專利名稱：癌相關(guān)表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌相關(guān)表位，針對所述表位的抗體和多肽結(jié)合實體。本發(fā)明還涉及包括所述表位，抗體或結(jié)合實體的診斷試劑，并且涉及將所述表位，抗體或結(jié)合實體用于多種診斷或治療目的的用途。本發(fā)明還涉及藥用組合物，所述組合物包括表位，抗體或結(jié)合實體。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤有時候會表達特有的抗原或“標記”，這種抗原或“標記”提供了用于檢測，以及可能地治療所述癌癥的手段。例如，可以純化和制備所述腫瘤所特有的抗原，并用于制備抗體。由所述抗原產(chǎn)生的抗體可用作監(jiān)測宿主體內(nèi)腫瘤標記水平的檢測工具，以便跟蹤疾病的進程或治療效果。將抗體與毒素連接，并且用于治療癌癥。在某些場合下，可以將所述抗原用作疫苗，以便刺激癌癥患者體內(nèi)的抗體反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng)，并因此抑制所述癌的生長和擴散。
腺上皮細胞包括中間絲的網(wǎng)絡(luò)，它主要由細胞角蛋白8(K8)和細胞角蛋白18(K18)的復合物組成。所述中間絲通過形成與橋粒型的特殊細胞-細胞接觸連接的穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)，提供了對機械應(yīng)力的彈性(1)?？梢詫⒅虚g絲分成小組，它在高等真核生物中是以組織特異性和細胞類型限制形式表達的(2)。在上皮細胞中，中間絲由化學計量上相等量的I型(較小的，酸性)和II型(較大的，中性或堿性)細胞角蛋白多肽組成，由它們形成有力的相互作用的異源二聚體(3-5)。
每一種細胞角蛋白多肽由中央的300-350個氨基酸的α-螺旋桿狀結(jié)構(gòu)域組成，其旁側(cè)為具有各種長度和組成的非螺旋頭部(N-末端)和尾部(C-末端)結(jié)構(gòu)域。還可以將所述桿狀結(jié)構(gòu)域進一步細分成四個亞結(jié)構(gòu)域(1A，1B，2A和2B)，在它們中間插有短的非螺旋接頭(L1，L12，L2)。類似地，可以將所述頭部結(jié)構(gòu)域細分成三個結(jié)構(gòu)域末端結(jié)構(gòu)域(E1)，可變結(jié)構(gòu)域(V1)，和與最接近所述桿狀結(jié)構(gòu)域具有序列同源性的區(qū)(H1)(6)。
所述中間絲的組裝似乎涉及若干相關(guān)的步驟，這些步驟取決于不同結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。一般來說，I型和II型細胞角蛋白多肽是平行排列的，以便產(chǎn)生卷曲螺旋型異源二聚體(7，8)。然后，通過兩個二聚體的反向平行，交錯，并排聚合，形成了四聚體。所述四聚體頭對頭的聚合，以便形成原絲，然后，由8個原絲組合產(chǎn)生最終的10納米的絲(9)。
所述組裝的桿由2個卷曲螺旋型亞基形成了原絲主鏈結(jié)構(gòu)。不過，所述頭部和尾部結(jié)構(gòu)域不會被認為是所述絲狀主鏈的一部分。相反，所述頭部和尾部結(jié)構(gòu)域似乎是橫向突出的，并且導致了原絲和中間絲包裝。所述頭部和尾部結(jié)構(gòu)域，還可能導致了中間絲與其他細胞成分的相互作用(10-12)。因此，缺乏所述頭部和尾部結(jié)構(gòu)域的細胞角蛋白，通常能夠產(chǎn)生卷曲螺旋型和較高級別的橫向相互作用。不過，缺乏絲的伸長性(13)。
I型細胞角蛋白8(K8)和II型細胞角蛋白18(K18)是諸如腸道，肝臟和乳腺管的上皮層的簡單的或單層上皮的中間絲的主要成分(4)。這兩種細胞角蛋白形成了異原二聚體和纖絲。對K8和K18細胞角蛋白進行的缺失研究業(yè)已證實了所述頭部結(jié)構(gòu)域在形成異源二聚體和纖絲方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。共轉(zhuǎn)染頭部缺失的K8和頭部缺失的K18，導致了分散的非纖維形狀的形成，而共轉(zhuǎn)染一個無頭的和一個完整的細胞角蛋白的組合，導致了細胞質(zhì)顆?；蛟w維的形成(12)。更詳細的分析表明，在通過缺失每一種細胞角蛋白的前66個氨基酸對K8和K18進行N-末端截短時，僅僅產(chǎn)生了短的和不規(guī)則的中間絲(13)。完整的，或幾乎完整的所述頭部結(jié)構(gòu)域的H1區(qū)，是產(chǎn)生所述短絲所必需的。在進一步去掉H1結(jié)構(gòu)域的主要部分，以便在截短的K8(75-483號氨基酸)和K截短的18(67-385號氨基酸)之間形成復合物時，只形成了四聚體。H1區(qū)的重要性，顯然與它參與兩種異源二聚體的排列相關(guān)，并且與所形成的異源四聚體復合物的穩(wěn)定化相關(guān)。
K8和K18的確切功能在很大程度上尚屬未知，不過，最新的資料表明，這兩種細胞角蛋白在天然發(fā)育中是重要的。以顯性性狀在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達的K18的突變體(arg89cys)，導致了肝臟和胰腺中間絲網(wǎng)絡(luò)的明顯破壞，導致了肝細胞不穩(wěn)定性，以及相關(guān)的肝臟炎癥和壞死(14，15)。K8或K19剔除小鼠的表型，包括完全或部分妊娠中期胚胎致死，這取決于存活動物的遺傳學背景，雌性不育性以及成體結(jié)腸直腸增生(16-18)。其他資料業(yè)已表明，K8/K18絲在多種藥物抗性中發(fā)揮作用(19-21)。
在細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)育期間，K8和K18的細胞類型特異性得到保留，使得可以將它們用作組織類型鑒定的臨床組織病理學標記(22-24)。假設(shè)K8和K18的細胞類型特異性在細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)育期間是保守的，人們不能期望K8和K18細胞角蛋白能在癌細胞中表現(xiàn)出新的抗原性表位。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了包括兩種獨立多肽的分離的癌相關(guān)表位。第一種多肽可以具有細胞角蛋白8的SEQ ID NO3，而第二種多肽可以具有細胞角蛋白18的SEQ ID NO4。另外，第一種多肽可以具有細胞角蛋白8的SEQ ID NO5，而第二種多肽可以具有細胞角蛋白18的SEQ IDNO6。另外，第一種多肽可以具有細胞角蛋白8的SEQ ID NO3，而第二種多肽可以具有細胞角蛋白18的SEQ ID NO6。第一種多肽還可以具有細胞角蛋白8的SEQ ID NO5，而第二種多肽可以具有細胞角蛋白18的SEQ ID NO4。
所述分離的表位可以在腺癌細胞的絲狀細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)中檢測到，不過，在正常細胞中基本不能檢測到?？梢詸z測到所述表位的腺癌的例子包括結(jié)腸腺癌，卵巢腺癌，腎臟腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原細胞瘤睪丸癌細胞?？梢詫⑺霰砦挥糜谥苽浒┨禺愋钥贵w，并且用于通過檢測癌癥患者的血液，血清，糞便或尿液中的所述抗原表位或針對所述表位的抗體診斷癌癥。因此，在一種實施方案中，所述表位是在試劑盒中提供的。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合本發(fā)明的任何癌相關(guān)表位的抗體或其他結(jié)合實體。在一種實施方案中，所述抗體或結(jié)合實體，可以包括含有SEQ ID NO7-35中任意一個的多肽。優(yōu)選的抗體或結(jié)合實體，包括含有SEQ ID NO21-35中任意一個的或它們的組合的多肽。在另一種實施方案中，本發(fā)明涉及含有SEQ ID NO7-33的任意組合的多肽，其中，所述多肽可以結(jié)合本發(fā)明的表位。所述抗體或結(jié)合實體，能夠由含有SEQ ID NO36-39中任意一項的核酸編碼。所述結(jié)合實體或抗體能夠檢測結(jié)腸腺癌，卵巢腺癌，腎臟腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原細胞瘤睪丸癌細胞中的絲狀細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)中的癌相關(guān)表位。所述抗體或結(jié)合實體可以具有與它連接的標記或診斷顯像制劑，本發(fā)明還提供了含有所述結(jié)合實體或抗體的組合物和試劑盒。在使用抗體時，所述抗體優(yōu)選不是COU-1單克隆抗體。
本發(fā)明還提供了檢測腺癌的方法，包括讓本發(fā)明的抗體或結(jié)合實體與測試樣品接觸，并且檢測所述抗體或結(jié)合實體是否與癌相關(guān)表位結(jié)合。所述抗體和結(jié)合實體可以具有與它連接的標記或診斷顯像試劑。
本發(fā)明還提供了通過施用能夠與所述癌相關(guān)表位結(jié)合的治療有效量的本發(fā)明的抗體或結(jié)合實體治療哺乳動物癌癥的方法。所述抗體或結(jié)合實體，可以具有與它連接的可用于治療的試劑。
本發(fā)明還提供了治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的癌相關(guān)表位。
本發(fā)明還提供了治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的蛋白酶抑制劑，它能通過抑制裂解細胞角蛋白8和細胞角蛋白18的蛋白酶，抑制本發(fā)明癌相關(guān)表位的形成。在一種實施方案中，所述蛋白酶是胰蛋白酶樣蛋白酶，而所述抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑或胰蛋白酶抑制劑。
本發(fā)明還提供了鑒定突變型抗體的方法，包括將編碼具有SEQ IDNO7-35中任意一個的多肽的核酸與編碼噬菌體外被蛋白的核酸融合，以便制備編碼融合蛋白的重組核酸；使編碼所述融合蛋白的重組核酸突變，以便制備編碼所述突變型融合蛋白的突變核酸；在噬菌體表面上表達所述突變型融合蛋白，并且，選擇與本發(fā)明的癌相關(guān)表位結(jié)合的噬菌體。
附圖的說明

圖1表示從結(jié)腸癌組織中純化細胞角蛋白。
圖1A提供了細胞角蛋白富集材料的洗脫曲線(OD280，實線)，將所述材料加樣到裝有含有SDS緩沖液的QFF陰離子交換柱(100-ml床體積)上，并且，用高達1M NaCl的線性梯度洗脫(短劃線)。在所述鹽梯度的第一個和第二個峰中，觀察到了含有COU-1反應(yīng)性的級份。
圖1B提供了圖1A所示洗脫曲線的一部分的放大示意圖。該放大的曲線提供了各個級份(30-53)的OD280吸收(實線)，鹽梯度(短劃線)和COU-1反應(yīng)性(點線)的比較。將所述級份包衣到ELISA孔上，并且與COU-1抗體起反應(yīng)。
圖1C提供了來自級份41-50，原始勻漿物(H)和加樣到QFF陰離子交換柱(S)上的級份的電泳分離的蛋白的考馬斯染色印跡。包括結(jié)腸癌細胞系Colon137(C137)的提取物作為對照。
圖1D提供了來自級份41-50，原始勻漿物(H)和加樣到QFF陰離子交換柱(S)上的材料的電泳分離的蛋白的Western印跡(用COU-1染色)。包括結(jié)腸癌細胞系Colon137(C137)的提取物作為對照。該印跡說明了通過QFF柱獲得的細胞角蛋白的純度，以及COU-1抗體與分子量為42-46kDa的3個條帶的反應(yīng)性。
圖2提供了由結(jié)腸癌組織純化的或在相同條件下由正常結(jié)腸上皮純化的細胞角蛋白制劑的Western印跡分析。以10倍的稀釋比例(1∶1，1∶10，1∶100)將勻漿物(homog)和陰離子交換層析純化的材料(QFF)加樣到SDS-PAGE凝膠上。將所述蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并且，用COU-1或鼠抗-K18 Mab染色。盡管抗-K18抗體能對來自正常和惡性腫瘤結(jié)腸上皮的細胞角蛋白制劑強烈染色，但COU-1只能對來自癌組織的細胞角蛋白強烈染色(大約42-46kDa的三條帶)，而不能對來自正常上皮的細胞角蛋白染色。
圖3表示從結(jié)腸癌組織中純化的細胞角蛋白的SDS-PAGE分離和N-末端測序，并且進一步說明了N-末端-截短的K8，K18和K19細胞角蛋白在結(jié)腸癌組織中的存在。
圖3A是SDS-PAGE-分離的純化細胞角蛋白的PVDF膜印跡。該膜的區(qū)域(a)是用考馬斯染色的。所述膜的條還用COU-1抗體(b區(qū))，小鼠抗-K8抗體(c區(qū))和小鼠抗-K18抗體(d區(qū))染色。以上數(shù)據(jù)表明，可以檢測到10條不同的蛋白帶(1-10)。分別對這10條帶進行N-末端測序。
圖3B提供了從結(jié)腸癌組織中分離的細胞角蛋白的氨基酸序列，該序列是通過N-末端測序測定的(SEQ ID NOs54-61)。另外，示出了具有一組K8/K18抗體的不同的分離的細胞角蛋白的反應(yīng)性。
圖4提供了K8和K18細胞角蛋白的結(jié)構(gòu)域的圖譜(中央)。所述細胞角蛋白多肽的二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域，是通過氨基酸序列鑒定的。示出了中央桿狀結(jié)構(gòu)域，其旁側(cè)為非螺旋N-末端頭部結(jié)構(gòu)域和非-螺旋C末端尾部結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域1A，1B，2A和2B是由接頭L1，L12和L2間隔的桿的α螺旋亞結(jié)構(gòu)域。該附圖還提供了K8和K18 N-末端和C-末端缺失蛋白的示意性說明。缺失蛋白名稱提供了所述缺失蛋白的起始和終止氨基酸殘基編號。所有缺失蛋白是以GST融合蛋白形式表達的。在括號中示出了在與互補的角蛋白溫育之后，缺失蛋白片段與COU-1的陽性(+)和陰性(-)反應(yīng)性。
圖5提供了一組C-末端缺失的K18片段的Western印跡分析。含有以GST融合蛋白形式表達的一組C-末端缺失的K18片段的SDS-PAGE凝膠進行平行電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用山羊抗-GST抗體(A)，COU-1(B)或小鼠抗-K18抗體(CY-90)(D)染色。
圖5A是以GST融合蛋白形式表達的一組電泳分離的C-末端缺失的K18蛋白片段的Western印跡，它是用山羊抗-GST抗體染色的。在頂部提供了不同K18蛋白片段的身份，其中，數(shù)字表示在不同的K18蛋白片段中存在哪些氨基酸。將GST蛋白制劑用作GST抗體染色的陽性對照。將MCF7癌細胞裂解物用作細胞角蛋白表位的陽性對照(看不到染色，因為在所述裂解物中不存在GST蛋白)。所述GST抗體染色表明，所有K18片段表達良好，并且，以大致相同的水平表達。
圖5B是在圖5A中提供的一組通過電泳分離的C-末端缺失的K18片段的Western印跡的復制件，它是用COU-1抗體染色的。在該印跡上，COU-1只能與用作陽性對照的MCF7癌細胞裂解物起反應(yīng)。沒有觀察到COU-1與每一種K18片段的明顯結(jié)合。
圖5C是在圖5A中提供的一組通過電泳分離的C-末端缺失的K18片段的Western印跡的復制件。不過，在對COU-1染色之前將該印跡與純化的完整的K8一起溫育。在與K8復合之后，COU-1能有效結(jié)合某些K18片段。
圖5D是圖5A中提供的一組通過電泳分離的C-末端缺失的K18片段的Western印跡的復制件，它是用小鼠抗-K18抗體(CY-90)染色的。所述CY-90抗體能與相當于非復合的K18的C-末端部分的340-390號殘基的表位起反應(yīng)。
圖6提供了一組C-末端缺失的K18片段的SDS-PAGE和Western印跡分析。SDS-PAGE凝膠含有一組以GST融合蛋白形式表達的C-末端缺失的K8片段，這些凝膠是平行電泳的，并且用考馬斯藍染色(A)，或者轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并且用COU-1染色(B)，或在染色HMab COU-1之前，與純化的完整K18一起溫育(C)。
圖6A是用考馬斯藍染色的一組電泳分離的C-末端缺失的K18片段的SDS-PAGE凝膠。在頂部提供了不同K8蛋白片段的身份，其中，數(shù)字表示存在于不同K18蛋白片段上的氨基酸的范圍?？捡R斯藍染色證實了所有片段是以大致相同的良好水平表達的。
圖6B是圖6A中所提供的一組通過電泳分離的C-末端缺失的K8片段的Western印跡的復制件，它是用COU-1抗體染色的。沒有觀察到COU-1與單獨的K8片段的結(jié)合。在該印跡上，COU-1只能與所述陽性對照-MCF7癌細胞裂解物起反應(yīng)。
圖6C是圖6A中所提供的一組通過電泳分離的C-末端缺失的K8片段的Western印跡的復制件，在對HMab COU-1染色之前，與純化的完整K18一起溫育。COU-1能有效結(jié)合K8片段，因為此時它們業(yè)已與K18形成了復合物。
圖7提供了在用COU-1染色前通過電泳分離的，并且轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的，然后與不同的純化的C-末端缺失的K8或K18片段一起溫育以便形成K8/K18復合物的一組C-末端缺失的K8或K18片段的Western印跡分析。
圖7A提供了通過電泳分離的，并且轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的一組C-末端缺失的K18(1-72)，K18(1-124)，K18(1-187)和完整K18蛋白片段的Western印跡。然后將所述膜與純化的C-末端缺失的K8(1-129)片段一起溫育，并且用COU-1染色，所述COU-1抗體能強有力地結(jié)合K18(1-124)/K8(1-129)復合物。
圖7B是圖7A中所提供的一組通過電泳分離的C-末端缺失的K18片段的Western印跡，將該印跡與純化的C-末端缺失的K8(1-233)片段一起溫育，并且用COU-1染色。對于K18(1-187)/K8(1-233)復合物來說，缺少COU-1染色，或者只能看到微弱的染色。
圖7C是在圖7A中提供的一組通過電泳分離的C-末端缺失的K18片段的Western印跡的復制件，將它與純化的完整K8一起溫育，并且用COU-1染色。對于K18(1-187)/完整的K8復合物來說，缺少COU-1染色，或只能觀察到微弱的染色。
圖7D提供了通過電泳分離，并且轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的一組C-末端缺失的K18(1-85)，K8(1-129)，K8(1-233)和完整的K8多肽的Western印跡。然后將所述膜與純化的K8(1-124)一起溫育，并且用COU-1染色。COU-1抗體能識別與K18(1-124)復合的K8(1-129)，以及與K18(1-124)復合的K8(1-233)。對于含有K8(1-85)的復合物來說，沒有觀察到COU-1結(jié)合。
圖7E是在圖7D中提供的一組通過電泳分離的C-末端缺失的K8片段的Western印跡的復制件，將它與純化的K18(1-187)一起溫育，并且用COU-1染色。所述COU-1抗體能識別與K18(1-187)復合的K8(1-129)，以及與K18(1-187)復合的K8(1-233)。對于任何含有K8(1-85)的所有復合物來說，都沒有觀察到COU-1結(jié)合。
圖7F是在圖7D中提供的一組通過電泳分離的C-末端缺失的K8片段的復制件，將它與純化的K18(1-213)一起溫育，并且用COU-1染色。所述COU-1抗體能識別與K8(1-129)復合的K18(1-213)，以及與K8(1-233)K18(1-187)復合的K18(1-213)。對于所有含有K8(1-85)的復合物來說，都沒有觀察到COU-1結(jié)合。
圖8提供了K8/K18異型復合物的N-末端頭部結(jié)構(gòu)域和相鄰的桿狀結(jié)構(gòu)域的示意圖。
圖8A確定了K8(SEQ ID NO62)和K18(SEQ ID NO63)被蛋白裂解的位點(箭頭)。對于細胞角蛋白K8來說，裂解是在Arg-22之后，在Arg-39之后，在Val-65之后，以及在Leu-75之后。對于細胞角蛋白K18來說，裂解是在Arg-49之后，以及在Ile-67之后。還示出了翻譯后磷酸化(PO4，P)或糖基化(GlcNac，G)殘基的位置。
