專利名稱：骨橋蛋白、少突神經膠質細胞和髓鞘形成的制作方法
技術領域：
骨橋蛋白影響少突神經膠質細胞的發(fā)育。由于少突神經膠質細胞有助于髓鞘再生，所以骨橋蛋白在髓鞘再生過程中具有一定的作用。
背景技術：
骨橋蛋白是一種磷蛋白，分子量為44-66kD，其變化與該蛋白來源物種、被改良的程度如糖基化的程度有關。骨橋蛋白又稱為分泌性磷蛋白1、骨涎蛋白、尿石蛋白以及早期T淋巴細胞活化抗原-1(eta-1)。骨橋蛋白是酸性的，可結合鈣。骨橋蛋白含有粘著氨基酸序列Arg-Gly-Asp(RGD)，該粘著氨基酸序列主要與細胞表面αvβ3整合素相互作用，但也和αvβ1、αvβ5、α9β1和α1β1整合素相互作用。骨橋蛋白在多種不同細胞類型中均有表達，且可能具有很多功能。例如，骨橋蛋白可能在組織基質重塑或骨吸收過程中起一定的作用；作為一種粘附因子，還可能在免疫細胞功能和腫瘤轉移過程中起一定作用。人類編碼骨橋蛋白的單基因位于4號染色體長臂上。
在神經系統(tǒng)的多種細胞中也已發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白。業(yè)已發(fā)現(xiàn)神經節(jié)和腦的多個部分的初級感覺神經元表達骨橋蛋白。因此，骨橋蛋白可能在神經發(fā)育與功能中具有一定的作用。
多發(fā)性硬化癥的部分特征為神經過程脫髓鞘。脫髓鞘現(xiàn)象也見于中樞神經系統(tǒng)和周圍神經系統(tǒng)的若干其它嚴重疾病，包括脊髓損傷、神經感染和神經病變。
在以脫髓鞘為特征的疾病以及患脫髓鞘嚙齒動物的模型中，有證據(jù)說明可以發(fā)生髓鞘再生現(xiàn)象。例如，在多發(fā)性硬化癥中，似乎存在周期性的脫髓鞘和髓鞘再生現(xiàn)象。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供一種方法，即以骨橋蛋白水平影響少突神經膠質細胞的分化、少突神經膠質細胞的數(shù)量以及髓鞘形成。由于神經元脫髓鞘可導致異常信號轉導，所以控制髓鞘形成是有益的。中樞神經系統(tǒng)中，髓磷脂由少突神經膠質細胞生成。
本發(fā)明的另一目的是提供一種通過調控骨橋蛋白水平而調控髓鞘形成的方法。
本發(fā)明的又一目的是提供一種通過調控骨橋蛋白水平而調控少突神經膠質細胞分化的方法。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種通過調控骨橋蛋白水平而調控少突神經膠質細胞遷移的方法。骨橋蛋白水平的調控可以通過影響骨橋蛋白或其受體如αvβ3的代謝來進行。骨橋蛋白的作用可通過TH1細胞介導或受到TH1細胞影響。
本發(fā)明的這些目的和其它目的是通過對骨橋蛋白抑制少突神經膠質細胞前體細胞分化的觀察而達到的。因此，骨橋蛋白水平的降低導致少突神經膠質細胞的加速分化。分化的減少伴隨著前體細胞的增殖。前體細胞數(shù)量的增加導致更多的前體細胞、最終導致更多的少突神經膠質細胞例如聚集在脫髓鞘區(qū)域附近。骨橋蛋白還刺激少突神經膠質細胞向脫髓鞘區(qū)域的遷移。更多數(shù)量的少突神經膠質細胞可加強髓鞘再生。
這些目的也可以通過影響靶細胞獲取、結合骨橋蛋白的能力以及對骨橋蛋白響應的能力來實現(xiàn)。不能獲取骨橋蛋白及對骨橋蛋白作出反應的細胞不會分化，而是增殖。
發(fā)明詳述觀察結果表明，骨橋蛋白可使人類少突神經膠質細胞系的細胞呈現(xiàn)異常的生長特性。當暴露于骨橋蛋白時，少突神經膠質細胞系的細胞由較大的立方形細胞變成類似于祖細胞的較小雙極細胞。骨橋蛋白對神經母細胞瘤細胞則沒有這種作用。少突神經膠質細胞及其前體的形態(tài)學特征已知，并可用于測定一種分子是否具有類似于骨橋蛋白的去分化或分化抑制活性。因此，骨橋蛋白可引起少突神經膠質細胞的去分化和/或阻止前體細胞或低度分化細胞分化為成熟的少突神經膠質細胞。
當骨橋蛋白水平降低時，少突神經膠質細胞祖細胞開始分化為成熟少突神經膠質細胞，該成熟少突神經膠質細胞除其它功能之外，還可使神經元髓鞘形成。
骨橋蛋白也可作為一種趨化因子。骨橋蛋白可存在于大鼠髓鞘再生病變(remyelinating lesions)處。少突神經膠質細胞祖細胞遷移進這些病變部位，并在其中參與髓鞘再生。這些細胞按骨橋蛋白濃度梯度從骨橋蛋白濃度較低的區(qū)域移動到骨橋蛋白濃度較高的區(qū)域。骨橋蛋白可引起響應細胞(包括祖細胞在內)遷移進脫髓鞘區(qū)域，并在其中產生髓鞘再生作用。
因此，骨橋蛋白可抑制少突神經膠質細胞祖細胞的分化，并誘導這種少突神經膠質細胞祖細胞遷移到含骨橋蛋白濃度較高的區(qū)域。
骨橋蛋白也可誘導巨噬細胞或小膠質細胞、或誘導兩者一起遷移進入脫髓鞘部位。在那里，這些細胞可“清除”髓磷脂碎片。髓磷脂碎片的清除是髓鞘再生的前提條件。
出于本發(fā)明的這些目的，由于骨橋蛋白和其受體之間相互作用的關系，技術人員將會認識到，為了達到趨化和/或分化抑制的理想目標，兩種手段中的任何一種都可以實踐一下。因此，這里關于骨橋蛋白或其受體的討論應該被認為具有同樣的意義，而且如果達到了理想的結果，可適用于兩者中的任何一個，例如趨化或分化控制。
骨橋蛋白的基因序列是已知的并可為技術人員所利用。因此，可利用已知的重組核酸技術(例如，如Sambrook等編輯，″Molecular CloningALaboratory Manual，”第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989和″Current Protocols in MolecularBiology，”John Wiley & Sons，N.Y.1989所述)，采用常規(guī)方法獲取骨橋蛋白在所選擇細胞中的表達。將骨橋蛋白核酸亞克隆入合適的載體，再導入合適的細胞，即可獲得表達。該載體可以保持在染色體外，也可以整合入宿主基因組。各種控制元件可以導入載體以獲得骨橋蛋白高水平表達或其受控表達。例如，增強子、特定的啟動子以及剪接位點等等均可用。
在某些實施方案中，重組哺乳動物表達載體能將骨橋蛋白核酸優(yōu)選地表達于特定的細胞類型(例如，組織特異的調控元件可用于表達該核酸)。組織特異的調控元件在本領域內是已知的。適當?shù)慕M織特異性啟動子的非限制性的例子包括，例如，神經元特異的啟動子(如神經絲啟動子；Byrne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)865473-5477)和成纖維細胞、內胚層細胞、小膠質細胞及少突神經膠質細胞特異性啟動子。發(fā)育調節(jié)啟動子也包括在內，例如鼠hox啟動子(Kessel等，Science(1990)249374-379)及α-胎蛋白啟動子(Campes等，Genes Dev.(1989)3537-546)。
或者，如本領域內已知的，表達的控制也可利用特定的可誘導啟動子而達到。例如，可使用四環(huán)素/tet激活蛋白系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用可結合激活蛋白或可被激活蛋白誘導的操縱子元件。然而，激活蛋白結合四環(huán)素，該反應阻礙了激活蛋白與操縱子元件的結合。因此四環(huán)素抑制了操縱子元件下游克隆的轉基因的表達。
因為本發(fā)明的目標之一是獲取骨橋蛋白的功能，故有可能獲得截短的或經修飾的骨橋蛋白，以增加或減少表達、便于處理或盡量減小副作用。因此，骨橋蛋白核酸或蛋白可通過已知的技術來處理，以獲取截短或經修飾的骨橋蛋白，該蛋白可結合骨橋蛋白受體并保持產生或引發(fā)本發(fā)明所需之特殊作用的能力。
