專利名稱：：保守的奈瑟球菌抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及奈瑟球菌屬(AW^"/fl)細(xì)菌的保守抗原。
背景技術(shù)：
：腦膜炎奈瑟球菌(iVe^wi"mem'"g"/^fo)是不能動的、對人有致病性的革蘭陰性雙球菌。根據(jù)該菌的莢膜多糖，已經(jīng)鑒定出12種腦膜炎奈瑟球菌的血清型。A型是亞撒哈拉-非洲地區(qū)流行病中最常見的病原體。B型和C型血清型菌是導(dǎo)致美國以及大多數(shù)發(fā)達(dá)國家內(nèi)絕大多數(shù)病例的原因。W135和Y型血清型菌是導(dǎo)致美國和發(fā)達(dá)國家的其余病例的原因。目前使用的腦膜炎球菌疫苗是由血清型A、C、Y和W135組成的四價(jià)多糖疫苗。然而，這種方法不能用于B型腦膜炎球菌，因?yàn)閙enB莢膜多糖是a(2-8)-相連的N-乙酰基神經(jīng)氨酸的聚合物，它也存在于哺乳動物組織中。一種menB疫苗方法采用外膜蛋白(OMP)的混合物。為了克服抗原性變異，已經(jīng)構(gòu)建了含有高達(dá)9種不同膜孔蛋白的多價(jià)疫苗(例如，PoolmanJT(1992)"腦膜炎球菌疫苗的發(fā)展"Infect.AgentsDis.4:13-28)。用于外膜疫苗的其它蛋白是opa和opc蛋白，但是這些方法均不能克服抗原性變異(例如Ala'Aldeen和Borriello(1996)"腦膜炎球菌運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白l和2均是外露的，并產(chǎn)生能殺傷同源和異源菌株的殺菌性抗體"Vaccine14(1):49-53)。大量的奈瑟球菌蛋白質(zhì)和核苷酸序列公開于W099/24578、W099/36544、WO99/57280和WO00/22430。這4件申請的內(nèi)容在此引用作為參考。菌株MC58的全面序列數(shù)據(jù)公開在Tettelin等人的Science(2000)287:1809-1815中，該文獻(xiàn)的內(nèi)容也在此引用作為參考。
發(fā)明內(nèi)容為了確保在菌株間的最大識別性和反應(yīng)性，可以使用在不同的奈瑟球菌物種、血清型和菌株之間保守的蛋白質(zhì)區(qū)域。因此，本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)含有在大多數(shù)奈瑟球菌(尤其是腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌)中共有的氨基酸序列區(qū)段。本發(fā)明提供了含有奈瑟球菌蛋白片段的蛋白質(zhì)，其中所述片段包含n個(gè)連續(xù)的保守氨基酸，條件是本發(fā)明在其范圍內(nèi)并不包括全長奈瑟球菌蛋白。根據(jù)具體蛋白質(zhì)，n為7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20或更高)。所述片段宜包含奈瑟球菌蛋白的一個(gè)抗原或免疫原區(qū)域。"保守的"氨基酸是在至少x^奈瑟球菌的特定奈瑟球菌蛋白中存在的氨基酸。x的值可以是50%或更高，例如66%、75%、80%、卯％、95%或甚至100%(即該氨基酸存在于所有奈瑟球菌的有關(guān)蛋白質(zhì)中)。為了確定一個(gè)氨基酸在特定奈瑟球菌蛋白中是否是"保守的"，需要比較在多種不同奈瑟球菌("參照群")的有關(guān)蛋白序列中的該氨基酸。參照群可包括大量不同的奈瑟球菌物種(優(yōu)選腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌)，或者可以包括單一物種。參照群可包括某一特定物種的大量不同的血清型(例如腦膜炎奈瑟球菌的A、B、C。、W135、X、Y、Z和29E血清型)，或者包括單一血清型。參照群還可包括某一特定血清型的大量不同的菌株(例如B型腦膜炎奈瑟球菌的NG6/88、BZ198、NG3/88、297—0、BZ147、BZ169、528、BZ133、NGE31、NGH38、NGH15、BZ232、BZ83和44/76株)。一種優(yōu)選的參照群由5種最常見的腦膜炎奈瑟球菌菌株和/或5種最常見的淋病奈瑟球菌菌株構(gòu)成。參照群宜含有來自合適的系統(tǒng)發(fā)生樹的k不同分支的k菌株，例如在以下文獻(xiàn)中公開的那些(a)Ni等人(1992)EpidemiolInfect109:227-239;(b)Wolff等人(1992)核酸研究(Nucl.AcidsRes.)20:46757;(c)Bygraves&Maiden(1992)遺傳微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol.);(d)Caugant等人，(1987)細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)69:2781-2792。另一種可供使用的系統(tǒng)發(fā)生樹如本申請圖8所示，另一種如圖9b所示。應(yīng)理解，某一特定物種、血清型或菌株，只有它編碼蛋白質(zhì)且該蛋白質(zhì)中存在有關(guān)氨基酸時(shí)，才被包括在參照群中。例如，在下述ORF40中的氨基酸例子中，參照群不應(yīng)包括淋病奈瑟球菌，因?yàn)樵撐锓N不含有ORF40。因此，對于在腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌中都存在的蛋白質(zhì)，優(yōu)選的參照群包括■腦膜炎奈瑟球菌A，Z2491菌株■腦膜炎奈瑟球菌B，NG6/88菌株■腦膜炎奈瑟球菌W，A22菌株■淋病奈瑟球菌，NgF62菌株6這些菌株在下列文獻(xiàn)中有描述(a)SeilerA.等人(1996)分子微生物學(xué)(Mol.Microbiol.)19(4:841-856);(b)Maiden等人,(1998)美國科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95:3140-3145;(c)Virji等人(1992)分子微生物學(xué)(Mol.Microbio.)6:1271-1279;(d)Dempsey等人，(1991)細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)173:5476-5486。然而，對于僅存在于腦膜炎奈瑟球菌中的蛋白質(zhì)，優(yōu)選的參照群包括<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>不同奈瑟球菌的氨基酸序列可以用計(jì)算機(jī)輕易地進(jìn)行比較。這通常涉及用算法，例如CLUSTAL[Thompsonetal(1994)核酸研究(Nuc1.AcidsRes.)22:4673-4680;TrendsBiochemSci(1998)23:403-405]或PILEUP算法[GCGWisconsin軟件包的組成部分，優(yōu)選9.0版]，將多個(gè)序列進(jìn)行比對。保守氨基酸在多序列比對中是很明顯的，在有關(guān)的氨基酸位置處，大多數(shù)被比對的序列會含有特定的氨基酸。還可以用程序，例如BOXSHADE[可從例如NIH在線獲得]、PRETTYBOX[GCGWisconsin,版本10]或JALVIEW[可從EB在線獲得]，保守氨基酸可更清楚地用肉眼看出。所述蛋白質(zhì)優(yōu)選含有在W099/24578、W099/36544、WO99/57280和WO00/22430中公開的蛋白質(zhì)之一的片段、或在Tettelin等人Science(2000)287:1809-1815中公開的21580RF之一的片段。更具體地，它優(yōu)選含有本文公開(見本文的實(shí)施例)的ORF4、ORF40、ORF46、蛋白質(zhì)225、蛋白質(zhì)235、蛋白質(zhì)519、蛋白質(zhì)726、蛋白質(zhì)919和蛋白質(zhì)953中一種或多種蛋白的片段。通常，本發(fā)明的蛋白不含有在W099/24578、W099/36544、WO99/57280、WO00/22430、或Tettelin等人文獻(xiàn)中明確公開的蛋白質(zhì)序列。本發(fā)明還提供了含有附圖中所示序列之一的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白當(dāng)然可用各種方法(例如重組表達(dá)、天然表達(dá)、從細(xì)胞培養(yǎng)中純化、化學(xué)合成等)制成各種形式(例如天然的、融合蛋白等)。它們宜制成基本上純的形式(即基本上不含其它奈瑟球菌或宿主細(xì)胞的蛋白)。另一方面，本發(fā)明提供了能結(jié)合這些蛋白的抗體。它們可能是多克隆的或單克隆的，可用任何合適的方法制得。另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明蛋白的核酸。還應(yīng)理解，本發(fā)明提供的核酸包括與這些序列互補(bǔ)的序列(例如用于反義或探針目的)。此外，本發(fā)明提供了與實(shí)施例中公開的腦膜炎奈瑟球菌核酸雜交的核酸，優(yōu)選在"高度嚴(yán)緊"條件下(如65。C，在0.1xSSC，0.5。/。SDS溶液)。當(dāng)然，本發(fā)明的核酸可用許多方式制得(例如化學(xué)合成，從基因組或cDNA文庫、7或從生物體本身制得等)，并可采用各種形式(例如單鏈、雙鏈、載體、探針等)。另外，術(shù)語"核酸"包括DNA和RNA，以及它們的類似物，如含有修飾骨架的那些類似物，還包括肽核酸(PNA)等。另一方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的核苷酸序列的載體(如表達(dá)載體)以及用這些載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的蛋白、抗體和/核酸的組合物。例如，這些組合物適合用作疫苗，或作為診斷性試劑，或作為免疫原性組合物。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的核酸、蛋白或抗體用作藥劑(例如作為疫苗)或作為診斷性試劑。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的核酸、蛋白或抗體在生產(chǎn)下列物質(zhì)中的應(yīng)用(i)用于治療或預(yù)防奈瑟球菌感染的藥劑；(ii)用于檢測奈瑟球菌或檢測抗奈瑟球菌抗體是否存在的診斷性試劑；和/或(iii)用于產(chǎn)生抗奈瑟球菌屬細(xì)菌的抗體的試劑。該用途宜適用于奈瑟球菌屬的所有物種。當(dāng)奈瑟球菌蛋白含有超過q。/。的保守的氨基酸時(shí)，本發(fā)明就提供了奈瑟球菌蛋白(或其片段)作為非菌株特異性的蛋白的用途，該蛋白在多個(gè)物種、血清型和菌株之間表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性。q值可以是50X60X、75%、80%、卯％、95%或甚至100%。本發(fā)明還提供了一種治療患者的方法，該方法包括給予患者治療有效量的本發(fā)明的核酸、蛋白和/或抗體。另一方面，本發(fā)明提供了各種方法。提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明蛋白的方法，該方法包括步驟在誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的條件下，培育本發(fā)明的宿主細(xì)胞。提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白或核酸的方法，該方法包括步驟部分或全部用化學(xué)方法合成蛋白質(zhì)或核酸。提供了一種檢測本發(fā)明的多核苷酸的方法，該方法包括下列步驟(a)在雜交條件下使本發(fā)明的核酸探針與生物樣品接觸，形成雙鏈體；和(b)檢測所述雙鏈體。提供了一種檢測本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括下列步驟(a)在適合形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下使本發(fā)明的抗體和生物樣品接觸；和(b)檢測所述復(fù)合物。圖1一7顯示了由BOXSHADE提供的(l)ORF40、(2)ORF4、(3)225、(4)235、(5)287、(6)519、(7)919的序列比對。保守氨基酸有黑色背景。圖8顯示了系統(tǒng)發(fā)生樹。圖9A顯示了在腦膜炎奈瑟球菌中ORF4、ORF40、225、235、287、519、919的氨基酸序列的變異性。這些序列被用于構(gòu)建圖9B中所示的系統(tǒng)發(fā)生樹。圖10—19顯示了由BOXSHADE提供的(10)ORF4、(11)ORF40、(12)ORF46、(13)225、8(14)235、(15)287、(16)519、(17)726、(18)919、(19)953的序列比對。圖20顯示了ORF4、225、235、519、和919的Western印跡結(jié)果。具體實(shí)施例方式下面列出了可用于實(shí)施本發(fā)明(例如處于免疫接種或診斷目的使用所公開的序列)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和程序的概述。這一概述并不限制本發(fā)明，相反它給出了可供使用但是并非必需的例子。綜述除非另有描述，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第2版(1989);《DNA克隆》第I和II巻(D.N.Glover編1985);《寡核苷酸合成》(M丄Gait編，1984);《核酸雜交》(B.D.Hames和S丄Higgins編.1984);《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(B.D.Hames和S丄Higgins編，1984);《動物細(xì)胞培養(yǎng)》(R.I.Freshney編，1986);《固定化細(xì)胞和酶》(IRL出版社，1986);B.Perbal，《分子克隆實(shí)用指南》(1984);《酶學(xué)方法》系列叢書(AcademicPress,Inc.),尤其是154和155巻；《哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體》(J.H.Miller和M.P.Calos編，1987，ColdSpringHarborLaboratory);Mayer和Walker編(1987)，《細(xì)胞和分子生物學(xué)的免疫化學(xué)方法》(AcademicPress,London);Scopes,(1987)《蛋白質(zhì)純化原理和實(shí)踐》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊》I-IV巻(D.C.Weir和C.C.Blackwell編1986)。在本說明書中采用了核苷酸和氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)縮寫。本文引用的所有出版物、專利和專利申請均全部納入本文作參考。具體地，國際專利申請W099/24578、W099/36544、WO99/57280和WO00/22430的內(nèi)容被并入本文定義當(dāng)組合物中總X+Y重量的至少85%是X時(shí)，則稱含有X的組合物"基本上沒有Y"。較佳的，X占組合物中X+Y總重量的至少約90%，更佳至少約95%或者甚至99%(重量)。術(shù)語"包含"指"含有"和"由......構(gòu)成"，例如"包含"X的組合物可以完全由X構(gòu)成，或者可以含有X之外的物質(zhì)，例如X+Y。術(shù)語"異源"指在自然界中發(fā)現(xiàn)不在一起的兩種生物學(xué)組分。此組分可以是宿主細(xì)胞、基因、或調(diào)控區(qū)如啟動子。盡管異源組分在自然界中發(fā)現(xiàn)不在一起，但是它們能一起起作用，例如當(dāng)與某基因異源的一種啟動子與該基因操作性相連時(shí)。另一個(gè)例子是奈瑟球菌序列與小鼠宿主細(xì)胞異源。另一例子是來自相同或不同蛋白質(zhì)的兩個(gè)表位，它們以自然界沒有的排列形式組裝在單個(gè)蛋白質(zhì)上。"復(fù)制起點(diǎn)"是啟動和調(diào)節(jié)多核苷酸(例如表達(dá)載體)復(fù)制的一種多核苷酸序列。復(fù)制起點(diǎn)可作為細(xì)胞內(nèi)多核苷酸復(fù)制的自主性單位，能在其自身的控制下進(jìn)行復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)是載體在特定宿主細(xì)胞中復(fù)制所需要的。有了某一復(fù)制起點(diǎn)，表達(dá)載體就能在細(xì)胞中合適蛋白的存在下高拷貝數(shù)的復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)的例子是在酵母中有效的自主復(fù)制序列；以及在COS-7細(xì)胞中有效的病毒性T-抗原。"突變體"序列定義為與天然或公開的序列不同但具有序列相同性的DNA、RNA或氨基酸序列。根據(jù)具體的序列，天然或公開的序列與突變體序列之間的序列相同性程度宜大于50%(例如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高，其中序列相同性如上所述用Smith-Waterman算法計(jì)算出)。如本文所述，本文提供的核酸序列的核酸分子或區(qū)域的"等位基因變體"是在另一或第二個(gè)分離株的基因組中基本上相同的基因座上的核酸分子或區(qū)域，由于諸如突變或重組引起的自然變異，它們具有相似但不相同的核酸序列。編碼區(qū)等位基因變體通常編碼的蛋白具有與其比較基因所編碼蛋白相似的活性。等位基因變體還可包含基因5'或3'非翻譯區(qū)中的變化，例如在調(diào)節(jié)控制區(qū)中的變化(例如見美國專利5,753,235)。表達(dá)系統(tǒng)奈瑟球菌核苷酸序列可在各種不同的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)；例如與哺乳動物細(xì)胞、桿狀病毒、植物、細(xì)菌和酵母一起使用的那些系統(tǒng)。i.哺乳動物系統(tǒng)哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域中已知的。哺乳動物啟動子是能結(jié)合哺乳動物RNA聚合酶并啟動下游(3')編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子具有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，其通常鄰近編碼序列的5'端，還具有一個(gè)TATA盒，其通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25-30個(gè)堿基對(bp)處。認(rèn)為TATA盒指導(dǎo)RNA聚合酶II在正確位點(diǎn)開始RNA合成。哺乳動物啟動子還含有一個(gè)上游啟動子元件，其通常位于TATA盒上游100至200bp內(nèi)。該上游啟動子元件決定了轉(zhuǎn)錄啟動的速度，并可在兩個(gè)方向之一上起作用[Sambrook等人(1989)"克隆基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)"《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》，第2版]。哺乳動物病毒基因通常是高表達(dá)的，具有寬的宿主范圍；因此，編碼哺乳動物病毒基因的序列提供了特別有用的啟動子序列。例子包括SV40早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP)以及單純皰疹病毒啟動子。另外，10從非病毒基因(如鼠金屬硫蛋白基因)衍生的序列也提供了有用的啟動子序列。表達(dá)可以是組成型的或受調(diào)控的(誘導(dǎo)型)，取決于啟動子能否在激素反應(yīng)性細(xì)胞中用促糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)。增強(qiáng)元件(增強(qiáng)子)的存在，聯(lián)合上述啟動子元件通常會提高表達(dá)水平。增強(qiáng)子是這樣一種調(diào)控性DNA序列，當(dāng)其與同源或異源啟動子相連，合成在正常的RNA起始位點(diǎn)開始時(shí)，它能刺激轉(zhuǎn)錄提高IOOO倍。