Pl. 5-1,2-2 ；PI. 19,15-1 ；. 12-1，13 ；Pl. 7-2,4 ；Pl. 22，14 ；Pl. 7-1,1 ；Pl. 18_1，3，6。-脊髓灰質(zhì)炎抗原[例如210，211]，如IPV。混合物可包含一種或多種這些抗原，需要時(shí)可去毒(例如百日咳毒素用化學(xué)和/ 或遺傳方法去毒)。當(dāng)組合物中包括白喉抗原時(shí)，優(yōu)選也包括破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原。類似地，當(dāng)包 括破傷風(fēng)抗原時(shí)，優(yōu)選也包括白喉和百日咳抗原。類似地，當(dāng)包括百日咳抗原時(shí)，優(yōu)選也包 括白喉和破傷風(fēng)抗原。這種DTP組合可用于重建凍干綴合物?；旌衔镏械目乖ǔＲ灾辽俑? μ g/ml的濃度存在。一般任何給定抗原的濃度足 夠引起針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。除了在發(fā)明組合物中使用蛋白抗原外，可使用編碼抗原的核酸。因此，發(fā)明組合物 的蛋白成分能用編碼蛋白的核酸(優(yōu)選DNA，如以質(zhì)粒的形式)取代。類似地，發(fā)明組合物 可包括模擬糖抗原如模擬表位[212]或抗獨(dú)特型抗體的蛋白質(zhì)。它們可取代單獨(dú)糖成分， 或能補(bǔ)充它們。例如，疫苗可包括MenC[213]或MenA[214]莢膜多糖的肽模擬物取代糖本 身。發(fā)明的組合物可包括抗菌劑，特別是當(dāng)以多劑量形式包裝時(shí)。發(fā)明的組合物可包括去垢劑，例如吐溫(聚山梨醇酯)，如吐溫80。去垢劑一般以 低水平存在，如< 0.01%。發(fā)明的組合物可包括鈉鹽(例如氯化鈉)以產(chǎn)生滲透性。典型濃度為10士2mg/ml NaCl。發(fā)明的組合物一般包括緩沖液。典型是磷酸緩沖液。發(fā)明的組合物可包括糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖[215]或海藻糖[216])， 例如約15-30mg/ml (如25mg/ml)，特別是如果它們要凍干或如果它們包括從凍干物質(zhì)再?gòu)?fù) 原的物質(zhì)。用于凍干的組合物PH可調(diào)至約6. 1，然后凍干。本發(fā)明提供包含綴合莢膜糖的組合物，綴合莢膜糖來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌血清組A， C，W135和Y的至少三種，其中該組合物包含蔗糖。這些糖優(yōu)選是寡糖。該組合物可包含 < 50 μ g總腦膜炎球菌糖每劑量(例如彡40 μ g，彡30 μ g，彡20 μ g，彡10 μ g)。優(yōu)選的組 合物包括血清組A, C，W135 ；血清組A，C，Y ；血清組C，W135，Y ；和血清組A，C，W135和Y四 種。可采用經(jīng)修飾的MenA糖。該組合物可為液體或干燥(例如凍干)形式。當(dāng)為液體形 式時(shí)，蔗糖濃度優(yōu)選在5-50mg/ml之間例如約25mg/ml。當(dāng)為凍干形式時(shí)，優(yōu)選該組合物不 包含鋁鹽佐劑。該組合物還可包含來(lái)自下列一種或多種的抗原(a)腦膜炎奈瑟球菌血清 組B ； (b)流感嗜血桿菌B型；和/或(c)肺炎鏈球菌。免疫原性發(fā)明組合物是免疫原性的。優(yōu)選的免疫原性組合物是疫苗。根據(jù)發(fā)明的疫苗可以 是預(yù)防(即防止感染)或治療性(即治療感染后的疾病)，但通常是預(yù)防性。除了以上提到的成分外，發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗通常包括1種或多種‘藥 學(xué)上可接受載體’，藥學(xué)上可接受載體所包括的載體本身不誘導(dǎo)對(duì)接受組合物個(gè)體有害的 抗體生成。合適的載體一般是大、緩慢代謝的大分子，如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合 氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖[216]、乳糖和脂質(zhì)聚集物(例如油滴或脂質(zhì)體)。這 種載體對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。疫苗也可包含稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。另外，可存