骨橋蛋白核酸突變可通過標準技術如定點誘變及PCR介導的誘變而引入。優(yōu)選地，在一個或多個預測的非必需氨基酸殘基處進行保守氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈笔侵冈摪被釟埢灰痪哂蓄愃苽孺湹陌被釟埢〈?。例如，本領域對具有類似側鏈的氨基酸殘基家族已有所定義。該家族包括堿性側鏈氨基酸(如賴氨酸、精氨酸及組氨酸)、酸性側鏈氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)、中性極性側鏈氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸及半胱氨酸)、非極性側鏈氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸及色氨酸)、分支側鏈氨基酸(如蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)及芳香族側鏈氨基酸(如酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸及組氨酸)。因此骨橋蛋白或其受體內預測的非必需氨基酸殘基優(yōu)選地用來自相同側鏈家族的另一氨基酸殘基所取代。作為一種替換方式，也可以沿著骨橋蛋白編碼序列的全部或部分序列隨機地引入突變，例如通過飽和誘變的方式；而且可以進行所生成突變體的骨橋蛋白活性篩選，以鑒定出仍保持活性的突變體。在誘變之后，所編碼的蛋白可以進行重組表達，蛋白的活性也可以被測定。
本發(fā)明也包括反義核酸分子，即與編碼蛋白的有義核酸互補的分子，例如與雙鏈cDNA分子編碼鏈互補或mRNA序列互補的分子，以從實質上減少骨橋蛋白或其受體的表達。相應地，反義核酸可以通過氫鍵與有義核酸結合。反義核酸可以與完整的骨橋蛋白或其受體的編碼鏈互補，也可以只與其一部分互補，例如，可以與該蛋白編碼區(qū)(或開放性讀框)的全部或一部分互補。反義核酸分子還可以是與編碼骨橋蛋白或其受體的核苷酸序列編碼鏈的非編碼區(qū)反義。非編碼區(qū)(5′和3′非轉譯區(qū))是編碼區(qū)側翼的5′和3′序列，它們不被翻譯成氨基酸，但可具有調控作用。如果骨橋蛋白或其受體的正常表達依賴于該側翼位點，那么該側翼位點可以是作用的目標。
假如編碼骨橋蛋白或其受體的編碼鏈序列已知，本發(fā)明的反義核酸的設計可以根據(jù)Watson & Crick堿基配對原則。反義核酸分子可以與適當mRNA的完整編碼區(qū)互補，但更優(yōu)選地，反義核酸分子是這樣的寡核苷酸，其只與相關mRNA的編碼區(qū)或非編碼區(qū)的一部分反義。例如，反義寡核苷酸可以是與骨橋蛋白mRNA翻譯起始位點附近區(qū)域互補的序列。反義寡核苷酸的長度可以是例如約為5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸序列。本發(fā)明之反義核酸可以采用本技術領域內已知的方法利用化學合成和酶促連接反應來構建。例如，反義核酸(例如反義寡核苷酸)可以用天然存在的核苷酸或多種經修飾的核苷酸以化學方式合成；這些經修飾的核苷酸是設計用于增加分子的生物穩(wěn)定性，或增加反義核酸和有意核酸所形成雙鏈體的物理穩(wěn)定性，例如硫代磷酸酯衍生物、膦酸脂衍生物和吖啶取代的核苷酸均可以使用。
這種反義技術可用于產生基因敲除動物，使骨橋蛋白基因或骨橋蛋白受體基因失去功能。反義核酸分子可以針對編碼序列或非編碼序列，例如調控序列，如啟動子。反義分子可以是RNA或DNA。由于反義分子會降解或通過細胞分裂而被稀釋，所以通常反義分子使基因失活的作用是瞬時的。然而，反義構建體可配置組成型或誘導型啟動子，以獲得該反義分子的更多表達。
較長久的基因失活可以通過將反義構建體整合到宿主細胞基因組內的方式來達到。這一點可以通過同源重組等方法實現(xiàn)，正如本領域內已知的。在生殖細胞或前體細胞中的同源重組可以產生這樣一種動物，其體內某一組織、器官或整個機體中骨橋蛋白基因或骨橋蛋白受體基因已失活，當整個機體基因失活時則產生了基因敲除轉基因動物。
可用于生成反義核酸的經修飾核苷酸包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖queosine、次黃苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖queosine、5-甲氧基羰甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤等?；蛘?，反義核酸可以用生物學方法產生，即將核酸以反義方向亞克隆入一個表達載體(即從被插入的核酸轉錄的RNA是所關注目標核酸的反義方向序列)。
本發(fā)明之反義核酸分子一般施用于某一受試對象或由受試對象原位產生后，與編碼骨橋蛋白或其受體的細胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結合，從而抑制該蛋白的表達，例如通過抑制轉錄和/或翻譯的方式來抑制該蛋白的表達。雜交可以是通過傳統(tǒng)的核苷酸互補作用而形成一種穩(wěn)定的雙鏈體，或者，例如在結合DNA雙鏈體的反義核酸分子的情況下，通過與雙螺旋大溝的特異性相互作用而實現(xiàn)，或是結合到骨橋蛋白或其受體的調控區(qū)域。
本發(fā)明之反義核酸分子給藥途徑的一個的例子是直接注入組織部位?；蛘撸梢孕揎椃戳x核酸分子使之選擇性地作用于靶細胞，然后全身給藥。例如，為了用于全身給藥，反義分子可以被修飾成能特異結合表達在靶細胞表面的受體或抗原的分子，例如，可將反義核酸分子連接到能與細胞表面受體或抗原結合的肽或抗體上。反義核酸分子也可以用本申請書所述之載體遞送至細胞。為了使胞內反義分子達到足夠的濃度，可將反義核酸分子置于強啟動子控制下，優(yōu)選使用pol II或pol III啟動子。
本發(fā)明之反義核酸分子可以是一種α-異頭核酸分子。α-異頭核酸分子與互補RNA形成特異的雙鏈雜交體，其兩條鏈彼此平行(Gaultier等，Nucleic Acids Res.(1987)156625-6641)。反義核酸分子也可以包含一個甲基核糖核苷酸(Inoue等，Nucleic Acids Res.(1987)156131-6148)，或一個嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等，F(xiàn)EBS Lett.(1987)215327-330)。
本發(fā)明也包括了核酶。核酶是一些具有RNA酶活性的催化性RNA分子，能夠切割與核酶雜交的單鏈核酸，例如mRNA。因此，核酶(例如錘頭狀核酶，參閱Haselhoff等，Nature(1988)334585-591)可用于在催化條件下切割相關的mRNA轉錄物以抑制該mRNA的翻譯。具有骨橋蛋白或其受體核酸特異性的核酶可以根據(jù)骨橋蛋白或其受體的核苷酸序列而設計。例如，可以構建四膜蟲L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位點的核苷酸序列與被切割的骨橋蛋白或其受體的mRNA核苷酸序列互補，參閱美國專利號4,987,071及5,116,742?；蛘?，也可用骨橋蛋白mRNA從一個RNA分子庫中選擇具有特異RNA酶活性的催化性RNA，參閱如Bartel等，Science(1993)2611411-1418。