圖8B是說明如何裂解K8和K18細胞角蛋白的N-末端頭部結(jié)構(gòu)域能夠?qū)е聵?gòu)像變化，以便使得COU-1抗體能夠接觸所述表位的示意圖。該示意圖與在體內(nèi)在癌細胞中進行的觀察，以及對重組K8/K18復合物的形成進行的觀察吻合。該示意圖還說明了如何體外缺失兩種細胞角蛋白之一的C-末端結(jié)構(gòu)域的主要部分也能夠人工暴露COU-1表位。該示意圖還與對一組重組K8/K18缺失蛋白進行的復合物形成研究吻合。
圖9表示COU-1優(yōu)先與含有N-末端缺失的K8片段的異型的復合物結(jié)合。該附圖提供了SDS-PAGE-分離的K8和K18蛋白的PVDF膜印跡。A區(qū)具有在用COU-1染色前通過電泳分離，然后與純化的K18(50-430)起反應(yīng)的完整的K8或K8(66-483)蛋白。B區(qū)具有在用COU-1染色之前，與純化的完整的K18一起溫育的完整的K8或K8(66-483)蛋白。C區(qū)具有在用COU-1染色之前通過電泳分離的，與純化的K8(66-483)一起溫育的K18(50-430)和完整的K18。在含有K8(66-483)/K18(50-430)和K8(66-483)/完整的K18的泳道中，觀察到了COU-1強有力染色的大約75kDa的帶(K8/K18蛋白+GST融合蛋白)。D區(qū)具有在用COU-1染色之前，通過電泳分離的，并且與純化的完整K8一起溫育的K18(50-430)和完整的K18蛋白。對于完整的K8/K18(50-430)和完整的K8/完整的K18來說，只觀察到了微弱的染色。
圖10表示通過ELISA測定的COU-1能優(yōu)先結(jié)合截短形式的重組異型K8/K18復合物。異型的復合物，是通過將純化的重組K8(1-129)或完整的K8與純化的重組K18(1-124)或完整的K18以相等的摩爾比組合制備的。將該復合物的5μg/ml溶液用于對ELISA平板進行包衣。以系列稀釋的形式，將ELISA平板與COU-1一起溫育。檢測結(jié)合的COU-1，并且通過AP-標記的二級抗人κ抗體和對硝基苯磷酸觀察。如圖所示，K8(1-129)/完整的K18復合物(菱形符號)和K8/K18(1-124)(圓形)，能比完整的K8/完整的K18復合物結(jié)合更多的COU-1抗體。
圖11表示N-末端-截短的K8/K18復合物(A和E)和K18(B和F)在乳腺癌細胞中的分布。將乙醇固定的MCF7乳腺癌細胞分別與COU-1抗體(A和E)和CY90單克隆抗體(B和F)一起溫育，所述抗體能結(jié)合完整的K18。用FITC-山羊抗人γ-鏈抗體檢測結(jié)合的COU-1(綠色)，并且用德克薩斯紅-山羊抗-小鼠IgG抗體檢測結(jié)合的CY90(紅色)。包括DIC圖象(D和H)，以便觀察所述細胞的組成。在兩種抗體之間觀察到了部分共同定位，它是通過融合的圖象中的黃色所表現(xiàn)的(C和G)，不過，N末端截短的K8/K18復合物，主要存在于新形成的增殖的癌細胞中(箭頭)，而K18結(jié)構(gòu)等同地存在于所有細胞中(箭頭端頭)。
圖12表示由COU-1識別的N-末端截短的K8/K18復合物(A和E)以及由Mab CY-90識別的K18(B和F)在乳腺癌細胞中的細胞分布。按圖11所述對MCF7乳腺癌細胞進行處理和染色。包括DIC圖象(D和H)，以便顯示所述細胞的組成。盡管整個中間絲是由Mab CY-90染色的(箭頭端頭)，COU-1(箭頭)只能對短的原纖維和球狀結(jié)構(gòu)染色。觀察到了兩種抗體的共同定位，正如通過融合的圖象中的黃色所表現(xiàn)的(C和G)。
圖13提供了人單克隆抗體COU-1的可變重鏈和輕鏈的氨基酸序列，與最密切相關(guān)的種系序列進行比較(SEQ ID NOs7-20)。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，獨立的K8細胞角蛋白多肽能與K18細胞角蛋白多肽結(jié)合，以便形成僅存在于癌細胞中，而不存在于正常細胞中的抗原表位。所述腫瘤表位，是通過對癌細胞中的K8/K18復合物的特異性蛋白裂解產(chǎn)生的。將出現(xiàn)在癌細胞中的所述新的表位用于制備抗體或結(jié)合實體，可將它用于診斷癌癥，并且用于治療癌癥患者。
定義術(shù)語“抗體”是以最廣義的含義使用的，并且具體涵蓋單克隆抗體(包括完整長度的單克隆抗體)，多克隆抗體，多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段(例如，F(xiàn)ab，F(xiàn)(ab′)2和Fv)，只要它們具有需要的生物學活性就行。
本文所使用的術(shù)語“結(jié)合實體”，是能結(jié)合通過本發(fā)明鑒定的表位的多肽。例如，本發(fā)明的結(jié)合實體是能結(jié)合包括兩種獨立的多肽，細胞角蛋白8多肽和細胞角蛋白18多肽的表位的多肽，其中，細胞角蛋白8多肽包括SEQ ID NO3或SEQ ID NO5，而細胞角蛋白18多肽包括SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
術(shù)語“癌”或“癌的”表示或描述哺乳動物的生理學狀態(tài)，它通常以失控的細胞生長為特征。所述癌的例子包括，但不局限于癌腫，淋巴瘤，胚細胞瘤，肉瘤和白血病。所述癌癥的更具體的例子包括結(jié)腸腺癌，卵巢腺癌，腎臟腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原細胞瘤睪丸癌組織。
所述COU-1抗體是通過人雜交瘤細胞系B9165(ECACC 87040201)生產(chǎn)的單克隆抗體。它能夠與癌相關(guān)抗原結(jié)合，所述癌相關(guān)抗原表觀分子量為大約43,000，而等電點在大約5.4-6.2的范圍內(nèi)。
短語“控制序列”表示在特定宿主生物中可操作地連接的編碼序列表達所必需的DNA序列。例如，所述適用于原核生物的所述控制序列包括啟動子，任選地包括操縱子序列，以及核糖體結(jié)合位點。已知真核細胞利用啟動子，聚腺苷酸化信號和增強子。
參考抗原表位，抗體，核酸，蛋白，多肽或肽的“衍生物”具有相關(guān)的，但是不同于各自相應(yīng)的參考抗原表位，抗體，核酸，蛋白，多肽或肽的序列或化學結(jié)構(gòu)。所述衍生的抗原表位，抗體，核酸，蛋白，多肽或肽，通常是專門制備的，以便增強或整合在所述參考抗原性表位，抗體，核酸，蛋白，多肽或肽中不存在或只能微弱存在的某些化學，物理學或功能特性。衍生的核酸的核苷酸序列與參考核酸不同，而衍生的抗原表位，抗體，核酸，蛋白，多肽或肽分別與參考抗原表位，抗體，核酸，蛋白，多肽或肽的氨基酸序列不同。所述序列差異包括一種或多種取代，插入，添加，缺失，融合和截短，所述差異能夠以任何組合形式存在。差異可能微小(例如一個核苷酸或氨基酸的差異)，或更明顯，涉及到若干個或多個核苷酸或氨基酸。不過，所述衍生物的序列與所述參考序列沒有這么大的差異，以至本領(lǐng)域技術(shù)人員不會認為所述衍生物和參照物在結(jié)構(gòu)和/或功能方面相關(guān)。一般來說，差異是有限的，因此，所述參照物和衍生物在總體上是非常類似的，并且在很多區(qū)域是相同的?！白凅w”與“衍生的”核酸，蛋白，多肽或肽的差別在于，所述變體可以具有沉默的結(jié)構(gòu)差異，所述差異不會明顯改變所述參考核酸，蛋白，多肽或肽的化學，物理學或功能特性。相反，參照物和衍生的核酸，蛋白，多肽或肽之間的差別是為了改善所述參考核酸，蛋白，多肽或肽的一種或多種化學，物理學或功能特性而有意引入的改變。
術(shù)語“相同性”或“同源性”應(yīng)當被理解成在對所述序列進行比對，并且在必要時引入缺口以便獲得完整序列的最大百分相同性，并且沒有將任何保守性取代視為所述序列相同性的一部分之后，表示候選序列上的氨基酸殘基與比對的相應(yīng)序列的殘基的相同的百分比。N-或C-末端延伸或插入，都不被認為會降低相同性或同源性。用于比對的方法和計算機程序為本領(lǐng)域所熟知。序列相同性可以用序列分析軟件測定(例如，序列分析軟件包，Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 UniversityAve.，Madison，Wis.53705)。該軟件通過確定各種取代，缺失和其他修飾的同源性程度，使類似的序列匹配。
“脂質(zhì)體”是用于給哺乳動物輸送藥物(如本文所披露的抗原性表位和抗體突變體，以及任選地化療制劑)的由各種類型脂類，磷脂，和/或表面活性劑組成的小泡。脂質(zhì)體的成分通常是以雙層形式排列的，類似于生物學膜的脂類排列。
“哺乳動物”表示被劃分為哺乳動物的任何動物，包括人，家畜和農(nóng)畜，非人靈長類，和動物園動物，體育動物或?qū)櫸?，如狗，馬，貓，牛等。
當核酸與另一種核酸序列形成功能性關(guān)系時，它就是“可操作地連接的”。它可以是以這種方式連接的基因和調(diào)控序列，使得當合適的分子(例如，轉(zhuǎn)錄激活蛋白)與所述調(diào)控序列結(jié)合時，可以進行基因表達。例如，編碼前導序列或分泌前導序列的DNA可操作地與編碼多肽的DNA連接，如果所述多肽是以參與所述多肽分泌的前蛋白形式表達的話；啟動子或增強子可操作地與編碼序列連接，如果它影響所述序列的轉(zhuǎn)錄的話；或核糖體結(jié)合位點可操作地與編碼序列連接，如果它影響所述序列的轉(zhuǎn)錄的話；或核糖體結(jié)合位點可操作地與編碼序列連接，如果它的定位有利于翻譯的話。一般來說，“可操作地連接”表示被連接的DNA序列是連續(xù)的，對于分泌前導序列來說是連續(xù)的并且在閱讀相。不過，增強子不一定是連續(xù)的。連接是通過在常見的限制位點上連接實現(xiàn)的。如果不存在所述位點的話，所述合成的寡核苷酸連接物或接頭是按照常規(guī)操作使用的。
術(shù)語“蛋白”，“多肽”和“肽”是被交換使用的。它們表示通過肽或酰胺鍵連接在一起的兩個(2)或兩個以上氨基酸的鏈，與翻譯后修飾(例如糖基化或磷酸化)無關(guān)?？乖砦缓涂贵w被專門用于本定義的范圍內(nèi)。本發(fā)明的多肽可以包括一個以上亞基，其中，每一個亞基是由獨立的DNA序列編碼的。
與抗原，抗體或結(jié)合實體多肽序列相關(guān)的短語“大體上相同的”，應(yīng)當被理解成與參考多肽序列具有至少70％，優(yōu)選75％，更優(yōu)選80％，更優(yōu)選85％，更優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％，特別優(yōu)選97％或98％的序列相同性的多肽。對于多肽來說，所述比對序列的長度，通常至少為25個氨基酸。對于核酸來說，所述長度通常為至少75個核苷酸。
參考抗原性表位，抗體片段，結(jié)合實體，核酸，蛋白，多肽或肽的“變體”分別是具有與相應(yīng)的參考抗原性表位，抗體片段，結(jié)合實體，核酸，蛋白，多肽或肽相關(guān)，但是不同的序列的抗原性表位，抗體片段，結(jié)合實體，核酸，蛋白，多肽或肽。變體和參考抗原性表位，抗體片段，結(jié)合實體，核酸，蛋白，多肽或肽之間的差異是沉默的或保守性差異。變體核酸在核苷酸序列上與參考核酸不同，而變體抗原性表位，抗體片段，結(jié)合實體，蛋白，多肽或肽在氨基酸序列上分別與所述參考抗原性表位，抗體片段，結(jié)合實體，蛋白，多肽或肽不同。變體和參考抗原性表位，抗體片段，結(jié)合實體，核酸，蛋白，多肽或肽可能在序列上存在一個或多個取代，插入，添加，缺失，融合和截短的差異，這些差異能夠以任何組合形式出現(xiàn)。差異可能微小(例如，一個核苷酸或氨基酸的差異)，或更明顯。不過，所述變體的結(jié)構(gòu)和功能與所述參照物的差別，沒有大到使本領(lǐng)域技術(shù)人員不會認為所述變體和參照物在結(jié)構(gòu)和/或功能方面是相關(guān)的程度。一般來說，差異是有限的，以便所述參照物和變體總體上非常類似的，并且在很多區(qū)域是相同的。
表位根據(jù)本發(fā)明，通過對細胞角蛋白K8和細胞角蛋白K18蛋白的特異性蛋白水解裂解，在多種腺癌細胞中產(chǎn)生了一種或多種可以免疫學識別的新型表位，正常的，非癌細胞不具有所述新型表位。細胞角蛋白K8和細胞角蛋白K18蛋白是不同的蛋白。不過，它們能形成細胞角蛋白K8/細胞角蛋白K18復合物。所述可以免疫學識別的新型表位，包括來自細胞角蛋白K8和細胞角蛋白K18蛋白的氨基酸。
本發(fā)明的表位基本上不存在于正常組織中。不過，所述表位在結(jié)腸腺癌，卵巢腺癌，腎臟腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原細胞瘤睪丸癌組織中會變得暴露。在增殖期間，本發(fā)明的表位主要存在于所述細胞類型的絲狀細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)中。測試表明，所述表位在某些肉瘤，惡性黑素瘤，B-淋巴瘤或胸腺瘤中檢測不到。
下面提供了人細胞角蛋白K8的序列(SEQ ID NO1)。
1 SIRVTQKSYK VSTSGPRAFS SRSYTSGPGS RISSSSFSRV41 GSSNFRGGLG GGYGGASGMG GITAVTVNQS LLSPLSLEVD81 PNIQAVRTQE KEQIKTLNNK FASFIDKVRF LEQQNKMLET121 KWSLLQQQKT ARSNMDNMFE SYINNLRRQL ETLGQEKLKL161 EAELGNMQGL VEDFKNKYED EINKRTEMEN EFVLIKKDVD201 EAYMNKVELE SRLEGLTDEI NFLRQLYEEE IRELQSQISD241 TSVVLSMDNS RSLDMESIIA EVKAQYEDIA NRSRAEAESM281 YQIKYEELQS LAGKHGDDLR RTKTEISEMN RNISRLQAEI321 EGLKGQRASL EAAIADAEQR GELAIKDANA KLSELEAALQ361 RAKQDMARQL REYQELMNVK LALDIDIATY RKLLEGEESP401 LESGMQNMSI HTKTTGGYAG GLSSAYGDLT DPGLSYSLGS441 SFGSGAGSSS FSRTSSSRAV VVKKIETRDG KLVSESSDVL481 PK下面提供了人細胞角蛋白K8的核苷酸序列(SEQ ID NO45)。
1 TTCGGCAATT CCTACCTCCA CTCCTGCCTC CACCATGTCC41 ATCAGGGTGA CCCAGAAGTC CTACAAGGTG TCCACCTCTG81 GCCCCCGGGC CTTCAGCAGC CGCTCCTACA CGAGTGGGCC121 CGGTTCCCGC ATCAGCTCCT CGAGCTTCTC CCGAGTGGGC161 AGCAGCAACT TTCGCGGTGG CCTGGGCGGC GGCTATGGTG201 GGGCCAGCGG CATGGGAGGC ATCACCGCAG TTACGGTCAA241 CCAGAGCCTG CTGAGCCCCT TGTCCCTGGA GGTGGACCCC281 AACATCCAGG CCGTGCGCAC CCAGGAGAAG GAGCAGATCA321 AGACCCTGAA CAACAAGTTT GCCTCCTTCA TAGACAAGGT361 ACGGTTCCTG GAGCAGCAGA ACAAGATGCT GGAGACCAAG401 TGGAGCCTCC TGCAGCAGCA GAAGACGGCT CGAAGCAACA441 TGGACAACAT GTTCGAGAGC TACATCAACA ACCTTAGGCG481 GCAGCTGGAG ACTCTGGGCC AGGAGAAGCT GAAGCTGGAG521 GCGGAGCTTG GCAACATGCA GGGGCTGGTG GAGGACTTCA541 AGAACAAGTA TGAGGATGAG ATCAATAAGC GTACAGAGAT601 GGAGAACGAA TTTGTCCTCA TCAAGAAGGA TGTGGATGAA641 GCATACATGA ACAAGGTAGA GCTGGAGTCT CGCCTGGAAG681 GGCTGACCGA CGAGATCAAC TTCCTCAGGC AGCTGTATGA721 AGAGGAGATC CGGGAGCTGC AGTCCCAGAT CTCGGACACA761 TCTGTGGTGC TGTCCATGGA CAACAGCCGC TCCCTGGACA801 TGGAGAGCAT CATTGCTGAG GTCAAGGCAC AGTACGAGGA841 TATTGCCAAC CGCAGCCGGG CTGAGGCTGA GAGCATGTAC881 CAGATCAAGT ATGAGGAGCT GCAGAGCCTG GCTGGGAAGC921 ACGGGGATGA CCTGCGGCGC ACAAAGACTG AGATCTCAGA961 GATGAACCGG AACATCAGCC GGCTCCAGGC TGAGATTGAG
1001 GGCCTCAAAG GCCAGAGGGC TTCCCTGGAG GCCGCCATTG1041 CAGATGCCGA GCAGCGTGGA GAGCTGGCCA TTAAGGATGC1081 CAACGCCAAG TTGTCCGAGC TGGAGGCCGC CCTGCAGCGG1121 GCCAAGCAGG ACATGGCCCG GCAGCTGCGT GAGTACCAGG1161 AGCTGATGAA CGTCAAGCTG GCCCTGGACA TCGACATCGC1201 CACCTACAGG AAGCTGCTGG AGGGCGAGGA GAGCCCGCTG1241 GAGTCTGGGA TGCAGAACAT GAGTATTCAT ACGAAGACCA1281 CCGGCGGCTA TGCGGGTGGT TTGAGCTCGG CCTATGGGGA1321 CCTCACAGAC CCCGGCCTCA GCTACAGCCT GGGCTCCAGC1361 TTTGGCTCTG GCGCGGGCTC CAGCTCCTTC AGCCGCACCA1401 GCTCCTCCAG GGCCGTGGTT GTGAAGAAGA TCGAGACACG1441 TGATGGGAAG CTGGTGTCTG AGTCCTCTGA CGTCCTGCCC1481 AAGTGAACAG CTGCGGCAGC CCCTCCCAGC CTACCCCTCC1521 TGCGCTGCCC CAGAGCCTGG GAAGGAGGCC GCTATGCAGG1561 GTAGCACTGG GAACAGGAGA CCCACCTGAG GCTCAGCCCT1601 AGCCCTCAGC CCACCTGGGG AGTTTACTAC CTGGGGACCC1641 CCCTTGCCCA TGCCTCCAGC TACAAAACAA TTCAATTGCT1681 TTTTTTTTTT TTGGTCCCAA AATAAAACCT CAGCTAGCTC1721 TGCC下面提供了人細胞角蛋白K18的序列(SEQ ID NO2)。
1 SFTTRSTFST NYRSLGSVQA PSYGARPVSS AASVYAGAGG41 SGSRISVSRS TSFRGGMGSG GLATGIAGGL AGMGGIQNEK81 ETMQSLNDRL ASYLDRVRSL ETENRRLESK IREHLEKKGP121 QVRDWSHYFK IIEDLRAQIF ANTVDNARIV LQIDNARLAA161 DDFRVKYETE LAMRQSVEND IHGLRKVIDD TNITRLQLET201 EIEALKEELL FMKKNHEEEV KGLQAQIASS GLTVEVDAPK241 SQDLAKIMAD IRAQYDELAR KNREELDKYW SQQIEESTTV281 VTTQSAEVGA AETTLTELRR TVQSLEIDLD SMRNLKASLE321 NSLREVEARY ALQMEQLNGI LLHLESELAQ TRAEGQRQAQ361 EYEALLNIKV KLEAEIATYR RLLEDGEDFN LGDALDSSNS401 MQTIQKTTTR RIVDGKVVSE TNDTKVLRH下面提供了人細胞角蛋白K18的核苷酸序列(SEQ ID NO46)。