當(dāng)增強(qiáng)子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游或下游，處于正?；蚍D(zhuǎn)方向，或距離啟動子1000個(gè)核苷酸以上的距離時(shí)，它均具有活性[Maniatis等人(1987)Science236:1237;Alberts等人(l989)《細(xì)胞分子生物學(xué)》，第2版]。從病毒衍生獲得的增強(qiáng)子元件可能是特別有用的，因?yàn)樗鼈兺ǔ＞哂休^寬的宿主范圍。例子包括SV40早期基因增強(qiáng)子[Dijkema等人(1985)EMBOJ.4:761]以及衍生自Rous肉瘤病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)的增強(qiáng)子/啟動子[Gorman等人(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.79:6777]以及來自人巨細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子/啟動子[Boshart等人(1985)Cdl41:521]。另外，一些增強(qiáng)子僅僅在誘導(dǎo)物(例如激素或金屬離子)的存在下是可調(diào)節(jié)的并具有活性[Sassone-Corsi禾口Borell"l986)TrendsGenet.2:215;Maniatis等人(l987)Science236:1237]DNA分子可在哺乳動物細(xì)胞中胞內(nèi)表達(dá)。啟動子序列可以和DNA分子直接相連，在這種情況下，重組蛋白的N端第一個(gè)氨基酸始終是甲硫氨酸，其由ATG起始密碼子編碼。如果需要，可通過和溴化氰體外培育來從蛋白上切下此N端。另外，外來蛋白也可從細(xì)胞中分泌到生長培養(yǎng)基中，方法是產(chǎn)生嵌合的DNA分子，該DNA分子編碼的融合蛋白包括一前導(dǎo)序列片段，該片段在哺乳動物細(xì)胞中提供了外源蛋白的分泌。較佳的，在前導(dǎo)序列片段和外源基因之間可以有能在體內(nèi)或體外斷裂的加工位點(diǎn)。前導(dǎo)序列片段通常編碼一種信號肽，該信號肽由引導(dǎo)蛋白分泌出細(xì)胞的疏水性氨基酸組成。腺病毒三聯(lián)前導(dǎo)序列是哺乳動物細(xì)胞中分泌外來蛋白的一個(gè)前導(dǎo)序列的例子。通常，哺乳動物細(xì)胞識別的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列是位于翻譯終止密碼子3'的調(diào)控區(qū)域，因此它和啟動子元件一起連接在編碼序列的側(cè)面。成熟mRNA的3'端由定點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄后斷裂和聚腺苷酸化形成[Birnstiel等人(1985)Cell41:349;Proudfoot禾口Whitelaw(1988)"真核RNA的終端和3'端加工"《轉(zhuǎn)錄和剪接》(B.D.Hames禾BD.M.Glover編)；Proudfoot(1989)TrendsBiochem.Sci.14:105]。這些序列指導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄，mRNA能被翻譯成該DNA編碼的多肽。轉(zhuǎn)錄終止子/聚腺苷酸化信號的例子包括從SV40衍生的那些[Sambrook等人(1989)"克隆基因在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)"《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》]。通常，上述組件，包括啟動子、聚腺苷酸化信號以及轉(zhuǎn)錄終止序列被一起放在表達(dá)構(gòu)建物中。如果需要，表達(dá)構(gòu)建物中還包括增強(qiáng)子、具有功能性剪接供體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子以及前導(dǎo)序列。表達(dá)構(gòu)建物通常以復(fù)制子形式維持，例如是能在宿主(如哺乳動物細(xì)胞或細(xì)菌)中穩(wěn)定維持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。哺乳動物復(fù)制系統(tǒng)包括從動物病毒衍生的那些系統(tǒng)，其需要反式作用因子來進(jìn)行復(fù)制。例如，含有乳多空病毒復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒，如SV40[Gluzman(1981)Cell23:175]或多瘤病毒，在合適的病毒T抗原存在下復(fù)制出極高的拷貝數(shù)。哺乳動物復(fù)制子的其它例子包括衍生自牛乳頭瘤病毒和EB病毒的復(fù)制子。另外，復(fù)制子可以有兩個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，從而使其能維持在例如哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)并能在原核宿主中克隆和擴(kuò)增。這些哺乳動物細(xì)菌穿梭載體的例子包括pMT2[Kaufman等人(1989)Mol.Cell.Biol.9:946]和pHEBO[Shimizu等人(1986)Mo1.Cell.Biol.6:1074]。所用的轉(zhuǎn)化程序取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域所知的，其包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、Polybrene(l，5-二甲基-l,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、將多核苷酸包裹在脂質(zhì)體中以及將DNA直接顯微注射到胞核中?？勺鳛樗拗鬟M(jìn)行表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞系是本領(lǐng)域中已知的，其包括許多從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的無限增殖細(xì)胞系，包括但不局限于，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、海拉細(xì)胞、乳倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如HepG2)和其它許多細(xì)胞系。ii.桿狀病毒系統(tǒng)也可將編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸插入合適的昆蟲表達(dá)載體中，并與該載體中的控制元件操作性相連。載體構(gòu)建采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)?？偟貋碚f，表達(dá)系統(tǒng)的組分包括一種轉(zhuǎn)移載體，通常是細(xì)菌質(zhì)粒，其含有桿狀病毒基因組片段以及便于插入待表達(dá)異源基因的限制性位點(diǎn)；野生型桿狀病毒，其序列與轉(zhuǎn)移載體中的桿狀病毒特異性片段同源(這使得異源基因能同源重組到桿狀病毒基因組中)；以及合適的昆蟲宿主細(xì)胞和生長培養(yǎng)基。將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列插入轉(zhuǎn)移載體中后，將載體和野生型病毒基因組轉(zhuǎn)染到昆蟲宿主細(xì)胞中，使載體和病毒基因組重組。表達(dá)包裝的重組病毒，鑒定并純化重組噬斑。桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)材料及其方法，除別的以外，可以試劑盒形式購自Invitrogen，SanDiegoCA("MaxBac"試劑盒)。這些技術(shù)通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，在Summers禾卩Smith的TexasAgriculturalExperimentStationBulletinNo.1555(1987)(后稱"Summer和Smith的文章")中有充分描述。在將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列插入桿狀病毒基因組之前，通常將上述組件，包括啟動子、前導(dǎo)序列(如果需要)、感興趣的編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列裝配在中間置換型構(gòu)建物(轉(zhuǎn)移載體)中。該構(gòu)建物可含有單個(gè)基因以及操作性相連的調(diào)控元件；多個(gè)基因，12每個(gè)基因有其自己的一套操作性相連調(diào)控元件；或是由同一組調(diào)控元件調(diào)控的多個(gè)基因。中間置換型構(gòu)建物通常保持在一個(gè)復(fù)制子中，例如能在宿主(如細(xì)菌)內(nèi)穩(wěn)定保持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。復(fù)制子將具有一個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，從而使其能保持在合適的宿主中進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。目前，用來將外源基因?qū)階cNPV的最常用的轉(zhuǎn)移載體是pAc373。還可設(shè)計(jì)本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的其它許多載體。這些載體例如包括，pVL985(其將多角體蛋白的起始密碼子從ATG變?yōu)锳TT，在ATT下游32個(gè)堿基對處引入一個(gè)萬aw7/I克隆位點(diǎn)；見Luckow和Summers,Virology(1989)17:31)。質(zhì)粒通常還含有多角體蛋白聚腺苷酸化信號(Mmer等人(1988)Arm.Rev.Microbiol.,42:177)以及用來在大腸桿菌中選擇和繁殖的原核氨芐青霉素抗性(amp)基因和復(fù)制起點(diǎn)。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體通常含有桿狀病毒啟動子。桿狀病毒啟動子是能結(jié)合桿狀病毒RNA聚合酶并啟動下游(5'到3')編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動子具有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，該區(qū)通常鄰近編碼序列的5'端。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括一個(gè)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)以及一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體還可能具有稱為增強(qiáng)子的第二區(qū)，如果該區(qū)域存在，它通常遠(yuǎn)離結(jié)構(gòu)基因。表達(dá)可以是調(diào)控型或組成型的。在病毒感染周期晚期大量轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因提供了特別有用的啟動子序列。例子包括從編碼病毒多角體蛋白的基因衍生獲得的序列，F(xiàn)riesen等人(1986)"桿狀病毒基因表達(dá)的調(diào)控"《桿狀病毒分子生物學(xué)》(WalterDoerfler編輯)；EPO公開號127839和155476;以及編碼p10蛋白的基因，Vlak等人(1988)，J.Gen.Virol.69:765。編碼合適的信號序列的DNA可以衍生自分泌的昆蟲或桿狀病毒蛋白(如桿狀病毒多角體蛋白基因)的基因(Carbonell等人,(1988)Gene，73:409)。另外，由于哺乳動物細(xì)胞翻譯后修飾的信號(如信號肽斷裂、蛋白水解斷裂和磷酸化)看來可被昆蟲細(xì)胞識別，且分泌和胞核積累所需的信號看來在非脊椎動物細(xì)胞和脊椎動物細(xì)胞之間是保守的，因此也可用非昆蟲來源的前導(dǎo)序列來提供昆蟲中的分泌，這些前導(dǎo)序列例如是從編碼人oc-干擾素(Maeda等人(1985)，Nature315:592)、人胃泌素釋放的肽(Lebacq-Verheyden等人(1988)，Molec.Cell.Biol.8:3129)、人IL-2(Smith等人(1985)PNAS，82:8404)、小鼠IL-3(Miyajima等人(1987)Gene58:273)和人葡糖腦苷脂酶(Martin等人(1988)DNA，7:99)的基因衍生獲得的。重組多肽或聚蛋白可以在胞內(nèi)表達(dá)，或如果它用合適的調(diào)控序列表達(dá)，它可被分泌。非融合的外源蛋白的良好胞內(nèi)表達(dá)理想的通常需要具有短前導(dǎo)序列的異源基因在ATG起始信號前有合適的翻譯起始信號。如果需要，可通過和溴化氰體外培育來從成熟蛋白上切下N端甲硫氨酸。另外，可通過產(chǎn)生嵌合的DNA分子將非天然分泌的重組聚蛋白或蛋白從昆蟲細(xì)胞中分泌出來，該嵌合的DNA分子所編碼的融合蛋白包含一前導(dǎo)序列片段，該片段提供了昆蟲中分泌外源蛋白的作用。該前導(dǎo)序列片段通常編碼一種信號肽，該信號肽包含的疏水性氨基酸引導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。在插入了編碼該蛋白表達(dá)產(chǎn)物前體的DNA序列和/或基因后，用轉(zhuǎn)移載體的異源DNA和野生型桿狀病毒的基因組DNA共同轉(zhuǎn)化(通常是共轉(zhuǎn)染)昆蟲細(xì)胞宿主。此構(gòu)建物的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列通常包含2-5kb的桿狀病毒基因組片段。將異源DNA引入桿狀病毒中所需位點(diǎn)內(nèi)的方法是本領(lǐng)域所知的。(見Summers和Smith的文章，同上；Ju等人(1987);Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)3:2156;和Luckow和Summers(1989))。例如，插入可以是通過同源雙交換重組來插入一個(gè)基因如多角體蛋白基因中；插入還可以是插入工程改造入所需桿狀病毒基因內(nèi)的限制性酶切位點(diǎn)中。Miller等人(19S9)，Bioessays4:91。當(dāng)DNA序列被克隆在表達(dá)載體多角體蛋白基因位置中時(shí)，其5'和3'均側(cè)接了多角體蛋白特異性序列，并位于多角體蛋白啟動子的下游。隨后將新形成的桿狀病毒表達(dá)載體包裝到感染性重組桿狀病毒中。發(fā)生同源重組的頻率很低(在約1%和5%之間)；因此，共轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的大多數(shù)病毒仍是野生型病毒。因此，需要用一種方法來鑒別重組病毒。該表達(dá)系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是肉眼篩選能區(qū)分重組病毒。在病毒感染后期，天然病毒產(chǎn)生的多角體蛋白在受其感染細(xì)胞的胞核中產(chǎn)生的水平非常高。累積的多角體蛋白形成的包涵體還含有包埋顆粒。這些包涵體的大小為15微米，它們具有高度的折光性，從而使它們呈現(xiàn)明亮的發(fā)光外觀，在光學(xué)顯微鏡下很容易觀察。感染了重組病毒的細(xì)胞缺少包涵體。為了區(qū)分重組病毒和野生型病毒，用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將轉(zhuǎn)染上清接種到單層昆蟲細(xì)胞上形成噬斑。S卩，在光學(xué)顯微鏡下篩選存在(表明是野生型病毒)或不存在(表明是重組病毒)包涵體的噬斑。"當(dāng)代微生物學(xué)方法"第2巻(Ausubel等人編輯)，16.8(增補(bǔ)10,1990);Summers禾口Smith,同上；Miller等人(1989)。已經(jīng)開發(fā)出感染進(jìn)入幾種昆蟲細(xì)胞的重組桿狀病毒表達(dá)載體。例如，已經(jīng)開發(fā)出用于感染以下昆蟲細(xì)胞的重組桿狀病毒埃及伊蚊、苜蓿丫紋夜蛾、家蠶、黑尾果蠅、草地夜蛾和粉紋夜蛾(WO89/046699;Carbonell等人(1985)J.Virol.56:153;Wright(1986)Nature321:718;Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.3:2156;綜述見Fraser等人(1989)InVitroCell.Dev.Biol.25:225)?？梢再彽眉?xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基用于在桿狀病毒/表達(dá)系統(tǒng)中直接表達(dá)和融合表達(dá)異源多肽；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所知的。例如見Summers和Smith,同上。然后，經(jīng)修飾的昆蟲細(xì)胞可以生長在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基能穩(wěn)定地保持該質(zhì)粒于修飾的昆蟲宿主中。當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物的基因處于可誘導(dǎo)的控制下時(shí)，可以使宿主生長至高密度，并誘導(dǎo)表達(dá)。另外，當(dāng)表達(dá)是組成型表達(dá)時(shí)，產(chǎn)物將被連續(xù)表達(dá)到培養(yǎng)基中，營養(yǎng)性培養(yǎng)基必需不斷循環(huán)，取出感興趣的產(chǎn)物同時(shí)補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物。產(chǎn)物可用以下這些技術(shù)來純化例如層析，如HPLC、親和層析、離子交換層析等；電泳；密度梯度離心；溶劑抽提等。產(chǎn)物可按需作進(jìn)一步純化，以基本上除去所有也分泌到培養(yǎng)基中或由昆蟲細(xì)胞裂解而產(chǎn)生的昆蟲蛋白，以提供一種至少基本上不含宿主碎片如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖的產(chǎn)物。為了進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，將從轉(zhuǎn)化子衍生獲得的重組宿主細(xì)胞培育在允許重組蛋白的編碼序列表達(dá)的條件下。這些條件將隨所選定的宿主細(xì)胞而變。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易根據(jù)本領(lǐng)域已知的知識來確定該條件。iii.植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)本領(lǐng)域已知有許多植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和全植物遺傳表達(dá)系統(tǒng)。典型的植物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)包括在以下專利中描述的那些，例如US5,693,506;US5,659,122;和US5,608,143。Zenk，Phytochemistry30:3861-3863(1991)中描述了在植物細(xì)胞培養(yǎng)物中遺傳表達(dá)的其它例子。除上述參考文獻(xiàn)外，關(guān)于植物蛋白信號肽的描述還可在下列文獻(xiàn)中找到Vaulcombe等人，Mol.Gen.Genet.209:33-40(1987);Chandler等人，PlantMolecularBiology3:407-418(1984);Rogers,J.Biol.Chem.260:3731-3738(1985);Rothstein等人,Gene55:353-356(1987);Whittier等人，NucleicAcidsResearch15:2515-2535(1987);Wirsel等人，MolecularMicrobiology3:3-14(1989);Yu等人，Gene122:247-253(1992)。