21在輔助物質(zhì)如潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。無(wú)菌、無(wú)熱原的磷酸緩沖生理鹽水是典型 的載體。關(guān)于藥學(xué)上可接受賦形劑的詳盡討論可獲得自參考文獻(xiàn)217。用作疫苗的免疫原性組合物包括免疫上有效量的抗原以及所需任何其它成分。 ‘免疫上有效量’指以單劑量或作為一系列的部分施用給個(gè)體的量對(duì)治療或預(yù)防有效。此 量可變化，取決于待治療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、待治療個(gè)體的分類組(例如非人的 靈長(zhǎng)類動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需保護(hù)程度、疫苗制劑、治 療醫(yī)生對(duì)醫(yī)學(xué)情況的評(píng)估和其它相關(guān)因素。預(yù)期量在相對(duì)廣泛的范圍內(nèi)，范圍能通過(guò)常 規(guī)試驗(yàn)確定，每劑量各腦膜炎球菌糖抗原的典型量在1 μ g和200 μ g間，例如約1 μ g、約 2. 5yg、約4yg、約5yg或約101^(表示為糖)。能確定發(fā)明組合物的免疫原性，通過(guò)將它們施用給測(cè)試受試者(如12-16個(gè)月齡 的兒童或動(dòng)物模型[218])并然后確定標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，包括總和高親合力抗莢膜IgG的血清殺菌 抗體(SBA)和ELISA效價(jià)(GMT)。這些免疫反應(yīng)一般在組合物施用后約4周確定，與組合物 施用前確定的值相比較。優(yōu)選SBA增加至少4倍或8倍。當(dāng)施用超過(guò)1個(gè)劑量組合物時(shí)， 可進(jìn)行1次以上的施用后確定。優(yōu)選的發(fā)明組合物能賦予病人的抗體效價(jià)，效價(jià)高于可接受百分比人受試者各抗 原成分的血清保護(hù)的標(biāo)準(zhǔn)。熟知有相關(guān)抗體效價(jià)的抗原，在其之上認(rèn)為宿主是對(duì)抗原血清 轉(zhuǎn)換的，這種效價(jià)由組織如世界衛(wèi)生組織(WHO)公布。優(yōu)選大于80%的統(tǒng)計(jì)顯著性受試者 樣品發(fā)生血清轉(zhuǎn)換，更優(yōu)選大于90 %，更加優(yōu)選大于93 %且最優(yōu)選96-100 %。給予本發(fā)明組合物本發(fā)明組合物可注射。腸胃外注射可以是皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)。優(yōu)選肌肉內(nèi)施用到大腿或上 臂。注射可經(jīng)針(例如皮下注射針)，但可另外使用無(wú)針的注射。典型的肌肉內(nèi)劑量是 0. 5ml。給藥可以是單劑量方案或多劑量方案。多劑量可用于初步的免疫方案和/或加強(qiáng) 的免疫方案。初步的劑量方案可接著加強(qiáng)的免疫方案。致敏劑量間(例如4-16周間)和 致敏與加強(qiáng)間的合適時(shí)間選擇可常規(guī)確定。一般將本發(fā)明組合物給予動(dòng)物，具體說(shuō)，可治療人對(duì)象。該組合物對(duì)于疫苗接種兒 童和青年尤其有用。醫(yī)學(xué)方法和應(yīng)用發(fā)明也提供在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法，包括用本發(fā)明組合物注射患者。 免疫反應(yīng)優(yōu)選保護(hù)性地抗腦膜炎球菌疾病，可包括體液免疫反應(yīng)和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)?