1 CGGGGTCGTC CGCAAAGCCT GAGTCCTGTC CTTTCTCTCT41 CCCCGGACAG CATGAGCTTC ACCACTCGCT CCACCTTCTC81 CACCAACTAC CGGTCCCTGG GCTCTGTCCA GGCGCCCAGC121 TACGGCGCCC GGCCGGTCAG CAGCGCGGCC AGCGTCTATG161 CAGGCGCTGG GGGCTCTGGT TCCCGGATCT CCGTGTCCCG201 CTCCACCAGC TTCAGGGGCG GCATGGGGTC CGGGGGCCTG241 GCCACCGGGA TAGCCGGGGG TCTGGCAGGA ATGGGAGGCA281 TCCAGAACGA GAAGGAGACC ATGCAAAGCC TGAACGACCG321 CCTGGCCTCT TACCTGGACA GAGTGAGGAG CCTGGAGACC361 GAGAACCGGA GGCTGGAGAG CAAAATCCGG GAGCACTTGG401 AGAAGAAGGG ACCCCAGGTC AGAGACTGGA GCCATTACTT
441 CAAGATCATC GAGGACCTGA GGGCTCAGAT CTTCGCAAAT481 ACTGTGGACA ATGCCCGCAT CGTTCTGCAG ATTGACAATG521 CCCGTCTTGC TGCTGATGAC TTTAGAGTCA AGTATGAGAC561 AGAGCTGGCC ATGCGCCAGT CTGTGGAGAA CGACATCCAT601 GGGCTCCGCA AGGTCATTGA TGACACCAAT ATCACACGAC641 TGCAGCTGGA GACAGAGATC GAGGCTCTCA AGGAGGAGCT681 GCTCTTCATG AAGAAGAACC ACGAAGAGGA AGTAAAAGGC721 CTACAAGCCC AGATTGCCAG CTCTGGGTTG ACCGTGGAGG761 TAGATGCCCC CAAATCTCAG GACCTCGCCA AGATCATGGC801 AGACATCCGG GCCCAATATG ACGAGCTGGC TCGGAAGAAC841 CGAGAGGAGC TAGACAAGTA CTGGTCTCAG CAGATTGAGG881 AGAGCACCAC AGTGGTCACC ACACAGTCTG CTGAGGTTGG921 AGCTGCTGAG ACGACGCTCA CAGAGCTGAG ACGTACAGTC961 CAGTCCTTGG AGATCGACCT GGACTCCATG AGAAATCTGA1001 AGGCCAGCTT GGAGAACAGC CTGAGGGAGG TGGAGGCCCG1041 CTACGCCCTA CAGATGGAGC AGCTCAACGG GATCCTGCTG1081 CACCTTGAGT CAGAGCTGGC ACAGACCCGG GCAGAGGGAC1121 AGCGCCAGGC CCAGGAGTAT GAGGCCCTGC TGAACATCAA1161 GGTCAAGCTG GAGGCTGAGA TCGCCACCTA CCGCCGCCTG1201 CTGGAAGATG GCGAGGACTT TAATCTTGGT GATGCCTTGG1241 ACAGCAGCAA CTCCATGCAA ACCATCCAAA AGACCACCAC1281 CCGCCGGATA GTGGATGGCA AAGTGGTGTC TGAGACCAAT1321 GACACCAAAG TTCTGAGGCA TTAAGCCAGC AGAAGCAGGG1361 TACCCTTTGG GGAGCAGGAG GCCAATAAAA AGTTCAGAGT1401 TCATTGGATG TC本發(fā)明的表位由兩種多肽組成，細胞角蛋白K8多肽和細胞角蛋白K18多肽。不過，所述細胞角蛋白K8多肽比具有482個氨基酸的完整長度的細胞角蛋白K8多肽短。另外，所述細胞角蛋白K18多肽比具有429個氨基酸的完整長度的細胞角蛋白K18多肽短。在某些實施方案中，所述細胞角蛋白K8多肽短于大約475個氨基酸，或短于大約450個氨基酸，或短于大約425個氨基酸，或短于大約400個氨基酸。在某些實施方案中，所述細胞角蛋白K18多肽短于大約425個氨基酸，或短于大約415個氨基酸，或短于大約400個氨基酸，或短于大約375個氨基酸。
本發(fā)明表位的一種例子構(gòu)成兩種獨立蛋白的肽區(qū)，即細胞角蛋白K8(SEQ ID NO3)和細胞角蛋白K18(SEQ ID NO3)。下面提供了被命名為SEQ ID NO3包括細胞角蛋白8序列的85-129號氨基酸的表位。
1 AVRTQEKEQI KTLNNKFASF IDKVRFLEQQ NKMLETKWSL41 LQQQ
下面提供了被命名為SEQ ID NO4的還包括細胞角蛋白18的72-124號氨基酸的表位。
1 AGMGGIQNEK ETMQSLNDRL ASYLDRVRSL ETENRRLESK41 IREHLEKKGP QVR在某些例子中，可能需要允許細胞角蛋白K8和細胞角蛋白K18多肽之間相互作用的合適的三維結(jié)構(gòu)，以便獲得最佳免疫反應(yīng)性。因此可以將較長的細胞角蛋白多肽用作抗原。例如，可以將具有SEQ IDNO5的細胞角蛋白K8多肽與合適的細胞角蛋白K18多肽一起使用，以便制備抗體。SEQ ID NO5如下。
84 AVRTQE KEQIKTLNNK101 FASFIDKVRF LEQQNKMLET KWSLLQQQKT ARSNMDNMFE141 SYINNLRRQL ETLGQEKLKL EAELGNMQGL VEDFKNKYED181 EINKRTEMEN EFVLIKKDVD EAYMNKVELE SRLEGLTDEI221 NFLRQLYEEE IRELQSQISD TSVVLSMDNS RSLDMESIIA261 EVKAQYEDIA NRSRAEAESM YQIKYEELQS LAGKHGDDLR301 RTKTEISEMN RNISRLQAEI EGLKGQRASL EAAIADAEQR341 GELAIKDANA KLSELEAALQ RAKODMARQL REYQELMNVK381 LALDIDIATY RKLLEGEESP LESGMQNMSI HTKTTGGYAG421 GLSSAYGDLT DPGLSYSLGS SFGSGAGSSS FSRTSSSRAV461 VVKKIETRDG KLVSESSDVL PK類似地，具有SEQ ID NO6的細胞角蛋白K18多肽可以與合適的細胞角蛋白K8一起使用，以便制備抗體。SEQ ID NO6如下。
71AGMGGIQNEK ETMQSLNDRL ASYLDRVRSL101 ETENRRLESK IREHLEKKGP QVRDWSHYFK IIEDLRAQIF141 ANTVDNARIV LQIDNARLAA DDFRVKYETE LAMRQSVEND181 IHGLRKVIDD TNITRLQLET EIEALKEELL FMKKNHEEEV221 KGLQAQIASS GLTVEVDAPK SQDLAKIMAD IRAQYDELAR261 KNREELDKYW SQQIEESTTV VTTQSAEVGA AETTLTELRR301 TVQSLEIDLD SMRNLKASLE NSLREVEARY ALQMEQLNGI341 LLHLESELAQ TRAEGQRQAQ EYEALLNIKV KLEAEIATYR381 RLLEDGEDFN LGDALDSSNS MQTIQKTTTR RIVDGKVVSE421 TNDTKVLRH本發(fā)明還預期抗原表位“片段”。所述片段不包括完整長度的細胞角蛋白，不過，確實編碼相對SEQ ID NO3-6的抗原性表位而言，具有類似或改善了的免疫學特性的抗原。因此，諸如SEQ ID NO3-6的抗原性表位片段可以小到大約6個氨基酸，大約9個氨基酸，大約12個氨基酸，大約15個氨基酸，大約17個氨基酸，大約18個氨基酸，大約20個氨基酸，大約25個氨基酸，大約30個氨基酸，或更多個氨基酸。一般，本發(fā)明的片段抗原性表位可以具有任何大小的上限，只要它相對于通過SEQ ID NO3-6中任意一個的組合所形成的表位具有相似的或改進的免疫學特性就行。
本發(fā)明還預期包括SEQ ID NO3和SEQ ID NO4肽組合的融合蛋白。所述融合蛋白將兩種肽連接在一起，以便所述肽能夠更容易地形成本發(fā)明的癌相關(guān)表位。
融合多肽通?？梢允褂脴藴始夹g(shù)制備，包括化學綴合。融合多肽還能夠以重組多肽形式表達，在表達系統(tǒng)中能夠相對非融合多肽以更高的水平生產(chǎn)。簡單地講，可以分別組裝編碼所述多肽成分的DNA序列，并且連接到合適的表達載體上。用或不用肽接頭將編碼一種多肽成分的DNA序列的3’末端與編碼第二種多肽成分的DNA序列的5’末端連接，以便所述序列的讀框同相。這樣能夠翻譯成一種融合多肽，它保留了兩種多肽成分的生物學活性。
可以將接頭序列用于隔離第一種和第二種多肽成分為足以確保每一種多肽折疊成它的二級和三級結(jié)構(gòu)的距離。所述接頭可以是肽，多肽，烷基鏈或其他合適的間隔分子。
使用本領(lǐng)域所熟知的標準技術(shù)，將肽或肽接頭序列整合入融合多肽。合適的肽接頭序列可以根據(jù)以下因素選擇(1)它們采用靈活延伸的構(gòu)象的能力；(2)它們不采用可以與第一和第二種肽上的功能性表位相互作用的二級結(jié)構(gòu)的能力；和(3)缺乏有可能與所述多肽功能性表位起反應(yīng)的疏水性或帶電荷的殘基。在某些實施方案中，所述肽接頭序列包括Gly，Asn和Ser殘基。諸如Thr和Ala的其他接近中性的氨基酸，也可用于所述接頭序列中。可以用作接頭的氨基酸序列包括披露于以下文獻中的序列Maratea等，Gene 4039-46，1985；Murphy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838258-8262，1986；美國專利號4,935,233和美國專利號4,751,180。所述接頭序列的長度一般為1-大約50個氨基酸。當所述第一和第二種多肽具有非必需N-末端氨基酸區(qū)域時，接頭序列通常是不必要的，所述區(qū)域可以用于隔離功能性結(jié)構(gòu)域，并且阻止空間干擾。
所述融合多肽可以包括本文所披露的多肽表位(例如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4肽)以及不相關(guān)的免疫原性蛋白，如能夠誘導記憶反應(yīng)的免疫原性蛋白。所述蛋白的例子包括破傷風，結(jié)核和肝炎蛋白(例如，參見Stoute等New Engl.J Med.，33686-91，1997)。
在一種實施方案中，將能夠促進針對SEQ ID NO3和SEQ ID NO4肽表位的免疫反應(yīng)發(fā)展的肽或多肽用作所述接頭。所述免疫學融合配偶體可以源于分枝桿菌屬(Mycobacterium)。例如，所述免疫學融合配偶體可以是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberduosis)產(chǎn)生的Ra12片段。Ra12組合物以及將其用于增強異源多核苷酸/多肽序列的表達和/或免疫原性的方法，披露于美國專利申請流水號60/158,585中，該文獻的內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。簡單地講，Ra12表示一種多核苷酸區(qū)，它是結(jié)核分枝桿菌MTB32A核酸的亞序列。MTB32A是由結(jié)核分枝桿菌的有毒和無毒菌株中的基因編碼的分子量為32KD的絲氨酸蛋白酶。業(yè)已披露了MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列(例如，美國專利申請流水號60/158,585；還可參見Skeiky等，Infection and Immun.(1999)673998-4007，被收作本文參考)。MTB32A編碼序列的C-末端片段能以高水平表達，并且在整個純化過程中保持可溶性多肽的形式。另外，Ra12能夠增強與它融合的異源免疫原性多肽的免疫原性。一種有用的Ra12融合多肽包括相當于MTB32A的192-323號氨基酸殘基的14KD C-末端片段。其他有用的Ra12多核苷酸，通常包括至少大約15個連續(xù)的核苷酸，至少大約30個核苷酸，至少大約60個核苷酸，至少大約100個核苷酸，至少大約200個核苷酸，或至少大約300個核苷酸，它能編碼Ra12多肽的一部分。
Ra12多核苷酸可以包括天然序列(即編碼Ra12多肽或它的一部分的內(nèi)源序列)，或者可以包括所述序列的變體。Ra12多核苷酸變體可以包括一個或多個取代，添加，缺失和/或插入，以便相對于包括天然Ra12多肽的融合多肽而言，它所編碼的融合多肽的生物學活性不會明顯減弱。變體優(yōu)選與編碼天然Ra12多肽或它的一部分的多核苷酸序列具有至少大約70％的相同性，更優(yōu)選至少大約80％的相同性，最優(yōu)選至少大約90％的相同性。
在另一種實施方案中，免疫學融合配偶體源于蛋白D，它是格蘭氏陰性細菌流感嗜血菌(Haemophilus influenza)B的表面蛋白(WO91/18926)。蛋白D的有用部分，大體上包括該蛋白的前1/3(例如，N-末端的前100-110個氨基酸)。另外，所述蛋白D融合配偶體可以是脂肪酸化(lipidated)的。在某些優(yōu)選實施方案中，脂蛋白D融合配偶體的前109個殘基包含在N-末端，以便提供具有額外外源T-細胞表位的多肽，并且提高在大腸桿菌(E.coli)中的表達水平(因此發(fā)揮表達增強子的作用)。所述脂類尾巴能確保所述抗原呈遞到抗原呈遞細胞的最佳呈遞作用。其他融合配偶體包括源于流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(血凝素)。通常，使用N-末端81個氨基酸，盡管可以使用包括T-輔助表位的不同的片段。
在另一種實施方案中，所述免疫性融合配偶體是被稱為LYTA的蛋白或它的一部分(優(yōu)選C-末端部分)。LYTA源于肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，它能合成被稱為酰胺酶LYTA的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因編碼；Gene 43265-292，1986)。LYTA是自溶素，它能特異性地降解肽聚糖主鏈上的某些鍵。LYTA蛋白的C-末端結(jié)構(gòu)域，決定對膽堿的親和力，或?qū)δ承┠憠A類似物，如DEAE的親和力。業(yè)已將這種特性用于開發(fā)可用于表達融合蛋白的大腸桿菌C-LYTA表達質(zhì)粒。業(yè)已描述了在氨基末端包括C-LYTA片段的雜合蛋白的純化(參見Biotechnology 10795-798，1992)。在一種優(yōu)選實施方案中，可以將LYTA的重復部分整合到融合多肽中。重復部分存在于始于178號殘基的C-末端區(qū)。特別優(yōu)選的重復部分整合了188-305號殘基。
另一種說明性實施方案涉及融合多肽，以及編碼它們的多核苷酸，其中，所述融合配偶體包括能夠?qū)⒁环N多肽引導到內(nèi)體/溶酶體區(qū)室的導向信號，正如在美國專利號5,633,234中所描述的。本發(fā)明的免疫原性多肽在與該導向信號融合時，能夠更有效地與II型MHC分子結(jié)合，以便提供所述多肽的CD4+T-細胞特異性的體內(nèi)刺激的增強。
本發(fā)明的多肽和融合蛋白是用多種已知合成和/或重組技術(shù)中的任意一種制備的。少于大約150個氨基酸的多肽和融合蛋白可以通過合成方法制備，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)。在一種說明性例子中，所述多肽是用任何可以通過商業(yè)渠道獲得的固相技術(shù)合成的，如Merrifield固相合成方法，其中，氨基酸是依次添加到生長的氨基酸鏈上的。參見Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963。用于多肽自動合成的設(shè)備可以從諸如PerkinElmer/Applied BioSystems Division(Foster City，Calif.)的供應(yīng)商那里購買，并且可以按照生產(chǎn)商的說明操作。
本發(fā)明的小的和大的融合蛋白和多肽表位，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得的任何其他方法生產(chǎn)。例如，所述融合蛋白和多肽表位，可以通過使用多種方法中的任意一種向表達載體中插入編碼選擇的融合蛋白或多肽表位的核酸而以重組方式制備。一般來說，使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將編碼所需蛋白或多肽的核酸插入合適的限制性內(nèi)切酶位點。一般，參見Sambrook等，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Sambrook和Russell，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd edition(January 15，2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN0879695765；Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，Green Publishing Associates and WileyInterscience，NY(1989))。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的標準連接技術(shù)構(gòu)建含有融合蛋白或多肽表位的表達載體。
將所述連接的核酸序列可操作地與合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件連接，所述元件有利于本發(fā)明融合蛋白和多肽表位的表達。決定蛋白表達的調(diào)控元件僅位于所述多肽的編碼區(qū)的5’末端。類似地，結(jié)束翻譯的終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號，僅存在于編碼所述融合蛋白或多肽表位的核酸序列的3’末端。在構(gòu)建了具有可操作地連接的調(diào)控元件的編碼感興趣的多肽的核酸之后，可以將該表達盒導入宿主細胞，并且可以表達所編碼的多肽。
一般，本發(fā)明的多肽組合物(包括融合多肽)是分離的。“分離的”多肽是從它的原始環(huán)境中取出的多肽。例如，天然存在的蛋白或多肽如果是與它的天然系統(tǒng)中的某些或所有共同存在的材料分離的話，它就是分離的。所述多肽還可以是純化的，例如，所述多肽表位和融合蛋白的純度可以至少為大約90％，或至少大約95％，或至少大約99％。
抗體和結(jié)合實體本發(fā)明的細胞角蛋白表位是以均勻的小斑點形式分布在活的癌和腺癌細胞表面上的。免疫組織學研究業(yè)已證實，本發(fā)明的與癌相關(guān)的表位與正常的細胞角蛋白8和18不同，可用于區(qū)分惡性腫瘤和正常結(jié)腸上皮，以及區(qū)分肝臟中的結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移，以及周圍的正常肝細胞。另外，本發(fā)明的癌相關(guān)表位與活體檢查的惡性腫瘤部位內(nèi)的增殖細胞的膜結(jié)合，而靜息細胞在進行所述表位的染色時具有絲狀形式。
本發(fā)明提供了針對本發(fā)明表位的抗體制劑和結(jié)合實體，例如，抗體或結(jié)合實體能夠結(jié)合來自細胞角蛋白K8的至少一種肽和來自細胞角蛋白K18的至少一種肽的抗原混合物。來自細胞角蛋白K8的肽的例子包括SEQ ID NO3和SEQ ID NO5。來自細胞角蛋白K18的肽的例子包括SEQ ID NO4和S EQ ID NO6。
在一種實施方案中，所述抗體或結(jié)合實體可以包括含有SEQ IDNO7-35，47-49中任意一個的多肽。在某些實施方案中，抗體和結(jié)合實體包括基本由SEQ ID NO21-35，47-49中任意一個組成的多肽。在其他實施方案中，抗體和結(jié)合實體包括基本由SEQ ID NO8，10，12，15，17，19，22，24，27，29或32中任意一個組成的多肽。在另一種實施方案中，本發(fā)明涉及含有SEQ ID NO7-33，47-49中的任意組合的結(jié)合實體多肽，其中，所述多肽能夠結(jié)合本發(fā)明的表位。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的抗體樣多肽的核酸。在一種實施方案中，所述核酸編碼含有SEQ ID NO7-35，47-49中任意一個的多肽，其中，所述核酸編碼能夠結(jié)合本發(fā)明表位的多肽。在另一種實施方案中，所述核酸編碼SEQ ID NO7-33，47-49中兩個或兩個以上的組合，其中，所述核酸編碼能夠結(jié)合本發(fā)明表位的結(jié)合實體多肽。優(yōu)選的核酸編碼基本由SEQ ID NO21-33中任意一個或SEQ ID NO8，10，12，15，17，19，22，24，27，29或32中任意一個的多肽組成。本發(fā)明的其他核酸包括核苷酸序列SEQ ID NO36-39。