關(guān)于用植物激素、赤霉素酸和赤霉素酸誘導(dǎo)分泌的酶調(diào)節(jié)植物基因表達(dá)的描述可在R丄.Jones和J.MacMillin，Gibberellins，《植物生理學(xué)進(jìn)展》，MalcolmB.Wilkins編輯，1984PitmanPublishingLimited,London,21-52頁中找到。描述其它調(diào)節(jié)代謝的基因的參考文獻(xiàn)參見Sheen,PlantCell,2:1027-1038(1990);Maas等人，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會雜志(EMBOJ.)9:3447-3452(1990);Benkel和Hickey，美國科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.).84:1337-1339(1987)。通常，利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，將所需的多核苷酸序列插入一表達(dá)盒中，該表達(dá)盒含有為在植物中操作而設(shè)計(jì)的基因調(diào)控元件。將該表達(dá)盒插入所需的表達(dá)載體中，表達(dá)盒的上游和下游有適合在植物宿主中表達(dá)的伴隨序列。這些伴隨序列可來自質(zhì)?；虿《?，并為載體提供所需的性能，以允許載體將DNA從起初的克隆宿主(如細(xì)菌)中移動到所需植物宿主中?；A(chǔ)的細(xì)菌/植物載體構(gòu)建物最好能提供寬的宿主范圍原核復(fù)制起點(diǎn)；原核可選擇標(biāo)記；以及，對于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化而言，宜提供TDNA序列用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移至植物染色體。當(dāng)異源基因不易檢測時(shí)，該構(gòu)建物最好還具有一個(gè)適用于確定植物細(xì)胞是否已經(jīng)轉(zhuǎn)化的可選擇標(biāo)記基因。關(guān)于合適標(biāo)記(例如對于禾草類家族成員)的綜述可在Wilmink和Dons，1993，PlantMol.Biol.Reptr，11(2):165-185中找到。還建議采用適合將異源序列整合到植物基因組中的序列。這些序列可能包括用于同源重組的轉(zhuǎn)座子序列以及允許將異源表達(dá)盒隨機(jī)插入植物基因組中的Ti序列。合適15的原核可選擇標(biāo)記包括抗生素(如氨芐青霉素或四環(huán)素)抗性標(biāo)記。編碼其它功能的其它DNA序列也可存在于載體中，這是本領(lǐng)域所知的。本發(fā)明的核酸分子可包括在一個(gè)表達(dá)盒中來表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)。通常只要一個(gè)表達(dá)盒，但是兩個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒也是可行的。除了編碼異源蛋白的序列外，重組表達(dá)盒還含有下列元件啟動子區(qū)域、植物5'非翻譯序列、起始密碼子(根據(jù)結(jié)構(gòu)基因原來是否具有而定)、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止序列。表達(dá)盒5'和3'端的獨(dú)特限制性酶位點(diǎn)能使表達(dá)盒方便地插入預(yù)先存在的載體中。異源編碼序列可以用于任何與本發(fā)明有關(guān)的蛋白。編碼感興趣的蛋白的序列將編碼出一個(gè)信號肽，該信號肽能適當(dāng)?shù)丶庸ず娃D(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，并且通常缺少可能會導(dǎo)致本發(fā)明的所需蛋白與膜結(jié)合的序列。由于對于大部分來說，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)將針對發(fā)芽期間表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，采用提供轉(zhuǎn)運(yùn)的信號肽，也可提供轉(zhuǎn)運(yùn)感興趣的蛋白質(zhì)。通過這種方式，感興趣的蛋白將從表達(dá)該蛋白的細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)出來，并能被有效地收獲。通常，種子中的分泌是通過糊粉或小盾體上皮層進(jìn)入種子的胚乳。盡管不需要使蛋白從產(chǎn)生該蛋白的細(xì)胞中分泌出來，但是這種分泌有利于重組蛋白的分離和純化。由于所需基因產(chǎn)物的最終表達(dá)將在真核細(xì)胞中進(jìn)行，因此需要確定克隆的基因部分是否含有作為內(nèi)含子被宿主剪接體機(jī)制加工的序列。如果是這樣，需要對"內(nèi)含子"區(qū)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，以防止一部分遺傳信息作為錯(cuò)誤的內(nèi)含子密碼而喪失，Reed和Maniatis，Cell41:95-105，1985?？捎梦⒘恳埔汗芤詸C(jī)械方式轉(zhuǎn)移重組DNA，將載體直接顯微注射到植物細(xì)胞中。Crossway，Mol.Gen.Genet,202:179-185。還可用聚乙二醇將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，Krens等人，Nature,296，72-74，1982。導(dǎo)入核酸片段的另一種方法是用小顆粒進(jìn)行高速彈道貫穿，在這些小珠或顆粒的基質(zhì)中或表面上帶有核酸，Klein等人，Nature,327，70-73,1987，Knudsen和Muller，1991，Planta，185:330-336提出用顆粒轟擊大麥胚乳以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大麥。還有一種導(dǎo)入方法是使原生質(zhì)體和其它實(shí)體(微細(xì)胞(minicell)、細(xì)胞、溶酶體或其它可融合的脂質(zhì)表面體)融合，F(xiàn)raley等人，美國科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，79，1859-1863，1982。載體也可通過電穿孔導(dǎo)入植物細(xì)胞中。(Fromm等人，PNAS82:5824，1958)。在該技術(shù)中，在含有基因構(gòu)建物的質(zhì)粒存在下電穿孔植物原生質(zhì)體。高電場強(qiáng)度的電脈沖使生物膜可逆地被通透，從而允許導(dǎo)入質(zhì)粒。電穿孔的植物原生質(zhì)體重新形成細(xì)胞壁，分裂并形成植物愈傷組織。能分離出原生質(zhì)體并能培育成全再生植物的所有植物，都能用本發(fā)明進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而回收得到含有轉(zhuǎn)基因的全植物。已經(jīng)知道實(shí)際上可以從培育的細(xì)胞或組織再生所有的植物，其包括但不局限于，甘蔗、甜菜、棉花、果實(shí)和其它樹、豆科植物和蔬菜的所有主要種類。一些合適的植物包括，例如，草莓屬、蓮花屬、苜蓿屬、驢食豆屬、三葉草屬、胡盧巴屬、豇豆屬、柑橘屬、亞麻屬、老鸛草屬、木薯屬(Mflm力W)、胡蘿卜屬(Z)""CM)、鼠耳芥屬、蕓苔屬、蘿卜屬、白芥屬、顛茄屬、辣椒屬、曼陀羅屬、天仙子屬、番茄屬、煙草屬、茄屬、碧冬茄屬、毛地黃屬、Majorana、菊苣屬、向日葵屬、萵苣屬、雀麥屬、天門冬屬、金魚草屬、龍骨角屬、龍面花屬(iVem";'fl)、天竺葵屬、稷屬、狼尾草屬、毛茛屬、千里光屬、Sa/j^g/o^"、香瓜屬、5waa//a、大豆屬、黑麥草屬、玉蜀黍?qū)?、小麥、蜀黍?qū)俸吐恿_屬各種類。再生方式隨各種植物而有所不同，但是通常是首先提供含有異源基因拷貝的轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體懸液。形成愈傷組織，從愈傷組織中誘生出枝條，隨后是根。另外，從原生質(zhì)體懸液可以誘生形成胚胎。這些胚胎象天然的胚胎那樣發(fā)芽形成植物。培養(yǎng)基通常含有各種氨基酸和激素，如植物生長素和細(xì)胞分裂素。尤其是對于玉米和苜蓿屬來說，在培養(yǎng)基中加入谷氨酸和脯氨酸也是很有利的。枝條和根通常同時(shí)發(fā)育。有效的再生取決于培養(yǎng)基、基因型以及培養(yǎng)史。如果控制了這三個(gè)變量，那么再生能完全再現(xiàn)和重復(fù)。在一些植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，本發(fā)明所需的蛋白可能被排泄出來，或者蛋白可從全植物中提取出來。當(dāng)本發(fā)明所需的蛋白被分泌到培養(yǎng)基中后，就可進(jìn)行收集。或者，可以用機(jī)械方式破碎胚以及無胚-半種子或其它植物組織，以釋放出分泌到細(xì)胞和組織之間的蛋白。將該混合物懸于緩沖液中，以收回可溶性蛋白。然后用常規(guī)的蛋白分離和純化方法純化重組蛋白。用常規(guī)方法調(diào)節(jié)時(shí)間、溫度、pH、氧和體積等參數(shù)，以優(yōu)化異源蛋白的表達(dá)和回收。iv.細(xì)菌系統(tǒng)細(xì)菌表達(dá)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。細(xì)菌啟動子是能結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并啟動下游(3')編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動子具有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，其通常位于編碼序列的5'端附近。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)以及一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。細(xì)菌啟動子可能還有第二個(gè)功能區(qū)域稱為操縱子，它可能與毗鄰的RNA合成開始的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)重疊。該操縱子允許(可誘導(dǎo))對轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)，因?yàn)榛蜃瓒舻鞍卓赡芙Y(jié)合操縱子并因而抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。在負(fù)調(diào)節(jié)元件(如操縱子)不存在時(shí)，可能發(fā)生組成型表達(dá)。另外，正調(diào)節(jié)可通過基因激活蛋白結(jié)合序列來實(shí)現(xiàn)，如果有的話，該結(jié)合序列通常鄰近RNA聚合酶結(jié)合序列的(5')?；蚣せ畹鞍椎睦邮欠纸獯x物激活劑蛋白(CAP)，它幫助啟動大腸桿菌(E.coli)中的lac操縱子的轉(zhuǎn)錄[Raibaud等人(1984)Annu.Rev.Genet.18:173]。因此，表達(dá)的調(diào)控可能是正作用或負(fù)作用，從而增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄。編碼代謝途徑中的酶的序列提供了特別有用的啟動子序列。例子包括衍生自糖(如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人(1977)Nature198:1056]和麥芽糖)代謝酶的啟動子序列。其它例子包括衍生自生物合成酶(如色氨酸(trp))[Goeddel等人(198Q)Nuc.AcidsRes.178:4057;Yelverton等人(1981)Nucl.AcidsRes.9:731;美國專利4,738,921;EP-A-0036776和EP-A-0121775]的啟動子序列。(3-內(nèi)酰胺酶(bla)啟動子系統(tǒng)[Weissmann(1981)"干擾素的克隆和其它錯(cuò)誤"《干擾素3》(I.Gresser編輯)]，人嗜菌體PL[Shimatake等人(1981)Nature292:128]和T5[美國專利4,689,406]啟動子系統(tǒng)也提供了有用的啟動子序列。另外，非天然存在的合成的啟動子也可象細(xì)菌啟動子一樣起作用。例如，一種細(xì)菌或嗜菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄激活序列可以和另一種細(xì)菌或嗜菌體啟動子的操縱子序列連接在一起，形成合成的雜交啟動子[美國專利4,551,433]。例如，tac啟動子是雜合的trp-lac啟動子，它由trp啟動子以及受lac阻遏蛋白調(diào)節(jié)的lac操縱子序列組成[Amann等人(1983)Gene25:167;deBoer等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80:21]。另外，細(xì)菌啟動子可包括非細(xì)菌來源但能結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并啟動轉(zhuǎn)錄的天然存在的啟動子。天然存在的非細(xì)菌來源的啟動子還能和相容的RNA聚合酶偶聯(lián)在一起，從而在原核細(xì)胞中高水平地表達(dá)某些基因[Studier等人(1986)J.Mol.Biol.189:113;Tabor等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82:1074]。另外，雜合的啟動子還可由嗜菌體啟動子以及大腸桿菌操縱子區(qū)域組成(EP-A-0267851)。除了有功能的啟動子序列外，有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)對于外來基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)也是有用的。在大腸桿菌中，核糖體結(jié)合位點(diǎn)稱為Shine-Dalgamo(SD)序列，其包括起始密碼子(ATG)以及在起始密碼子上游3-ll個(gè)核苷酸處的長度為3-9個(gè)核苷酸的序列[Shine等人(1975)Nature254:34]。認(rèn)為SD序列是通過SD序列和大腸桿菌16SrRNA的3'端之間堿基配對來促進(jìn)mRNA與核糖體結(jié)合的[Steitz等人(1979)"信使RNA中的遺傳信號和核苷酸序列"生物學(xué)調(diào)節(jié)和發(fā)育基因表達(dá)"(編者R.F.Goldberger)]。為了表達(dá)具有弱的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的原核基因和真核基因[Sambrook等人(1989)"克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá)"《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》]。DNA分子可以在胞內(nèi)表達(dá)。啟動子序列可以直接與DNA分子相連，在這種情況下，N端的第一個(gè)氨基酸始終是甲硫氨酸，其由ATG起始密碼子編碼。如果需要，可通過和溴化氰體外培育或通過和細(xì)菌甲硫氨酸N-端肽酶體內(nèi)或體外培育，將N端的甲硫氨酸從蛋白質(zhì)上切下(EP-A-0219237)。融合蛋白為直接表達(dá)提供了另一種方法。通常，將編碼內(nèi)源細(xì)菌蛋白或其它穩(wěn)定的蛋白之N端部分的DNA序列與異源編碼序列的5'端融合。在表達(dá)時(shí)，該構(gòu)建物將提供這兩個(gè)氨基酸序列的融合物。例如，入噬菌體細(xì)胞基因可以和外源基因的5'端相連并在細(xì)菌中表達(dá)。所得融合蛋白宜保留一個(gè)酶(因子Xa)加工位點(diǎn)，以便將噬菌體蛋白與外源基因切開[Nagai等人(1984)Nature309:810]。融合蛋白也可用lacZ[Jia等人(1987)Gene60:197]，trpE[Allen等人(1987)J.Biotechnol.5:93;Makoff等人(1989)'J.Gen.Microbiol.135:11]以及Chey[EP-A-0324647]基因的序列組成。兩個(gè)氨基酸序列連接處的DNA序列可以編碼或不編碼一可切割的位點(diǎn)。另一個(gè)例子是遍在蛋白融合蛋白。這種融合蛋白由遍在蛋白區(qū)域組成，該區(qū)域宜保留一個(gè)酶(例如遍在蛋白特異性加工蛋白酶)加工位點(diǎn)，以便將外源蛋白和遍在蛋白切開。通過這種方法，可以分離獲得天然的外源蛋白[Miller等人(1989)Bio/Technology7:698〗。另外，還可通過產(chǎn)生嵌合的DNA分子來將外源蛋白分泌出細(xì)胞，該嵌合的DNA分子編碼的融合蛋白含有一個(gè)信號肽序列片段，該序列片段能使細(xì)菌中的外源蛋白分泌出來[美國專利4,336，336]。信號序列片段通常編碼一個(gè)信號肽，該信號肽含有疏水性氨基酸，能指引蛋白分泌出細(xì)胞。蛋白質(zhì)被分泌到生長培養(yǎng)基(革蘭陽性菌)中或細(xì)胞內(nèi)膜和外膜之間的周質(zhì)間隙內(nèi)(革蘭陰性菌)。在編碼的信號肽片段和外源基因之間宜具有能在體內(nèi)或體外切割的加工位點(diǎn)。編碼合適信號序列的DNA可以從分泌性細(xì)菌蛋白的基因衍生獲得，這些基因例如是大腸桿菌外膜蛋白基因(ompA)[Masui等人(1983)，《基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)操作》；Ghrayeb等人(1984)EMBOJ.3:2437]以及大腸桿菌堿性磷酸酶信號序列(phoA)[Oka等人(1985)Proc.Nat1.Acad.Sci.82:7212]。另一個(gè)例子是，可采用各種芽孢桿菌菌株的a淀粉酶基因的信號序列將異源蛋白分泌出枯草芽孢桿菌[Palva等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:5582;EP-A-0244042]。通常，細(xì)菌所識別的轉(zhuǎn)錄終止序列是位于翻譯終止密碼子3'的調(diào)控區(qū)，它和啟動子一起側(cè)接在編碼序列的兩側(cè)。這些序列指導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄，而mRNA能被翻譯成該DNA所編碼的多肽。轉(zhuǎn)錄終止序列通常包括約50個(gè)核苷酸的DNA序列，該序列能形成幫助終止轉(zhuǎn)錄的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。例子包括衍生自具有強(qiáng)啟動子的基因(如大腸桿菌中的trp基因以及其它生物合成的基因)的轉(zhuǎn)錄終止序列。上述組件，包括啟動子、信號序列(如果需要的)、感興趣的編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列通常一起被放在表達(dá)構(gòu)建物中。表達(dá)構(gòu)建物通常以復(fù)制子的形式維持，例如能在宿主(如細(xì)菌)中穩(wěn)定維持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。復(fù)制子具有一個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，從而允許其維持在原核宿主中或進(jìn)行表達(dá)或進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。另外，復(fù)制子可以是高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)大致在約5至200之間，通常在約10至150之間。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主宜含有至少約10個(gè)質(zhì)粒，更佳的含有至少約20個(gè)質(zhì)粒。根據(jù)載體以及外源蛋白對宿主的影響，可以選擇高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的載體。