；?者優(yōu)選兒童。該方法可在已經(jīng)引起抗腦膜炎奈瑟球菌的患者中引起加強(qiáng)反應(yīng)。本發(fā)明還提供以下物質(zhì)在制造在動(dòng)物中引起免疫反應(yīng)的可注射藥物中的應(yīng)用 (i)來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌血清組A，C，W135和Y中的至少兩種的莢膜糖，其中所述莢膜糖與 載體蛋白綴合和/或是寡糖，和(ii)來(lái)自下列一種或多種的抗原(a)腦膜炎奈瑟球菌血 清組B ； (b)流感嗜血桿菌B型；和或(c)肺炎鏈球菌。藥物優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療細(xì)菌 性腦膜炎。一種檢查治療性處理功效的方法包括監(jiān)控施用發(fā)明組合物后的細(xì)菌感染。一種檢查預(yù)防性處理功效的方法包括監(jiān)控施用組合物后抗需處理抗原的免疫反應(yīng)。異源宿主盡管用于本發(fā)明組合物的多肽可在原始宿主(例如腦膜炎奈瑟球菌或肺炎鏈球 菌)中表達(dá)，但優(yōu)選使用異源宿主。異源宿主可以是原核(如細(xì)菌)或真核生物。它優(yōu)選是 大腸桿菌，但其它合適的宿主包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)、乳酉先胺奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、分枝桿菌(Mycobacteris)(例如結(jié)核分枝桿菌)、酵母等。綜合術(shù)語(yǔ)“包含”指“包含”以及“由…組成”，例如“包含” X的組合物可由X唯一組成 或包括另外成分，例如X+Y。涉及數(shù)值χ的術(shù)語(yǔ)“約”指例如χ士 10%。單詞“基本上”不排除“完全”，例如，“基本沒(méi)有”Y的組合物可完全沒(méi)有Y。必要 時(shí)，單詞“基本上”可從發(fā)明定義中省略。菌株可作為下標(biāo)表示，例如741MC58是來(lái)自菌株MC58的蛋白741。除非另有說(shuō)明，本 文所示蛋白(例如沒(méi)有下標(biāo))來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌菌株2996，此菌株可作為‘參考’菌株。 然而，要理解發(fā)明一般不受菌株限制。如上所示，一般參考蛋白(例如‘287’、‘919’等) 可包括來(lái)自任何菌株的蛋白。通常，它與2996的序列同一性為90%或更多(例如91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多)。當(dāng)使用雜合蛋白時(shí)，雜合體(即個(gè) 別的-X-部分)內(nèi)的單獨(dú)抗原可來(lái)自1個(gè)或多個(gè)菌株。例如當(dāng)η = 2時(shí)，X2可來(lái)自與&相 同的菌株或來(lái)自不同菌株。當(dāng)η = 3時(shí)，菌株可以是(I)X1 = X2 = X3(Ii)X1 = X2^ X3(iii) X1 ^ X2 = X3(iv)X1 興 X2 興 X3 或(V)X1 = X2 ^ X3 等。術(shù)語(yǔ)“烷基”指直和分支形式的烷基。烷基能用1、2或3個(gè)雜原子間斷，雜原子選 自-0-、-ΝΗ-或-S-。烷基也能用1、2或3個(gè)雙和/或三鍵間斷。然而，術(shù)語(yǔ)“烷基”通常指 沒(méi)有雜原子間斷或雙或三鍵間斷的烷基。當(dāng)提及CV12烷基時(shí)，烷基可包含1到12間任意數(shù) 量的碳原子(例如Q、C2、C3> C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10, Cn、C12)。類似地，當(dāng)提及C1^6烷基時(shí)， 烷基可包含1到6間任意數(shù)量的碳原子(例如C” C2, C3> C4, C5, C6)。術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”包括環(huán)烷基、聚環(huán)烷基和環(huán)鏈烯基以及這些與烷基的組合，如環(huán)烷 基烷基。環(huán)烷基能用1、2或3個(gè)雜原子間斷，雜原子選自-0-、-ΝΗ-或-S-。然而，術(shù)語(yǔ)“環(huán) 烷基”通常指沒(méi)有雜原子間斷的環(huán)烷基。環(huán)烷基的例子包括環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)己 基甲基和金剛烷基。當(dāng)提及C3_12環(huán)烷基時(shí)，環(huán)烷基可包含3到12間任意數(shù)量的碳原子(例