本發(fā)明還提供了通過現(xiàn)有方法制備的能夠結(jié)合本發(fā)明表位的抗體。
屬于血漿蛋白家族的抗體分子被稱為免疫球蛋白，它的基本結(jié)構(gòu)模塊，免疫球蛋白折疊或結(jié)構(gòu)域被以各種形式用于免疫系統(tǒng)的很多分子中，以及用于其他生物學識別系統(tǒng)的很多分子中。標準抗體是四聚體結(jié)構(gòu)，它由兩個相同的免疫球蛋白重鏈和兩個相同的輕鏈組成，并且分子量為大約150,000道爾頓。
抗體的重鏈和輕鏈由不同的結(jié)構(gòu)域組成。每一個輕鏈具有一個可變結(jié)構(gòu)域(VL)和一個恒定結(jié)構(gòu)域(CL)，而每一個重鏈具有一個可變結(jié)構(gòu)域(VH)和三或四個恒定結(jié)構(gòu)域(CH)。例如，參見Alzari，P.N.，Lascombe，M.-B.&Poljak，R.J.(1988)Three-dimensionalstructure of antibodies。Annu.Rev.Immunol.6，555-580。將由大約110個氨基酸殘基組成的每一個結(jié)構(gòu)域折疊成特有的β-夾心結(jié)構(gòu)，它是由兩個β-折疊，即免疫球蛋白折疊彼此相互包裝形成的。VH和VL結(jié)構(gòu)域各自具有三個互補決定區(qū)(CDR1-3)，它們是環(huán)，或轉(zhuǎn)角，在所述結(jié)構(gòu)域的一端連接β-鏈。輕鏈和重鏈的可變區(qū)通常導致了抗原特異性，盡管不同的鏈對特異性的作用并不總是相同的?？贵w分子業(yè)已進化，以便通過使用六個隨機的環(huán)(CDRs)，結(jié)合大量的分子。
根據(jù)其重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列，可以將免疫球蛋白劃分成不同的類型。存在至少五種主要類型的免疫球蛋白IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且可以將其中的若干種進一步劃分成亞型(同種型)，例如IgG-1，IgG-2，IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。相當于不同類型免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域分別被稱為α，δ，ε，γ和μ。根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列，可以將抗體的輕鏈劃分成被稱為κ和λ的兩種明顯不同類型中的一種。不同類型的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)是眾所周知的。
術(shù)語“可變的”在用于表示抗體的可變結(jié)構(gòu)域時，是指可變結(jié)構(gòu)域的某些部分在不同抗體的序列之間明顯不同的事實。所述可變結(jié)構(gòu)域是用于結(jié)合的，并且決定每一種特定抗體對它的特定抗原的特異性。不過，所述可變性在抗體的可變結(jié)構(gòu)域中不是均勻分布的。它集中在被稱為互補決定區(qū)(CDRs)的三個片段，所述片段在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中又被稱為超變區(qū)。
可變結(jié)構(gòu)域的更高度保守的部分被稱為構(gòu)架(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包括四個FR區(qū)，主要采用β-折疊構(gòu)型，通過三個CDRs連接，它能形成環(huán)狀連接，并且，在某些場合下形成所述β折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每一條鏈上的CDRs通過FR區(qū)保持在緊密相鄰的距離內(nèi)，且與來自其他鏈的CDRs保持在緊密相鄰的距離內(nèi)，導致抗體的抗原結(jié)合位點的形成。所述恒定區(qū)并不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是，具有各種效應(yīng)子功能，如在抗體依賴型細胞毒性中參與所述抗體。
因此，可用于本發(fā)明中的抗體可以是多種形式中的任意一種，包括完整的免疫球蛋白，抗體片段，如Fv，F(xiàn)ab，以及類似的片段，包括可變結(jié)構(gòu)域互補決定區(qū)(CDR)的單鏈抗體，以及類似形式，所有形式都屬于本文所使用的廣義的術(shù)語“抗體”的范圍。本發(fā)明預期多克隆或單克隆抗體的任何特異的使用，并且，不局限于能識別并且與特殊抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。在優(yōu)選實施方案中，在下文所描述的治療和篩選方法的場合下，使用抗體或它的片段，它對本發(fā)明的抗原或表位來說是免疫特異性的。在某些實施方案中，所述抗體不是COU-1抗體。
術(shù)語“抗體片段”表示完整長度抗體的一部分，通常是抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2和Fv片段。對抗體的木瓜蛋白酶消化，產(chǎn)生了兩種相同的抗原結(jié)合片段，被稱為Fab片段，它們各自具有一個抗原結(jié)合位點，和殘余的″Fc″片段，這樣的稱謂是因為它的便于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生了F(ab′)2片段，它具有能夠交聯(lián)抗原的兩個抗原結(jié)合片段，以及殘余的其他片段(該片段被稱為PFc′)。其他片段可以包括雙功能抗體(diabodies)，線性抗體，單鏈抗體分子，以及由抗體片段形成的多特異性抗體。正如在本文中所使用的，與抗體相關(guān)的“功能性片段”表示Fv，F(xiàn)(ab)和F(ab′)2片段。
因此，本發(fā)明所預期的抗體片段是不完整長度的抗體，不過，相對于諸如COU-1抗體的抗體而言，確實具有類似的或改進的免疫學特性。因此，本發(fā)明預期COU-1抗體片段和/或具有SEQ ID NO7-35抗體中的任意一個的多肽的片段。所述抗體片段可以小到大約4個氨基酸，5個氨基酸，6個氨基酸，7個氨基酸，9個氨基酸，大約12個氨基酸，大約15個氨基酸，大約17個氨基酸，大約18個氨基酸，大約20個氨基酸，大約25個氨基酸，大約30個氨基酸或更多。
一般，本發(fā)明的抗體片段可以具有任意的大小上限，只要它具有與能夠以特異性結(jié)合通過SEQ ID NO3-6中任意一個的組合形成的表位的抗體具有相似的或相同的免疫學特性就行。所述參考抗體可以是COU-1抗體。例如，結(jié)合實體和輕鏈抗體片段可以具有少于大約200個氨基酸，少于大約175個氨基酸，少于大約150個氨基酸，或少于大約120個氨基酸，如果所述抗體片段與輕鏈抗體亞基相關(guān)的話。另外，結(jié)合實體和重鏈抗體片段，可以具有少于大約425個氨基酸，少于大約400個氨基酸，少于大約375個氨基酸，少于大約350個氨基酸，少于大約325個氨基酸，或少于大約300個氨基酸，如果所述抗體片段與重鏈抗體亞基相關(guān)的話。
抗體片段保留了選擇性地與它的抗原，表位或受體結(jié)合的某些能力。某些抗體片段的類型是按以下方式定義的(1)Fab是包括抗體分子的單價抗原結(jié)合片段的片段。Fab片段可以通過用木瓜蛋白酶消化完整的抗體產(chǎn)生，以便得到完整的輕鏈和重鏈的一部分。
(2)Fab′是抗體分子的片段，可以通過用胃蛋白酶處理完整的抗體，然后進行還原，以便產(chǎn)生完整的輕鏈和重鏈的一部分而獲得。用每個抗體分子獲得了兩個Fab′片段。Fab′片段與Fab片段的不同之處在于，在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。
(3)(Fab′)2是抗體的片段，它可以通過用胃蛋白酶處理完整抗體而不進行隨后的還原而獲得。F(ab′)2是通過兩個二硫鍵維持在一起的兩個Fab′片段的二聚體。
(4)Fv是包括完整的抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片段。該區(qū)由具有緊密的，非共價結(jié)合的一個重鏈和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體(VH-VL二聚體)組成。在該構(gòu)型中，每一個可變結(jié)構(gòu)域的三個CDRs相互作用，以便在VH-VL二聚體的表面上形成抗原結(jié)合位點?？傊@六個CDRs產(chǎn)生了所述抗體的抗原結(jié)合特異性。不過，即使是一個可變結(jié)構(gòu)域(或僅包括對抗原特異的三個CDRs的Fv的一半)，也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力比完整結(jié)合位點要低。
(5)單鏈抗體(″SCA″)，被定義為包括通過合適的多肽接頭連接的輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)的基因工程產(chǎn)生的分子，如遺傳學融合的單鏈分子。所述單鏈抗體還被稱為“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段。一般，F(xiàn)v多肽還包括VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，它使得sFv能夠形成抗原結(jié)合所需要的結(jié)構(gòu)。有關(guān)sFv的綜述，可以參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，113卷，Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag，N.Y.，pp.269-315(1994)。
術(shù)語“雙功能抗體”表示具有兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，這些片段包括與相同的多肽鏈(VH-VL)上的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。通過使用不是太短的接頭，使得以上兩個結(jié)構(gòu)域能夠在相同的鏈上配對，強制所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈上的互補結(jié)構(gòu)域配對，以便產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。例如，雙功能抗體更詳細地描述于以下文獻中EP 404,097；WO 93/11161，和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得用于制備多克隆抗體的方法。例如，參見Green等，Production of Polyclonal Antisera，inImmunochemical Protocols(Manson，ed.)，pages 1-5(HumanaPress)；Coligan等，Production of Polyclonal Antisera inRabbits，Rats Mice and Hamsters，inCurrent Protocols inImmunology，section 2.4.1(1992)，這些文獻被收作本文參考。
單克隆抗體的制備同樣是常規(guī)的。例如，參見Kohler &Milstein，Nature，256495(1975)；Coligan等，sections 2.5.1-2.6.7；和Harlow等，inAntibodiesA Laboratory Manual，page 726(Cold Spring Harbor Pub.(1988))，以上文獻被收作本文參考。可以通過多種業(yè)已完善的技術(shù)，從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化單克隆抗體。所述分離技術(shù)包括用A蛋白瓊脂糖進行的親和層析，大小排阻層析，和離子交換層析。例如，參見Coligan等，sections 2.7.1-2.7.12和sections 2.9.1-2.9.3；Barnes等，Purification of lmmunoglobulin G(IgG)，inMethods inMolecular Biology，Vol.10，pages 79-104(Humana Press(1992)。
體外和體內(nèi)操作單克隆抗體的方法，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體，可以通過雜交瘤方法制備，該方法最初是由Kohler和Milstein，Nature 256，495(1975)描述的，或者可以通過重組方法制備，例如，在美國專利號4,816,567中所描述的。本發(fā)明所使用的單克隆抗體，還可以利用描述于以下文獻中的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離Clackson等Nature 352624-628(1991)，以及Marks等，J.Mol Biol.222581-597(1991)。另一種方法涉及通過重組方式使單克隆抗體人源化，以便制備含有人類特異性和可識別的序列的抗體。有關(guān)綜述參見Holmes等，J.Immunol.，1582192-2201(1997)和Vaswani等，AnnalsAllergy，Asthma & Immunol.，81105-115(1998)。
本文所使用的術(shù)語“單克隆抗體”表示從一群大體上均勻的抗體中獲得的抗體，即構(gòu)成所述群體的每一種抗體是相同的，可能天然發(fā)生的突變除外，這些突變可能以很少的數(shù)量存在。單克隆抗體是高度特異的，針對一個抗原位點的。另外，與常規(guī)多克隆抗體制劑不同，所述抗體通常包括針對不同決定簇(表位)的不同的抗體，每一種單克隆抗體是針對所述抗原上的一個決定簇的。除了它們的特異性之外，所述單克隆抗體的優(yōu)點在于，它們是通過雜交瘤培養(yǎng)物合成的，沒有受到其他免疫球蛋白的污染。修飾詞“單克隆”表示抗體的特征，表明所述抗體的特征是從大體上均勻的抗體群體獲得的，并且不被理解成通過任何特性方法生產(chǎn)所述抗體。
本發(fā)明的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，以及所述抗體的片段，只要它們具有需要的生物學活性就行，其中，重鏈和/或輕鏈的一部分與源于特定物種的抗體的相應(yīng)的序列相同或同源，或?qū)儆谔囟ǖ目贵w類型或亞型，而所述鏈的其他部分與源于另一種物種的相應(yīng)的序列相同或同源，或?qū)儆诹硪环N抗體類型或亞型(美國專利號4,816,567)；Morrison等Proc.Natl.AcadSci.81，6851-6855(1984)。
制備抗體片段的方法也是本領(lǐng)域所公知的(例如參見Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York，(1988)，被收作本文參考)。本發(fā)明的抗體片段可以通過對所述抗體的蛋白水解或通過在大腸桿菌中表達所述片段的DNA而制備。抗體片段可以通過用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗體的常規(guī)方法獲得。例如，抗體片段可以通過用胃蛋白酶對抗體進行酶促裂解產(chǎn)生，以便提供被稱為F(ab′)2的5S片段。可以用硫醇還原制劑進一步裂解該片段，并且通過對二硫鍵的裂解任選地產(chǎn)生了巰基的封閉基團，以便產(chǎn)生3.5S Fab′單價片段。另外，使用胃蛋白酶的酶促裂解，直接產(chǎn)生了兩個單價Fab′片段和一個Fc片段。例如，所述方法描述于以下文獻中美國專利號4,036,945和4,331,647，以及其中所包含的參考文獻。以上專利被以全文形式收作本文參考。
還可以使用裂解抗體的其他方法，如分離重鏈，以便形成單價輕鏈片段，進一步裂解片段，或其他酶促，化學，或遺傳學技術(shù)。只要所述片段能夠結(jié)合由完整的抗體識別的抗原就行。例如，F(xiàn)v片段包括VH和VL鏈的結(jié)合。這種結(jié)合可以是非共價的，或所述可變鏈可以通過分子間二硫鍵結(jié)合或通過諸如戊二醛的化學物質(zhì)交聯(lián)。Fv片段優(yōu)選包括通過肽接頭連接的VH和VL鏈。所述單鏈抗原結(jié)合蛋白(sFv)是通過構(gòu)建包括通過寡核苷酸連接的編碼VH和VL結(jié)構(gòu)域的DNA序列的結(jié)構(gòu)基因而制備的。將所述結(jié)構(gòu)基因插入表達載體，然后將所述載體導入諸如大腸桿菌的宿主細胞。所述重組宿主細胞合成了一條多肽鏈，通過接頭肽連接兩個V結(jié)構(gòu)域。例如，用于生產(chǎn)sFvs的方法描述于以下文獻中Whitlow等，Methodsa Companion toMethods in Enzymology.Vol.2，page 97(1991)；Bird等，Science242423-426(1988)；Ladner等，美國專利號4,946,778；和Pack等，Bio/Technology 111271-77(1993)。
另一種形式的抗體片段是編碼一個互補決定區(qū)(CDR)的肽。CDR肽(“最低識別單位”)通常參與抗原識別和結(jié)合。CDR肽可以通過克隆或構(gòu)建編碼感興趣的抗體的CDR的基因而獲得。例如，所述基因是通過聚合酶鏈反應(yīng)，由抗體生產(chǎn)性細胞的RNA合成所述可變區(qū)而制備的。例如，參見Larrick等，Methodsa Companion toMethods in Enzymology.Vol.2，page 106(1991)。
本發(fā)明涉及人和人源化形式的非人(例如鼠)抗體。所述人源化抗體是嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白鏈或它的片段(如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2或抗體的其他抗原結(jié)合序列)，它包括源于非人免疫球蛋白的最低序列。對于大部分來說，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中，來自所述受體的互補決定區(qū)(CDR)的殘基被來自諸如小鼠，大鼠或兔子的非人物種的具有需要的特異性，親和力和能力的CDR(供體抗體)的殘基所取代。
在某些例子中，所述人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架殘基被相應(yīng)的非人殘基所取代。另外，人源化抗體可以包括在所述受體抗體或輸入的CDR或構(gòu)架序列中都不存在的殘基。進行上述修飾，是為了進一步調(diào)整和優(yōu)化抗體性能。一般，人源化抗體大體上包括至少一種，通常兩種可變結(jié)構(gòu)域中的全部，其中，全部或基本上全部CDR區(qū)相當于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，且FR區(qū)的全部或基本上全部，是人免疫球蛋白共有序列的結(jié)構(gòu)域。所述人源化抗體最好還包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。有關(guān)細節(jié)可以參見Jones等，Nature 321，522-525(1986)；Reichmann等，Nature 332，323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2，593-596(1992)；Holmes，等，J.Immunol.，1582192-2201(1997)；和Vaswani，等，Annals Allergy，Asthma &Immunol.，81105-115(1998)。