另外，表達(dá)構(gòu)建物可以和一個(gè)整合載體一起整合入細(xì)菌基因組中。整合載體通常含有至少一個(gè)序列與細(xì)菌染色體同源，從而允許該載體整合。整合看來是載體和細(xì)菌染色體中的同源DNA之間重組的結(jié)果。例如，用不同芽孢桿菌菌株的DNA構(gòu)建的整合載體整合到芽孢桿菌染色體中(EP-A-0127328)。整合載體還可包含噬菌體或轉(zhuǎn)座子序列通常，染色體外構(gòu)建物以及整合的表達(dá)構(gòu)建物可含有可選擇的標(biāo)記，以便選擇已經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株?？蛇x擇標(biāo)記可在細(xì)菌宿主中表達(dá)，其包括賦予細(xì)菌對藥物(如氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素、卡那霉素(新霉素)和四環(huán)素)抗性的基因[Davies等人(1978)A皿u.Rev.Microbiol.32:469]。可選擇標(biāo)記還可包括生物合成性基因，如在組氨酸、色氨酸以及亮氨酸生物合成途徑中的那些基因。另外，上述某些組件可以一起放在轉(zhuǎn)化載體中。轉(zhuǎn)化載體通常包含一個(gè)可選擇標(biāo)記，如上所述，該載體以復(fù)制子形式維持或發(fā)展成一個(gè)整合載體。已經(jīng)開發(fā)出了用于轉(zhuǎn)化到許多細(xì)菌中的表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體(無論是染色體外復(fù)制子還是整合載體)。例如，已經(jīng)開發(fā)出了用于下列細(xì)菌的表達(dá)載體枯草芽孢桿菌[Palva等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:5582;EP-A-0036259和063953;PCT出版物WO84/04541]，大腸桿菌[Shimatake等人，(1981)Nature292:128;Amann等人，(1985)Gene40:183;Studier等人，(1986)J.Mol.Biol.189:113;EP-A-0036776、136829和136卯7]，酪鏈球菌[Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54:655];淺青紫鏈球菌[Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54:655],淺青紫鏈霉菌[USpatent4，745，056].將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主的方法是本領(lǐng)域熟知的，通常包括用氯化鈣或其它試劑(如二價(jià)陽離子和DMSO)處理對細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。DNA還可通過電穿孔方法導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化程序通常因待轉(zhuǎn)化的細(xì)菌種類而不同。[參見，例如使用桿菌Masson等人，(1989)F￡MSMfcraWo/.60:273;Palva等人，(1982)/Voc.Ato/.Jcadf/&479:5582;EP-A-0036259和063953;WO84/04541;使用彎曲桿菌Miller等人，(1988)/Voc.淑/.XcW.Sci.W:856;和Wang等人，(1990)/Sa"e"W.772:949;使用埃希氏大腸桿菌Cohen等人，(1973)Prac.Ato/.Jcacf.Sc/.69:2110;Dower等人，(1988)M/c/e/c^cMs7"76:6127;Kushner(1978)"用ColEl-衍生質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的改進(jìn)方法"(H.W.Boyer和S.Nicosia編輯)；Mandel等人，(1970)乂Mo/.S/o/.53:159;Taketo(1988)所ocW附.949:318;使用乳酸桿菌Chassy等人，(1987)F￡MSM;troWo/.Ze".W:173;使用假單胞菌Fiedler等人，(1988)^wa/.Aoc/zem770:38;使用葡萄球菌Augustin等人，(1990)F￡MSMicroWo/.66:203;使用鏈球菌Barany等人，(1980)7.5a"en'o/.W4:698;Harlander(1987)"用電穿孔轉(zhuǎn)化鏈球菌產(chǎn)乳酸微生物"5Yr，ococca/GewWcs(J.Ferretti禾口R.CurtissIII編輯)；Perry等人，(1981)/w/e"./附聽w.32:1295;Powell等人，(1988)4pp/.￡"v/row.M/cro&W.W:655;Somkuti等人，(1987)iVoc.々/五w.Cowg.說o&c/mo/ogy7:412]。v.酵母表達(dá)酵母表達(dá)系統(tǒng)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。酵母啟動子是能結(jié)合酵母RNA聚合酶并啟動下游(3')編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動子具有一個(gè)轉(zhuǎn)錄20起始區(qū)，它通常位于編碼序列的5'端附近。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)("TATA"盒)以及一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。酵母啟動子可能還有第二個(gè)功能區(qū)域稱為上游激活序列(UAS)，如果存在的話，它通常遠(yuǎn)離結(jié)構(gòu)基因。UAS能調(diào)節(jié)表達(dá)(可誘導(dǎo))。在UAS不存在時(shí)，發(fā)生組成型表達(dá)。表達(dá)的調(diào)控可能是正作用或負(fù)作用的，從而增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄。酵母是一種發(fā)酵生物體，具有活潑的代謝途徑，因此編碼代謝途徑中的酶的序列提供了特別有用的啟動子序列。例子包括醇脫氫酶(ADH)(EP-A-0284044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸變位酶、以及丙酮酸激酶(PyK)(EP-A-0329203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PH05基因也提供了有用的啟動子序列[Myanoham等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:1]。另外，非天然存在的合成的啟動子也可象酵母啟動子一樣起作用。例如，一種酵母啟動子的UAS序列可以和另一種酵母啟動子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)連接在一起，形成合成的雜合啟動子。這種雜合啟動子的例子包括與GAP轉(zhuǎn)錄激活區(qū)相連的ADH調(diào)控序列(美國專利No.4,876，197和4,880，734)。雜合啟動子的其它例子包括由ADH2、GAL4、GAL10或PH05基因的調(diào)控序列組成的啟動子與糖酵解酶基因如GAP或PyK的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的組合(EP-A-0164556)。另外，酵母啟動子可包括非酵母來源但能結(jié)合酵母RNA聚合酶并啟動轉(zhuǎn)錄的天然存在的啟動子。這些啟動子的例子包括，尤其是，[Cohen等人，(1980)TVa".^cfl^.77:1078;Henikoff等人，(1981)iV加we2S3:835;Hollenberg等人，(1981)C釘.M/c油'o/./國畫/.96:119;Hollenberg等人，(1979)"細(xì)菌抗生素抗性基因在釀酒酵母中的表達(dá)"尸/cwm/dyo/A/e力ca/'￡"v/ro"we"M/cmdCowmen:/"/7w/oW"wce(K.N.Timmis禾口A.Puhler編輯)；Mercerau-Puigalon等人，(1980)77:163;Panthier等人，(1980)Cwr.2:109]。DNA分子可以在酵母菌胞內(nèi)表達(dá)。啟動子序列可以直接與DNA分子相連，在這種情況下，重組蛋白N端的第一個(gè)氨基酸始終是甲硫氨酸，其由ATG起始密碼子編碼。如果需要，可通過和溴化氰體外培育將N端的甲硫氨酸從蛋白質(zhì)上切下。象在哺乳動物、植物、桿狀病毒以及細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中一樣，融合蛋白為酵母表達(dá)系統(tǒng)提供了另一種方法。通常，將編碼內(nèi)源酵母蛋白或其它穩(wěn)定的蛋白之N端部分的DNA序列與異源編碼序列的5'端融合。在表達(dá)時(shí)，該構(gòu)建物將提供這兩個(gè)氨基酸序列的融合物。例如，酵母或人超氧化物歧化酶(SOD)基因可以和外源基因5'端相連并在酵母中表達(dá)。兩個(gè)氨基酸序列連接處的DNA序列可以編碼或不編碼可切割的位點(diǎn)。例如參見EP-A-0196056。另一個(gè)例子是遍在蛋白融合蛋白。這種融合蛋白由遍在蛋白區(qū)域組成，該區(qū)域宜保留一個(gè)酶(例如遍在蛋白特異性加工蛋白酶)加工位點(diǎn)，以便將外源蛋白和遍在蛋白切開。因此，通過這種方法，可以分離獲得天然的外源蛋白(例如WO88/02楊6)。另外，還可通過產(chǎn)生嵌合的DNA分子來將外源蛋白從細(xì)胞分泌到生長培養(yǎng)基中，該嵌合的DNA分子編碼的融合蛋白含有一個(gè)前導(dǎo)序列片段，該前導(dǎo)序列片段能使酵母中的外源蛋白分泌出來。較佳的，在編碼的前導(dǎo)片段和外來基因之間宜具有能在體內(nèi)或體外切割的加工位點(diǎn)。該前導(dǎo)序列片段通常編碼了含有疏水性氨基酸的信號肽，其引導(dǎo)蛋白從細(xì)胞分泌出來。編碼合適信號序列的DNA可以從分泌性酵母蛋白的基因衍生獲得，這些基因例如有酵母轉(zhuǎn)化酶基因(EP-A-0012873;JPO62:096,086)以及A-因子基因(美國專利4,588,684)。另外，非酵母來源的前導(dǎo)序列(如干擾素前導(dǎo)序列)的存在也能提供分泌出酵母的作用(EP-A-0060057)。較佳的一類分泌前導(dǎo)序列采用了酵母a-因子基因的片段，其含有"pre"信號序列和"pro"區(qū)。可采用的oc因子片段的類型包括全長pre-proa因子前導(dǎo)序列(約83個(gè)氨基酸殘基)以及截短的a-因子前導(dǎo)序列(通常約25至50個(gè)氨基酸殘基)(美國專利4,546,083和4,870,008;EP-A-0324274)。采用a-因子前導(dǎo)片段提供分泌作用的其它前導(dǎo)序列包括雜合的a-因子前導(dǎo)序列，其由第一個(gè)酵母的pre序列以及第二個(gè)酵母a因子的pro區(qū)域組成(例如見WO89/02463)。通常，酵母識別的轉(zhuǎn)錄終止序列是位于翻譯終止密碼子3'的調(diào)控區(qū)，其和啟動子一起側(cè)接在編碼序列的兩側(cè)。這些序列指導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄，而mRNA能被翻譯成該DNA所編碼的多肽。轉(zhuǎn)錄終止序列和其它酵母識別的終止序列的例子是編碼糖酵解酶的那些轉(zhuǎn)錄終止序列。上述組件，包括啟動子、前導(dǎo)序列(如果需要的)、感興趣的編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列，通常被一起放在表達(dá)構(gòu)建物中。表達(dá)構(gòu)建物通常以復(fù)制子的形式保持，例如能在宿主(如酵母或細(xì)菌)中穩(wěn)定保持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。復(fù)制子可能具有兩個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，從而允許其能維持在例如酵母中進(jìn)行表達(dá)，并能維持在原核宿主進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。這些酵母-細(xì)菌穿梭載體的例子包括YEp24[Botstein等人(1979)Gene8:17-24]，pCL/1[Brake等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:4642-4646]和YRpl7[Stinchcomb等人(1982)J.Mol.Biol.158:157]。另夕卜，復(fù)制子可以是高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)大致在約5至200之間，通常在約10至150之間。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主宜含有至少約IO個(gè)質(zhì)粒，更佳的含有至少約20個(gè)質(zhì)粒。根據(jù)載體以及外源蛋白對宿主的影響，可以選擇高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的載體。例如參見Brake等人，同上另外，表達(dá)構(gòu)建物可以和一個(gè)整合載體一起整合入酵母基因組中。整合載體通常含有至少一個(gè)序列與酵母染色體同源，從而允許該載體整合，最好含有兩個(gè)同源序列側(cè)接該表達(dá)構(gòu)建物。整合看來是載體和酵母染色體中同源DNA之間重組的結(jié)果[Orr-Weaver等人(1983)MethodsinEnzymol.101:228-245]。通過選擇合適的同源序列插入載體中，可將整合載體導(dǎo)入酵母中某一特定的基因座。見Orr-Weaver等人，同上?？梢哉先胍粋€(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建物，這可能會影響重組蛋白產(chǎn)生的水平[Rine等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:6750]。載體中的染色體序列可以載體中的單個(gè)片段形式存在(從而導(dǎo)致整個(gè)載體的整合)，或是與染色體中的相鄰片段同源的兩個(gè)片段，這兩個(gè)片段在載體中側(cè)接在表達(dá)構(gòu)建物兩側(cè)，從而可導(dǎo)致僅表達(dá)構(gòu)建物的穩(wěn)定性整合。通常，染色體外構(gòu)建物以及整合的表達(dá)可建物均含有可選擇的標(biāo)記，以便選擇已經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母菌株。可選擇標(biāo)記可包括能在酵母宿主中表達(dá)的生物合成基因(如ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和ALG7以及G418抗性基因)，這些基因分別賦予酵母細(xì)胞對衣霉素以及G418的抗性。另外，合適的可選擇標(biāo)記還可能為酵母在毒性化合物(如金屬)存在下提供生長能力。例如，CUP1的存在使酵母能在銅離子存在下生長[Butt等人，(1987)Microbiol,Rev.51:351]。另外，上述某些組件可以一起放在轉(zhuǎn)化載體中。轉(zhuǎn)化載體通常包含一個(gè)可選擇標(biāo)記，如上所述，該載體以復(fù)制子形式維持或發(fā)展成一個(gè)整合載體。已經(jīng)開發(fā)出了用于轉(zhuǎn)化入許多酵母中的表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體(無論是染色體外復(fù)制子還是整合載體)。例如，已經(jīng)開發(fā)出用于下列酵母菌的表達(dá)載體和將外源DNA導(dǎo)入酵母宿主的方法白色念珠菌[Kurtz，等人，(1986)Mo/.Ce〃.歷o/.6:142]，麥芽糖念珠菌[Kunze，等人，(1985)萬aw'cMfcroWo/.Z5:141]，多形漢遜酵母[Gleeson，等人，(1986)>/M/croWo/."2:3459;Roggenkamp等人，(1986)Mo/.2d302]，脆壁克魯維酵母[Das，等人，(1984)/.Sac&Wo/.755:1165]，乳酸克魯維酵母[DeLouvencourt等人，(1983)5a"eno/.754:737;VandenBerg等人，(1990)5/o/rec/2"o/ogyS:135]，季也蒙畢赤酵母[Kunze等人，(1985)/5a;/cMfcro6/。/.25:141〗，巴斯德畢赤酵母[Cregg，等人，(1985)Mo/.Ce〃.BZo/.5:3376;美國專利No.4,837,148和4,929,555]，釀酒酵母[Hinnen等人，(1978)/Voc.Sc/.75:1929;Ito等人，(1983)JSa"e〃'o/.753:163],栗酒裂植酵母[Beach禾BNurse(1981)iVa""300:706],以及ya/row;fl//po(y"ca[Davidow，等人，(1985)Cww.70:380471Gaillardin，等人，(1985)Cwn".70:49]。將外源DNA導(dǎo)入酵母宿主的方法是本領(lǐng)域熟知的，通常包括用堿陽離子處理轉(zhuǎn)化原生質(zhì)球或完整酵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)化程序通常因待轉(zhuǎn)化的酵母種類而不同。例如參見，[Kurtz等人，(1986)Mo/.Ce〃.B/o/.6:142;Kunze等人，(1985)5awcM;croWo/.Z5:141;念珠菌];[Gleeson等人，(1986)■/M/croWo/."2:3459;Roggenkamp等人，(1986)她/.G匿r.甜:302;漢遜酵母];[Das等人，(1984)/5a"mo/."S:1165;DeLouvencourt等人，(1983)/.754:1165;VandenBerg等人，(1990)萬/o/rec/mo/ogyS:135;克魯維酵母];[Cregg等人，(1985)Mo/.Ce〃.Ao/.5:3376;Kunze23等人，(1985)/.5flw'cMkroWo/.25:141;美國專利No.4，837,148和4,929,555;畢赤酵母];[Hinnen等人，(1978)Prac.淑/.Sc/.固75;1929;Ito等人，(1983)/Ba"en'o/."3:163釀酒酵母];[Beach禾tJNurse(1981)7VamM300:7O6;裂殖酵母];[Davidow等人，(1985)Cwr.70:39;Gaillardin等人，(1985)O^r.70:49;Yarrowia]。抗體本文所用的術(shù)語"抗體"指由至少一個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)組成的一個(gè)或一組多肽。"抗體結(jié)合位點(diǎn)"是一個(gè)三維結(jié)合空間，其內(nèi)表面形狀和電荷分布與抗原表位的特征互補(bǔ)，從而使抗體與抗原結(jié)合。"抗體"例如包括，脊椎動物抗體、雜合抗體、嵌合抗體、人源化抗體、經(jīng)修飾的抗體、單價(jià)抗體、Fab蛋白以及單結(jié)構(gòu)域抗體。針對本發(fā)明蛋白的抗體可用于親和層析、免疫試驗(yàn)以及區(qū)別/鑒定奈瑟球菌蛋白。針對本發(fā)明蛋白的多克隆和單克隆抗體可用常規(guī)方法制得。通常，首先用蛋白來免疫合適的動物，較佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可獲得的血清體積多，能獲得標(biāo)記的抗家兔和抗山羊抗體，因此對于制備多克隆抗血清來說，家兔和山羊是較佳的。免疫通常這樣進(jìn)行將蛋白以鹽水(較佳的以佐劑如Freimd氏完全佐劑)混合或乳化，然后腸胃外(通常是皮下或肌內(nèi))注射該混合物或乳劑。每次注射50-200微克的劑量就足夠了。2-6周后用鹽水(較佳的是用Freund氏不完全佐劑)配的蛋白質(zhì)注射一次或多次以強(qiáng)化免疫。另外可以用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行體外免疫來產(chǎn)生抗體，從本發(fā)明的目的來看，認(rèn)為其與體內(nèi)免疫等效。