本發(fā)明還包括形成三螺旋結構的核酸分子。例如，通過以與骨橋蛋白調控區(qū)(如骨橋蛋白啟動子和/或增強子)互補的核苷酸序列為靶序列，形成阻礙靶細胞內骨橋蛋白基因轉錄的三螺旋結構，從而可以抑制骨橋蛋白基因的表達。一般可參閱Helene，Anticancer Drug Dis.(1991)6(6)569；Helene Ann，NY Acad.Sci.(1992)66027；以及Maher，Bioassays(1992)14(12)807。
在優(yōu)選的實施方案中，可以對本發(fā)明之核酸分子的堿基、糖基或磷酸基主鏈部分進行修飾，以改善該分子的例如穩(wěn)定性、可雜交性或可溶性。例如，可以修飾核酸的脫氧核糖磷酸基主鏈以產生肽核酸(參閱Hyrup等Bioorganic & Medicinal Chemistry(1996)45)。本申請書中所使用的術語“肽核酸”或“PNA”指的是核酸類似物，例如DNA類似物，其中脫氧核糖磷酸主鏈被假肽主鏈取代，而只有四種天然核堿基被保留。PNA的中性主鏈已被證明可在低離子強度的條件下特異性地雜交到DNA和RNA上。PNA寡聚物的合成可使用標準的固相肽合成方案來實現(xiàn)，正如前述Hyrup等(1996)和Perry-O’Keefe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)9314670文中所述。
正如本申請書所公開的，堿基配對并非是阻斷骨橋蛋白或其受體表達的必不可少的條件，適配體是與特定的核酸相互作用的核酸，其作用方式和蛋白與蛋白之間相互作用或蛋白與核酸之間相互作用的方式相同，即依賴于變化、其它吸引力和構象。
此外某些類似物不一定就是核酸，蛋白或碳水化合物也可以對骨橋蛋白或其受體核酸具有特異性，并因此而阻礙其轉錄或翻譯。
如果骨橋蛋白或其生物活性部分以重組的方法產生，優(yōu)選地基本上不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基僅占蛋白制備物體積的約20％、10％、5％以下或更少。
如果骨橋蛋白或其一部分以化學合成的方法產生，優(yōu)選地基本不含化合物前體或其它化合物，也就是說，把它與從參與該蛋白合成的化合物前體或其它化合物分開。相應地，這種骨橋蛋白制備物含有約30％、20％、10％、5％以下或更少(按干重計)的化合物前體或非骨橋蛋白化合物。
由于少突神經膠質細胞及其前體對髓鞘再生很重要，一個合適的宿主細胞將是少突神經膠質細胞或少突神經膠質細胞前體。作為轉化細胞的位點，由這樣的經轉化細胞產生的骨橋蛋白表達可作為天然存在的少突神經膠質細胞前體或少突神經膠質細胞遷移的焦點。
適合用于轉化的宿主細胞為膠質細胞，例如分泌骨橋蛋白的小膠質細胞。同樣，由經轉化的膠質細胞產生的骨橋蛋白將為少突神經膠質細胞前體遷移到一個特定位點提供了刺激。骨橋蛋白還將導致少突神經膠質細胞延遲分化。少突神經膠質細胞成熟的減少以及少突神經膠質細胞前體的增殖增加了在特定位點少突神經膠質細胞的最終數(shù)目，從而促進或增加了髓鞘再生過程。
另一種適合用于轉化的細胞是成纖維細胞或其它可以定位到特定位點的內胚層細胞。成纖維細胞可以在特定的位點表達骨橋蛋白，從而增加了少突神經膠質細胞前體的數(shù)量。
這種已轉化細胞可被置于需要髓鞘再生的部位，往往是在中樞神經系統(tǒng)內。因此，用于植入已轉化細胞的多種已知的外科方法均可用來在所需部位獲得表達骨橋蛋白的細胞。
或者，可將純化的骨橋蛋白或其截短的生物學有效部分滴注入某一部位，或將其置入一釋放裝置中，例如硅橡膠植入物等。這樣，骨橋蛋白就可在需要髓鞘再生的部位以預定的速率局部釋放。骨橋蛋白可將細胞吸引到該部位。
因為骨橋蛋白是由諸如少突神經膠質細胞前體和小膠質細胞等細胞表達的，所以，它是這些細胞群體的一種標志。因此，檢測骨橋蛋白是鑒定諸如少突神經膠質細胞前體等細胞的一種手段。很多不同的方法都可用于探索少突神經膠質細胞前體細胞的這個性質，如RIA、ELISA、TaqMan、Northern印跡法或熒光分析。
例如，針對骨橋蛋白的抗體可用于鑒定活躍地產生和分泌骨橋蛋白的細胞。該抗體可以針對骨橋蛋白或骨橋蛋白mRNA，其中所述mRNA可以是單獨的也可以是與核糖體結合。正如本領域中所知的，抗體可以被直接地或間接地標上標記；間接標記時，骨橋蛋白抗體可通過另一分子，例如某種結合分子或另一種抗體而被識別。
很多不同的分子均可用于直接標記骨橋蛋白抗體，如某種放射性標記、酶標記、熒光化合物標記及化學發(fā)光化合物標記等等。各種標記物可以用本領域中已知的技術附于抗體分子上，例如可用某種已標記的氨基酸前體、或通過其它代謝手段，如通過化學方法將標記物以共價鍵結合到抗體分子上，或者利用某種接頭分子標記，等等。然后再用某種合適的檢測手段確定已標記的抗體分子的存在?？蓹z測物質的例子包括各種酶、輔基、熒光物質、發(fā)光物質、生物發(fā)光物質和放射性物質等。合適的酶的例子包括辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶。合適的輔基復合物例子包括鏈親和素/生物素和親和素/生物素。合適的熒光物質的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白等。發(fā)光材料的一個例子是魯米諾。生物發(fā)光物質的例子包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白。合適的放射性物質的例子包括125I，131I，35S或3H等。
在間接檢測結合抗體的情況下，可使用能結合骨橋蛋白抗體的抗體。例如，如果骨橋蛋白抗體是從某種非人類的物種中制備的話，二級抗體可以是針對該物種的同種異型決定簇的抗體?；蛘撸菢虻鞍卓贵w的獨特型決定族可以作為靶分子。或者，其它可以鑒定骨橋蛋白抗體的結合分子也可以使用。例如，如果該骨橋蛋白抗體是可被蛋白A或蛋白G識別的IgG分子，那么蛋白A或蛋白G就可以是經標記的報道分子。上文所討論的各種標記物均可用于標記蛋白A或蛋白G。另一個這樣的結合分子對是利用生物素來標記抗體分子，然后用標記的親和素分子來探測生物素標記的抗體分子。
或者，核酸可用于檢測存在于少突神經膠質細胞前體內的骨橋蛋白。這樣的核酸被稱為適配體，可以從本領域已知的寡核苷酸庫中獲取。
骨橋蛋白核酸也可以被檢測。在這種情況下，檢測骨橋蛋白表達的一種合適的方法是監(jiān)測骨橋蛋白信息的存在。檢測信息的已知方法包括Northern印跡法、Taqman分析、原位雜交等等。標記骨橋蛋白特異的核酸探針并使之與骨橋蛋白mRNA雜交。雜交之后，再使用適當?shù)臋z測手段來顯示可用上述許多手段中的任何一種標記的骨橋蛋白探針。如同上述基于蛋白的系統(tǒng)的利用，骨橋蛋白探針核酸可被直接地標上標記物，或者用另一個已被標記的報道分子可用于識別所結合的探針。
作為少突神經膠質細胞前體的一種趨化因子，骨橋蛋白可用于表征和分離少突神經膠質細胞前體以及可移動的少突神經膠質細胞。監(jiān)測細胞運動性的分析方法是本領域內已知的，例如，可將骨橋蛋白黏附于瓊脂糖等半固體基質上，然后讓能識別并向趨化因子移動的細胞暴露于被結合的骨橋蛋白，以測定是否有任何細胞能夠進入基質。
通過利用少突神經膠質細胞前體和少突神經膠質細胞在骨橋蛋白作用下的可移動性，以及使用諸如上文所述的抗體分子等結合分子，可以形成純化少突神經膠質細胞前體或少突神經膠質細胞的一種手段。例如，可將被骨橋蛋白趨化的細胞從一混合細胞群體中區(qū)分出來。再如，可用一種骨橋蛋白抗體從一群細胞中分離少突神經膠質細胞前體或少突神經膠質細胞。例如，骨橋蛋白抗體可被固定在諸如小珠、培養(yǎng)板表面等固體基質上，并暴露于一混合細胞群體。被該抗體結合的細胞可與那些未被該抗體結合的細胞分離，以獲得一個少突神經膠質細胞和/或少突神經膠質細胞前體富集的群體。