女口 Cg Λ C^ Λ C^ Λ Cg Λ Cj Λ Cg Λ Cg λ C-^q λ C^ λ C^) °術(shù)語(yǔ)“芳基”指芳族基，如苯基或萘基。當(dāng)提及C5_12芳基時(shí)，芳基可包含5到12間 任意數(shù)量的碳原子(例如c5、C6、C7、C8、C9、C10, C11, C12)。術(shù)語(yǔ)“C5_12芳基-CV6烷基”指基團(tuán)如芐基、苯乙基和萘甲基。氮保護(hù)基團(tuán)包括甲硅烷基(如TMS、TES、TBS、TIPS)、?；苌?如鄰苯二甲 酰亞胺、三氟乙酰胺、甲氧基羰基、乙氧基羰基、t-丁氧基羰基(Boc)、芐氧基羰基(Z或 Cbz)、9_芴甲氧基羰基(Fmoc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、2，2，2-三氯乙氧基羰基 (Troc))、磺酰衍生物(如β-三甲基甲硅烷基乙磺酰(SES))、亞磺酰衍生物、Ci_12烷基、芐基、二苯甲基、三苯甲基、9-苯基芴等。優(yōu)選的氮保護(hù)基團(tuán)是Fmoc。應(yīng)理解糖環(huán)能以開放或閉合形式存在，盡管本文的結(jié)構(gòu)式中顯示閉合形式，發(fā)明 也包括開放形式。用于促進(jìn)克隆或純化等的序列不一定有助于發(fā)明且可省略或去除。發(fā)明的多肽能通過(guò)多種方法(如重組表達(dá)、從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化、化學(xué)合成(至少 部分)等)和以多種形式(如天然、融合、非糖基化、脂化等)制備。它們優(yōu)選制成基本純 化的形式(即基本沒(méi)有其它腦膜炎奈瑟球菌或宿主細(xì)胞蛋白質(zhì))。根據(jù)發(fā)明的核酸能以許多方式制備(如通過(guò)化學(xué)合成(至少部分)、來(lái)自基因組或 cDNA文庫(kù)、來(lái)自生物體本身等)且可采用多種形式(如單鏈、雙鏈、載體、探針等)。它們優(yōu) 選制成充分純化的形式(即基本沒(méi)有其它腦膜炎奈瑟球菌或宿主細(xì)胞核酸)。術(shù)語(yǔ)“核酸” 包括DNA和RNA以及它們的類似物，如含修飾主鏈(例如硫代磷酸等)以及肽核酸(PNA) 等。發(fā)明包括所含序列與上述互補(bǔ)的核酸(例如用于反義或探測(cè)目的)。血清組之后，腦膜炎球菌分類包括血清型、血清亞型，然后是免疫型，標(biāo)準(zhǔn)命名列 出血清組、血清型、血清亞型和免疫型，各由冒號(hào)隔開，如B :4 :P1. 15 :L3，7，9。在血清組B 內(nèi)，一些譜系導(dǎo)致疾病頻繁(高侵入性)，一些譜系引起比其它譜系更嚴(yán)重的疾病形式(高 毒性)，其它的根本不導(dǎo)致疾病。識(shí)別了 7個(gè)高毒性譜系，即亞群I、III和IV-l、ET-5復(fù)合 體、ET-37復(fù)合體、A4簇和譜系3。它們通過(guò)多位點(diǎn)酶電泳(MLEE)確定，但多位點(diǎn)序列分型 (MLST)也用于分類腦膜炎球菌[參考文獻(xiàn)41]。實(shí)施發(fā)明的方式1.用于人肌肉內(nèi)給藥的腦膜炎球菌糖如參考文獻(xiàn)7所述制備來(lái)自MenC，Menffl35, MenY和任選地，MenA的寡糖綴合物。 用這些制備下列6種組合物的各0. 5ml劑量(每0. 5ml劑量的量) *血清組A組分為凍干形式，用CWY液體組合物稀釋得到最終的ACWY組合物。