將免疫后的動物血液抽取到玻璃或塑料容器中，25。C培育該血液1小時(shí)，然后4"C培育2-18小時(shí)，獲得多克隆抗血清。離心(例如1000g10分鐘)回收血清。家兔每次取血可獲得約20-50毫升。用Kohler和Milstein的標(biāo)準(zhǔn)方法[Nature(1975)256:495-96]或其改進(jìn)方法制得單克隆抗體。通常，如上所述對小鼠或大鼠免疫。然而，并非是對動物取血然后抽提血清，而是取出脾臟(以及任選地取出幾個(gè)大的淋巴結(jié))，將其分離成單細(xì)胞。如果需要，可將細(xì)胞懸液(在除去非特異性粘附的細(xì)胞后)加入包被了蛋白質(zhì)抗原的板或孔中，對脾細(xì)胞進(jìn)行篩選。表達(dá)抗原特異性的膜結(jié)合免疫球蛋白的B細(xì)胞結(jié)合到板上，不象懸液其它物質(zhì)那樣被洗去。然后使所得B細(xì)胞或所有解離的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤，培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基(如次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷培養(yǎng)基，"HAT")中。通過有限稀釋接種所得雜交瘤，并測定特異性結(jié)合免疫抗原(且不結(jié)合無關(guān)抗原)的抗體的產(chǎn)生。然后，體外(例如在組織培養(yǎng)瓶或中空纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(如小鼠腹水中)培養(yǎng)所選的分泌單克隆抗體的雜交瘤。如果需要，抗體(無論是多克隆還是單克隆抗體)可用常規(guī)技術(shù)來標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、放射活性原子(具體是32P和1251)、密電子試劑、酶、以及具有特異性結(jié)合配偶的配體。酶通常靠其活性來檢測。例如，辣根過氧化物酶通常是檢測其將3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)變成藍(lán)色的能力，可用分光光度計(jì)定量測定。"特異性結(jié)合配偶"指能以高特異性結(jié)合配體分子的蛋白質(zhì)，例如抗原以及對其有特異性的單克隆抗體。其它特異性結(jié)合配偶包括生物素和親和素或鏈親和素，IgG和蛋白A，以及本領(lǐng)域已知的許多受體-配體對。應(yīng)理解，上述內(nèi)容并非要將各種標(biāo)記分成不同的類，因?yàn)橥粯?biāo)記可在幾種不同的模型中起作用。例如，1251可作為放射活性標(biāo)記，或作為密電子試劑。HRP可作為酶或單抗的抗原。另外，一種物質(zhì)可以和各種標(biāo)記組合以獲得所需的效果。例如，在實(shí)施本發(fā)明中，單抗和親和素也需要標(biāo)記，因此，可以用生物素標(biāo)記單抗，并用標(biāo)記了1251的親和素檢測其存在，或用標(biāo)記HRP的抗生物素單抗檢測其存在。其它替換和可能性對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的，所以應(yīng)認(rèn)作等價(jià)物屬于本發(fā)明的范圍。藥物組合物藥物組合物可包含本發(fā)明的多肽、抗體或核酸。該藥物組合物將包含治療有效量的本發(fā)明的多肽、抗體或多核苷酸。本文所用的術(shù)語"治療有效量"指治療劑治療、緩解或預(yù)防目標(biāo)疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預(yù)防效果的量。該效果例如可通過化學(xué)標(biāo)記或抗原水平來檢測。治療效果也包括生理性癥狀的減少，例如導(dǎo)致體溫降低。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質(zhì)和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預(yù)先指定準(zhǔn)確的有效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可以用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定該有效量，臨床醫(yī)師是能夠判斷出來的。為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個(gè)體約0.01毫克/千克至50毫克/千克或0.05毫克/千克至10毫克/千克的DNA構(gòu)建物。藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑(例如抗體、多肽、基因或其它治療劑)給藥的載體。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個(gè)體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。合適的載體可能是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸(polylacticacid)、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。本文可用的藥學(xué)上可接受的鹽例如有無機(jī)酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；以及有機(jī)酸鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。治療性組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另25外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。脂質(zhì)體也包括在藥學(xué)上可接受的載體的定義中。輸藥方法一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其直接給予對象。待治療的對象可以是動物；尤其可以治療人對象。直接輸送該組合物通常可通過皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸送至組織間隙來實(shí)現(xiàn)。組合物也可輸送至病灶區(qū)。其它給藥方式包括口服和肺給藥、栓劑和透皮或經(jīng)皮膚施用(參見例如WO98/20734)、用針、基因槍或手持噴霧器(hypospray)。治療劑量方案可以是單劑方案或多劑方案。疫苗本發(fā)明的疫苗可以是預(yù)防性的(即預(yù)防感染)或治療性的(即在感染后治療疾病)。這些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸，通常與"藥學(xué)上可接受的載體"組合，這些載體包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個(gè)體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質(zhì)凝集物(如油滴或脂質(zhì)體)以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑("佐劑")作用。另外，抗原或免疫原可以和細(xì)菌類毒素(如白喉、破傷風(fēng)、霍亂、幽門螺桿菌等病原體的類毒素)偶聯(lián)。增強(qiáng)組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限于(l)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油型乳劑配方(有或沒有其它特異性的免疫刺激劑，如胞壁酰肽(見下文)或細(xì)菌細(xì)胞壁成分)，例如，(a)MF59(WO90/14837;第10章疫苗設(shè)計(jì)亞基和佐劑方法，PowelI&Newman編，PlenumPress,1995)，其含有5%鯊烯、0.5%吐溫80和0.5。/。Span85(任選地含有不同量的MTP-PE(見下文)，雖然并不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA))制成亞微米級顆粒；(b)SAF，其含有10%鯊烯、0.4%吐溫80、5n/。普盧蘭尼克(pluronic)嵌段聚合物L(fēng)121以及thr-MDP(見下文)，微量流化成亞微米級乳劑或渦流振蕩產(chǎn)生粒徑較大的乳劑，和(c)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(RibiImmunochem,Hamilton,MT),其含有2%鯊烯、0.2%吐溫80以及取自單磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和細(xì)胞壁骨架(CWS)的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分，較佳的是MPL+CWS(Detox);(3)皂素佐劑，例如可釆用StimulonTM(CambridgeBioscience,Worcester,MA)或從其產(chǎn)生的顆粒，如ISCOM(免疫刺激性復(fù)合物)；(4)Freund完全佐劑(CFA)和Freund不完全佐劑(IFA);(5)細(xì)胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(如y干擾素)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CFS)、腫瘤壞死因子(TNF)等；以及(6)作為免疫刺激劑來增強(qiáng)組合物效果的其它物質(zhì)。Alum和MF59是較佳的。如上所述，胞壁酰肽包括但不局限于，N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氦酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰氨?；?L-丙氨酸-2-(r-2'-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。免疫原性組合物(如用于免疫的抗原/免疫原/多肽/蛋白/核酸，藥學(xué)上可接受的載體以及佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等可存在于這類運(yùn)載體中。通常，可將免疫原性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在脂質(zhì)體中，在上述藥學(xué)上可接受的載體下增強(qiáng)佐劑效果。用作疫苗的免疫原性組合物，包含免疫學(xué)有效量的抗原性或免疫原性多肽以及上述其它所需的組分。"免疫學(xué)有效量"指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個(gè)體的量對治療或預(yù)防是有效的。該用量根據(jù)所治療個(gè)體的健康狀況和生理狀況、所治療個(gè)體的類別(如非人靈長類等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對醫(yī)療狀況的評估、及其它的相關(guān)因素而定。預(yù)計(jì)該用量將在相對較寬的范圍內(nèi)，可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。常規(guī)方法是從腸胃外途徑通過注射給予免疫原性組合物，例如皮下、肌內(nèi)或透皮給藥(例如WO98/20734)。適合其它給藥方式的其它配方包括口服和肺制劑、栓劑和透皮應(yīng)用。治療劑量可以是單劑方案或多劑方案。疫苗可以結(jié)合其它免疫調(diào)節(jié)劑一起給予作為以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的疫苗的一種替代方案是，可以采用DNA疫苗接種[例如，Robi腸n禾口Torres(1997)SeminarsinImmunology9:271-283;Donnelly等人(1997)A廳Rev.Immunol15:617-648;見下文]?；蜉斔洼d體用于輸送構(gòu)建物的基因治療載體可以口服或全身性給予，其中所述構(gòu)建物包括本發(fā)明治療劑的編碼序列，將其輸送至哺乳動物以便在哺乳動物體內(nèi)表達(dá)。這些構(gòu)建物可利用體內(nèi)或活體外方式中的病毒或非病毒載體方法。這些編碼序列的表達(dá)可用內(nèi)源哺乳動物啟動子或異源啟動子誘導(dǎo)。編碼序列的體內(nèi)表達(dá)可以是組成型的或受調(diào)控的。本發(fā)明包括能表達(dá)所涉及的核酸序列的基因輸送運(yùn)載體。基因輸送運(yùn)載體宜為病毒載體，更佳的是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒或甲病毒載體。27病毒載體還可以是星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、細(xì)小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒或披膜病毒的病毒載體。通常參見Jolly(1994)Omcw772er";7少1:51-64;Kimura(1994)//ww朋77^ra;;;5:845-852;Connelly(1995)//wmflw77^ra;7少6:185-193;以及Kaplitt(1994)iV^we6:148-153。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是本領(lǐng)域中熟知的并且我們認(rèn)為任何逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體都可用于本發(fā)明，它們包括B、C和D型逆轉(zhuǎn)錄病毒、異嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如NZB-X1、NZB-X2禾卩NZB9-1(見0'Neil1(1985)J.Virol.53:160)廣嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒如MCF和MCF-MLV(見Kelly(1983)J.Virol45:291)、泡沫病毒和慢病毒。見《RNA腫瘤病毒》第2版，ColdSpringHarborLaboratory,1985。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體的諸部分可從不同逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生獲得。例如，逆轉(zhuǎn)錄載體LTR可以從小鼠肉瘤病毒衍生獲得，tRNA結(jié)合位點(diǎn)可以從Rous肉瘤病毒衍生獲得，包裝信號從小鼠白血病病毒獲得，第二鏈的合成起點(diǎn)從禽類白血病病毒獲得?？蓪⑦@些重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入合適的包裝細(xì)胞系，用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)感受態(tài)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒(見美國專利5，591，624)。通過將嵌合性整合酶摻入逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，以便將其定點(diǎn)整合到宿主細(xì)胞DNA中(見W096/37626)。較佳的重組病毒載體是復(fù)制缺陷型重組病毒。適合與上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體一起使用的包裝細(xì)胞系是本領(lǐng)域熟知的，很容易制得(見WO95/30763和WO92/05266),并能用來產(chǎn)生能生產(chǎn)重組載體顆粒的生產(chǎn)型細(xì)胞系(也稱為載體細(xì)胞系或"VCL")。包裝細(xì)胞系宜從人親代細(xì)胞(如HT1080細(xì)胞)或貂親代細(xì)胞系制取，以便消除人血清的滅活作用。用來構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體的較佳的逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括禽類白血病病毒、牛白血病病毒、鼠白血病病毒、水貂細(xì)胞灶誘導(dǎo)病毒、鼠肉瘤病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒和Rous肉瘤病毒。特別佳的鼠白血病病毒包括4070A和1504A(Hartley和Rowe(1976)/PW19:19-25)，Abelson(ATCCNo.VR-999),Friend(ATCCNo.VR國245)，Graffi，Gross(ATCCNolVR-590),Kirsten，Harvey肉瘤病毒和Rauscher(ATCCNo.VR-998)以及莫洛尼鼠白血病病毒(ATCCNo.VR-190)。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒可以從保藏機(jī)構(gòu)或保藏中心如Rockville，Maryland的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，或用常用的技術(shù)從已知來源分離獲得?？捎糜诒景l(fā)明的典型的已知逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體包括在以下專利申請中描述的那些載體GB2200651，EP0415731，EP0345242，EP0334301，WO89/02468;WO89/05349,WO89/09271,WO卯/02806，WO90/07936,WO94/03622,W093/25698,W093/25234,WO93/11230,WO93/10218,WO91/02805,WO91/02825,WO95/07994,US5,219,740，US4,405,712，US4,861,719，US4,980,289，US4,777,127，US5,591,624.另見Vile(1993)Omcwi"53:3860-3864;Vile(1993)C匿wi^53:962-967;Ram(1993)Ca"c"53(1993)83-88;Takamiya(1992)/TVewrosc/33:493-503;Baba(1993)JA^z^oywrg79:729-735;Mann(1983)Ce〃33:153;Cane(1984)PraciW"」cadSc/81:6349;以及Miller(1990)i/w附朋G面772"，1。人腺病毒基因治療載體也是本領(lǐng)域中已知的，并可用于本發(fā)明。例如參見Berkner(1988)腸&c/7m々薦6:616和Rosenfeld(1991)5We"ce252:431，以及WO93/07283'WO93/06223和WO93/07282。用于本發(fā)明的典型的已知的腺病毒基因治療載體包括在上述文獻(xiàn)以及下述專利中描述的那些例子W094/12649,WO93/03769,W093/19191,W094/28938,W095/11984,W095層655，WO95/27071,W095/29993,W095/34671,WO96/05320,WO94/08026,WO94/11506,WO93/06223,W094/24299,W095/l楊2，W095/24297,WO95/02697,W094/28152,W094/24299,WO95/09241,WO95/25807,WO95/05835，WO94/18922和WO95/09654。另夕卜，可以采用Curiel(1992)Hum.GeneTher.3:147-154中描述的給予和已殺死腺病毒相連的DNA的方法。本發(fā)明的基因輸遞載體還包括腺病毒伴隨病毒(AAV)載體。用于本發(fā)明的這種載體的主要且較佳的例子是Srivastava，WO93/09239中公開的AAV-2為基礎(chǔ)的載體。最佳的AAV載體包含兩個(gè)AAV反向末端重復(fù)序列，其中通過替換核苷酸對天然D-序列進(jìn)行修飾，使至少5-18個(gè)天然的核苷酸(較佳的至少10-18個(gè)天然核苷酸，最佳的10個(gè)天然核苷酸)被保留下來，而D-序列其余的核苷酸缺失或用非天然核苷酸取代。