盡管可以獲得制備抗體的標準化方法，抗體大小，抗體的多鏈結(jié)構(gòu)以及存在于抗體上的六個結(jié)合環(huán)的復雜性，構(gòu)成了對改進和生產(chǎn)大量抗體的障礙。因此，本發(fā)明還預期使用結(jié)合實體，它包括能夠識別并且結(jié)合本發(fā)明表位的多肽。
因此，本發(fā)明還涉及能夠結(jié)合本發(fā)明的癌相關(guān)表位的抗體和其他結(jié)合實體。在某些實施方案中，所述抗體和結(jié)合實體具有SEQ ID NO7-33。下面提供了SEQ ID NO7-33的序列。
SEQ ID NO 序列 Ab區(qū)SEQ ID NO7 GAEVKKPGASVKVSCKASDYTFS VH FR1SEQ ID NO8 SYYMHVH CDR1SEQ ID NO9 WVRQAPGQGLEWMG VH FR2SEQ ID NO10IINPSGGSTSYAQKFQGVH CDR2SEQ ID NO11RVTMTRDTSTNTVYMELSSLRSE VH FR3DTAVYYCARSEQ ID NO12DQVVVAATLSNYGMDV VH CDR3SEQ ID NO13WGQGTTVTVSSAST VH FR4SEQ ID NO14ELTQSPGTLSLSPGERATLSCVL FR1SEQ ID NO15RASQSVSSSYLA VL CDR1SEQ ID NO16WYQQKPGQAPRLLIY VL FR2SEQ ID NO17DASNRAT VL CDR2SEQ ID NO18GIPARFSGSGSGTDFTLTISSVL FR3LEPEDFAVYYCSEQ ID NO19QQGTNWGIAVL CDR3SEQ ID NO20FGQGTRLDIKR VL FR4SEQ ID NO21TQSPGTLSLSPGERATLSC VL FR1SEQ ID NO22GASSRAT VL CDR2SEQ ID NO23GIPDRFSGSGSGTDFTLTI VL FR3SRLEPEDFAAYYCSEQ ID NO24QQYGNSPPYT VL CDR3SEQ ID NO25FGQGTKLEIVL FR4SEQ ID NO26TQSPDSLAVSLGERATINC VL FR1SEQ ID NO27KSSQSLLYSSNNKNYTAVL CDR1SEQ ID NO28WYQQKPGQPPKLLIY VL FR2SEQ ID NO29WASTRES VL CDR2SEQ ID NO30GVPDRFSGSGSGTVL FR3SEQ ID NO31DFTLTISSLQAEDVAGYYC VL FR3SEQ ID NO32QQYYSTPPMVL CDR3SEQ ID NO33FGQGTKVEIVL FR4
從能分泌COU-1抗體的細胞中，分離編碼肽SEQ ID NO7-33的核酸。盡管不是所有的通過這種篩選方法分離的核酸編碼的多肽都能結(jié)合癌相關(guān)表位，業(yè)已通過噬菌體展示和其他實驗證實肽SEQ ID NO7-33在結(jié)合方面發(fā)揮作用。另外，在不同抗體片段克隆的類似區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了若干種差異。例如，分離的可變輕鏈CDR1片段具有RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO15)以及KSSQSLLYSSNNKNYLA(SEQ ID NO27)。類似地，分離的可變輕鏈CDR2片段具有DASNRAT(SEQ ID NO17)，GASSRAT(SEQ ID NO22)或WASTRES(SEQ ID NO29)。另外，分離的可變輕鏈CDR3片段具有QQYGNSPPYT(SEQ ID NO24)或QQYYSTPPM(SEQ ID NO32)。因此，并不是所有的克隆都相同。
有多種蛋白可以起著蛋白支架的作用，結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，SEQ IDNO7-33，47-49肽的任意一種或它的變體)可以與它連接。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合或與本發(fā)明的癌相關(guān)表位相互作用，而所述蛋白構(gòu)架只能保持和穩(wěn)定所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以便它們能夠結(jié)合?？梢允褂枚喾N蛋白構(gòu)架。例如，可以使用噬菌體衣殼蛋白，綜述參見Clackson &Wells，Trends Biotechnol.12173-184(1994)。實際上，按本文所描述的方法使用所述噬菌體衣殼蛋白，以便篩選SEQ ID NO7-33肽(參見實施例)。另外，業(yè)已將噬菌體衣殼蛋白用作支架用于展示隨機肽序列，包括牛胰腺胰蛋白酶抑制劑(Roberts等，PNAS 892429-2433(1992))，人生長激素(Lowman等，Biochemistry 3010832-10838(1991))，Venturini等，Protein Peptide Letters170-75(1994))，和鏈球菌屬的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(O′Neil等，Techniques in Protein Chemistry V(Crabb，L，.ed.)pp.517-524，Academic Press，San Diego(1994))。所述支架業(yè)已展示了一種隨機化的環(huán)或區(qū)域，可以對它進行修飾，以便包括本文所提供的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO7-33，47-49)。
研究人員業(yè)已將小的74個氨基酸的α-淀粉酶抑制劑Tendamistat用作絲狀噬菌體M13的呈遞構(gòu)架。McConnell，S.J.，& Hoess，R.H.，J.Mol.Biol.250460-470(1995)。Tendamistat是來自唐德鏈霉菌(Streptomyces tendae)的β-折疊蛋白。它具有多種特征，使得它成為用于結(jié)合肽的有吸引力的支架，這些特征包括它的小的尺寸，穩(wěn)定性，以及高分辨NMR和X-射線結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的可利用性。Tendamistat的總體拓撲結(jié)構(gòu)，類似于免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的拓撲結(jié)構(gòu)，通過一系列的環(huán)將兩個β折疊連接在一起。與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域不同，Tendamistat的β折疊通過兩個，而不是一個二硫鍵保持在一起，產(chǎn)生了所述蛋白的明顯的穩(wěn)定性。通過與存在于免疫球蛋白中的CDR環(huán)的類比，Tendamistat的環(huán)可以發(fā)揮類似的功能，并且能夠通過體外誘變方便地隨機化。不過，Tendamistat源于唐德鏈霉菌，并且在人體內(nèi)可以具有免疫原性。不過，它的小的尺寸，可能降低或抑制它的免疫原性。
另外，業(yè)已將III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域用作蛋白構(gòu)架，結(jié)合實體可以與它連接。例如，將所述III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域用作結(jié)合實體(例如CDR肽)的蛋白構(gòu)架的序列，載體和克隆方法披露于美國專利申請?zhí)?0020019517中。纖連蛋白是一種大型蛋白，它在細胞外基質(zhì)的形成和細胞-細胞相互作用方面發(fā)揮重要作用。纖連蛋白由三種類型(I，II和III)的小的結(jié)構(gòu)域的很多重復組成。Baron，M.，Norman，D.G.& Campbell，I.D.(1991)Protein modules Trends Biochem.Sci.16，13-17。III型纖連蛋白是免疫球蛋白超家族的大的亞家族(Fn3家族或s-型Ig家族)的一部分。Fn3家族包括細胞粘附分子，細胞表面激素和細胞因子受體，侶伴蛋白，和碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。有關(guān)綜述，參見Bork，P.& Doolittle，R.F.(1992)Proposedacquisition of an animal protein domain by bacteria.Proc.Nati.Acad.Sci.USA 89，8990-8994；Jones，E.Y.(1993)Theimmunoglobulin superfamily Curr.Opinion Struct.Biol.3，846-852；Bork，P.，Hom，L.& Sander，C.(1994)Theimmunoglobulin fold.Structural classification，sequencepatterns and common core.J.Mol.Biol.242，309-320；Campbell，I.D.& Spitzfaden，C.(1994)Building proteins withfibronectin type III modules Structure 2，233-337；Harpez，Y.& Chothia，C.(1994)Many of the immunoglobulin superfailydomains in cell adhesion molecules and surface receptorsbelong to a new structural set wllich is close to thatcoutaining variable domains J.Mol.Diol.238，528-539。
在所述免疫系統(tǒng)中，選擇特異性抗體，并且用大型文庫擴增(親和力成熟)。在所述免疫細胞中采用的組合技術(shù)，可以通過誘變和制備結(jié)合實體的組合文庫而模擬。因此，結(jié)合實體，抗體片段和抗體可以通過展示類型技術(shù)制備，包括，但不局限于噬菌體展示，逆轉(zhuǎn)錄病毒展示，核糖體展示和其他使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)的技術(shù)，并且，所得到的分子可以進行其他成熟，如親和力成熟，因為所述技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的。Wright和Harris，同上。Hanes和Plucthau PNAS USA944937-4942(1997)(核糖體展示)，Parmley和Smith Gene 73305-318(1988)(噬菌體展示)，Scott TIBS 17241-245(1992)，Cwirla等PNAS USA 876378-6382(1990)，Russel等Nucl.AcidsResearch 211081-1085(1993)，Hoganboom等Immunol.Reviews13043-68(1992)，Chiswell和McCafferty TIBTECH 1080-84(1992)，以及美國專利號5,733,743。
因此，本發(fā)明還提供了使抗體突變以便優(yōu)化它們的親和力，選擇性，結(jié)合強度和/或其他理想特性的方法。突變型抗體表示一種抗體的氨基酸序列變體。一般，所述突變抗體上的一個或多個氨基酸殘基與存在于參考抗體上的相應(yīng)殘基不同。所述突變抗體與所述參考氨基酸必須具有少于100％的序列相同性或相似性。一般，突變抗體與參考抗體的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有至少75％的氨基酸序列相同性或相似性。突變抗體與參考抗體的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列優(yōu)選具有至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％的氨基酸序列相同性或相似性。突變抗體的一種方法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。
例如，可以將使用噬菌體展示的親和力成熟用作制備突變抗體的一種方法。使用噬菌體展示的親和力成熟表示描述于以下文獻中的方法Lowman等，Biochemistry 30(45)10832-10838(1991)，還可參見Hawkins等，J.Mol Biol.254889-896(1992)。盡管對以下說明沒有更多限制，可以將該方法簡單地描述為涉及若干抗體超變區(qū)在多個不同位點的突變，其目標是在每一個位點產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。因此，所產(chǎn)生的抗體突變體，是以單價形式作為融合蛋白由絲狀噬菌體顆粒表達的。通常對M13的基因III產(chǎn)物進行融合。各種突變體的噬菌體表達，可以通過對感興趣的性狀的若干輪選擇進行循環(huán)，例如，結(jié)合親和力或選擇性。分離感興趣的突變體并且測序。所述方法更詳細地描述于以下文獻中美國專利5,750,373，美國專利6,290,957和Cunningham，B.C.等，EMBO J.13(11)，2508-2515(1994)。
在一種實施方案中，本發(fā)明提供了如下方法，即操縱抗體多肽或抗體編碼性核酸，制備能識別與COU-1抗體相同的表位的具有改善了的結(jié)合特性的抗體和抗體片段。
突變COU-1抗體的部分的所述方法包括將編碼具有SEQ ID NO7-35中的任意一個或SEQ ID NO8，10，12，15，17，19，22，24，27，29，32，47，48或49中任意一個的多肽的核酸融合在編碼噬菌體外被蛋白的核酸上，以便制備編碼融合蛋白的重組核酸，使編碼所述融合蛋白的重組核酸突變，以便制備編碼突變?nèi)诤系鞍椎耐蛔兒怂?，在噬菌體的表面上表達所述突變?nèi)诤系鞍祝⑶疫x擇與本發(fā)明表位結(jié)合的噬菌體。
在一種實施方案中，所述方法包括將具有SEQ ID NO7-35的任意組合或SEQ ID NO8，10，12，15，17，19，22，24，27，29，32，47，48或49的任意組合的多肽的核酸與編碼噬菌體外被蛋白的核酸融合，以便制備編碼融合蛋白的重組核酸，使編碼所述融合蛋白的重組核酸突變，以便制備編碼突變?nèi)诤系鞍椎耐蛔兒怂?，在噬菌體表面上表達所述突變?nèi)诤系鞍?，并且選擇能結(jié)合本發(fā)明表位的噬菌體。
在另一種實施方案中，所述方法包括將編碼SEQ ID NO26，15，27，22，23，24和25中的每一個的多肽的核酸與編碼噬菌體外被蛋白的核酸融合，以便制備編碼融合蛋白的重組核酸，使編碼所述融合蛋白的重組核酸突變，以便制備編碼突變?nèi)诤系鞍椎耐蛔兒怂?，在噬菌體表面上表達所述突變?nèi)诤系鞍?，并且選擇能結(jié)合本發(fā)明表位的噬菌體。
在另一種實施方案中，所述方法包括將編碼具有SEQ ID NO26，27，28，29，30，31，32和33中的每一個的多肽的核酸與編碼噬菌體外被蛋白的核酸融合，以便制備編碼融合蛋白的重組核酸，使編碼所述融合蛋白的重組核酸突變，以便制備編碼突變?nèi)诤系鞍椎耐蛔兒怂?，在噬菌體表面上表達所述突變?nèi)诤系鞍祝⑶疫x擇能結(jié)合本發(fā)明表位的噬菌體。
在另一種實施方案中，所述方法涉及將編碼具有SEQ ID NOSEQID NO34或SEQ ID NO35的多肽的核酸與編碼噬菌體外被蛋白的核酸融合，以便制備編碼融合蛋白的重組核酸，使編碼所述融合蛋白的重組核酸突變，以便制備編碼突變?nèi)诤系鞍椎耐蛔兒怂幔谑删w表面上表達所述突變?nèi)诤系鞍?，并且選擇能結(jié)合本發(fā)明表位的噬菌體。SEQ ID NO34和35編碼可以結(jié)合本發(fā)明表位的有用的可變輕鏈。下面提供了SEQ ID NO34。
TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYCQQYGNSPPYTFGQGTKLEI下面提供了SEQ ID NO35。
TQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAGYYCQQYYSTPPMFGQGTKVEI所述方法還涉及將包括與COU-1相關(guān)的可變重鏈和輕鏈(例如SEQID NO36-39中的任意一個)的核酸與編碼噬菌體外被蛋白的核酸融合，以便制備編碼融合蛋白的重組核酸，使編碼所述融合蛋白的重組核酸突變，以便制備編碼突變?nèi)诤系鞍椎耐蛔兒怂?，讓所述突變?nèi)诤系鞍自谑删w表面上表達，并且選擇能結(jié)合本發(fā)明表位的噬菌體。
因此，本發(fā)明涉及編碼與COU-1相關(guān)的可變重鏈的核酸，例如，下面提供的SEQ ID NO36。
GGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCGTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCAGCAGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATCAACCCTAGTGGTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAACACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGTGGTGGTAGCTGCTACTTTGTCCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
在另一種實施方案中，本發(fā)明涉及編碼與COU-1相關(guān)的可變輕鏈的核酸，例如，下面提供的SEQ ID NO37。
GAGCTCACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGGGTACCAACTGGGGGATCGCCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGATATTAAACGA在另一種實施方案中，本發(fā)明涉及編碼與COU-1相關(guān)的可變輕鏈的核酸，例如，下面提供的SEQ ID NO38(又被稱為L8)。
ACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGCGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAACTCACCTCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCA在另一種實施方案中，本發(fā)明涉及編碼與COU-1相關(guān)的可變輕鏈，例如，SEQ ID NO39(又被稱為T5)。
ACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTCTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGTTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGGTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTACTCCTCCGATGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATC
所述方法還包括構(gòu)建含有編碼本發(fā)明多肽的核酸的可復制的表達載體，例如，包括SEQ ID NO7-35中任意一個的多肽，或包括SEQ IDNO36-39中任意一個的核酸。所述核酸還可以編碼包括本發(fā)明多肽(例如SEQ ID NO7-35中任意一個)和天然或野生型噬菌體外被蛋白的至少一部分的融合蛋白。所述表達載體還可以具有可操作地與編碼所述融合蛋白的核酸連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。在編碼所述抗體多肽的核酸內(nèi)的一個或多個特定位點上對所述載體進行突變，以便形成含有相關(guān)的核酸的質(zhì)粒的家族或“文庫”，它們各自編碼略微不同的抗體多肽。用所述質(zhì)粒家族轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞。用具有編碼所述噬菌體外被蛋白的基因的輔助噬菌體感染所述轉(zhuǎn)化過的宿主細胞，并且，在適合形成重組噬菌粒顆粒的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化過的，感染過的宿主細胞。每一種重組噬菌粒在噬菌粒顆粒表面上具有大致一個拷貝的融合蛋白。為了篩選所述噬菌粒，讓所述噬菌粒顆粒接觸本發(fā)明的表位或抗原。將能結(jié)合所述表位或抗原的噬菌粒顆粒與不能結(jié)合所述表位或抗原的噬菌粒顆粒分離。另外，優(yōu)選通過分別克隆具有可接受的結(jié)合特性的噬菌粒并再次測試它們的親和力一次或多次進行其他輪次的選擇。還可以將能適當結(jié)合所述表位或抗原的噬菌粒顆粒中的所述質(zhì)粒分離，克隆，甚至再次突變，以便進一步選擇所述需要的抗體特性，例如，具有良好的結(jié)合親和力。
所述方法可應(yīng)用于由一種以上亞基多肽組成的多肽復合物。在這種情況下，將編碼每一種感興趣的亞基的核酸分別融合在噬菌體外被蛋白上，并且分別分析它們的結(jié)合特性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員所使用的任何克隆方法，都可用于制備表達載體，用于所述親和力成熟/噬菌體展示方法中。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地采用已知的克隆方法，將編碼抗體超變區(qū)的核酸融合在編碼噬菌體外被蛋白的核酸上。例如，參見Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989；Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，2001。
因此，本發(fā)明涉及選擇具有所需特性的抗體和/或抗體片段或多肽的方法。所述理想的特性可以包括對本發(fā)明表位的增強了的結(jié)合親和力或選擇性。
本發(fā)明的抗體和抗體片段，是分離的抗體和抗體片段。分離的抗體是業(yè)已鑒定的并且從生產(chǎn)它的環(huán)境的成分中分離和/或回收的抗體。其生產(chǎn)環(huán)境的污染成分，是會干擾所述抗體的診斷或治療用途的材料，并且可能包括酶，激素，和其他蛋白類或非蛋白類溶質(zhì)。術(shù)語“分離的抗體”還包括重組細胞內(nèi)的抗體，因為將不存在所述抗體的天然環(huán)境中的至少一種成分。不過，一般來說，分離的抗體可以通過至少一個純化步驟制備。
如果需要的話，本發(fā)明的抗體可以通過任何可利用的方法純化。例如，所述抗體可以通過將抗體制劑結(jié)合在固體支持物上進行親和純化，將用于制備所述抗體的抗原結(jié)合在所述支持物上。在洗去污染物之后，可以通過已知方法洗脫所述抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以了解免疫學技術(shù)領(lǐng)域的多種常見技術(shù)，這些技術(shù)被用于純化和/或濃縮多克隆抗體，以及單克隆抗體(例如，參見Coligan等，Unit 9，CurrentProtocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，被收作本文參考)。
在優(yōu)選實施方案中，所述抗體通過至少三種不同的方法衡量是純化的1)通過Lowry方法測定超過抗體重量95％，最優(yōu)選超過抗體重量的99％；2)通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀可以達到足以獲得N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基的程度；或3)在還原或非還原條件下，使用考馬斯藍或優(yōu)選使用銀染料，通過SDS-PAGE能達到均勻性。
抗原，結(jié)合實體和抗體變體和衍生物本發(fā)明還提供了本發(fā)明所鑒定的抗原性表位，結(jié)合實體和抗體片段的變體和衍生物。例如，SEQ ID NO3，4，5或6抗原性表位的任何衍生物或變體，都被認為屬于本發(fā)明的范圍，特別是當所述變體或衍生物在作為疫苗用于預防或治療腺癌時，保留了或具有改善的特異性，或者是用于檢測腺癌的改進的標記。類似地，本發(fā)明預期SEQ ID NO7-35抗體多肽的任何衍生物或變體，特別是當所述變體或衍生的抗體多肽對本發(fā)明的抗原性表位具有改善了的特異性或結(jié)合親和力時，例如，具有SEQ ID NO3，4，5或6的抗原性表位。
本發(fā)明的衍生物和變體抗原性表位和抗體片段是通過在參考抗原表位和抗體片段的N-末端和/或C-末端缺失或添加一個或多個氨基酸；在所述參考抗原表位和抗體片段內(nèi)的一個和多個位點缺失或添加一個或多個氨基酸；或在所述參考抗原表位和抗體片段內(nèi)的一個和多個位點取代一個或多個氨基酸而由所述參考抗原表位和抗體產(chǎn)生的。因此，本發(fā)明的抗原表位和抗體片段能夠以多種方式改變，包括氨基酸取代，缺失，截短和插入。
例如，所述變體和衍生的抗原表位和抗體片段，可能是通過人類操作產(chǎn)生的。例如，使用上文所描述的噬菌體展示的親和力成熟技術(shù)，可用于制備具有本發(fā)明的抗原表位和抗體片段的變體和衍生物。用于突變或改變多肽序列的其他方法，在本領(lǐng)域中通常是可以獲得的。例如，抗原表位和抗體片段的氨基酸序列可以通過在編碼所述抗原表位和抗體片段上的DNA的突變制備。用于誘變和核苷酸序列改變的方法在本領(lǐng)域中也是可以獲得的。例如，參見Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)；Kunkel等，Methods in Enzymol.，154，367(1987)；美國專利號4,873,192；Walker and Gaastra，eds.，Techniques in Molecular Biology，MacMillan PublishingCompany，New York(1983)，以及這些文章中所引用的參考文獻。不會對感興趣的肽的結(jié)構(gòu)完整性和/或生物學活性產(chǎn)生負面影響的合適的氨基酸取代的指南，可以從Dayhoff等的模型中查閱到(Atlas ofProtein Sequence and Structure)，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，C.D.(1978))，被收作本文參考。
本發(fā)明的抗原表位和抗體片段的衍生物和變體與SEQ ID NO3-35中任意一個的氨基酸位置具有至少大約90％，91％，92％，93％或94％的相同性，并且通常具有相對具有SEQ ID NO3-35中任意一個的抗原表位和抗體片段的類似的或改善了的免疫學特性。在理想的實施方案中，抗原表位和抗體片段的衍生物和變體與SEQ ID NO3-35中任意一個的氨基酸位置具有至少大約95％或96％的相同性，并且，通常具有類似于和好于具有SEQ ID NO3-35的抗體片段的抗原表位的免疫學特性。在更優(yōu)選的實施方案中，所述抗原表位和抗體片段衍生物以及變體與SEQ ID NO3-35中任意一個的氨基酸位置具有至少大約97％或98％的相同性，并且通常具有相對具有SEQ ID NO3-35的抗原表位和抗體片段的類似的或改善了的免疫學特性。
“類似的或改善了的免疫學特性”表示SEQ ID NO3，4，5或6抗原表位的衍生物保留了或具有改善了的作為疫苗用于預防或治療腺癌的活性，或是用于檢測腺癌的改善了的標記。類似地，SEQ ID NO7-35抗體多肽的衍生物或變體當它們具有對本發(fā)明的抗原表位，例如具有SEQ ID NO3，4，5或6的抗原表位的改善了的特異性或結(jié)合親和力時，就具有“類似的或改善了的免疫學特性”。
所述抗原表位，結(jié)合實體和抗體片段以及它的衍生物和變體的氨基酸殘基，可以是遺傳學編碼的L-氨基酸，天然存在的非遺傳學編碼的L-氨基酸，合成的L-氨基酸或上述任意一種的D-對映體。在本發(fā)明中用于二十種遺傳學編碼的L-氨基酸和常見非編碼氨基酸的氨基酸符號是常規(guī)的，并且如表1所示。
表1
本發(fā)明范圍內(nèi)的本發(fā)明抗原表位和抗體片段的變體，可以具有用類似化學和/或物理學特性的一種氨基酸取代的一個或多個氨基酸，只要所述變體肽的主鏈部分具有相對于具有SEQ ID NO3-35中任意一個的抗原表位和抗體片段的類似的或改善了的免疫學特性就行。衍生的抗原表位和抗體片段可以具有其他肽或化學部分，以及用具有不同化學和/或物理特性的氨基酸取代過的一個或多個氨基酸，只要所述衍生的抗原表位和抗體片段具有相對于具有SEQ ID NO3-35中任意一個的抗原表位和抗體片段的類似的或改善了的免疫學特性就行。
可以相互取代以便形成本發(fā)明的變體抗原表位和抗體片段的氨基酸通常屬于類似的類型或亞型。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，可以將氨基酸劃分成三種主要類型親水性氨基酸，疏水性氨基酸和半胱氨酸樣氨基酸，這主要取決于所述氨基酸側(cè)鏈的特征。這些主要類型可以進一步劃分成亞型。親水性氨基酸包括具有酸性，堿性或極性側(cè)鏈的氨基酸，而疏水性氨基酸包括具有芳族或非極性側(cè)鏈的氨基酸。非極性氨基酸可以進一步細分成包括脂族氨基酸。本文所使用的氨基酸類型的定義如下“疏水性氨基酸”表示具有在生理學pH條件下不帶電荷的側(cè)鏈的氨基酸，并且它是被水溶液排斥的。遺傳學編碼的疏水性氨基酸的例子包括Ile，Leu和Val。非遺傳學編碼的疏水性氨基酸的例子包括t-BuA。
“芳族氨基酸”表示具有包括至少一個具有共軛的π-電子系統(tǒng)的環(huán)的側(cè)鏈(芳族基團)的疏水性氨基酸。芳族基團還可以用諸如烷基，烯基，炔基，羥基，磺?；?，硝基和氨基，以及其他基團的取代基取代。遺傳學編碼的芳族氨基酸的例子包括苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。常見的非遺傳學編碼的芳族氨基酸包括苯基甘氨酸，2-萘基丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，和4-氟苯丙氨酸。
“非極性氨基酸”表示具有在生理學pH下通常是不帶電荷的并且是無極性的側(cè)鏈的疏水性氨基酸。遺傳學編碼的非極性氨基酸的例子包括甘氨酸，脯氨酸，和甲硫氨酸。非編碼的無極性氨基酸的例子包括Cha。
“脂族氨基酸”表示具有飽和的或不飽和的直鏈，支鏈或環(huán)狀烴側(cè)鏈的非極性氨基酸。遺傳學編碼的脂族氨基酸的例子包括Ala，Leu，Val和Ile。非編碼的脂族氨基酸的例子包括NIe。
“親水性氨基酸”表示具有由水溶液吸引的側(cè)鏈的氨基酸。遺傳學編碼的親水性氨基酸的例子包括Ser和Lys。非編碼的親水性氨基酸的例子包括Cit和hCys。
“酸性氨基酸”表示具有pK值小于7的側(cè)鏈的親水性氨基酸。酸性氨基酸通常具有在生理學pH下帶負電荷的側(cè)鏈，這是由于喪失了氫離子。遺傳學編碼的酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸和谷氨酸。
“堿性氨基酸”表示具有pK值大于7的側(cè)鏈的親水性氨基酸。堿性氨基酸通常具有在生理學pH下帶正電荷的側(cè)鏈，這是由于與水合氫離子的結(jié)合產(chǎn)生的。遺傳學編碼的堿性氨基酸的例子包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸。非遺傳學編碼的堿性氨基酸的例子包括非環(huán)狀氨基酸鳥氨酸，2，3-二氨基丙酸，2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
“非極性氨基酸”表示具有在生理學pH下不帶電荷的側(cè)鏈的親水性氨基酸，不過，它具有如下鍵，其中由兩個原子所共同擁有的電子對由所述原子之一更緊密地保持。遺傳學編碼的極性氨基酸的例子包括天冬酰胺和谷氨酰胺。非遺傳學編碼的極性氨基酸的例子包括瓜氨酸，N-乙酰賴氨酸和甲硫氨酸亞砜。
“半胱氨酸樣氨基酸”表示具有能夠與另一個氨基酸殘基的側(cè)鏈形成共價鍵的側(cè)鏈的氨基酸，如二硫鍵。通常，半胱氨酸樣氨基酸一般具有包括至少一個硫醇(SH)基團的側(cè)鏈。遺傳學編碼的半胱氨酸樣氨基酸的例子包括半胱氨酸。非遺傳學編碼的半胱氨酸樣氨基酸的例子包括高半胱氨酸和青霉胺。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所能夠理解的，上述分類不是絕對的。若干種氨基酸具有一種以上特有的特征，并且因此能夠包括在一種以上類型中。例如，酪氨酸同時具有芳族環(huán)和極性羥基。因此，酪氨酸具有雙重特性，并且能夠包含在芳族和極性類型中。類似地，除了能夠形成二硫鍵之外，半胱氨酸還具有非極性特征。因此，盡管不能嚴格劃分為疏水性或非極性氨基酸，在很多場合下，可將半胱氨酸用于賦予多肽的疏水性。
在本發(fā)明的變體多肽上存在的或取代它上面的氨基酸的某些通常會遇到的不是遺傳學編碼的氨基酸包括，但不局限于β-丙氨酸(b-Ala)和其他ω-氨基酸，如3-氨基丙酸(Dap)，2，3-二氨基丙酸(Dpr)，4-氨基丁酸等等；α-氨基異丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸(MeGly)；鳥氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔-丁基丙氨酸(t-BuA)；叔-丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基異亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；環(huán)己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亞砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰賴氨酸(AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，3-二氨基丁酸(Dbu)；對-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基纈氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)和高絲氨酸(hSer)。所述氨基酸同樣屬于上面所定義的類型。
上述遺傳學編碼的和非編碼的氨基酸的分類歸納在下面的表2中。應(yīng)當理解的是，表2僅僅是用于說明目的的，而不是要窮舉可以包括本文所描述的變體和衍生的抗原表位和抗體片段的氨基酸殘基?？捎糜谥苽浔疚乃枋龅淖凅w和衍生的多肽的其他氨基酸殘基可以從以下文獻中查閱到，例如，F(xiàn)asman，1989，CRC Practical Handbookof Biochemistry and Molecular Biology，CRC Press，Inc.，以及它所引用的參考文獻。沒有在這里專門提到的氨基酸，可以根據(jù)已知的行為和/或它們的特征性化學和/或物理學特征方便地劃分成上述類型，在劃分時與專門指定的氨基酸進行比較。
表2
本發(fā)明的抗原表位和抗體片段可以具有通過任何類似的分類的氨基酸取代的任何氨基酸，以便產(chǎn)生變體抗原表位或變體抗體片段，只要所述變體具有與具有SEQ ID NO3-35中任意一個的抗原表位和抗體片段的特征相似或改善了的免疫學特性就行。
因此，本發(fā)明還涉及具有與按照本發(fā)明方法分離的可變輕鏈或重鏈CDR片段相關(guān)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體和抗體。例如，可變輕鏈CDR1片段可以排列如下RASQS V-SSS ----Y LA(SEQ ID NO15)KSSQS LLYSS NNKNY LA(SEQ ID NO27)相關(guān)的可變輕鏈CDR1片段和結(jié)合實體具有以下結(jié)構(gòu)式(SEQ ID NO47)。
Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27
其中Xaa11是堿性氨基酸；Xaa12是脂族氨基酸或極性氨基酸；Xaa13，Xaa15，Xaa19，和Xaa20分別是絲氨基酸；Xaa14是谷氨酰胺；Xaa16，Xaa26，和Xaa27分別是脂族氨基酸；Xaa17是脂族氨基酸或不是氨基酸；Xaa18和Xaa25分別是極性氨基酸；Xaa21，Xaa22，和Xaa24分別是極性氨基酸或不是氨基酸；和Xaa23是堿性氨基酸或不是氨基酸。
在某些實施方案中，Xaa21，Xaa22，和Xaa24是天冬酰胺或不是氨基酸。在其他實施方案中，Xaa25是酪氨酸。
所述可變輕鏈CDR2片段可以排列如下DASNRAT(SEQ ID NO17)GASSRAT(SEQ ID NO22)和WASTRES(SEQ ID NO29)。
相關(guān)的可變輕鏈CDR2片段和結(jié)合實體具有以下結(jié)構(gòu)式(SEQ ID NO48)。
Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37其中Xaa31是酸性氨基酸，非極性或芳族氨基酸；Xaa32是丙氨酸；Xaa33是絲氨酸；Xaa34和Xaa37分別是極性氨基酸；Xaa35是堿性氨基酸；而Xaa36是酸性或脂族氨基酸。
所述可變輕鏈CDR3片段可以排列如下QQYGNSPPYT(SEQ ID NO24)和QQYYSTPPM(SEQ ID NO32)。
相關(guān)的可變輕鏈CDR3片段和結(jié)合實體具有以下結(jié)構(gòu)式(SEQ ID NO49)。
Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50其中Xaa41和Xaa42分別是谷氨酰胺；Xaa43是酪氨酸；Xaa44和Xaa49分別是非極性，極性或芳族氨基酸；Xaa45和Xaa46分別是極性氨基酸；Xaa47和Xaa48分別是脯氨酸；而Xaa50是極性氨基酸或不是氨基酸。
檢測癌相關(guān)表位本發(fā)明還提供了在生物學檢測樣品中檢測本發(fā)明的癌相關(guān)表位的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的任何免疫測定或體內(nèi)成像方法，都可用于檢測生物學測試樣品中的本發(fā)明的癌相關(guān)表位。例如，本發(fā)明的癌相關(guān)表位可以通過免疫化學，免疫組織學，ELISA，放射免疫測定，核磁共振，磁共振成像，表面等離子體共振和相關(guān)的方法檢測。
所述方法可以包括讓測試樣品與能夠結(jié)合本發(fā)明的癌相關(guān)表位的抗體或結(jié)合實體接觸的步驟，以及檢測所述抗體或結(jié)合實體是否與所述樣品的成分結(jié)合的步驟。所述方法還包括從被懷疑患有癌癥的患者體內(nèi)獲得生物學樣品(例如，細胞，血液，血漿，組織等)的步驟，讓所述樣品與對本發(fā)明的癌相關(guān)表位特異的標記過的抗體或標記過的結(jié)合實體接觸的步驟，以及利用標準免疫測定和/或診斷成像技術(shù)檢測所述表位的步驟。所述抗體或結(jié)合實體與所述生物學樣品的結(jié)合，表明了所述樣品含有所述表位。
在另一種實施方案中，可以將所述癌相關(guān)表位用于檢測患有癌癥的哺乳動物的血液，血清，或組織中的抗體。當所述癌相關(guān)表位在惡性轉(zhuǎn)化期間變得暴露時，所述抗體可以在哺乳動物體內(nèi)自然產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明提供了檢測哺乳動物體內(nèi)的癌的方法，包括讓檢測樣品與本發(fā)明的癌相關(guān)表位接觸，并且檢測來自所述測試樣品的抗體是否業(yè)已與所述癌相關(guān)表位結(jié)合。
能與本發(fā)明的癌相關(guān)表位和/或包括本發(fā)明的癌相關(guān)表位的多肽起反應(yīng)的抗體或結(jié)合實體可以進行標記，或與診斷成像試劑結(jié)合，以便有利于癌的檢測。
術(shù)語“標記”和診斷成像劑，表示直接和間接與抗體，抗原或表位綴合的可檢測的化合物或組合物。所述標記本身是可檢測的(例如，放射性同位素標記或熒光標記)，或者對于酶標記來說，能夠催化可以檢測的底物化合物或組合物的化學改變。