通過(guò)肌肉內(nèi)注射在12-16月齡的兒童大腿部給予這些疫苗，單劑量(對(duì)于 Menjugate 在大于12個(gè)月的兒童中有效)或4周后第二次注射?？杀容^接種疫苗前和接 種疫苗后(例如在第4周，如果接受了兩次劑量然后在第8周)的血清BCA和IgG。2.兩瓶組合物用于人的綴合物制備為2個(gè)獨(dú)立的瓶。瓶1含有MenA綴合物的凍干粉，還有蔗糖 和磷酸二氫鉀。瓶2含有MenC，MenWl35和MenY綴合物，還有氯化鈉，聚山梨醇酯80，磷酸 鈉緩沖液，和任選的懸液形式的磷酸鋁佐劑。使用之前，用瓶2的0. 6ml液體重建瓶1，得到 的0. 5ml可用于給藥。制備了 3種劑量。在重建的形式中，疫苗含有下列抗原 在重建的形式中，疫苗含有下列其它抗原 因此可有六種疫苗-3種不同劑量(10，20或40 μ g總糖)，各有或沒(méi)有磷酸鋁佐 劑。將糖劑量最高的佐劑疫苗給予健康的年齡18-45歲的人對(duì)象。用于比較，對(duì)照對(duì) 象接受(a)瓶1(在緩沖液中重建)和瓶2產(chǎn)品，在相同時(shí)間不同手臂，或(WMencevax 。 各患者組有30個(gè)人。在疫苗接種前28天和疫苗接種后28天收集血液，以評(píng)價(jià)免疫反應(yīng)和收集實(shí)驗(yàn)室 安全指數(shù)(全血計(jì)數(shù)，血液化學(xué)分析，肝腎功能測(cè)試和尿分析)。疫苗被很好耐受，沒(méi)有意外 的不良反應(yīng)。在研究過(guò)程中實(shí)驗(yàn)室指數(shù)未發(fā)生顯著異常改變。在血清樣品中測(cè)定血清組A，C，W135, Y特異性SBA和IgG (用ELISA檢測(cè))。SBA 效價(jià)表示為在60分鐘時(shí)殺傷率> 50%的最終血清稀釋度的倒數(shù)。對(duì)于IgG檢測(cè)，用改進(jìn) 的ELISA來(lái)測(cè)定高親和力抗體。對(duì)于功能性抗體的檢測(cè)，使用了有兩個(gè)不同外源補(bǔ)體來(lái)源 的SBA 幼兔補(bǔ)體來(lái)源和人補(bǔ)體來(lái)源。高親和力IgG結(jié)果如下(平均GMC(y g/ml)，95%置信區(qū)間)
SBA結(jié)果如下(％反應(yīng)者和平均GMT，均為95%置信區(qū)間) 對(duì)于各血清組，在各疫苗組(ACWY，A+CWY和Mencevax對(duì)照)中，高親和力ELISA 抗莢膜IgG GMC和以兔和人補(bǔ)體試驗(yàn)測(cè)定的SBA GMT，在注射后均升高。在疫苗注射后29 天，對(duì)各血清組的人補(bǔ)體SBA效價(jià) 4的對(duì)象百分?jǐn)?shù)在綴合物疫苗組中為90%-100%， 在對(duì)照組中為83%-100%。用兔補(bǔ)體來(lái)源，對(duì)各血清組的補(bǔ)體SBA效價(jià)彡1 128的對(duì)象 百分?jǐn)?shù)在綴合物疫苗組中為93% -100%，在對(duì)照組中為90% -100%?？傮w來(lái)說(shuō)，綴合物組中的免疫反應(yīng)(GMC和GMT)好于Mencevax對(duì)照組。尤其在血 清組W-135中看到這種改善。因此，本發(fā)明綴合疫苗安全，耐受性好，誘導(dǎo)的功能性免疫反 應(yīng)與用批準(zhǔn)的四價(jià)多糖疫苗免疫接種后相同或更好。3.使用修飾的MenA糖從MenA中純化得到莢膜多糖并水解產(chǎn)生MenA寡糖。多糖(2g)在50mM乙酸鈉緩 沖液pH4. 75中50°C水解約4小時(shí)，多糖濃度為10mg/mL[73]。水解后，溶液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)
來(lái)干燥。寡糖用下列反應(yīng)流程活化 寡糖溶解于DMSO以產(chǎn)生lOmg/mL的糖濃度。根據(jù)1 20的寡糖⑶I摩爾比， 然后加入21.262g⑶I且反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?6小時(shí)。通過(guò)在80 20 (ν/ν)丙酮DMSO 混合物中選擇性沉淀，接著離心純化所得MenA-CDI化合物。通過(guò)確定游離咪唑與結(jié)合咪唑 的比例計(jì)算活化反應(yīng)效率約為67. 9%。在第2個(gè)反應(yīng)步驟中，MenA-⑶I寡糖溶解于DMSO，糖濃度約為10mg/mL。