AAV反向末端重復(fù)序列的天然D-序列是每個(gè)AAV反向末端重復(fù)序列中不參與HP形成的20個(gè)串聯(lián)核苷酸的序列(即每一端有一個(gè)序列)。非天然的替換核苷酸可以是天然D-序列該位置中所見核苷酸以外的任何核苷酸。其它可采用的典型AAV載體是pWP-19、pWN-l，兩者均公開在Nahreini(1993)Gene124:257-262中。這樣的AAV載體的另一個(gè)例子是psub201(見Samulski(1987)J.Virol.61:3096)。另一個(gè)典型的AAV載體是Double-DITR載體。Double-DITR載體的構(gòu)建方案公開在美國專利5,478,745中。還有其它的載體是公開在Carter的美國專利4,797,368和Muzyczka的美國專利5,139,941、Chartejee的美國專利5,474,935和Kotin的W094/288157中的載體?？捎糜诒景l(fā)明的另一個(gè)AAV載體例子是SSV9AFABTKneo，它含有AFP增強(qiáng)子和白蛋白啟動子，并且主要指導(dǎo)肝內(nèi)表達(dá)。其結(jié)構(gòu)和構(gòu)建方案公開在Su(1996)HumanGeneTherapy7:463-470中。其它的AAV基因治療載體在美國專利5,354,678，5,173,414，5,139,941，5,252,479中有所描述。本發(fā)明的基因治療載體還包括皰疹載體。主要且較佳的例子是含有編碼胸苷激酶多肽的序列的單純皰疹病毒載體，如公開在US5,288,641和EP0176170(Roizman)中的那些。其它典型的單純皰疹病毒載體包括WO95/04139中公開的HFEM/ICP6-LacZ(WistarInstitute)、Geller(1988)Science241:1667-1669以及WO90/09441和WO92/07945中公開的pHSVlac、Fink(1992)HumanGeneTherapy3:11-19中描述的HSVUs3::pgC陽lacZ、EP0453242(Breakefield)中描述的HSV7134、2RH105和GAL4以及保藏于ATCC、保藏29號為ATCCVR-977和ATCCVR-260的那些病毒。還考慮到甲病毒基因基因治療載體也可用于本發(fā)明。較佳的甲病毒載體是新培斯病毒載體。披膜病毒、SemlikiForest病毒(ATCCVR-67;ATCCVR-1247)、Middleberg病毒(ATCCVR-370)、RossRiver病毒(ATCCVR-373;ATCCVR-1246)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCCVR923;ATCCVR-1250;ATCCVR-1249;ATCCVR-532)、以及在美國專利5,091,309，5,217,879以及WO92/10578中描述的那些。更具體地說，可以采用1995年3月15日提交的美國申請08/405,627、W094/21792、WO92/10578、WO95/07994、US5,091,309和US5,217,879中描述的那些甲病毒載體。這些甲病毒可以從保藏機(jī)構(gòu)或保藏中心如Rockville，Maryland的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，或用常用的技術(shù)從己知來源分離獲得。較佳的是，釆用細(xì)胞毒性降低的甲病毒載體(見USSN08/679640)。DNA載體系統(tǒng)，如真核分層的(layered)表達(dá)系統(tǒng)也可用于表達(dá)本發(fā)明的核酸。關(guān)于真核分層的表達(dá)系統(tǒng)詳見WO95/07994。較佳的，本發(fā)明的真核分層表達(dá)系統(tǒng)宜從甲病毒載體衍生獲得，更佳的從新培斯病毒載體衍生獲得。適用于本發(fā)明的其它病毒載體包括從脊髓灰質(zhì)炎病毒衍生的載體，例如ATCCVR-58以及在Evans，Nature339(1989)385和Sabin(1973),腸/.S,cmdan^za"'o"1:115中描述的那些；鼻病毒，例如ATCCVR-1110以及在Arnold(19卯)■/Ce〃別oc/zewL401中描述的那些；痘病毒，如金黃色痘病毒或牛痘病毒，例如ATCCVR-111和ATCCVR-2010,以及在Fisher-Hoch(1989)iVocAto/爿cfld86:317;Flexner(1989)爿""爿cad569:86，F(xiàn)lexner(1990)&cc/"e8:17;US4,603,112，US4,769,330以及WO89/01973中描述的那些；SV40病毒，例如ATCCVR-305以及在Mulligan(1979)A^"re277:108和Madzak(1992)/Ge"Wro/73:1533中描述的那些；流感病毒，例如ATCCVR-797以及用例如US5,166,057禾BEnami(19卯)ProcAto/爿cadSc/87:3802-3805;Enami和Palese(1991)/Fz>o/65:2711-2713;Luytjes(1989)C"/59:110中所述的反基因技術(shù)制得的重組流感病毒(另見McMichael(1983)A^/Med309:13，Yap(1978)iV"^/"273:238以及iVa/w"(1979)277:108);EP-0386882和Buchschacher(1992)F/ra/.66:2731中描述的人免疫缺陷病毒；麻疹病毒，例如ATCCVR-67禾QVR-1247,以及EP-0440219中描述的那些；奧拉病毒，例如ATCCVR-368;Bebaru病毒，例如ATCCVR-600和ATCCVR-1240;Cabassou病毒，例如ATCCVR-922;屈曲病毒，例如ATCCVR-64和ATCCVR-1241;FortMorgan病毒，例如ATCCVR-924;Getah病毒，例如ATCCVR-369和ATCCVR-1243;Kyzylagach病毒，例如ATCCVR-927;Mayaro病毒，例如ATCCVR-66;Mucambo病毒，例如ATCCVR-580和ATCCVR-1244;Ndumu病毒，例如ATCCVR-371;Pixuna病毒，例如ATCCVR-372和ATCCVR-1245;Tonate病毒，例如ATCCVR-925;Triniti病毒，例如ATCCVR-469;Una病毒，例如ATCCVR-374;Whataroa病毒，例如ATCCVR-926;Y-62-33病毒，例如ATCCVR-375;O'Nyong病毒，東部腦炎病毒，例如ATCCVR-65禾卩ATCCVR-1242;西部腦炎病毒，例如ATCCVR-70,ATCCVR-1251,ATCCVR-622和ATCCVR-1252;和冠狀病毒，例如ATCCVR-740和在Hamre(1966)iVocSocfic;MW121:1卯中描述的那些。將本發(fā)明的組合物輸送至細(xì)胞內(nèi)并不局限于上述病毒載體。還可采用其它輸送方法和介質(zhì)，例如核酸表達(dá)載體、與已被殺死的腺病毒相連或不相連的單獨(dú)的聚陽離子凝縮的DNA(例如參見1994年12月30日美國申請No.08/366,787和Curiel(1992)HumGeneTher3:147-154)、配體連接的DNA(例如參見Wu(1989)J.Biol.Chem.264:16985-16987)、真核細(xì)胞輸送載體細(xì)胞(例如參見1994年5月9日提交的美國申請No.08/240,030以及美國申請No.08/404,796)、光聚合水凝膠材料的沉淀、手提式基因轉(zhuǎn)移顆粒槍(如美國專利5,149,655所述)、電離輻射(如US5，206,152和WO92/11033所述)、核電荷中和或與細(xì)胞膜融合。其它方法在Philip(1994)MolCellBiol14:2411-2418以及Woffendin(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:1581-1585中有所描述?？梢圆捎妙w粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，例如參見美國申請No.60/023,867。簡言之，可將序列插入含有控制高水平表達(dá)的常規(guī)序列的常規(guī)載體中，然后和合成性基因轉(zhuǎn)移分子一起培育，這些基因轉(zhuǎn)移分子例如是聚合性DNA-結(jié)合陽離子(如聚賴氨酸、魚精蛋白和白蛋白)，其與細(xì)胞尋靶配體(如脫唾液酸血清類粘蛋白(如Wu和Wu(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432所述)、胰島素(如Hucked(1990)BiochemPharmacol40:253-263所述)、半乳糖(如Plank(1992)BioconjugateChem3:533-539所述)、乳糖或運(yùn)鐵蛋白)相連。裸DNA也可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。典型的裸DNA導(dǎo)入方法在WO90/11902和US5,580,859中有所描述。用可生物降解的乳膠珠可以改善攝取效果。在對珠粒的胞吞作用開始后，DNA包被的乳膠珠粒被有效地運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中。通過處理珠粒以提高其疏水性可進(jìn)一步改進(jìn)該方法，從而促進(jìn)核內(nèi)體的破壞和將DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中?？勺鳛榛蜉斔瓦\(yùn)載體的脂質(zhì)體在US5,422,120，W095/13796,W094/23697,W091/14445和EP-524,968中有所描述。如USSN60/023,867中所描述的，在非病毒輸送時(shí)，可將編碼多肽的核酸序列插入含有控制高水平表達(dá)的常規(guī)序列的常規(guī)載體中，然后和合成性基因轉(zhuǎn)移分子一起培育，這些基因轉(zhuǎn)移分子例如是聚合性DNA-結(jié)合陽離子(如聚賴氨酸、魚精蛋白和白蛋白)，其與細(xì)胞尋靶配體(如脫唾液酸血清類粘蛋白、胰島素、半乳糖、乳糖或運(yùn)鐵蛋白)相連。其它輸送系統(tǒng)包括采用脂質(zhì)體來包裹DNA，該DNA所含基因在各種組織特異性或活性普遍存在的啟動子控制下。適用的其它非病毒輸送系統(tǒng)包括機(jī)械輸送系統(tǒng)，如Woffendin等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(24):11581-11585中描述的方法。另外，這類編碼序列和表達(dá)產(chǎn)物可以通過光聚合的水凝膠材料的沉淀來輸送?？捎脕磔斔途幋a序列的其它基因輸送常規(guī)方法例如包括，用手提式基因轉(zhuǎn)移顆粒槍(如美國專利5,149,655所述)；用電離輻射來激活轉(zhuǎn)移的基因(如US5,206,152和WO92/11033所述)。典型的脂質(zhì)體和聚陽離子基因輸送載體在下列文獻(xiàn)中有所描述US5,422,120和4,762,915;WO95/13796;W094/23697;W091/14445;EP國0524968;Stryer，Biochemistry,236-240頁(1975)W.H.Freeman,SanFrancisco;Szoka(1980)S/oc/2ew5——勿a600:1;Bayer(1979)5/oc/ze附B/—勿a550:464;Rivnay(1987)她,/z149:119;Wang(1987)iVoc胸"ca""'84:7851;Plant(1989)j"a/別oc/2ew176:420。多核苷酸組合物可包含治療有效量的基因治療運(yùn)載體，其定義如上所述。出于本發(fā)明的目的，有效的劑量是給予個(gè)體約0.01毫克/千克至50毫克/千克或0.05毫克/千克至10毫克/千克的DNA構(gòu)建物。輸送方法一旦配制后，本發(fā)明的多核苷酸組合物可以以下三種方式給予(l)直接給予對象;(2)活體外輸送給對象衍生的細(xì)胞；或(3)體外表達(dá)重組蛋白。待處理的對象可以是哺乳動物或鳥類。另外，也可對人進(jìn)行治療。直接輸送該組合物通常可通過皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸送至組織間隙來實(shí)現(xiàn)。該組合物也可輸送至病損部位。其它給藥方式包括口服和肺給藥、栓劑和透皮或經(jīng)皮膚應(yīng)用(例如見WO98/20734)、用針、基因槍或手持噴霧器(hypospray)。治療劑量方案可以是單劑方案或多劑方案。活體外輸送以及將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞重新植入對象體內(nèi)的方法是本領(lǐng)域所熟知的，在例如W093/14778中有所描述。用于活體外應(yīng)用的細(xì)胞例子包括例如干細(xì)胞、尤其是造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。通常，對于活體外和體外應(yīng)用，核酸的輸送可通過以下步驟來實(shí)現(xiàn)，例如葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、Polybrene介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、將多核苷酸包裹在脂質(zhì)體中以及將DNA直接顯微注射到胞核中，所有這些均是本領(lǐng)域所熟知的多核苷酸和多肽藥物組合物除了上述的藥學(xué)上可接受的載體和鹽外，多核苷酸和多肽組合物中還可采用下列附加試劑。A.多肽一個(gè)例子是多肽，其包括但不局限于脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR);運(yùn)鐵蛋白;脫唾液酸糖蛋白；抗體；抗體片段；鐵蛋白；白介素；干擾素；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF);粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、干細(xì)胞因子和促紅細(xì)胞生成素。還可使用病毒抗原，如包膜蛋白。另外，可用來自其它32侵襲性生物的蛋白，例如瘧原蟲惡性瘧疾的環(huán)孢子蛋白的17個(gè)氨基酸的肽(稱為RII)B.激素，維生素等其它可包括的種類例如是激素、類固醇、雄激素、雌激素、甲狀腺激素或維生素、葉酸。c.聚亞垸基、多糖等另外，聚(亞烷基)二醇可以和所需的多核苷酸或多肽組合在一起。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，聚(亞烷基)二醇是聚乙二醇。另外，可以加入單糖、二糖或多糖。在此方面的一個(gè)較佳實(shí)施方案中，多糖是葡聚糖或DEAE-葡聚糖。另外有脫乙酰殼多糖和聚交酯-聚乙醇酸內(nèi)酯共聚物。D.脂質(zhì)和脂質(zhì)體所需的多核苷酸或多肽還可在輸送給對象或?qū)ο笱苌募?xì)胞之前包裹在脂質(zhì)中或包裹在脂質(zhì)體中。脂質(zhì)包裹通常用能穩(wěn)定結(jié)合或捕獲并保留核酸的脂質(zhì)體來實(shí)現(xiàn)。濃縮的多核苷酸或多肽與脂質(zhì)制劑之比可以不同，但是通常在約1:l(毫克DNA:微摩爾脂質(zhì))之間，或脂質(zhì)更多。關(guān)于脂質(zhì)體作為輸送核酸的載體的綜述參見Hug和Sleight(1991)Biochim.Biophys.Acta.1097:1-17;Straubinger(1983)Meth.Enzymol.101:512-527。用于本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑包括陽離子(帶正電荷)、陰離子(帶負(fù)電荷)和中性制劑。陽離子脂質(zhì)體已經(jīng)顯示出能以有功能的形式介導(dǎo)質(zhì)粒DNA的胞內(nèi)輸送(Felgner(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7416);mRNA(Malone(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6077-6081);和純化的轉(zhuǎn)錄因子的胞內(nèi)輸送(Debs(1990)J.Biol.Chem.265:10189-10192)。陽離子脂質(zhì)體很容易購得。例如，N[l-2，3-二油烯基氧)丙基]-N,N,N-三乙銨(DOTMA)脂質(zhì)體可以以Lipofectin的商標(biāo)從GIBCOBRL，GrandIsland,NY購得。(另見Feigner，同上)。其它商品脂質(zhì)體包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其它陽離子脂質(zhì)體可用本領(lǐng)域熟知的方法從易購得的材料制得。例如參見，Szoka(1978)PNAS75:4194-4198;WO90/11092關(guān)于DOTAP(l,2-二(油?；?-3-(三甲基銨溶)丙垸)脂質(zhì)體合成的描述。同樣，陰離子和中性脂質(zhì)體也是容易獲得的，例如購自AvantiPolarLipids(birmingham，AL)，或容易用易購得的材料制得。這種材料包括磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰乙醇胺、二油?；字Ｄ憠A(DOPC)、二油?；字８视?DOPG)、二33油?；字Ｒ掖及?DOPE)。這些材料還能以合適比例與DOTMA和DOTAP原料混合。用這些材料制備脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域熟知的。脂質(zhì)體可包含多層脂質(zhì)體(MLV)，小的單層脂質(zhì)體(SUV)、或大的單層脂質(zhì)體(LUV)。各種脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物可用本領(lǐng)域已知的方法制得。例如參見Straubinger(1983)Me仇/wwwwo/.101:512-527;Szoka(1978)尸roc.;Va".爿cad5W.75:4194-4198;Papahadjopoulos(1975)5z'oc/n附.5/o;/zj^.394:483;Wilson(1979)Ce〃17:77);Deamer禾口Bangham(1976)5/oc/n附.萬/—，勿a443:629;Ostro(1977)腸c/z置B/o;/z;^.Cowotm".76:836;Fraley(1979)尸roc.TVa".^cadJ7&476:3348);Enoch和Strittmatter(1979)/Voc.iVa,/.爿cac/.<Sc/.76:145;Fraley(1980)/CT^w.(1980)255:10431;Szoka和Papahadjopoulos(1978)iVoc.iVa〃.Jcat/.5W.75:145;以及Schaefer-Ridder(1982)S"'e"ce215:166。E.脂蛋白另外，脂蛋白也可加入待輸送的多核苷酸或多肽中。采用的脂蛋白的例子包括乳糜微粒、HDL、IDL、LDL和VLDL。還可采用這些蛋白的突變體、片段或融合蛋白。另外，可采用天然存在的脂蛋白的修飾物，例如乙?；腖DL。這些脂蛋白能使多核苷酸的輸送指向表達(dá)脂蛋白受體的細(xì)胞。較佳的，如果待輸送的多核苷酸中加入了脂蛋白，則組合物中不加入其它尋靶的配體。天然存在的脂蛋白包含脂質(zhì)和蛋白部分。蛋白部分稱為脫輔基蛋白。目前，己經(jīng)分離并鑒定出了脫輔基蛋白A、B、C、D和E。其中至少有兩個(gè)含有幾種蛋白，用羅馬數(shù)字AI、AI1、AIV;CI、CII、CIII命名。脂蛋白可包含多個(gè)脫輔基蛋白。例如，天然存在的乳糜微粒包含A、B、C和E，隨著時(shí)間的推移，這些脂蛋白失去A，得到C和E脫輔基蛋白。VLDL包含A、B、C、和E脫輔基蛋白，LDL包含脫輔基蛋白B;HDL包含脫輔基蛋白A、C和E。這些脫輔基蛋白的氨基酸是已知的，并且在下列文獻(xiàn)中有所描述Breslow(1985)A腿Rev.Biochem54:699;Law(1986)Adv.ExpMed.Biol.151:162;Chen(1986)JBiolChem261:12918;Kane(1980)ProcNatlAcadSciUSA77:2465;andUtermann(1984)HumGenet65:232。脂蛋白含有各種脂質(zhì)，包括甘油三酯、膽固醇(游離的和酯型)以及磷脂。