所述標記或診斷成像劑，可用于對能表達所述癌相關(guān)表位的細胞和組織成像。所述標記還可以與本發(fā)明的癌相關(guān)表位一起用于標準免疫測定中。標記和診斷成像劑包括，但不局限于硫酸鋇，碘醋胺酸，碘番酸，碘泊酸鈣，泛影酸鈉，泛影葡胺，甲泛葡胺，丁酰碘番酸鈉和放射性診斷制劑，包括正電子發(fā)射劑，如氟-18和碳-11；γ射線發(fā)射劑，如碘-123，锝-99m，碘-131和銦-111；用于核磁共振的核素，如氟和釓。
用于體內(nèi)診斷目的的順磁同位素也可根據(jù)本發(fā)明的方法應(yīng)用。存在多種可用于磁共振成像的元素的例子。例如，有關(guān)體內(nèi)核磁共振成像的討論可以參見Schaefer等，(1989)JACC 14，472-480；Shreve等，(1986)Magn.Reson.Med.3，336-340；Wolf，G.L.，(1984)Physiol.Chem.Phys.Med.NMR 16，93-95；Wesbey等，(1984)Physiol.Chem.Phys.Med.NMR 16，145-155；Runge等，(1984)Invest.Radiol.19，408-415。合適的熒光標記的例子包括熒光素標記，異硫氰酸鹽標記，羅丹明標記，藻紅蛋白標記，藻藍蛋白標記，別藻藍蛋白標記，鄰苯二醛標記，熒光胺標記等?；瘜W發(fā)光標記的例子包括魯米那標記，異魯米那標記，芳族吖啶酯標記，咪唑標記，吖啶鹽標記，草酸酯標記，熒光素標記，熒光素酶標記，水母發(fā)光蛋白標記等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以了解可以根據(jù)本發(fā)明使用的其他合適的標記。
所述標記與抗體或它的片段的結(jié)合，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的標準技術(shù)實現(xiàn)。典型的技術(shù)描述于以下文獻中Kennedy等，(1976)Clin.Chim.Acta 70，1-31；和Schurs等，(1977)Clin.Chim.Acta 81，1-40。在后面所提到的結(jié)合技術(shù)是戊二醛方法，高碘酸方法，二馬來酰亞胺方法，間馬來酰芐基-N-羥基-琥珀酰亞胺酯方法。上述所有方法都被收作本文參考。
可以將固相或固體支持物與本發(fā)明的抗體，結(jié)合實體，抗原或表位組合應(yīng)用。所述固相或固體支持物表示無水基質(zhì)，所述抗體，結(jié)合實體，抗原或表位可以與它連接。在本發(fā)明中固相和固體支持物的例子包括部分或完全由玻璃(例如，控制孔度玻璃)，多糖(例如瓊脂糖)，聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇和硅氧烷形成的固相和固體支持物。在某些實施方案中，根據(jù)具體場合，所述固相或支持物可以包括測定平板的孔；在其他場合下，它是純化柱(例如，親和層析柱)。該術(shù)語還包括分離的顆粒的不連續(xù)的固相，如在美國專利號4,275,149所描述的。治療根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的抗原表位，針對所述表位的抗體或結(jié)合實體，以及能抑制本發(fā)明表位形成的蛋白酶抑制劑，可用于癌癥的預防和/或治療。可以將本發(fā)明的抗原表位用作疫苗，用于刺激哺乳動物的免疫反應(yīng)，所述反應(yīng)是針對具有癌相關(guān)表位的細胞的。針對本發(fā)明抗原表位的抗體或結(jié)合實體能夠?qū)够蝾A防腺癌。另外，本發(fā)明預期施用能抑制細胞角蛋白8和/或細胞角蛋白18的裂解的蛋白酶抑制劑，以便預防和治療腺癌。
在一種實施方案中，本發(fā)明提供了預防或治療哺乳動物腺癌的方法，包括給所述哺乳動物施用足以刺激針對所述抗原表位的免疫學反應(yīng)的量的包括SEQ ID NO3-6中任意一個的抗原表位?？梢詫煞N或兩種以上包括SEQ ID NO3-6的多肽組合在治療組合物中，并且分若干個劑量，用一定時間施用，以便優(yōu)化所述哺乳動物的免疫學反應(yīng)。所述免疫學反應(yīng)可以通過觀察在所述哺乳動物的血流中是否存在針對本發(fā)明表位的抗體進行檢測和監(jiān)控。
本發(fā)明制備的能選擇性地與本發(fā)明的癌相關(guān)表位反應(yīng)的抗體和結(jié)合實體還可用于癌癥治療。因此，本發(fā)明提供了預防或治療哺乳動物腺癌的方法，包括給所述哺乳動物施用治療有效量的能夠結(jié)合包括SEQID NO3-6中任意一個的抗原表位的抗體或結(jié)合實體。
所述抗體或結(jié)合實體可以單獨使用，或與可用于治療的制劑結(jié)合或組合使用。抗體和/或結(jié)合實體可以給患有具有本發(fā)明抗原相關(guān)表位的任何癌癥的哺乳動物施用。所述施用可以同時提供治療性處理，和預防或防御性措施。例如，本發(fā)明的治療方法可用于阻止癌的擴散，并且導致癌的緩解。
在本文中，“可用于治療的制劑”包括任何能夠有利地靶定表達本文所描述的癌表位的細胞的任何治療分子，包括抗腫瘤劑，放射性碘化化合物，毒素，化療制劑，細胞抑制的或細胞裂解藥物。
例如，所述可用于治療的制劑包括adrimycin，氨魯米特，氨基喋呤，硫唑嘌呤，硫酸博來霉素，白消安，卡波鉑，洋紅霉素，卡氮芥，苯丁酸氮芥，順鉑，環(huán)磷酰胺，環(huán)孢菌素，cytarabidine，胞嘧啶阿拉伯糖苷，細胞毒素氮烯咪胺，放線菌素D，道諾霉素，正定霉素，阿霉素，esperamicins(參見美國專利號4,675,187)，足葉乙甙，氟尿嘧啶，異環(huán)磷酰胺，干擾素-α，環(huán)己亞硝脲，美法侖，巰基嘌呤，氨甲蝶呤，絲裂霉素C，米托坦，米托蒽醌，鹽酸甲基芐肼，紫杉酚，多西他塞(docetaxel)，替尼泊甙，硫鳥嘌呤，噻替哌，硫酸長春堿，硫酸長春新堿和長春烯堿。其他制劑包括披露于以下文獻中的制劑第52章，抗腫瘤劑(Paul Calabresi and Bruce A.Chabner)，以及對它的介紹，pp.1202-1263，of Goodman and Gilman′s″ThePharmacological Basis of Therapeutics″，Eighth Edition，1990，McGraw-Hill，Inc.(Health Professions Division)。毒素可以是蛋白，例如，美洲商陸抗病毒蛋白，霍亂毒素，百日咳毒素，蓖麻毒蛋白，gelonin，相思豆毒素，白喉外毒素或假單胞菌外毒素。毒素部分還可以是高能發(fā)射放射核素，如鈷-60，I-131，I-125，Y-90和Re-186，以及源于細菌，真菌，植物或動物的酶促活性毒素或它的片段。
根據(jù)本發(fā)明，可以將所述化療制劑用于減弱能表達本發(fā)明腫瘤相關(guān)表位的癌細胞和腫瘤的生長或擴散?？梢杂帽景l(fā)明的化療制劑治療的動物包括人，非人靈長類，母牛，馬，豬，綿羊，山羊，狗，貓，和嚙齒類動物等。在所有實施方案中，人類腫瘤抗原和人類對象是優(yōu)選的。
本發(fā)明還預期將物種依賴型抗體用于本發(fā)明的治療方法中。所述物種依賴型抗體具有與所選擇的物種大體上是非免疫學反應(yīng)性的恒定區(qū)。所述物種依賴型抗體特別適用于治療，因為它大體上不會產(chǎn)生免疫學反應(yīng)。所述物種依賴型抗體可以是上文所定義的多種類型抗體中的任意一種，不過優(yōu)選是哺乳動物的，更優(yōu)選是人源化的或人類抗體。
可以將可用于治療的制劑制備成具有本發(fā)明抗體的組合物，并且沒有必要直接連接在本發(fā)明的抗體上。不過，在某些實施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得的方法，將可用于治療的制劑連接在本發(fā)明的抗體上，例如，使用標準結(jié)合方法。
本發(fā)明還提供了預防或治療哺乳動物腺癌的方法，包括給所述哺乳動物施用治療有效量的能抑制包括SEQ ID NO3-6中任意一個的抗原表位形成的蛋白酶抑制劑。根據(jù)本發(fā)明，所述蛋白酶裂解的位點位于細胞角蛋白K8的22和40號氨基酸上。以及細胞角蛋白K18的50號氨基酸上，它們都包括共有序列Xaa1SR↓Xaa4(SEQ ID NO40)，其中Xaa1是絲氨酸，苯丙氨酸或纈氨酸，而Xaa4是絲氨酸或纈氨酸。所述裂解位點的結(jié)構(gòu)表明，決定所述裂解的所述酶是胰蛋白酶樣蛋白酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得胰蛋白酶抑制劑。例如，參見美國專利6,239,106；美國專利6,159,938；美國專利5,962,266。所述胰蛋白酶抑制劑包括可用于諸如絲氨酸蛋白酶的抑制劑，如激肽釋放酶，胰凝乳蛋白酶A和B，胰蛋白酶，彈性蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，凝血劑和前凝血劑，特別是活性形式的，包括凝固因子，如因子VIIa，IXa，Xa，XIa，和XIIa，纖溶酶，凝血酶；蛋白酶-3，腸激酶，頂體蛋白，組織蛋白酶，尿激酶和組織纖溶酶原激活物。
根據(jù)本發(fā)明，能夠抑制可以裂解Xaa1SR↓Xaa4(SEQ ID NO40)的蛋白酶的任何抑制劑都可用于預防或治療腺癌。例如，與Xaa1SR↓Xaa4(SEQ ID NO40)具有同源性，但是不能夠裂解的肽可以用作本發(fā)明治療方法的抑制劑。例如，可以使用的抑制劑的其他例子包括大豆胰蛋白酶抑制劑(或STI，購自Sigma Chemical Co.)，α-2-巨球蛋白，α-1-抗胰蛋白酶，抑蛋白酶肽，胰分泌型胰蛋白酶抑制劑(PSTI)，玉米和西葫蘆胰蛋白酶抑制劑(Wen等，Protein Exp.&Purif.4215(1993)；Pedersen等，J.Mol.Biol.236385(1994))，等等。來源于人類的一種有用的抑制劑候選物是以人淀粉樣β-蛋白前體(APPI)的循環(huán)同種型形式存在的，又被稱為蛋白酶連接蛋白-2。APPI包括被稱為KPI(Kunitz蛋白酶抑制劑)的Kunitz絲氨酸蛋白酶抑制劑。參見Ponte等，Nature，331525(1988)；Tanzi等，Nature331528(1988)；Johnstone等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1631248(1989)；Oltersdorf等，Nature 341144(1989)。人KPI與抑蛋白酶肽具有大約45％的氨基酸序列相同性。業(yè)已通過重組表達在多種系統(tǒng)中制備了分離的KPI結(jié)構(gòu)域，并且業(yè)已證實是有活性的絲氨酸蛋白酶抑制劑。例如，參見Sinha等，J.Biol.Chem.2658983(1990)。
腺癌的發(fā)展和/或化療的治療效力，可以通過本領(lǐng)域現(xiàn)有的方法測定。例如，特定化療制劑的效力，可以通過測定正在發(fā)生細胞死亡的腺癌細胞釋放的癌相關(guān)表位的數(shù)量確定。由細胞釋放的抗原表位(例如，具有SEQ ID NO3-6中任意一個的多肽，或所述多肽的組合)的濃度可以與來自健康的，未治療過的患者的標準進行比較，以便評估在患者體內(nèi)是否存在提高了的本發(fā)明表位的水平。可以在治療期間以獨立的間隔采集流體樣品，并且與標準進行比較。預計，本發(fā)明的與癌癥相關(guān)的抗原表位水平的改變，能夠指示治療的效力(即癌細胞死亡的速度)。預計癌相關(guān)抗原表位的釋放，可以在很多測試樣品中測定，包括血液，血漿，血清，糞便，尿液，唾液，陰道分泌物，精液，精子和任何組織樣品。
當所述測定方法被用于監(jiān)測腺癌的組織生活力或發(fā)展時，以一定間隔重復測定感興趣的樣品中抗原表位的存在和豐度的步驟，并且對這些值進行比較，檢測濃度的改變體現(xiàn)了所述組織狀態(tài)的改變。例如，腺癌相關(guān)表位的含量的提高，可能與腺癌的發(fā)展相關(guān)。在將所述測定方法用于評估治療的效力時，所述監(jiān)測步驟是在施用所述治療劑或進行治療方法之后進行的(例如，在施用化療制劑之后或在放射治療之后)。類似地，本發(fā)明的腺癌癌相關(guān)表位的水平的降低，可能與腺癌的抑制相關(guān)。
因此，可以通過本文所提供的癌相關(guān)抗原表位的存在鑒定腺癌。一旦鑒定了腺癌，就可以用抗體和能夠減弱細胞角蛋白8和18裂解的蛋白酶抑制劑處理所述腺癌。另外，本文所提供的方法可用于監(jiān)測疾病的發(fā)展和/或治療所述疾病。
組合物本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明抗體，結(jié)合實體，抗原表位或胰蛋白酶樣蛋白酶抑制劑的組合物。所述組合物可用于檢測本發(fā)明的抗原表位，并且用于涉及與本發(fā)明的抗原表位的存在相關(guān)的癌癥的預防和治療相關(guān)的治療方法。
本發(fā)明的抗體，結(jié)合實體，抗原表位和蛋白酶抑制劑可以制備成可以藥用的組合物，并且以適應(yīng)所選擇的施用途徑的多種形式給諸如人類患者的哺乳動物宿主施用。例如，施用途徑包括靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，皮下，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)和本領(lǐng)域技術(shù)人員所選擇的其他途徑。
本發(fā)明的抗體，結(jié)合實體，抗原表位和蛋白酶抑制劑的溶液可以用水或鹽水制備，并且任選地與無毒表面活性劑混合。用于靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)施用的制劑可以包括無菌水溶液，它還可以包括緩沖物，脂質(zhì)體，稀釋劑和其他合適的添加劑。
適合注射或輸液的藥用劑型，可以包括含有所述活性成分的無菌水溶液或分散液，所述無菌水溶液或分散液適合通過膠囊化在脂質(zhì)體中施用。在所有場合下，最終的劑型必須是無菌的流體，并且在生產(chǎn)和儲存條件下是穩(wěn)定的。
無菌注射溶液是通過以需要的用量將抗體，結(jié)合實體，抗原表位和蛋白酶抑制劑根據(jù)需要與上面所列舉的各種其他成分一起整合在合適的溶劑中，然后進行過濾消毒而制備的。
抗體，結(jié)合實體，抗原表位和蛋白酶抑制劑的有用劑量，可以通過觀察它們的體內(nèi)活性以及在動物模型中的體內(nèi)活性而確定。在小鼠和其他動物上推斷人類的有效劑量的方法為本領(lǐng)域所公知；例如參見美國專利號4,938,949。
一般，抗體，結(jié)合實體，抗原表位和蛋白酶抑制劑的合適劑量，在大約1-大約2000μg/kg范圍內(nèi)，例如，大約2.0-大約1500μg/kg體重/每次治療。優(yōu)選的劑量在每次治療受體的每千克體重大約3-大約500μg范圍內(nèi)，更優(yōu)選在大約10-大約300μg/kg/治療范圍內(nèi)，最優(yōu)選在大約20-大約200μg/kg/治療范圍內(nèi)。
所述抗體，結(jié)合實體，抗原表位和蛋白酶抑制劑，適宜以單位劑量形式施用，例如，每單位劑量形式含有5-1000μg，適宜的為10-750μg，最適宜的是50-500μg活性成分。
理想的是，應(yīng)當施用所述抗體，結(jié)合實體，抗原表位和蛋白酶抑制劑，以便獲得大約0.1-大約10nM的高峰血漿濃度，優(yōu)選大約0.2-10nM，最優(yōu)選大約0.5-大約5nM。例如，這一目的可以通過靜脈內(nèi)注射0.05-25％的抗體溶液，任選地在鹽水中注射而實現(xiàn)?？梢酝ㄟ^連續(xù)輸液維持理想的血液水平，以便提供大約0.01-10.0μg/kg/小時，或通過間接輸液含有大約0.4-50μg/kg的抗體。
理想的劑量適宜以單一劑量形式存在，或劃分成若干劑量，以適當?shù)拈g隔施用，例如，作為每天施用的兩個，三個，四個或更多個小劑量。所述小劑量本身還可以進一步細分，例如，劃分成多個獨立的松散間隔的施用；如多次靜脈內(nèi)劑量。例如，需要通過連續(xù)輸液或以獨立的劑量通過靜脈內(nèi)途徑長時間地施用本發(fā)明的組合物。
試劑盒本發(fā)明還提供了用于檢測本發(fā)明的抗原表位，并且用于治療腺癌的試劑盒。
用于檢測本發(fā)明的抗原表位的試劑盒，可以包括裝有能夠結(jié)合本發(fā)明的抗原表位的抗體或結(jié)合實體的容器?？梢詫λ隹贵w或結(jié)合實體進行標記，以便于檢測?？梢詫Κ毩⒌脑噭┖羞M行改良，以便實施本發(fā)明的一種或多種方法。
所述目標試劑盒還可以任選地包括至少一種實施所述方法所需要的其他制劑，所述方法是用所述試劑盒實施的。所述其他制劑的例子包括標記，標準物，對照，緩沖物，用于稀釋測試樣品的溶液，或有利于所述標記檢測的制劑。本發(fā)明試劑盒中所包含的試劑能夠以預先測定的單位形式提供，以便提供較高的準確性和精確性。通常，將試劑盒制劑和其他成分放置并且包裝在獨立的容器中。在所述試劑盒中還可以包括反應(yīng)容器，試管，微孔托盤，微量滴定平皿或其他容器?？梢詫⒉煌臉擞浻迷诓煌闹苿┥?，以便可以將每一種制劑彼此區(qū)分開來。
本發(fā)明的另一方面涉及用于治療腺癌的試劑盒，包括本發(fā)明的藥用組合物和說明材料。所述試劑盒可以包括裝有本發(fā)明的抗原表位，抗體，結(jié)合實體或抑制劑的容器。所述抗原表位能夠起著疫苗的作用，用于抑制轉(zhuǎn)移性腺癌的形成。所述抗體或結(jié)合實體是針對本發(fā)明的抗原表位的，并且可用于施用以治療或預防腺癌的擴散。細胞角蛋白8或12裂解的抑制劑還能夠抑制腺癌的形成和擴散。可以將所述抗原表位，抗體，結(jié)合實體或抑制劑的任意一種包含在所述試劑盒的合適的容器中。另外，可以在所述試劑盒的合適的容器中裝有抗原表位，抗體，結(jié)合實體或抑制劑的組合。
在本文中，“說明材料”包括出版物，記錄，圖表，或任何其他表達媒介，它被用于與本發(fā)明藥用組合物的用途聯(lián)系，用于抑制細胞角蛋白8或18的裂解或用于刺激所述免疫系統(tǒng)，以便在哺乳動物或患者體內(nèi)識別本發(fā)明的表位。例如，所述說明材料還可以說明本發(fā)明藥用組合物的合適劑量。例如，本發(fā)明的試劑盒的說明材料可以粘貼在裝有本發(fā)明藥用組合物的容器上，或者與裝有所述藥用組合物的容器一起運輸。另外，所述說明材料可以與本發(fā)明的容器分開運輸，以便所述說明材料和藥用組合物可以由接受者配合使用。
本發(fā)明還包括含有本發(fā)明藥用組合物的試劑盒和用于將所述組合物輸送到哺乳動物，例如患有腺癌的人類患者體內(nèi)的輸送裝置。舉例來說，所述輸送裝置可以是可擠壓的噴霧瓶，計量劑量噴霧瓶，氣溶膠噴霧裝置，噴霧器，干粉輸送裝置，自推進溶劑/粉末分配裝置，注射器，針頭，止血棉球或劑量測定容器。
將結(jié)合以下詳細例子對本發(fā)明作進一步說明，提供這些例子是為了說明本發(fā)明的，而不是為了限制本發(fā)明。
實施例1癌相關(guān)表位表征COU-1單克隆抗體的分離IgM HMab，COU-1是由雜交瘤細胞系B9165分泌的，所述細胞系是通過將人的類淋巴母細胞細胞系WI-L2-729-HF2與從結(jié)腸癌患者的腸系膜淋巴結(jié)中獲得的淋巴細胞融合而產(chǎn)生的(35)。在無菌條件下，切碎來自直腸結(jié)腸癌患者的腫瘤部位的腸系膜淋巴結(jié)。通過棉紗過濾除去碎片，并且通過在Ficoll-Isopaque(Boehringer-Mannheim，德意老聯(lián)邦共和國)上離心，純化淋巴細胞。
按照披露于以下文獻中的方法，將所述淋巴細胞與人融合細胞系W1-L2-729-HF2(稱之為HF2)(來自Tecniclone Int.，Santa Ana，Calif.，美國)融合Kohler，Immunological Methods Vol.II，Academic Press，1981，pp.285-298。HF2和淋巴細胞(107)之間的比例為1∶2。
在RPMI-1640培養(yǎng)基中一起洗滌HF2和所述淋巴細胞，并且通過離心收集所述細胞之后，將所述細胞沉淀物重新懸浮在0.5ml的50％聚乙二醇(PEG)6000中，穩(wěn)定搖晃1分鐘時間。在用RPMI-1640稀釋所述PEG之前，再將所述細胞溫育2分鐘。洗滌所得到的融合產(chǎn)物，并且重新懸浮在溶液培養(yǎng)基中[RPMI-1640，10％FCS(胎牛血清)，補充了HAT(2×10-4M次黃嘌呤，4×10-7M氨基喋呤，3.2×10-6M胸苷)]。將所述細胞鋪平板在96孔微量滴定板上，每孔使用含有2×105細胞的200μl體積。將細胞在選擇培養(yǎng)基上維持2周。在RPMI-1640中進一步培養(yǎng)，使用補充了次黃嘌呤和胸苷的10％FCS。在融合之后10天-4周，出現(xiàn)了生長的雜合體。在沒有飼養(yǎng)細胞的條件下，通過限制稀釋進行克隆。