根據(jù) 1 100的MenA-CDI單位=DMA摩爾比，加入36. 288g 99%鹽酸二甲胺(即R1和R2 = Me) 且反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物冷凍干燥并再溶解于lOmg/mL水溶液。為從寡糖制品中去除低分子量反應(yīng)試劑(特別是二甲胺(DMA))，經(jīng)3.5kDaMWC0 膜(Spectra/Por )進(jìn)行透析步驟。完成4個(gè)透析步驟(i)相對(duì)2L IM氯化鈉透析16小 時(shí)(透析因子1 20)，(ii)相對(duì)2L 0. 5M氯化鈉透析16小時(shí)(透析因子1 20)，(iii) 和(iv)相對(duì)2L WFI透析16小時(shí)(透析因子1 20)。為改善純化，也經(jīng)IkDaMWCO膜 (Centricon )進(jìn)行透析步驟。純化的MenA-CDI-DMA產(chǎn)物在25mM L-組氨酸(Fluka )中緩沖于pH6. 5。為制備修飾的MenA糖綴合物(MenA-OTI-DMA)，總方法如下-水解多糖以產(chǎn)生寡糖片段_寡糖片段的尺寸定位-還原胺化依大小排列的寡糖上的末端醛基-在CDI反應(yīng)前通過(guò)Fmoc基團(tuán)保護(hù)末端-NH2基團(tuán)-在DMA反應(yīng)期間內(nèi)部去保護(hù)-NH2基團(tuán)-通過(guò)SIDEA(N-羥基琥珀酰亞胺己二酸)活化末端-NH2基團(tuán)-共價(jià)附著于CRM197蛋白修飾的MenA寡糖綴合物在升高的溫度下對(duì)水解的抗性比其天然對(duì)應(yīng)物大許多。 例如，37°C 28天后，修飾寡糖的釋放糖百分比為6.4%，相比之下，天然抗原的釋放糖百分 比為23. 5%。此外，修飾寡糖誘導(dǎo)的效價(jià)不顯著低于用天然糖結(jié)構(gòu)獲得的效價(jià)。修飾的MenA綴合物結(jié)合MenC、Menffl35和MenY綴合物，替代未修飾的寡糖綴合 物。加入MenB抗原在如上所述凍干的MenA綴合物重建之前，將MenB抗原Δ G287-953 (SEQID NO 7)， 936-AG741(SEQ ID NO 8)和 NadA (SEQ ID NO 2)加入到最高劑量液體 C-W135-Y 混合物 中，以達(dá)到這3種多肽的每一種終濃度為20 μ g/劑量。因此重建的疫苗含有下列抗原 4.加入Hib抗原將凍干的HbOC綴合物與凍干的MenA綴合物混合，一起用C_W135_Y混合物重建以 產(chǎn)生下列疫苗 5.加入肺炎鏈球菌抗原在如上所述凍干的MenA綴合物重建之前，將肺炎鏈球菌綴合物抗原加入到中等 劑量液體C-W135-Y混合物中，以達(dá)到各血清型終濃度為2 μ g/劑量(對(duì)于血清型6B加倍)。 因此重建的疫苗含有下列抗原
應(yīng)理解本發(fā)明僅通過(guò)實(shí)施例進(jìn)行了描述，可進(jìn)行修改而仍在本發(fā)明的范圍和構(gòu)思 內(nèi)。參考文獻(xiàn)(參考文獻(xiàn)的內(nèi)容全部納入本文)[l]Vaccines,第 28 章，(Plotkin 禾口 Orenstein)第 3 版，(1999) ISBN 0-7216-7443-7.[2]Armand (1982) J. Biol. Stand. 10 :335_339.[3]Cadoz 等，(1985) Vaccine 3:340-342.[4] MMWR (1997) 46 (RR-5) 1-10.[5]Baklaic 等，(1983) Infect. Immun. 42 :599_604·[6]W002/058737.[7]W003/007985.[8]Rennels 等，(2002)Pediatr Infect Dis J 21 :978_979.[9]Campbell 等，(2002) J Infect Dis 186:1848-1851.[10]Costantino 等，(1992) Vaccine 10:691-698.[11] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49.[12]W002/00249.