天然存在的脂蛋白中脂質(zhì)的組成是不同的。例如，乳糜微粒主要含甘油三酯。關(guān)于天然存在的脂蛋白的脂質(zhì)含量更詳細(xì)的描述可在例如Meth.Enzymol.128(1986)中找到。選擇脂質(zhì)的組成，以使脫輔基蛋白的構(gòu)型有利于受體結(jié)合活性。還可選擇脂質(zhì)的組成，以促進(jìn)與多核苷酸結(jié)合分子中的疏水性相互作用和結(jié)合。天然存在的脂蛋白可以用諸如超離心方法從血清中分離出來。這些方法在Meth.Enzymol.(同上)；Pitas(1980)J.BioChem.255:5454-5460以及Mahey(1979)JClin.Invest64:743-750中有所描述。脂蛋白還可在體外產(chǎn)生，或通過在所需宿主細(xì)胞中表達(dá)脫輔基蛋白基因的重組方法產(chǎn)生。例如參見Atkinson(1986)AnnuRevBiophysChem15:403和Radding(1958)BiochimBiophysActa30:443。脂蛋白也可購自商業(yè)供應(yīng)商，如BiomedicalTechniologies，Inc.,Stoughton，Massachusetts,USA。關(guān)于脂蛋白的進(jìn)一步描述可在WO98/06437中找到。F.聚陽離子試劑聚陽離子試劑可以與或不與脂蛋白一起包括在含所需待輸送多核苷酸或多肽的組合物中。聚陽離子試劑通常在生理性相關(guān)的pH下表現(xiàn)出凈的正電荷，并能中和核酸的電荷，而有助于輸送至所需位置。這些試劑具有體外、活體外和體內(nèi)的用途。聚陽離子試劑可用來將核酸通過肌內(nèi)或皮下等輸送至活的對象。下面是用作聚陽離子試劑的多肽例子聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸和魚精蛋白。其它例子包括組蛋白、魚精蛋白、人血清白蛋白、DNA結(jié)合蛋白、非組蛋白染色體蛋白、DNA病毒的外殼蛋白，如(X174，轉(zhuǎn)錄因子還含有結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域，因此可用作核酸凝聚劑。簡言之，轉(zhuǎn)錄因子如C/CEBP、c-jun、c-fos、AP-1、AP-2、AP-3、CPF、Prot-l、Sp-l、Oct-l、Oct-2、CREP、和TFIID含有結(jié)合DNA序列的基本結(jié)構(gòu)域聚陽離子有機(jī)試劑包括精胺、亞精胺和腐胺。從上面的清單可以推出聚陽離子試劑的尺寸和生理性能，以構(gòu)建其它多肽聚陽離子試劑或產(chǎn)生合成的聚陽離子試劑。有用的合成聚陽離子試劑例如包括，DEAE-葡聚糖、Polybrene。LipofectinTM和lipofectAMINETM是與多核苷酸/多肽組合時(shí)形成聚陽離子復(fù)合物的單體。免疫診斷試驗(yàn)本發(fā)明的奈瑟球菌抗原可用于免疫試驗(yàn)來檢測抗體水平(或相反，可用抗奈瑟球菌抗體來檢測抗原水平)。根據(jù)明確的免疫試驗(yàn)，可以開發(fā)重組抗原，以代替侵入性診斷方法?？蓹z測生物學(xué)樣品(例如包括血液或血清樣品)中的抗奈瑟球菌蛋白的抗體。免疫試驗(yàn)的設(shè)計(jì)可作很大變化，其各種方案均是本領(lǐng)域中已知的。免疫試驗(yàn)的方案可采取例如競爭性、或直接反應(yīng)或夾心型試驗(yàn)。方案例如還可采用固體支持物，或可以采用免疫沉淀法。大多數(shù)試驗(yàn)涉及采用有標(biāo)記的抗體或多肽；該標(biāo)記例如可以是熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射活性標(biāo)記或染料分子。擴(kuò)增探針信號的試驗(yàn)也是已知的；其例子是采用生物素和親和素的試驗(yàn)，酶標(biāo)記的和介導(dǎo)的免疫試驗(yàn)，如ELISA試驗(yàn)。將合適的材料(包括本發(fā)明的組合物)以及進(jìn)行試驗(yàn)所需的其它試劑和材料(例如合適的緩沖液、鹽溶液等)和合適的試驗(yàn)說明書包裝到合適的容器中，構(gòu)成適用于免疫診斷且含有適當(dāng)標(biāo)記的試劑的試劑盒。核酸雜交"雜交"指兩個(gè)核酸序列相互之間通過氫鍵而結(jié)合。通常，一個(gè)序列固定于固體載體，另一個(gè)將游離于溶液內(nèi)。然后，在有利于形成氫鍵的條件下使兩個(gè)序列相互接觸。影響這種結(jié)合的因素包括溶劑的類型和體積；反應(yīng)溫度；雜交時(shí)間；攪拌；封閉液相序列與固體載體非特異性結(jié)合的試劑(Denhardt's試劑或BLOTTO);各序列的濃度；是否使用化合物來增加序列結(jié)合的速度(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；以及雜交后洗滌條件的嚴(yán)謹(jǐn)程度。見Sambrook等人[同上]第2巻，第9章，9.47至9.57頁。"嚴(yán)謹(jǐn)性"指有利于非常相似的序列結(jié)合而不利于不同序列結(jié)合的雜交反應(yīng)條件。例如，應(yīng)選擇溫度和鹽濃度的組合，使溫度比所研究的雜交的Tm計(jì)算值低大約120至20(TC。溫度和鹽濃度?？赏ㄟ^初步實(shí)驗(yàn)中憑經(jīng)驗(yàn)來確定，在初步實(shí)驗(yàn)中，固定在濾膜上的基因組DNA樣品與感興趣的序列雜交，然后在不同的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下洗滌。見Sambrook等人第9.50頁。在進(jìn)行例如Southern印跡時(shí)，要考慮的參數(shù)是(l)待印跡的DNA的復(fù)雜性以及(2)探針與受檢測序列之間的同源性。對于高度復(fù)雜的真核基因組中的單拷貝基因，待研究片段的總量可以在10的一個(gè)數(shù)量級范圍內(nèi)變化，質(zhì)粒為0.1至1微克，或?qū)⑹删w消化至10—9至10—8克。對于復(fù)雜性較低的多核苷酸，可以采用實(shí)際上更短的印跡、雜交以及接觸時(shí)間，更少量的起始多核苷酸，以及比活更低的探針。例如，從1微克酵母DNA開始，用僅僅l小時(shí)的接觸時(shí)間，印跡2小時(shí)，然后和108cpm/|ag的探針雜交4-8小時(shí)，就可以檢測單拷貝酵母基因。對于單拷貝哺乳動物基因而言，一種保守的方法是從10微克DNA開始，印跡過夜，在10%硫酸葡聚糖存在下用108Cpm/pg以上的探針雜交過夜，導(dǎo)致接觸時(shí)間約為24小時(shí)。有幾個(gè)因素可能會影響探針與感興趣片段之間的DNA-DNA雜交物的解鏈溫度(Tm)，因而影響雜交和洗滌的合適條件。在許多情況下，探針并非與待測片段100%同源。其它常常遇到的變量包括雜交序列的長度和G+C總含量，以及雜交緩沖液的離子強(qiáng)度和甲酰胺含量。所有這些因素的作用可近似表示成一個(gè)方程式Tn^81+16.6(logK)Ci)+0.4[y。(G+C)]-0.6(。/。甲酰胺)-600/n-1.5(。/o錯(cuò)配)其中Ci是鹽濃度(單價(jià)離子)，n是雜交物堿基對的長度(對Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284中的稍稍作了修改)。在設(shè)計(jì)雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)，影響核酸雜交的一些因素可以方便地予以改變。雜交和洗滌時(shí)的溫度以及洗滌時(shí)的鹽濃度的調(diào)節(jié)最為簡單。隨著雜交溫度(即嚴(yán)謹(jǐn)度)的升高，不同源的鏈之間發(fā)生雜交的可能性變得更少，結(jié)果背景值降低。如果放射性標(biāo)記的探針并非與固定的片段完全同源(這在基因家族和種間雜交實(shí)驗(yàn)中是常見的)，則必須降低雜交溫度，而背景值將會增加。洗滌溫度以類似的方式影響雜交帶的強(qiáng)度和背景值的程度。洗滌的嚴(yán)謹(jǐn)性也隨鹽濃度的降低而升高。通常，在50%甲酰胺存在下的方便的雜交溫度是對于靶片段同源性達(dá)95%至100%的探針而言，是42'C;對于同源性為90%至95%的探針，為37'C;對于同源性為85%和卯％的探針，為32。C。對于較低的同源性，應(yīng)用上述方程式應(yīng)相應(yīng)地降低甲酰胺含量和調(diào)節(jié)溫度。如果探針和靶片段之間的同源性是未知的，則最簡單的方法是從非嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交和洗滌條件開始。如果在放射自顯影后發(fā)現(xiàn)了非特異性的條帶或高背景值，則可在高嚴(yán)謹(jǐn)性下洗滌濾膜，并重新曝光。如果曝光所需時(shí)間使得該方法不切實(shí)際，則應(yīng)平行測試幾種雜交和/或洗滌嚴(yán)謹(jǐn)性。實(shí)施例實(shí)施例lW099/36544的實(shí)施例1公開了稱為"ORF40"的奈瑟球菌蛋白的克隆和表達(dá)。公開了來自A和B血清型腦膜炎奈瑟球菌的蛋白質(zhì)和DNA序列，完整的蛋白質(zhì)序列在601個(gè)氨基酸的重迭區(qū)上有83.7%相同。對于由腦膜炎奈瑟球菌的21個(gè)菌株構(gòu)成的參照群，對ORF40進(jìn)行了測序。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>這21個(gè)序列的比對示于圖1。保守氨基酸的區(qū)段是明顯的。例如前17個(gè)氨基酸是保守的(MNKIYRIIWNSALNAWV)，盡管在11位殘基處的絲氨酸并不存在于100%奈瑟球菌中。這之后是不保守的氨基酸，隨后又是16個(gè)保守氨基酸(BSELTRNHTKRASATV)。此蛋白質(zhì)的C端由116個(gè)保守氨基酸構(gòu)成。本實(shí)施例中鑒別出的保守區(qū)域證實(shí)，全長ORF40蛋白的片段適合作為多特異性的疫苗或診斷劑。再次對總共31個(gè)菌株的ORF40進(jìn)行了測序，并對序列進(jìn)行比對。結(jié)果示于圖11。特別感興趣的保守區(qū)域是一MNKIYRIIWNSALNAWV-VSELTRNHTKRASATV一TAVLAT"-TLKAGDNIiKIKQ-E"TVSJLKKDI/TDLTSV-TEKLSFGANG-KVNITSDTKGIiNFAKETAGTNGD一TVHIiNGIGSTIiTDTL-RAAS(V/I)KDVLNAGWNIKGVK_NVDFVRTYDTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKKTEVKIGAKTSVIKEKDGKLVTGK-KGENGSSTDEGEGLVTAKEVIDAVNKAGWRMKTTTANGQTGQADKFETVTSGT-GTTATVSKDDQGNITV-YDVNVGDALNVNQIiQNSGW肌DSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSM—PQFSSVSLGAGADAPTLSVD一NKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNL謹(jǐn)IDNVDGNARAGIAQAIATAGLVQAYLPGKSMMAIGGGTYRGEAGYAIGYSSISDGGNWIIKGTASGNSRGHrcASASVGYQW.實(shí)施例2W099/24578的實(shí)施例26公開了稱為"ORF4"的奈瑟球菌蛋白的克隆和表達(dá)。公開了來自A和B血清型腦膜炎奈瑟球菌的蛋白質(zhì)和DNA序列，以及腦膜炎奈瑟球菌的序列。氨基酸水平上序列間的相同性如下A型腦膜炎奈瑟球菌淋病奈瑟球菌B型腦膜炎奈瑟球菌在287個(gè)氨基酸中99.7%相同在288個(gè)氨基酸中97.6%相同對于由腦膜炎奈瑟球菌的32個(gè)菌株構(gòu)成的參照群，對ORF4進(jìn)行了測序。39<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>用PILEUP產(chǎn)生的序列比對示于圖2。保守氨基酸的區(qū)段是明顯的。例如前34個(gè)氨基酸是保守的，盡管在26位殘基處的絲氨酸并不存在于100%奈瑟球菌中。此蛋白質(zhì)的C端由228個(gè)保守氨基酸構(gòu)成。本實(shí)施例中鑒別出的保守區(qū)域證實(shí)，全長ORF4蛋白的片段適合作為多特異性的疫苗或診斷劑。再次對總共35個(gè)菌株的ORF4進(jìn)行了測序，并對序列進(jìn)行比對。結(jié)果示于圖10。特別感興趣的保守區(qū)域是，mktffktlsaaAlalilaacggqkosapAasasaaadnga-kkeivfgttvgdfgdmvke-elekkgytvklveftdyvrpnlaiiaege!ldinvfqhkpyiiddfkkeh肌ditevfqvptapiig;lypgklksleevkdgstvsapndpsnfarvlvmldelgwiiakdginpltaskadiaenlknikiveileaaqlprsradvdfavvngnyaissgmkltealfqepsfayvnwsavktadkdsqwlkdvteaynsdafkayahkrfegykspaawnegaak實(shí)施例3WO99/57280的實(shí)施例16公開了稱為"225"的奈瑟球菌蛋白的克隆和表達(dá)。公開了來自A和B血清型腦膜炎奈瑟球菌的蛋白質(zhì)和DNA序列，以及來自淋病奈瑟球菌的序列。對于由腦膜炎奈瑟球菌的34個(gè)菌株構(gòu)成的參照群，對225進(jìn)行了測序。識別編號菌株文獻(xiàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>Seiler等1996zol0一225BZ133Seiler等1996zoll_225NGE31Seiler等1996zol2一225NGF26Seiler等1996zo13—225NGE28Seiler等1996zol4_225NGH38Seiler等1996zol5_225SWZ107Seiler等1996zo6225Sei!er等1996zol7一225NGH36Seiler，19%zol8—225BZ232Seiler等1996zol9_225BZ83Seiler等1996zo20_22544/76Sdler等1996zo21一225MC58啟龍股份公司zo96一2252996啟龍股份公司組別乂zo22一225205卿啟龍股份公司zo23_225F6124啟龍股份公司z2491Z2491Maiden等1998組別czo24_225術(shù)18311啟龍股份公司zo25_22593/4286啟龍股份公司其他zo26一225A22(組別W)Maiden等1998zo27_225E26(組別X)Maiden等1998zo28_225seosoo(組別Y)Maiden^1998zo29_225E32(組別Z)Maiden等1998淋球菌zo32一225NgF62Maiden等1998zo33一225NgSN4啟龍股份公司fa.FA讓啟龍股份公司用PILEUP產(chǎn)生的序列比對示于圖3。保守氨基酸的區(qū)段是明顯的。例如前74個(gè)氨基酸是保守的，盡管在51位殘基處的異亮氨酸并不存在于100%奈瑟球菌中。此蛋白質(zhì)的C端由148個(gè)保守氨基酸構(gòu)成。類似的比對示于圖13。本實(shí)施例中鑒別出的保守區(qū)域證實(shí)，全長225蛋白的片段適合作為多特異性的疫苗或診斷劑。實(shí)施例4WO99/57280的實(shí)施例16公開了稱為"235"的奈瑟球菌蛋白的克隆和表達(dá)。公開了來自A和B血清型腦膜炎奈瑟球菌的蛋白質(zhì)和DNA序列，以及來自淋病奈瑟球菌的42序列。對于由腦膜炎奈瑟球菌的31個(gè)菌株構(gòu)成的參照群，對235進(jìn)行了測序。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>用PILEUP產(chǎn)生的序列比對示于圖4。保守氨基酸的區(qū)段是明顯的。蛋白質(zhì)整體上是保守的，盡管在168位殘基處的絲氨酸顯示有某些變化。本實(shí)施例中鑒別出的保守區(qū)域證實(shí)，全長235蛋白的片段適合作為多特異性的疫苗或診斷劑。再次對總共35個(gè)菌株的235進(jìn)行了測序，并對序列進(jìn)行比對。結(jié)果示于圖14。實(shí)施例5WO99/57280的實(shí)施例16公開了稱為"287"的奈瑟球菌蛋白的克隆和表達(dá)。公開了來自A和B血清型腦膜炎奈瑟球菌的蛋白質(zhì)和DNA序列，以及來自淋病奈瑟球菌的序列。對于由腦膜炎奈瑟球菌的6個(gè)菌株構(gòu)成的參照群，對287進(jìn)行了測序。識別編號菌株文獻(xiàn)組別a287—2BZ1訴Seiler等(1996)287—9NGP165Seiler等(1996)287一14NGH38Seiler等(1996)287一21MC58Virji等(1992)組別^z2491Z2491Maiden等(1998)淋球菌fa畫FA薩Dempsey等(1991)用PILEUP產(chǎn)生的序列比對示于圖5。保守氨基酸的區(qū)段是明顯的。例如前42個(gè)氨基酸是保守的，并且在蛋白質(zhì)的C端可從看見一個(gè)長的保守區(qū)域。本實(shí)施例中鑒別出的保守區(qū)域證實(shí)，全長287蛋白的片段適合作為多特異性的疫苗或診斷劑。再次對總共35個(gè)菌株(包括Cll，一種C血清型腦膜炎奈瑟球菌菌株)的287進(jìn)行了測序，并對序列進(jìn)行比對。結(jié)果示于圖15。特別感興趣的保守區(qū)域是44-MFKRSVIAMACI-ALSACGGGGGGSPDVKSADT-SKPAAPW-QDMAAVS-ENTGNGGAATTD-QNDMPQ-DGPSQNITLTHCK一KSEFE-RRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKL-GGSYAL-VQGEPAKGEMIAGTAVYNGEVLHFH-GRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMG-QKFKAAIDGNGFKGTWTENGGGDVSG(R/K)FYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKDRD實(shí)施例6WO99/57280的實(shí)施例16公開了稱為"519"的奈瑟球菌蛋白的克隆和表達(dá)。公開了來自A和B血清型腦膜炎奈瑟球菌的蛋白質(zhì)和DNA序列，以及來自淋病奈瑟球菌的序列。對于由腦膜炎奈瑟球菌的22個(gè)菌株構(gòu)成的參照群，對519進(jìn)行了測序。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>zv06一519assBZ147Seiler等1996zv07一519BZ，69SeiJer等996zvll一519NGE31Seiler等1996zvl2一519NGF26Seiler等1996zvl8一519BZ232Se"er等1996zvl9—519BZ83Seiler等1996zv20一519ass44/76Seikr等1996zv21_519assMC58啟龍股份公司rv96一5192996啟龍股份公司組別Azv22—519ass205900啟龍股份公司z2491一5i9Z249Maiden等9訴其他zv26—519A22(組別W)Maiden等1998zv27_519E26(組別X)Maiden等1998zv28_519860抑0(組別Y)Maiden等1998zv29一519assE32(組別Z)Maiden等〗998淋球菌zv32_519NgF62Maiden等1998fa畫一519FA1090啟龍股份公司用PILEUP產(chǎn)生的序列比對示于圖6。保守氨基酸的區(qū)段是明顯的，并且此蛋白質(zhì)顯示在其全長上是保守的。本實(shí)施例中鑒別出的保守區(qū)域證實(shí)，全長519蛋白的片段適合作為多特異性的疫苗或診斷劑。再次對總共33個(gè)菌株的519進(jìn)行了測序，并對序列進(jìn)行比對。結(jié)果示于圖16。特別感興趣的保守區(qū)域是-MEFFIILL-AVAVFGFKSFVVIPQQEVHVVERLGRFHRAI/TAGiLNILIPFIDRVAYRHSLKEIPLDVPSQVCITRDNTQLTVDGIIYFQVTDPKLASYGSSNYIMAITQLAQTTIiRSVIGRMELDKTFEERDEINS-TW-ALDEAAGAWGVKVLRYEIKDLVPPQEILRSMQAQITAEREKRARIAESEGRKIEQINLASGQREAEIQQSEGEAOAAVNASNAEKIARINRAKGEAESLRLVAEANAEANRQIAAALQTQSGADAVNLK工AGQYVTAFKNLAKEDNTRIKPAKVAEIGNPNFRRHEKFSPEAKTAK實(shí)施例7WO99/57280的實(shí)施例16公開了稱為"919"的奈瑟球菌蛋白的克隆和表達(dá)。