或者，使用一種如本申請書所教導的篩選分析法，可以鑒定并使用一種在結合靶細胞時誘導這些細胞遷移到所需部位的激動劑分子。該激動劑可從大量的候選化合物中被鑒定出來。
本文中所謂的“激動劑”是指當結合到骨橋蛋白受體上時，與激動劑相比，它能夠激活所需的胞內和/或細胞響應的分子組分。
本文中術語“部分激動劑”是指當結合到受體上時，與激動劑相比，它能夠較低程度地激活胞內和/或細胞響應的分子組分(例如骨橋蛋白但不限于骨橋蛋白)。
本文中術語“候選化合物”指的是適合用于篩選技術的化合物。這樣的化合物可以通過常規(guī)的藥物開發(fā)過程發(fā)現(xiàn)，該藥物開發(fā)過程涉及鑒定某種受體特異的內源性配體和/或篩選抗某一受體的候選化合物(這樣的篩選需要用競爭性試驗來評價功效)；或通過使用包括使用抗體和重組核酸在內的生物技術方法來發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明提供了一種方法(本文中又稱為“篩選分析”)以鑒定可與骨橋蛋白受體結合的或對骨橋蛋白活性有刺激或抑制作用的調節(jié)劑，即候選化合物或受試化合物或試劑(例如肽、擬肽(peptidomimetics)、小分子或其它藥物)。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供多種篩選候選化合物或受試化合物的分析方法，其中該候選化合物或受試化合物可與骨橋蛋白受體結合，或可調控骨橋蛋白受體或其生物活性部分的活性。本發(fā)明之受試化合物可通過本技術領域內已知的許多組合庫方法中的任何方法制備，其中所述組合庫方法包括生物庫法、空間可尋址的平行固相或液相庫法、需要使用重疊法的合成庫法、“一珠一化合物”庫法，以及使用親和層析選擇的合成庫法。其中生物庫方法僅限于肽庫，而另四種方法則可適用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物庫(Lam，Anticancer Drug Des.(1997)12145)。
在本技術領域內可查到分子庫合成方法的例子，例如DeWitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)906909；Erb等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)9111422；Zuckermann等，J.Med.Chem.(1994)372678；Cho等，Science(1993)2611303；Carrell等，Angew Chem.Iht.Ed.Engl.(1994)332059；Carell等，Angew Chem.Int.Ed.Engl.(1994)332061；以及Gallop等，J.Med.Chem.(1994)371233。
化合物庫可存在于溶液中(例如，Houghten Bio/Techniques(1992)13412-421)，或珠上(Lam，Nature(1991)35482-84)、芯片上(Fodor，Nature(1993)364555-556)、細菌上(美國專利號5,223,409)、孢子上(美國專利號5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、質粒上(Cull等，Proc.Natl.Aead.Sci.USA(1992)891865-1869)或噬菌體上(Scott等，Science(1990)249386-390；Devlin，Science(1990)249404-406；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)876378-6382；以及Felici，J.Mol.Biol.(1991)222301-310)。
在一個實施方案中，分析是以細胞為基礎而進行的。在該分析中，先讓在細胞表面上表達骨橋蛋白受體或其生物活性部分的細胞與一受試化合物接觸，然后測定該受試化合物與骨橋蛋白受體結合的能力。該細胞可以是例如酵母細胞或源自哺乳動物的細胞。受試化合物與骨橋蛋白受體結合的能力可通過以下方式來測定，例如使受試化合物與放射性同位素或酶標記物偶聯(lián)，使得該受試化合物與骨橋蛋白受體或其生物活性部分的結合可通過檢測復合體中標記化合物的方式來測定。又如，該受試化合物可以用125I、35S、14C或3H直接地或間接地標記，放射性同位素可通過射電輻射直接計數(shù)或通過閃爍計數(shù)而測出?；蛘撸茉嚮衔锟梢杂美备^氧化酶、堿性磷酸酶或螢光素酶等酶標記后，通過測定適宜底物到產物的轉換來檢測。
該分析也可以是使用帶標記骨橋蛋白的競爭性分析。這樣，本分析之步驟包括使在細胞表面表達骨橋蛋白受體或其生物活性部分的細胞與骨橋蛋白接觸以形成一種試驗混合物，再使該試驗混合物與受試化合物接觸并測定受試化合物與骨橋蛋白受體相互作用的能力。其中，測定受試化合物與骨橋蛋白受體相互作用的能力包括測定受試化合物比已知化合物優(yōu)先與骨橋蛋白受體或其生物活性部分結合的能力。
在另一實施方案中，分析也是以細胞為基礎的分析，包括使在細胞表面表達骨橋蛋白受體或其生物活性部分的細胞與受試化合物接觸，以及測定該受試化合物調控(例如刺激或抑制)骨橋蛋白受體或其生物活性部分活性的能力。測定受試化合物調控骨橋蛋白受體或其生物活性部分活性的能力，可以通過以下測定過程來實現(xiàn)例如，測定骨橋蛋白受體與骨橋蛋白結合的能力，或骨橋蛋白受體與骨橋蛋白相互作用的能力，或產生IL-12的能力。已知很多細胞表面分子可以結合骨橋蛋白，如CD44和αv、α6、β1、β3和β5鏈。α鏈和β鏈是整合素的亞基。
受體可以通過非配體分子激活，這些非配體分子不一定抑制配體的結合但可導致受體的結構變化，以引起受體的聚集、二聚體化或成簇現(xiàn)象，從而可導致受體活化。
這樣，可以針對骨橋蛋白受體的多個部分產生抗體。這些可以激活骨橋蛋白受體的抗體可以通過標準的分析方法例如監(jiān)測IL-12的產生而測定，而且可加以選擇。
上述抗體可用已知的技術來制備。由于涉及分子圖譜定位尤其是表位圖譜定位，所以單克隆抗體可能是首選的。單克隆抗體可以針對細胞表面所表達的完整受體，也可以針對已知在細胞表面所形成的肽。Geysen等人的第5,998,577號美國專利中所述的方法可用于許多種相關的肽的制備。
骨橋蛋白受體或其部分或片段，均可作為免疫原使用以通過那些制備多克隆抗體和單克隆抗體的標準技術制備可結合該蛋白的抗體。全長的骨橋蛋白受體可作為免疫原使用，或者，本發(fā)明提供的骨橋蛋白受體的抗原性肽片段可作為免疫原使用。骨橋蛋白受體的抗原性肽至少包含8個(優(yōu)選地為10、15、20、30或30個以上)已知序列的氨基酸殘基，并包含一個骨橋蛋白受體的表位，使得針對該肽的抗體與該蛋白形成一種特異的免疫復合體。
在一相關的方面，抗原性肽所包含的表位是與該受體的特定部分結合的骨橋蛋白受體區(qū)域，或是已知具有特定功能的區(qū)域。
使用骨橋蛋白受體免疫原制備抗體的方式通常是用該免疫原給一個合適的對象(如兔、山羊、小鼠或其它哺乳動物)進行免疫接種。合適的免疫原制劑可包含例如重組表達的骨橋蛋白受體或化學合成的骨橋蛋白受體。該制劑還可包含佐劑，例如弗氏完全或不完全佐劑，或類似的免疫刺激劑。用免疫原性骨橋蛋白受體制劑對合適對象的免疫可誘導多克隆反應。
本文所使用的術語“抗體”指的是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，也就是含有特異結合骨橋蛋白受體的抗原結合位點。特異結合骨橋蛋白受體的分子是指結合骨橋蛋白受體，但基本上不結合樣品(如天然含有骨橋蛋白受體的生物樣品)中其它分子的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的例子包括F(ab)和F(ab′)2片段，該兩種片段可以通過用酶例如胃蛋白酶來處理抗體的方式而產生。