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權(quán)利要求
一種含有莢膜糖的可注射免疫原性組合物，所述莢膜糖來(lái)自四種腦膜炎奈瑟球菌血清組A，C，W135和Y，其特征在于(i)莢膜糖與載體蛋白綴合，四個(gè)血清組有單獨(dú)綴合物；(ii)所述綴合物具有蛋白過(guò)量的糖∶蛋白比例(w/w)；和(iii)所述組合物含有每劑10μg 25μg的腦膜炎奈瑟球菌莢膜糖；和(iv)所述組合物含有糖醇或二糖。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，(a)所述糖醇是甘露醇；或(b)所述二糖 是蔗糖，或(c)所述二糖是海藻糖。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述蔗糖的濃度是5-50mg/ml。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物是凍干形式。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，四種綴合物各具有達(dá)1 5的糖/蛋白比 例(w/w)。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，每劑含有所述血清組A、C、W135和Y的四 種腦膜炎球菌綴合物的糖5 μ g或10 μ g。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述綴合物中的載體蛋白是CRM197。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，還含有氯化鈉。
9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物為0.5ml劑量。
10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述抗腦膜炎奈瑟球菌血清組A的抗原 是一個(gè)或多個(gè)羥基已被阻斷基團(tuán)替代的修飾的血清組A莢膜糖。
11.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，還含有來(lái)自下列一種或多種的抗原(a) 腦膜炎奈瑟球菌血清組B ； (b)流感嗜血桿菌B型；和/或(c)肺炎鏈球菌。
12.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物中的腦膜炎球菌糖抗原是與 載體蛋白綴合的寡糖。
13.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述載體蛋白是CRM197蛋白，流感嗜血桿 菌的蛋白D，破傷風(fēng)類毒素或白喉類毒素。
14.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，還含有鋁鹽佐劑。
15.如前任一權(quán)利要求所述的組合物的用途，其特征在于，用于制備在患者中引起免疫 反應(yīng)以預(yù)防和/或治療細(xì)菌性腦膜炎的疫苗。
16.四種腦膜炎奈瑟球菌血清組A，C，W135和Y的莢膜糖的用途，其特征在于，用于制 備一種可注射免疫原性組合物藥物，其中(i)莢膜糖與載體蛋白綴合，四個(gè)血清組有單獨(dú) 綴合物；(ii)所述綴合物具有蛋白過(guò)量的糖蛋白比例(w/V)；和(iii)所述組合物含有 每劑10μ g-25y g的腦膜炎奈瑟球菌莢膜糖；和(iv)所述組合物含有糖醇或二糖。
17.如權(quán)利要求16所述的用途，其特征在于，所述載體蛋白是CRM197蛋白，流感嗜血桿 菌的蛋白D，破傷風(fēng)類毒素或白喉類毒素。
全文摘要
一種含有莢膜糖的可注射免疫原性組合物，莢膜糖來(lái)自四種腦膜炎奈瑟球菌血清組A，C，W135和Y，(i)莢膜糖與載體蛋白綴合，四個(gè)血清組有單獨(dú)綴合物；(ii)腦膜炎奈瑟球菌血清組A、C、W135和Y的綴合物以2∶1∶1∶1的糖重量比例存在；和(iii)該組合物每劑量含有10μg-25μg的腦膜炎奈瑟球菌莢膜糖。還公開了組合物用于制備在患者中引起預(yù)防和/或治療細(xì)菌性腦膜炎的免疫反應(yīng)的疫苗的用途。
文檔編號(hào)C07K14/22GK101926988SQ201010118498
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2004年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月30日
發(fā)明者P·科斯坦蒂諾 申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷有限公司