公開了來自A和B血清型腦膜炎奈瑟球菌的蛋白質(zhì)和DNA序列，以及來自淋病奈瑟球菌的序列。46對于由腦膜炎奈瑟球菌的35個(gè)菌株構(gòu)成的參照群，對919進(jìn)行了測序。識別編號菌株文獻(xiàn)組別5zm0iNG6/88Seiler等1996加02BZ1訴Seiler等19鄰zm03NG3/88Seiler等1996加04297-0Seiler等1996加051000Seiler等1996加06BZ147Seiler等1996zm07BZ169Seiler等1996加08n528Seiler等1996加09NGP165Seiler等1996加IOBZ133Seiler等1996加llasbcNGE31Seiier等1996zml2NGF26Seiler等1996加13NGE28Seiler等1996加14NGH38Seiler等1996加1SSWZ107Seilw等1996加16NGH15Seiler等19%加17NGH36Seiler等1996加18BZ232Seiler等1996加19BZ83Seiler等1996加2044/76Seiler等1996zm21MC58啟龍股份公司加962996啟龍股份公司組別力加22205卿啟龍股份公司加23asbcF6124啟龍股份公司z2491Z2491Maiden等簡組別czm2490/18311啟龍股份公司zm2593/4286啟龍股份公司47<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>用PILEUP產(chǎn)生的序列比對示于圖7。另一比對示于圖18。保守氨基酸的區(qū)段是明顯的。該蛋白質(zhì)顯示幾乎全部保守。本實(shí)施例中鑒別出的保守區(qū)域證實(shí)，全長919蛋白的片段適合作為多特異性的疫苗或診斷劑。特別感興趣的保守區(qū)域是-MKKYLFRAALDFAKSLQSFRLGCANLKNRQGWQDVCAQAFQTPVHSFQAKQFFERYFTPWQVAGNGSIiAGTVTGYYEPVLKGDDRRTAQARFPIYGIPDDFISVPIiPAGLRSGKAIiVRIRQTGKNSGTIDN-GGTHTADLS_FPITARTTAIKGRFE^SRFLPYHTRNQINGGALDGKAPILGYAEDPVELFFMHIQGSGRLKTPSGKYIRIGYADKNEHPYVSIG(R/K)YMADKGYLKLGQTSMQGIK_YMRQNPQRIAEVIiGQNPSYIFFREL-NDGPVGALGTPLMGEYAGAVDRHYITLGAPLFVATAHPVTRKALiNiaiMAQDTGSAIKGAVRVDYFWGYGDEAGELAGKQKTTGYVWQLLPNGMKPEYRP實(shí)施例8W099/23578的實(shí)施例55公開了稱為"ORF46"的奈瑟球菌蛋白的克隆和表達(dá)。公開了來自A和B血清型腦膜炎奈瑟球菌的蛋白質(zhì)和DNA序列，以及來自淋病奈瑟球菌的序列。對于由B血清型腦膜炎奈瑟球菌的6個(gè)菌株構(gòu)成的參照群，對全長ORF46進(jìn)行了測序。這些序列的比對示于圖12，從中可明顯看出保守氨基酸的區(qū)段。特別感興趣的保守區(qū)域是-RKISLILSILAVCIiPMHAHASDIiANDSFIRQVU)RQHFEPDGKYHLFGSRGELAERSGHIGLG-IQSHQLGNLMIQQAAIKGNIGYIVRFSDHGHEVHSPFDNHASHSDSDEAGSPVDGFSLYRIHWDGYEHHPADGYDGPQGGGYPAPKGARDIYSYDIKGVAQNIRLNLTDNRSTGQRIADRFHNAG-MLTQGVGDGFKRATRYSPELDRSGNAAEAFNGTADIVKNIIGAAGEIVGAGDAVQGISEGSNIAVMHGLGLLSTENKMARINDLADMAOLKDYAAAAIRDWAVONPNAAQGIEAVSNIF-IPIK。IGAVRGKYGLGGITAHP(V/I)KRSQMGEIALPKGKSAVS-NFADAAYAKYPSPYHSRN.IRS.肌EORYGKENITSSTVPPSN(3KNViaANKRHPKTKVPFDGKGFPNFEKDVKYORF46的保守區(qū)域證實(shí)，該蛋白的片段適合作為多特異性的疫苗或診斷劑。實(shí)施例9WO99/57280公開了稱為"726"的奈瑟球菌蛋白的克隆和表達(dá)。公開了來自A和B血清型腦膜炎奈瑟球菌的蛋白質(zhì)和DNA序列。對于由A、B和C血清型腦膜炎奈瑟球菌的7個(gè)菌株構(gòu)成的參照群，對726進(jìn)行了測序。這些序列的比對示于圖17，從中可明顯看出保守氨基酸的區(qū)段。特別感興趣的保守區(qū)域是_IYFKNGnfDDTIiG-IPEGAVAVRAEEYAAUiAGQAQGGQ工AADSDGRPVIiTPPRPS(D/E)YHEWDGKKW-AAAAARFAEQKTATAFRLA-KADELKNSUAGYPQVEIDSFYRQEKEALARQADNNAPTPMLAQIAAARGVEIiDVLIEKV(I/V)SKSAR3jAVAAGAIIGKRQQLEDiaN-IETAPGLDAIiEKEIEEWT726的保守區(qū)域證實(shí)，該蛋白的片段適合作為多特異性的疫苗或診斷劑。實(shí)施例10WO99/57280公開了稱為"953"的奈瑟球菌蛋白的克隆和表達(dá)。公開了來自A和B血清型腦膜炎奈瑟球菌的蛋白質(zhì)和DNA序列，以及來自淋病奈瑟球菌的序列。對于由A、B和C血清型腦膜炎奈瑟球菌的8個(gè)菌株構(gòu)成的參照群，對953進(jìn)行了測序。這些序列的比對示于圖19，從中可明顯看出保守氨基酸的區(qū)段。該蛋白質(zhì)是高度保守的。特別感興趣的保守區(qū)域是49-MKKIIFAALAAAAVGTASAATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIP(I/V)ANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAftQYPDIRFVSTKFNFNGKKL、.'SVDGNI/TMHGKTAPVKIiKAEKFNCYQSPM_ATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIP(I/V)ANLQSGSQHETDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKiavSVDGNIjTMHGKTAPVKIiKAEKFNCYQSPM-KTEVCGGDFSTTIDRTKWG(M/V>DYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ953的保守區(qū)域證實(shí)，該蛋白的片段適合作為多特異性的疫苗或診斷劑。系統(tǒng)發(fā)生樹圖8是顯示107種腦膜炎奈瑟球菌菌株的遺傳關(guān)系的樹狀分枝圖，它基于對6個(gè)基因片段的MLST分析結(jié)果[改編自Maiden等人(1998)PNASUSA95:3140]。該樹狀分枝圖可用于選擇代表性的B血清型腦膜炎球菌菌株(箭頭)。5種額外的菌株(對于這5種菌株，Wang等人[J.Infect.Dis(1993)167:1320]、Seiler等人[Mol.Microbiol.(1996)19:841]和Virji等人[Mol.Microbiol.(1992)6:1271]己獨(dú)立地確定了它們在遺傳上歸為超毒譜系)，被疊加在樹狀分枝圖上并用星號標(biāo)出。除了22種MenB菌株之外，還使用2種MenA菌株，2種MenC菌株，MenY、X、Z和W135中各一種菌株。這些菌株用名稱前的粗體字母表示。當(dāng)沒有系統(tǒng)發(fā)生數(shù)據(jù)時(shí)，菌株就列于系統(tǒng)發(fā)生樹之外。標(biāo)出了超毒株ET-5、ET—37和IV—1。序列變異性圖9a是腦膜炎奈瑟球菌中蛋白質(zhì)225、235、287、519、919、ORF4和ORF40的氨基酸序列變異性的示意圖。水平軸表示MC58的序列。MenB菌株中的氨基酸差異用水平軸上方的垂直線表示。在A、C、Y、X、Z和W135血清型之中的差異用軸下方的線表示。垂直線的高度表示具有氨基酸差異的菌株數(shù)目。這樣，峰表示可變區(qū)域。在225和287下方的短橫線表示在某些菌株中缺失的序列區(qū)段。圖9b是用相同的7種蛋白獲得的腦膜炎奈瑟球菌菌株的樹狀分枝圖。根據(jù)這些基因的系統(tǒng)發(fā)生分析提供了與圖8相符的、包括了超毒株的樹狀分枝圖。線條標(biāo)出的菌株包括了與MLST分析相符的、得到100%引導(dǎo)支持(bootstrapsupport)的菌株。在每個(gè)節(jié)點(diǎn)下方的數(shù)目是引導(dǎo)數(shù)值(僅報(bào)道大于80%的數(shù)值)。不同菌株的基因序列用GCG軟件包中的PILEUP程序比對。用鄰接算法[Saitou&Nei(1987)Mol.Biol.Evol.4:406],使用PHYLIP軟件包中的NEIGHBOR程序，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。用Kimura—雙參數(shù)[Kimura(1980),J.Mol.Evol.16:111]，計(jì)算31種腦膜炎奈瑟球菌菌株的兩兩距離。在分析中排出了ORF40的N端區(qū)域、全長27和225的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。允許總共1000個(gè)引導(dǎo)復(fù)制(replicate)來評估支持水平。超毒株的聚集成束得到了最大簡約性分析的證實(shí)。Western印跡通過Western印跡分析各種不同菌株的ORF4、225、235、519和919抗原。結(jié)果示于圖20。對于225，印跡顯示不同菌株有不同大小的片段，其中箭頭指出了正確大小的條帶。225蛋白含有缺失區(qū)域和所界定的重復(fù)插入片段，印跡上的片段大小與基因變異性數(shù)據(jù)相符。用于圖20的菌株如下B血清型腦膜炎奈瑟球菌l=NG6/886=BZ14711二NGE3116=NGH1521=MC582=BZ1987=BZ16912=NGF2617=NGH3696=29963=NG3/888=52813二NGE2818=BZ2324=297—09=NGP16514=NGH3819=BZ835=100010=BZ13315=SWZ10720=44/76A血清型腦膜炎奈瑟球菌22=20590023=F6124C血清型腦膜炎奈瑟球菌24=90/1831125=93/4286其他腦膜炎奈瑟球菌26二A22(W血清型)27二E26(X血清型)28二860800(Y血清型)29=E32(Z血清型)其他奈瑟球菌30=灰色奈瑟菌L17-乳糖奈瑟菌L19^乳糖奈瑟菌31二淋病奈瑟球菌F6232=淋病奈瑟球菌SN4應(yīng)理解，本發(fā)明是僅通過實(shí)施例方式進(jìn)行描述的，而且可以在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行改動。5權(quán)利要求1.一種蛋白質(zhì)，其特征在于，它含有奈瑟球菌蛋白的片段，所述的片段含有7個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的保守氨基酸，條件是該蛋白不是全長的奈瑟球菌蛋白。2.如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述的片段由20個(gè)或更多連續(xù)的保守氨基酸構(gòu)成。3.如權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述的保守氨基酸存在于至少50%或更多的奈瑟球菌參照群中。4.如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述的參照群包括多個(gè)不同的奈瑟球菌屬物種，優(yōu)選腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌。5.如權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述的參照群包括多個(gè)不同血清型的腦膜炎奈瑟球菌。6.如權(quán)利要求3或4所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述的參照群包含腦膜炎奈瑟球菌A，Z2491菌株；腦膜炎奈瑟球菌B，NG6/88菌株；腦膜炎奈瑟球菌W，A22菌株；和淋病奈瑟球菌，NgF62菌株。7.如權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述的參照群包含腦膜炎奈瑟球菌A，Z2491菌株；腦膜炎奈瑟球菌B，NG6/88菌株；和腦膜炎奈瑟球菌W，A22菌株。8.如權(quán)利要求l一7中任一權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)包含W099/24578、W099/36544、WO99/57280或WO99/22430中所公開的蛋白質(zhì)片段。9.如權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)包含ORF4、ORF40、ORF46、蛋白質(zhì)225、蛋白質(zhì)235、蛋白質(zhì)287、蛋白質(zhì)519、蛋白質(zhì)726、蛋白質(zhì)919和蛋白質(zhì)953中一種或多種的片段。10.如權(quán)利要求l一7中任一權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，含有Tettlin等人Science(2000)287:1809-1815中所公開的蛋白質(zhì)片段。11.一種核酸，其特征在于，它編碼上述任一權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)。12.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)、或權(quán)利要求11所述的核酸的用途，其特征在于，用于制備藥物。13.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)、或權(quán)利要求11所述的核酸的用途，其特征在于，用于制備治療或預(yù)防奈瑟球菌感染的藥物。14.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)、或權(quán)利要求11所述的核酸的用途，其特征在于，用于制備多特異性診斷劑。15.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，它包括下列一種或多種氨基酸序列mnkiyriiwnsalnawv;vseltrnhtkrasatv;FTYSIiKKDI/TDLTSV,'TEKIiSFGANG'，KVNITSDTKGIiNFAKETAGTNGD,'TV副GIGSTLTDT"raas(v/i)kdvlnagwn1kgvk;nvdfvrtydtveflsadtktttvnveskdngkktevkigaktsvikekdgklvtgk'.kgengsstdege"vtakevidavnkagwrmktttangqtgqadkfetvtsgt'-gttatvskddqgnitv,'pgfssvsiigagadaptlsvd,'nkpvritnvapgvkegdvtnvaqlkgvaqnlnnridnvdgnaragiaqaiataglvqaylpgksmmaigggtyrgeagytvigyssisoggnwiikgtasgnsrghfgasasvgitqw.kkeivfgttvgdfgdmvke,'eliekkgytvklveftdyvrpnlaiiaegeldinvfqhkpylddfkkehnlditevfqvptapliglypgiaksleevkdgstvsapndpsnfarvlvm:ldelgwiku(dginpi/raskadiae肌kniiave:leaaq乙prsradvdfavvngnymssgmk:ltealfqepsfayv柳savktadkdsqwlkdvteaynsdafkayahkrfe!gykspaawneGAAK'-MFKRSVIAMACI;AIiSACGGGGGGSPDVKSADT,'skpaapvv'-QDMAAVS'.entgnggaattd,'dgpsgniti/thck'-RRSARSRRSLPAEMPUPVNQADTLIVDGEAVSI/TGHSGNlFAPEGNYRYI/TYGAEia,VQGEPAKGEMLAGTAVyNGEVLHPH;GRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMG,'qkfkaaidgngfkgtwtengggdvsg(r/k)fygpageevagkysyrptdaekggfgvfagkkdrd;meffi工ix/DGIIYFOVrDPKLASYGSSNYIMAITOLAQTTLRSVIGRMELCOTFEERDEINSTVV,'ALDEAAGAWGVKVI^YEIKDLVPPQEILRSMQAQITAEREKRARIAESEGRKIEQINliASGQREAEIQQSEGEAQAAVNASNAEKIARINRAKGEAESLRLVAEANAEANRQIAAALQTQSGADAV歸IAGQYVTAFK肌AKEDNTRIKPAKVAEIGNPNFRRHEKFSPEAKTAK,'IiQSFRLGCANLKNRQGWQDVCAQAFQTPVHSFQAKQFFERYrrPWQVAGNGSljAGTVTGY化PVLKGDDRRTAGARFPIYGIPDDFISVPLPAGLRSGKALVRIRGTGKNSGTIDN/GGTHTADIiS,'DKNEHPYVSIG(R/K)YM^DKGmaGQTSMQGIK/Y柳QNPQRLAEVLGQHPSYIFFREL,'NDGPVGALGTPLMGEYAGAVDRHYITLGAPLFVATAHPVTRKAL肌UMAQDTGSMKGAVRVI^FWGYGDEAGELAGKOKTTGYVWQLLPNGMKPEYRP,.RKISLILSIIiAVCLPMHAHASDLANDSFI醇LDRQHFEPDGKYHLFGSRGEIiAERSGHIGliG,'IOSHQLGNLMIQQAAIKGhJIGYIVRFSDHGHEVHSPFDNHASHSDSDEftGSPVDGFSLYRIHWDGYEHHPADGYDGPQGGGYPAPKGARDIYSYDIKGVAONIRIiNI/TDMRSTGQIUiADRniNAG,.MI/TQGVGDGFKRATRYSPE:LDRSG叫AEAFNGTADIVKNIIGAAGE工VGftGDAVQGISEG浙AVMHGLGIiLSTENKMARINDLADMAQLKDYAAMIRDWAVQMPNAAQGIEAVSmF''IPIKGIGAVRGKYGLGGITAHP(V/1)KRSQMGEIALPKGKSAVSNFADAAYAKYPSPYHSRNIRSNLEQRYGKENITSSTVPPSNGKNVfaANKRHPKTKVPFDGKGFPNFEKDVKY''IYTOIGFYDDTLG''IPEGAVAVRAEEYAMXAGQAQGGQIAADSDGRPVI/rPPRPS(t)/E)YHEWDGKKW'.AAGAIIGKRQO乙EDKWIETAPGLDM^EIEEWT)ANLQSGSQHrTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFMFNGKKLVSVDGNl/TMHGKTAPVKIiKAEKFNCyQSPM;DlFDAAQYPDlRFVSTKFNFNGKiaVSVDGNI/rMHGKTAPViaKAEKFNCYQSPM''禾口KTEVCGGDFSTTIDRTKWG(M/V)DYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQn全文摘要本發(fā)明提供了保守的奈瑟球菌抗原。為了確保最大程度的菌株間識別性和反應(yīng)性，可以利用在不同的奈瑟球菌物種、血清型和菌株之間保守的蛋白質(zhì)區(qū)域。本發(fā)明提供了含有氨基酸序列區(qū)段的蛋白質(zhì)，這些區(qū)段在大多數(shù)奈瑟球菌，尤其是腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌中是共有的。文檔編號A61P31/00GK101298473SQ20081009279公開日2008年11月5日申請日期2000年4月28日優(yōu)先權(quán)日1999年4月30日發(fā)明者R·拉普奧利申請人:啟龍股份公司