本文所使用的術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組分”指的是這樣一群抗體分子，其只含有一種能與該骨橋蛋白受體的一特定表位發(fā)生免疫反應的抗原結合位點。因此，單克隆抗體組分一般顯示對某一特定表位的單一結合親合力。
該免疫對象中的抗體滴度可以用標準的技術在一定的時期內監(jiān)測，例如使用固定化的骨橋蛋白受體進行酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)。如果需要的話，針對骨橋蛋白受體的抗體分子可以從哺乳動物(例如從血液中)分離出來并用眾所周知的技術進一步純化以獲取IgG組分，例如采用蛋白A色譜法。在免疫后的某一適當時間，例如當抗體滴度最高的時候，可以從該免疫對象中獲取抗體產生細胞，并用于以標準技術來制備單克隆抗體，例如最初由Kohler等，Nature(1975)256495-497一文所述的雜交瘤技術、人類B細胞雜交瘤技術(Kohler等，Immunol.Today(1983)472)、EBV雜交瘤技術(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(1985)，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)或trioma技術。
產生雜交瘤的技術是眾所周知的(通常參閱Current Protocols inImmunology(1994)Coligan等編輯，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)。簡而言之，是將永生細胞系(一般是骨髓瘤細胞)與用所研究的免疫原按上述方法免疫的哺乳動物的淋巴細胞(一般是脾細胞)融合，再篩選所產生的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液，以鑒定能產生可與骨橋蛋白受體結合的單克隆抗體的雜交瘤。
許多用于融合淋巴細胞和永生細胞系的熟知方案中的任何一個都可用于產生單克隆抗體(參閱如Current Protocols in Immunology，見上文；Galfre等，Nature(1977)266550-552；Kenneth，Monoclonal AntibodiesANew Dimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp.，NewYork，NY(1980)；以及Lerner，Yale J.Biol.Med.(1981)54387-402等)。此外，普通技術人員也將會理解這類方法有著許多也很有用的變化形式。
通常，永生細胞系(例如骨髓瘤細胞系)與淋巴細胞來源于同一種哺乳動物。例如，小鼠雜交瘤細胞可以通過來源于經本發(fā)明的免疫原制劑免疫的小鼠的淋巴細胞與小鼠的永生細胞系融合的方式而產生，該永生細胞系的例子包括對含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基”)敏感的骨髓瘤細胞系。很多骨髓瘤細胞系都可按照標準的技術參與融合，如P3-NS1/l-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Agl4骨髓瘤細胞系。所述骨髓瘤細胞可購自ATCC。
通常，對HAT敏感的小鼠骨髓瘤細胞用聚乙二醇(PEG)與小鼠脾細胞融合。然后用HAT培養(yǎng)基選擇融合所得的雜交瘤細胞，該培養(yǎng)基將殺死未融合和未正確融合的骨髓瘤細胞(未融合的脾細胞于幾天后死亡，因為它們未被轉化)。產生本發(fā)明之單克隆抗體的雜交瘤細胞可通過篩選雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液中結合骨橋蛋白的抗體而檢測出來，例如，采用標準的ELISA分析法來檢測。
優(yōu)選地，該單克隆抗體是基本上或完全地來源于人類。因此，可采用本領域內已知的方法，使用人類抗體構架中含有非人類互補決定區(qū)的嵌合抗體。參閱PCT公開號WO 87/02671；歐洲專利申請?zhí)?84,187；歐洲專利申請?zhí)?71,496；歐洲專利申請?zhí)?73,494；PCT公開號WO 86/01533；美國專利號4,816,567；歐洲專利申請?zhí)?25,023；Better等，Science(1988)2401041-1043；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)843439-3443；Lin等，J.Immunol.(1987)1393521-3526；Sun等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84214-218；Nishimura等.，Canc.Res.(1987)47999-1005；Wood等，Nature(1985)314446-449；Shaw等，J.Natl.Cancer Inst.(1988)801553-1559；Morrison，Science(1985)2291202-1207；Oi等，Bio/Techniques(1986)4214；美國專利號5,225,539；Jones等，Nature(1986)321552-525；Verhoeyan等，Science(1988)2391534；以及Beidler等，J.Immuno1.(1988)1414053-4060。
人類抗體可以用體外技術制備。完全人類抗體尤其適用于人類患者的治療。這樣的抗體可以用轉基因小鼠產生，該小鼠不會表達內源性免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但能表達人類重鏈和輕鏈基因。Abgenix公司(Fremont，CA)用攜帶部分人類免疫球蛋白庫的小鼠在小鼠中制造人類單克隆抗體。他們用所選擇的抗原以標準方式免疫轉基因小鼠。針對該抗原的單克隆抗體可以用常規(guī)的雜交瘤細胞技術獲得。轉基因小鼠體內的人類免疫球蛋白外源基因在B細胞分化和隨后進行的類別轉換和體細胞突變的時候發(fā)生了重排。
除了制備單克隆抗體-分泌性雜交瘤細胞的方式，還可以用骨橋蛋白或其受體篩選重組的組合免疫球蛋白庫(例如抗體噬菌體展示庫)，從而分離出結合骨橋蛋白或其受體的免疫球蛋白庫成員，以此方式來鑒定和分離單克隆抗體。產生和篩選噬菌體展示庫的試劑盒已經商品化(例如，PharmaciaRecombinant Phage Antibody System，目錄號27-9400-01；以及StratageneSurfZAPPhage Display Kit，目錄號240612)。
此外，特別適用于產生和篩選抗體顯示庫之方法和試劑的例子可在如下文獻中查到美國專利號5,223,409；PCT公開號WO 92/18619；PCT公開號WO 91/17271；PCT公開號WO 92/20791；PCT公開號WO 92/15679；PCT公開號WO 93/01288；PCT公開號WO 92/01047；PCT公開號WO 92/09690；PCT公開號WO 90/02809；Fuchs等，Bio/Technology(1991)91370-1372；Hay等，Hum.Antibody Hybridomas(1992)381-85；Huse等。Science(1989)2461275-1281；以及Griffiths等，EMBO J.(1993)25(12)725-734。
因此，使用這樣的表位，即可鑒定與之結合的抗體。該抗體的重鏈和輕鏈被克隆，并被用于產生噬菌體顯示Fab片段。例如，重鏈基因可以被克隆到一個質粒載體內，使得重鏈可以被細菌分泌。輕鏈基因可以被克隆到一個噬菌體外殼蛋白基因內，使得輕鏈可以被表達在噬菌體表面上。用與噬菌體融合的人類輕鏈庫(隨機采集)感染表達非人類重鏈的細菌。所產生的子代噬菌體即可展示雜合抗體(人類輕鏈/非人類重鏈)。所選擇的抗原用于以淘篩方式篩選與選定抗原結合的噬菌體。鑒定這樣的噬菌體可能需要經過幾輪篩選。
從可結合選定抗原的選定噬菌體分離人類輕鏈基因。然后，用所選定的人類輕鏈基因來指導如下的人類重鏈基因選擇步驟。將選定的人類輕鏈基因插入載體由細菌表達。用與噬菌體融合的人類重鏈庫來感染可表達選定人類輕鏈的細菌。所產生的子代噬菌體顯示了人類抗體(人類輕鏈/人類重鏈)。
然后，用選定的抗原以淘篩的方式篩選與選定抗原結合的噬菌體。在該步驟選出的噬菌體顯示了完全人類抗體，它可識別被原來選出的非人類單克隆抗體識別的同樣表位。這些可編碼重鏈和輕鏈的基因很容易被分離，并可進一步處理以產生人類抗體。Jespers等人敘述了該項技術(Bio/Technology(1994)12899-903)。
骨橋蛋白抗體(例如單克隆抗體)可用于通過標準的技術例如親和色譜法或免疫沉淀法來分離骨橋蛋白。這樣的抗體可促進來源于細胞的天然骨橋蛋白的純化和由宿主細胞表達的重組骨橋蛋白的純化。而且，這樣的抗體可用于檢測(例如細胞裂解物中或細胞培養(yǎng)上清液中的)骨橋蛋白，以評價骨橋蛋白表達的豐度和模式。在診斷方面作為臨床試驗步驟的一部分，骨橋蛋白抗體可用于監(jiān)測組織中的蛋白水平，例如，測定一種具體治療方法的功效。
可激活骨橋蛋白受體的抗體可加以修飾，以盡量減小與骨橋蛋白介導的功能無關的活性，例如產生IL-12。因此，該抗體分子可被截短或發(fā)生突變，以盡量減小或除去除骨橋蛋白激活作用以外的活性。例如，對某些抗體來說，只有結合抗原的部分是所需的。因此，抗體的Fc部分可被除去。
表達骨橋蛋白受體的細胞與抗體接觸而被激活。然后，被激活的細胞與多種分子接觸，以鑒定那些改變受體活性的分子，無論是提高活化水平或是降低活化水平。符合這些標準的分子可在未用抗體處理但能表達骨橋蛋白受體的細胞上測試，以觀察其對未被激活的細胞的作用。然后再用已知的技術對靶分子進行測試和修飾，以作為候選藥物用于治療與骨橋蛋白代謝異常相關的疾病。
本發(fā)明的篩選分析法既適用于可溶性骨橋蛋白受體也適用于膜結合的骨橋蛋白受體。在含有可溶性骨橋蛋白受體的無細胞分析法的情況下，本技術領域中已知的膜增溶劑可用于將受體保持在溶液中。這類增溶劑的例子包括非離子型去污劑，例如正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛?；?N-甲基葡萄糖胺、癸酰基-N-甲基葡萄糖胺、Triton X-100、Triton X-114、Thesit、異十三烷基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-膽酰胺丙基)二甲胺基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-[(3-膽酰胺丙基)二甲胺基]-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CHAPSO)或N-十二烷基＝N，N-二甲基-3-氨溶-1-丙磺酸鹽。
固定骨橋蛋白、其受體或其靶分子，可能是一種合乎需要的做法，以便于其中任一種或兩種蛋白的復合形式與非復合形式之間的分離，并便于實現(xiàn)分析的自動化。試驗化合物與骨橋蛋白或其受體的結合，或骨橋蛋白或其受體在候選化合物存在或不存在這兩種不同的情況下與靶分子之間的相互作用，可在任何適合于容納該反應物的容器內實現(xiàn)。這類容器的例子包括微滴定板、試管和微離心管。在一個實施方案中，可在融合蛋白中引入一個結構域，使得上述任一種或兩種蛋白可與基質結合。例如，谷胱甘肽-S-轉移酶/骨橋蛋白融合蛋白、或谷胱甘肽-S-轉移酶/靶融合蛋白可被吸附在谷胱甘肽瓊脂糖珠上(Sigma Chemical，St.Louis，MO)。或者，可以使用谷胱甘肽衍生的微滴定板，然后再與該試驗化合物一起，或與該試驗化合物以及不被吸附的靶蛋白一起，或與受試化合物和骨橋蛋白一起，在有利于復合物形成的條件(例如在生理鹽濃度和pH值條件下)下培養(yǎng)。培養(yǎng)完畢后，洗滌瓊脂糖珠或微滴定板培養(yǎng)孔以除去任何未結合的組分，并按照如上所述的方法直接或間接地測定復合物的形成?；蛘撸蓪⒃搹秃衔飶幕|上解離下來，并使用標準技術測定骨橋蛋白結合或活性的水平。
其它將蛋白固定在基質上的技術也可用于本發(fā)明的篩選分析。例如，可以利用生物素和鏈親和素的結合作用來固定骨橋蛋白或其受體或靶分子。生物素標記的分子可以用本技術領域中眾所周知的技術(如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)從生物素-NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)來制備，并固定于鏈親和素包被的96孔培養(yǎng)板內(Pierce Chemicals)。
或者，易與骨橋蛋白、其受體或靶分子反應但不干擾其與靶分子結合的抗體可在該培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔內衍生，未被結合的靶分子或骨橋蛋白通過抗體結合而滯留在培養(yǎng)板的孔內。檢測這類復合物的方法，除了上述用于GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)固定的復合物的方法以外，還包括使用易與骨橋蛋白或靶分子反應的抗體所進行的復合物免疫檢測法，以及依賴于骨橋蛋白相關酶活性檢測的酶聯(lián)試驗。
在另一實施方案中，通過以下方法鑒定了骨橋蛋白功能的調控子使細胞與一候選化合物接觸，并測定所誘導的mRNA或蛋白在該細胞中的表達。在該候選化合物存在和不存在這兩種不同的情況下，對特定mRNA或蛋白的表達水平進行比較。在上述比較的基礎上，該候選化合物即可被鑒定為骨橋蛋白功能的調控子。
在本發(fā)明的另一方面，骨橋蛋白或其受體可作為“誘餌蛋白”而用于雙雜交試驗或三雜交試驗(參閱例如美國專利號5,283,317；Zervos等，Cell(1993)72223-232；Madura等，J.Biol.Chem.(1993)26812046-12054；Bartel等，Bio/Techniques(1993)14920-924；Iwabuchi等，Oncogene(1993)81693-1696；以及PCT公開號WO 94/10300)，以鑒定與骨橋蛋白或其受體結合或相互作用并調節(jié)骨橋蛋白活性的其他蛋白。
在另一實施方案中，希望盡量減少骨橋蛋白的產生或反應性，例如，當希望缺乏少突神經膠質細胞成熟時就是如此。骨橋蛋白的拮抗劑能夠通過某種方式抑制天然骨橋蛋白的一種或多種活性，例如，通過競爭地與骨橋蛋白受體結合而不將其激活。因此，可以用一種功能受限的變體進行治療而產生特殊的生物效果。相對于用天然存在的骨橋蛋白進行治療，用上述這種保留了天然蛋白一部分生物活性的變體對治療對象進行治療可減少副作用。
通過篩選突變體例如截短型突變體的組合庫，或通過獲得拮抗性抗體等方式，可以鑒定骨橋蛋白的拮抗劑，正如上文所述的鑒定激動劑。
由于可以制備大量的純骨橋蛋白或其受體，故可確定可能的功能區(qū)域之構象的物理特征以用于合理化藥物設計。一旦弄清了一個區(qū)域的形狀和離子結構，就可以確定應該與那些區(qū)域相互作用的候選藥物的結構，然后在未用過該藥物的細胞、動物和患者中進行試驗。能夠產生這種3維結構信息的方法包括X-射線結晶學、核磁共振波譜學和分子模建等。該3維結構還為鑒定其它已知蛋白質類似構象的區(qū)域創(chuàng)造了條件，對于這樣的區(qū)域，存在著有效的已知藥物。
作為防止少突神經膠質細胞前體細胞分化和促進這些前體細胞增殖以增加其數(shù)量的制劑，骨橋蛋白可在治療方面用于促進少突神經膠質細胞群在體內某特定部位的增殖和擴大。由于少突神經膠質細胞可在中樞神經系統(tǒng)內產生髓磷脂，所以骨橋蛋白的使用是在中樞神經系統(tǒng)內脫髓鞘部位促進髓鞘再生的一種手段，例如，在多發(fā)性硬化癥和其它以脫髓鞘為特征的疾病情況下。
骨橋蛋白與表達其受體的響應細胞結合。整合素受體例如αvβ3可與骨橋蛋白結合。少突神經膠質細胞前體的骨橋蛋白受體表達水平很高。
骨橋蛋白刺激表達αv鏈的細胞內IL12的產生。αv鏈在骨細胞、少突神經膠質細胞和神經膠質細胞內，以及在經溶血卵磷脂處理的動物中表達水平很高。αv鏈可與多種β鏈相連。
α6鏈可由星形膠質細胞和微神經膠質細胞很好地表達。β1和β3也可由這些類型的細胞很好地表達。β5當由星形膠質細胞和微神經膠質細胞表達時，β5可比由少突神經膠質細胞和少突神經膠質細胞前體表達時以更高的水平表達。
β3鏈也與IL12的表達相關。β3鏈的表達隨著少突神經膠質細胞的分化而下降。β1和β5鏈也與骨橋蛋白的新陳代謝過程相關。
因此，減少骨橋蛋白影響的另一方法是盡量降低骨橋蛋白受體的表達，或占據(jù)骨橋蛋白受體使得該受體不能與骨橋蛋白結合。通過降低例如αv鏈、β3鏈或它們兩者的表達就可達到這一目的。降低表達的目的可通過例如定點誘變、利用反義鏈分子等等實施。αv和β3的基因序列是為技術人員所熟知和易得的。出于本發(fā)明之目的，抑制被認為是失活和其它類似術語的同義詞，其結果是骨橋蛋白受體在不受干擾的條件下，不會在同樣的水平上起作用，因此，與骨橋蛋白相關的功能，例如趨化或防止前體的分化等功能被降低了。
或者，與骨橋蛋白受體結合但沒有骨橋蛋白活性的分子可用于阻斷受體。這樣的分子可以通過使用表達骨橋蛋白受體的細胞之方式來鑒定?？梢宰屵@些細胞與許多分子接觸以鑒定那些與骨橋蛋白受體結合但沒有骨橋蛋白活性的分子。篩選例如具有αvβ3結合活性的分子的方法是本技術領域內已知的，例如，可使用表達或過量表達αvβ3的細胞或經轉化的表達重組αvβ3的細胞。
抑制受體的分子可以是任何一種分子、肽、碳水化合物、有機分子或其組合。例如，許多現(xiàn)有的藥物與特定的受體配體是無關的，但具有類似于天然配體例如骨橋蛋白的構象或電荷或兩者兼有。
測定骨橋蛋白受體活性的方法是眾所周知的，例如IL12的產生。分析IL12的方法在本技術領域內也是已知的。
防止骨橋蛋白與受體結合的另一方法是使用這樣的抗體，該抗體與骨橋蛋白或其受體結合的方式將阻止骨橋蛋白與其受體結合。獲取抗骨橋蛋白或骨橋蛋白受體的抗體的方法在本技術領域內是已知的。在那些為與骨橋蛋白或其受體結合而形成的抗體中，可用一種競爭性分析方法來鑒定那些抑制骨橋蛋白與其受體結合的抗體。
在另一實施方案中，與受體結合但并不激活該受體的被截短或經修飾的骨橋蛋白，可按照本文中所講授的方法制備。
由于骨橋蛋白是通過細胞表面受體而起作用的，該受體觸發(fā)細胞質、核蛋白和核酸之間一連串的分子間相互作用，最終達到特定基因的活化和/或失活，例如IL12的活化和/或失活。受體下游的那些細胞內元件是提高或抑制骨橋蛋白功能的合適目標。經發(fā)現(xiàn)可干擾骨橋蛋白級聯(lián)信號的候選化合物也許是一個合適的藥物靶標。
核酸分子、骨橋蛋白及其受體、抗體及其調節(jié)因子，例如本發(fā)明的激動劑和拮抗劑可被摻入適合于施用的藥物組合物。這類組合物通常含有該活性成分以及可藥用載體。如本文中所使用的，術語“可藥用載體”意在包括適合于施用的任何和所有的溶劑、分散介質、賦形劑、載體、稀釋劑、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。將這樣的介質和試劑用于醫(yī)藥活性物質的做法是本技術領域內眾所周知的。除了某些常規(guī)的介質或試劑與活性化合物不相容的情況，可考慮在組合物內使用這類介質和試劑。輔助的活性化合物也可被加入該組合物內。
本發(fā)明之藥物組合物是以適合于預定給藥途徑的方式而配制的。給藥途徑的例子包括腸胃外施用(例如靜脈內、皮內、皮下)、經口(例如吸入)、透皮(局部的)、粘膜和直腸給藥。用于腸胃外、皮內或皮下給藥的溶液或懸浮液可包括以下組分無菌稀釋劑，例如注射用水、生理鹽水、非揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如EDTA；緩沖劑，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及調節(jié)滲透壓的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。pH值可用酸或堿來調節(jié)，例如HCl或NaOH。腸胃外制劑可密封于安瓿瓶、一次性注射器，或玻璃或塑料制成的各種劑量的小瓶。
適合于注射用的藥物組合物包括用于即時制備無菌注射液或分散劑的無菌水溶液(水溶性)或分散劑以及無菌粉末。對于靜脈內施用，適合的載體包括生理鹽水，抑菌水，Cremophor EL(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物都必須無菌而且應具有一定的流動性以便于注射。它在制造和儲存條件下都必須是穩(wěn)定的，必須加以處理以抵抗微生物例如細菌和真菌的污染。其載體可以是含有例如水、乙醇、多羥基化物(例如丙三醇、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)及其適當混合物的溶劑或分散介質。為了維持適當?shù)牧鲃有裕墒褂冒?，例如卵磷脂；若在分散劑的情況下，則可通過維持所需的顆粒大小來維持流動性；以及使用表面活性劑。為了預防微生物的作用，可使用多種抗細菌劑和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，優(yōu)選是在該組合物內加入等滲劑，例如糖、甘露醇和山梨糖醇之類的多元醇、或氯化鈉。注射型組合物的延遲吸收，可通過在組合物內加入延遲吸收的試劑而實現(xiàn)，例如加入單硬酯酸鋁和明膠。
無菌可注射溶液的制備是將該活性化合物以所需的劑量且根據(jù)需要與上述一種成分或幾種成份的組合一起加入適當?shù)娜軇?，隨后進行過濾滅菌。通常，分散劑制備是將該活性化合物加入無菌載體(其含有基本的分散介質)以及所需的上述其他成份。在制備無菌注射液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是從先前滅菌過濾的溶液通過真空干燥和冷凍干燥形成活性成分與任何其他所需成份的粉末。
口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用的載體。它們可被密封在明膠膠囊內或被壓成片劑。為了口服治療的目的，活性化合物可與賦形劑一起成型并以片劑、錠劑或膠囊劑的形式使用?？诜M合物也可以用液態(tài)載體制備而作為漱口液使用，該液態(tài)載體中的化合物經口腔途徑應用，或者漱口后吐出或者咽下。
藥學上相容的粘合劑和/或佐劑材料可被加入而成為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可包含以下任何成份或性質類似的化合物粘合劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖；崩解劑，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterotes；助滑劑，例如膠狀二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或調味劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或橙色調味劑。為了以吸入方式給藥，化合物可從含有適當揮發(fā)劑(例如二氧化碳之類的氣體)的加壓容器或分配器或霧化器以氣霧劑噴霧的形式遞送。
系統(tǒng)性給藥也可通過透粘膜或透皮的方式。對于透粘膜或透皮給藥，在制劑中使用了與所滲透屏障對應的滲透劑。這樣的滲透劑在本技術領域內是眾所周知的，例如，用于粘膜給藥的滲透劑包括去污劑、膽汁鹽以及梭鏈孢酸衍生物。粘膜給藥可通過使用鼻腔噴霧或栓劑來實現(xiàn)。對于透皮給藥，如本技術領域內眾所周知的，可將活性化合物配入軟膏、藥膏、凝膠或油膏。
該化合物也可制成栓劑的形式(例如使用具潤滑材料的常規(guī)栓劑基料，其熔解溫度為哺乳動物體溫，如可可脂和其他甘油脂)，或制成灌腸劑的形式用于直腸灌腸。
在一實施方案中，該活性化合物與可防止該化合物過快地從體內排出的載體一起制成藥劑，例如控制釋放的劑型，包括植入物和微膠囊遞送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到?、生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯共聚物、聚酐、聚甘醇酸、膠原、聚原酸酯以及聚乳酸。
制備這類藥劑的方法對于熟悉本技術者將是顯而易見的。各種材料也可以通過商業(yè)途徑從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.等公司購得。脂質體懸浮液(其含有用單克隆抗體靶向被感染細胞的脂質體)也可用作為可藥用載體。這些載體可按照為熟悉本技術者已知的方法制備，例如，按照美國專利號4,522,811所述的方法制備。
為了給藥方便和劑量一致，以單位劑量的形式配制口服或注射用組合物是特別有利的。本文中所謂的單位劑量形式指的是形體上獨立的單位，適合于作為單位劑量用于所治療的對象；每個單位含有所需的醫(yī)藥載體和算出的預定活性化合物含量，以產生所希望的治療效果。取決于疾病的類型和嚴重性，給患者輸入約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1至20mg/kg)的抗體是一種可供選擇的初始劑量，無論是一次或多次地分別給藥，還是連續(xù)地輸注。典型的日劑量范圍可從約1μg/kg至100mg/kg或以上，這取決于以上提到的因素。對于幾天或更長時間的重復性給藥，根據(jù)具體情況，應維持治療直至出現(xiàn)所希望的抑制疾病癥狀的效果。但是，其他劑量的療程也可能會有效。治療的進展情況可以常規(guī)的技術和分析很容易地監(jiān)測。WO 94/04188專利披露了一示范性劑量的療程。本發(fā)明之單位劑量的規(guī)格受制于且直接依賴于該活性化合物的獨特性質和所欲達到的具體治療效果，以及這種治療用活性化合物配制技術上的固有局限性。
由于骨橋蛋白可用于治療脫髓鞘疾病，故最好是將活性成分遞送至中樞神經系統(tǒng)。因此，可使用已知的立體定位注射法將活性成分輸入脊髓液或直接輸入腦。使藥物穿越血腦屏障的方法則是眾所周知的。
本申請書中所引用的所有參考文獻均以其整體而引述在此。
對于熟悉本技術領域的人員很明顯的一點是，對本說明書所討論的內容可進行各種各樣的修改和改變而不背離本發(fā)明之精神和范圍。
權利要求
1.一種調控少突神經膠質細胞分化的方法，其包括減少少突神經膠質細胞及其前體細胞暴露于骨橋蛋白。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述減少是通過使所述少突神經膠質細胞及其前體暴露于特異結合骨橋蛋白的抗體而實現(xiàn)的。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述減少是通過滅活骨橋蛋白受體而實現(xiàn)的。
4.如權利要求3所述的方法，其中使所述受體暴露于骨橋蛋白拮抗劑。
5.如權利要求3所述的方法，其中使所述受體暴露于結合所述受體的抗體。
6.一種調控少突神經膠質細胞分化的方法，其包括調控少突神經膠質細胞或其前體細胞上骨橋蛋白受體的活性。
7.一種在需要髓鞘再生的位點處誘導髓鞘再生的方法，其包括減少少突神經膠質細胞及其前體細胞在所述位點暴露于骨橋蛋白，以增加所述位點處少突神經膠質細胞前體的數(shù)量，然后增加所述前體細胞暴露于骨橋蛋白，以促進所述前體細胞分化為少突神經膠質細胞，其中所述少突神經膠質細胞加強了髓鞘再生。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述減少是通過利用與骨橋蛋白特異結合的抗體而實現(xiàn)的。
9.如權利要求7所述的方法，其中所述減少是通過滅活骨橋蛋白受體而實現(xiàn)的。
10.如權利要求7所述的方法，該方法進一步包括使遠離所述位點的細胞暴露于骨橋蛋白，其中骨橋蛋白是一種化學趨化因子并引起響應細胞向所述位點的遷移。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述骨橋蛋白是由星形膠質細胞分泌的。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述骨橋蛋白是由暴露于骨橋蛋白激動劑的細胞表達的。
13.如權利要求10所述的方法，其中所述骨橋蛋白是由暴露于結合骨橋蛋白受體的抗體的細胞表達的。
14.獲取能誘導細胞向需要髓鞘形成的位點遷移的分子的方法，其包括使表達骨橋蛋白受體的細胞暴露于候選分子；鑒定與所述受體結合的那些候選分子；使少突神經膠質細胞的前體細胞暴露于所述經鑒定的候選分子；以及鑒定誘導所述前體細胞遷移的那些候選分子。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述能誘導遷移的分子是骨橋蛋白激動劑或反向激動劑。
16.獲取能誘導少突神經膠質細胞去分化或阻止少突神經膠質細胞前體細胞分化的分子的方法，其包括使表達骨橋蛋白受體的細胞暴露于候選分子；鑒定與所述受體結合的那些候選分子；使少突神經膠質細胞前體細胞暴露于所述經鑒定的候選分子；以及鑒定能阻止所述前體細胞分化為成熟少突神經膠質細胞的那些候選分子。
17.獲取能誘導少突神經膠質細胞去分化或阻止少突神經膠質細胞前體細胞分化的分子的方法，其包括使表達骨橋蛋白受體的細胞暴露于候選分子；鑒定與所述受體結合的那些候選分子；使少突神經膠質細胞暴露于所述經鑒定的候選分子；以及鑒定能誘導所述少突神經膠質細胞去分化的那些候選分子。
全文摘要
骨橋蛋白是少突神經膠質細胞前體細胞的標記。骨橋蛋白也調控少突神經膠質細胞分化和中樞神經系統(tǒng)的髓鞘形成。骨橋蛋白誘導少突神經膠質細胞前體的遷移。
文檔編號A61K45/00GK1662249SQ03814788
公開日2005年8月31日 申請日期2003年6月24日 優(yōu)先權日2002年6月25日
發(fā)明者J·梅里爾, 樸素芬, O·霍克瓦, 紀中啟, F·卡馬喬, S·布施, 汪敏, 陳婷, R·J·迪納斯坦, 姚正斌, 陳陽德, 張新, K·尚德羅斯, 李嵐 申請人:安萬特藥物公司