通過ELISA，分析來自具有生長的克隆的孔的上清液的免疫球蛋白生產(chǎn)，使用用兔抗人Ig(H和L鏈)包衣的微量滴定平板(Dakopatts，Copenhagen，丹麥)，所述免抗人Ig用pH9.6的0.1M碳酸氫鹽，以1∶10,000的比例稀釋。用PBS-Tween(磷酸緩沖的鹽溶液--0.05％Tween 20)洗滌包衣過的孔，并且在室溫下與在PBS-Tween中以1∶10的比例稀釋的上清液一起溫育2小時。用對以1∶3000的比例在PBS-Tween中稀釋的IgM，IgA或IgG(Dakopatts，Copenhagen)特異的堿性磷酸酶(AP)-結(jié)合的抗體進行顯影。在室溫下溫育1小時之后，添加底物對-磷酸硝基苯酯(PNPP)，1mg/ml 10％二乙醇胺，1mM MgCl2，pH9.6。在37℃下溫育1小時之后，在405nm的波長下測定光學密度。通過稀釋IgM(Cappel)或IgG(Kabi AB，Stockholm，瑞典)建立用于定量的標準曲線。通過轉(zhuǎn)移到24孔大型平板(Nunc A/S，丹麥)上繁殖通過ELISA測定的產(chǎn)生免疫球蛋白(Ig)的雜合體。通過所述方法選擇的雜交瘤細胞系B9165(ECACC87040201)，分泌了下文所述的COU-1抗體，并且通過ELISA證實，在不改變培養(yǎng)基的條件下，使得它們生長2周時間，能產(chǎn)生1-5μg/IgM/ml。
所述雜交瘤細胞系B9165是由歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)保存的，CAMR，Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，英國，保藏號ECACC87040201。
通過免疫細胞化學分析進一步分析COU-1雜交瘤上清液與腫瘤細胞的反應(yīng)，或通過免疫組織化學分析，分析與腫瘤組織的反應(yīng)，正如下文所披露的。
COU-1抗體的免疫細胞化學分析對來自不同的人類腫瘤細胞系和來自外周人類血白細胞制備的細胞涂片進行免疫細胞化學分析。通過用甲醛-丙酮(9.5％甲醛，43％丙酮，溶解在86mM磷酸緩沖液中，pH7.2)處理，將細胞固定在載玻片上。將大約50μl的COU-1上清液(來自雜交瘤B9165；ECACC87040201)放置在固定細胞的涂片上，并且在4℃下，在潮濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，然后漂洗，并且在室溫下，與用PBS-Tween以1∶80的比例稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)-標記過的兔抗-人IgM(Dakopatts)一起溫育1小時。最后，添加過氧化物酶底物(0.01％H2O2和二氨基聯(lián)苯胺在PBS中配制成0.6μg/ml的濃度)。用蘇木精對所述涂片進行輕微的對染，并且封固。表3示出了通過分析各種細胞涂片上的COU-1獲得的結(jié)果。
表3通過免疫細胞化學測定的COU-1的反應(yīng)性細胞類型 名稱 反應(yīng)1.結(jié)腸腺癌Colon137 陽性2.結(jié)腸腺癌COLO 201 陽性3.黑素瘤 HU373 陰性4.乳腺癌 MCF-7 陽性5.十二指腸腺癌HUTU 80 陰性6.伯基特淋巴瘤EB-2 陰性7.人外周血白細胞 PBL 陰性與結(jié)腸和乳腺腺癌的選擇性反應(yīng)是明顯的。
在4℃下將活的COLO 201細胞(結(jié)腸腺癌細胞)與COU-1抗體一起溫育，然后與酶標記過的抗-Ig抗體一起溫育。然后將所述細胞涂抹在載玻片上，用戊二醛(0.17％，溶解在PBS中)固定，并且與底物一起溫育。用COU-1對COLO 201細胞進行染色，而對照細胞不染色(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。
免疫組織化學分析對在丙酮中固定的冷凍組織切片進行初步免疫組織化學分析。在與COU-1抗體(0.5μg/ml)一起溫育之前，通過與抗-μ-鏈抗體的Fab′片段(從Dakopatts，Copenhagen，丹麥購買)溫育，抑制內(nèi)源IgM。所述抗-μ-鏈抗體Fab′片段是按照以下文獻中的方法制備的B.Nielsen等，Hybridoma 6(1)，1987，pp.103-109)。盡管用COU-1抗體觀察到了癌組織的明確的特異性，但是在某些組織類型中(例如乳腺管)觀察到了某些非特異性結(jié)合。
采用改進了的固定方法，它能大體上消除與某些組織類型的非特異性交叉反應(yīng)，包括乳腺導管和乳腺管。組織樣品是從進行手術(shù)切除的結(jié)腸直腸癌患者體內(nèi)獲得的。正常結(jié)腸組織取自距腫瘤部位大約15厘米處的切除物。在4℃下，在96％的乙醇中固定組織6小時。然后，對組織進行石蠟包埋，并且切割成5微米的切片。在二甲苯中對切片進行脫石蠟，通過梯度乙醇進行再水合，并且用PBS-Tween洗滌。在室溫下，在潮濕培養(yǎng)箱中將切片與濃度均為0.5-10μg/ml的100μl的鼠單克隆抗體，人單克隆IgM抗體活正常多克隆人IgM抗體一起溫育2小時。洗滌所述載玻片，并且與AP-標記過的兔抗-人IgM(Dako，Glostrup，丹麥)，辣根過氧化物酶(HRP)標記過的兔抗-人IgM(Dako)或HRP-標記過的兔抗-小鼠IgG(Dako)一起溫育，所述抗體是用含有10％(w/v)牛血清清蛋白的PBS稀釋過的，溫育在室溫下進行1小時。在洗滌之后，通過用生色底物(0.6mg二氨基聯(lián)苯胺/ml PBS，含有0.01％H2O2)和具有0.2mg萘酚-AS-Mx磷酸(Sigma)的AP，1mg固紅TR鹽(Sigma)，20μg二甲基甲酰胺/ml 0.1M Tris/HCl，1M左旋咪唑，pH8.2顯影觀察HRP。用Mayer′s蘇木精對所述切片進行對染，在二甲苯中進行脫水，并且封固在Aquamount(Gurr，Poole，英國)中。
按上文所述進行免疫細胞化學分析的方法觀察結(jié)合的抗體。只有結(jié)腸腺癌切片中的腫瘤細胞能夠用COU-1染色。在扁桃腺組織中沒有觀察到染色。表4A和4B歸納了COU-1抗體與各種組織的反應(yīng)，其中，惡性腫瘤組織在表4A中提供，而非惡性腫瘤組織的反應(yīng)的缺乏在表4B中提供。
表4ACOU-1抗體反應(yīng)性與惡性腫瘤人組織組織結(jié)果a結(jié)腸腺癌19/21卵巢腺癌2/2腎臟腺癌1/2乳腺癌 7/9肺腺癌 7/7非精原細胞瘤睪丸癌 1/1肉瘤0/3惡性黑素瘤 0/7B-淋巴瘤0/1胸腺瘤 0/1a)陽性數(shù)量/檢測數(shù)量。
表4BCOU-1抗體反應(yīng)性與正常人組織
正常結(jié)腸上皮表現(xiàn)出所有分析過的人IgM，單克隆抗體，骨髓瘤IgM以及正常多克隆人IgM的結(jié)合。因此，IgM與正常結(jié)腸上皮的一般結(jié)合被判斷為非特異性的。
實施例2癌相關(guān)表位作圖材料和方法抗體如上文所述，IgM HMab，COU-1，是由雜交瘤細胞系B9165分泌的，該細胞系是通過將人的類淋巴母細胞細胞系WI-L2-729-HF2與從結(jié)腸癌患者的腸系膜淋巴結(jié)中獲得的淋巴細胞融合產(chǎn)生的。將雜交瘤細胞系B9165交由歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心保藏(ECACC)，CAMR，Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，英國，保藏號ECACC 87040201。有關(guān)ECACC的更多信息，可以在ecacc.org網(wǎng)站上查閱到。
所述人-人雜交瘤細胞系，是在無蛋白培養(yǎng)基中生長的補充了SSR3血清替代物(Medicult，Copenhagen，丹麥)的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，NY)。HMab COU-1是通過在瓊脂糖-結(jié)合的鼠抗-人μ-鏈單克隆抗體(Mab)上親和層析從細胞培養(yǎng)物上清液中純化的(HB57，ATCC，Rockville，MD)。用pH10.5的0.1M二乙胺洗脫所述抗體，然后通過FPLC分離。將從正常人血清中純化的IgM(Cappel，Cochranville，PA)用作對照。抗正常K8的鼠Mabs，M20以及抗正常K18的CY-90，是從Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)獲得的。
ELISA在4℃下，用存在于pH7.4的PBS中的來自細胞角蛋白純化方法的級份或不同的重組K8/K18復合物(5μg/ml)，對ELISA孔(Costar，Cambridge，MA)進行包衣過夜。用PBS洗滌所述孔2次，在37℃下，用由PBS配制的3％的BSA封閉1小時，并且，在37℃下，與HMab COU-1抗體一起溫育2小時。用PBS-0.05％Tween 20洗滌平板10次，并且用在PBS中稀釋1000倍的堿性磷酸酶(AP)-標記過的山羊抗-人κ鏈(Sigma)檢測結(jié)合的抗體。用對-磷酸硝基苯酯(Sigma)(1mg/ml 1mM MgCl2，10％(w/v)二乙醇胺，pH9.6)觀察結(jié)合的抗體，并且在405nm波長下讀數(shù)。
細胞培養(yǎng)物在補充了10％FCS，非必需氨基酸，1mM丙酮酸鈉，1mM HEPES緩沖液，100U青霉素/ml，100mg鏈霉素/ml和mM L-谷氨酰胺的Eagle′sMEM(Gibco)中，維持人乳腺腺癌細胞系MCF7(ATCC)。在補充了上述FCS，青霉素，鏈霉素，和L-谷氨酰胺的RPMI1640(Gibco)中，保持人結(jié)腸腺癌細胞系Colon137(由Ebbesen博士饋贈，AarhusUniversity，丹麥)。
從正常和惡性腫瘤組織中純化細胞角蛋白細胞角蛋白是用新鮮的，手術(shù)取出的，結(jié)腸癌組織或正常結(jié)腸上皮制備的。用刀片切碎組織樣品(1-5g)，并且用刀片轉(zhuǎn)子(Euro TurraxT20b basic，IKA Labortechnik，Staufen，德國)以27,000rpm的速度，在冰上在10-30ml含有1％(v/v)Emulphogene(Sigma)的Tris-緩沖的鹽溶液(TBS)(10mM Tris，0.14M NaCl，15mM NaN3，pH7.6)中勻漿3×5秒。酶抑制劑在勻漿超聲波處理，并且進行離子交換層析期間，在每毫升緩沖液中含有5m碘乙酰胺，10mM PMSF，5mM EDTA(均購自Sigma)，5mM Cyclocapron(KABI，Stockholm，瑞典)，和10U抑蛋白酶肽(Bayer，Leverkusen，德國)/ml。通過在4℃下以10,000g的速度離心10分鐘，使懸浮液沉淀，用含有1％Emulphogene的TBS洗滌2次，并且重新懸浮在緩沖液A(10mM TrispH8.6，含有0.1％SDS(w/v)和0.05％Emulphogene)中。在冰上對懸浮液進行超聲波處理3×15秒，并且在4℃下以12,000g的速度離心10分鐘。將上清液加樣到用緩沖液A預平衡的陰離子交換柱(20ml Q-Sepharose Fast Flow column，QFF，(Pharmacia Upjohn，Uppsala，瑞典))上。在用10倍柱體積的緩沖液A洗滌所述柱之后，結(jié)合的蛋白被用緩沖液A配制的高達1M的NaCl的線性梯度洗脫。收集1ml的級份，并且通過SDS-PAGE/Western印跡和ELISA進一步分析。對于ELISA來說，將10μl每一種級份添加到裝有10μl包含在100μl TBS中的SM2珠(BioRad)的孔中，然后按上述方法與COU-1一起溫育。所述珠能結(jié)合洗滌劑，因此能夠?qū)λ黾壏葜械牡鞍字苯舆M行包衣。
SDS-PAGE和Western印跡分析在不連續(xù)的緩沖液系統(tǒng)中，在8cm 4-20％或10％(w/v)聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，以便分析，并且在15cm 14％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，以便進行N-末端測序(36)。將樣品與2×樣品緩沖液(4％SDS，0.2％溴酚藍，20％甘油，溶解在100mM Tris緩沖的鹽溶液中)混合，煮沸5分鐘，并且在變性和還原(100mM DTT)條件下分解。用考馬斯亮藍觀察蛋白帶。在冰中，在100伏電壓下，用1小時時間將分離的蛋白電印跡到聚偏二氟乙烯膜上(PVDF，Immobilon P，Millipore，Bedford，MA)，使用轉(zhuǎn)移緩沖液(10％(v/v)乙醇，25mM Tris，200mM甘氨酸)。在轉(zhuǎn)移之前，在乙醇中預浸泡所述膜2分鐘，并且在轉(zhuǎn)移緩沖液中溫育所述膜和凝膠10分鐘。在轉(zhuǎn)移之后，在Western印跡緩沖液(50mM Tris，350mM NaCl，15mM NaN3，0.1％Tween-20)中封閉所述膜2小時，用Western印跡緩沖液洗滌3次，并且與COU-1抗體(5μg/ml)，小鼠抗-K8抗體(以1/2000的比例稀釋)，小鼠抗K-18抗體(以1/2000的比例稀釋)或山羊-抗-GST抗體(以1/1000的比例稀釋，Pharmacia Upjohn)在室溫下溫育過夜。用Western印跡緩沖液洗滌所述膜，并且與AP-綴合的兔-抗-山羊IgG抗體(以1/1000的比例稀釋，Sigma)，或AP-綴合的-兔-抗-人IgM抗體(以1/500的比例稀釋，DAKO，Glostrup，丹麥)一起，在室溫下溫育2小時。在用PBS洗滌3次之后，用在PBS中配制的0.2％的戊二醛在室溫下固定所述膜15分鐘，并且最終在PBS中洗滌。通過NBT/BCIP(Bio-Rad，Hercules，CA)觀察結(jié)合的AP綴合物。將懸浮在SDS樣品緩沖液中，并且進行過超聲波處理的MCF7或Colon137細胞用作抗原對照。將低范圍蛋白標記(Bio-Rad)用于指示片段的分子量。
氨基酸測序和氨基酸分析將以前描述的方法(37)用于氨基酸測序和氨基酸分析。對于N-末端測序來說，在SDS-PAGE上對純化的細胞角蛋白進行電泳，并且電印跡到PVDF膜上，然后用考馬斯檢測。將不同的帶從所述印跡上切除，并且用Applied Biosystems 470A蛋白測序儀(ABI，F(xiàn)orster City，CA)測序。使用BLAST程序在GenBank/EBI/DDBI/PDB數(shù)據(jù)庫中尋找與細胞角蛋白類似的序列。
重組K8和K18蛋白的表達和純化分析獲得了編碼一組K8和K18蛋白的質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a。所述一組蛋白由完整長度的和若干種N-末端和C-末端缺失的K8和K18片段組成，以GST融合蛋白形式克隆到修飾過的pGEX-2T載體上(38)。在37℃下，在補充了20mM MgCl2和50mg羧芐青霉素/ml的SuperBroth培養(yǎng)基中生長所述大腸桿菌培養(yǎng)物，直到OD600達到0.6。然后用1mM IPTG(Sigma)和4μM cAMP誘導蛋白表達，并且讓所述培養(yǎng)物在30℃下再生長3小時。在4℃下，以4,000g的速度使所述細菌沉淀15分鐘。為了進行SDS-PAGE，將所述沉淀重新懸浮在樣品緩沖液中，并且進行超聲波處理5×10秒，然后進行電泳。為了純化重組K8或K18蛋白，將按上述方法生長和處理過的400ml培養(yǎng)物的沉淀重新懸浮在50ml含有1mg/ml溶菌酶的裂解緩沖液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，5mM β-巰基乙醇，pH8.0)中，并且在4℃下溫育30分鐘。對所述懸浮液進行3×20秒的超聲波處理，并且在4℃下以20,000g的速度沉淀。在高鹽緩沖液(50mM Tris-HCl，2M NaCl，10mM EDTA，5mMβ-巰基乙醇，1％NP40，pH8.0)中洗滌所述沉淀2次，并且用裂解緩沖液洗滌1次。然后用含有2M尿素的裂解緩沖液洗滌所述沉淀2次，并且在4℃下保存在含有8M尿素的裂解緩沖液中。
異型結(jié)合測定按上述方法通過SDS-PAGE分離不同的C-或N-末端缺失的或完整的K8和K18蛋白組，并且轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在封閉之后，在4℃下將所述膜與存在于PBS，2％BSA和4M尿素中的100μg/ml純化的K8或K18蛋白一起溫育16小時；如果將K8蛋白轉(zhuǎn)移到所述膜上的話，然后，與純化的K18蛋白一起溫育所述膜，反之亦然(38)。然后用PBS洗滌所述膜，在室溫下與存在于含有10％FCS的Western印跡緩沖液中的COU-1(5μg/ml)一起溫育，并且按上述方法進行結(jié)合檢測。
表面等離子體共振使用BIAcore儀器(Pharmacia)，通過表面等離子體共振測定與重組完整的K8或K18(以及它的片段)的異型復合物結(jié)合的HMab COU-1的動力學。激活傳感器芯片，以便用N-羥基琥珀酰亞胺和N-乙基-N′-(3-二乙基氨基丙基)碳二亞胺固定。通過注射50μl的50μg/ml的樣品，將所述異型細胞角蛋白復合物結(jié)合在所述表面上。用pH8.5的30μl 1M的乙醇胺對過度激活的酯進行猝滅。通常固定了3000個共振單位。通過以5μl/分鐘的流速注射一定濃度范圍(0.5-80μg/ml)的COU-1，研究COU-1與固定化異型細胞角蛋白復合物的結(jié)合。以每單位時間共振單位的增加形式監(jiān)測所述結(jié)合。在所述解離期結(jié)束之后，以20μl/分鐘的流速獲得了解離測定。用10mM HCl，1M NaCI，pH2.0再生了所述結(jié)合表面，并且使所述表面對10次測定維持活性。按照以前描述的方法(39)，通過一系列的測定，確定結(jié)合和解離速度常數(shù)kon和koff。使用Bioevaluation程序3.1版(Pharmacia)根據(jù)動力學數(shù)據(jù)推測結(jié)合和解離常數(shù)。
聚焦激光掃描顯微術(shù)將細胞接種在Lab Tek腔室載玻片(Nalge Nunc，Naperville，IL)上，并且在37℃下，在5％CO2中，讓它生長48小時并且貼壁在玻璃載玻片上。用冰冷96％乙醇固定細胞5分鐘，用PBS洗滌3次，并且在室溫下，用存在于PBS中的10％正常山羊血清封閉1小時。在4℃下，將COU-1(5μg/ml)與小鼠抗-K8抗體(1/1000)或小鼠抗K-18抗體(1/1000)一起溫育過夜。在用PBS洗滌之后，在室溫下，將所述細胞與FITC-標記過的山羊-抗-人γ-鏈和德克薩斯紅-標記過的山羊抗-小鼠IgG抗體(稀釋比例1/200，均購自Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)一起遮光溫育1小時。用PBS洗滌所述細胞3×5分鐘，并且用存在于PBS/甘油中的抗退色制劑Slow FadeTM(MolecularProbes，Eugene，OR)封固所述載玻片。用與Zeiss Anyvert100TV連接的MRC-1024聚焦激光掃描顯微鏡(Bio-Rad)分析結(jié)果。作為對照，所有實驗另外以去掉所述一級抗體或添加所述物種和同種型匹配的對照抗體取代所述一級抗體形式再次進行。另外，獲得了分析的細胞的微分干涉相差(DIC)圖象。
結(jié)果從結(jié)腸癌和正常結(jié)腸上皮中純化細胞角蛋白通過利用細胞角蛋白和其他細胞骨架蛋白是以不可溶的絲狀結(jié)構(gòu)形式存在于生理學鹽濃度下的緩沖液中這一事實，分別將新鮮的，手術(shù)取出的結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸上皮用于提取細胞角蛋白K8和K18。將非離子洗滌劑添加到所述緩沖液中，以便改善勻漿，部分是通過破碎細胞膜。通過離心沉淀不溶性中間絲蛋白，然后溶解在含有SDS的緩沖液中，并且使用線性鹽梯度通過QFF陰離子交換層析分離。圖1A表示來自QFF陰離子交換柱的洗脫曲線。含有COU-1反應(yīng)性的級份存在于所述梯度的第一和第二個峰中(級份41-48)。通過將所述級份中的蛋白包衣在ELISA孔上，隨后通過與COU-1一起溫育檢測COU-1反應(yīng)性(圖1B)。Western印跡分析證實了COU-1與存在于同一級份的三條主要帶的反應(yīng)性(圖1D)。這三條帶上的蛋白只代表存在于所述級份中的分子量為41-46kDa的蛋白的一部分，正如通過對SDS分離的凝膠進行考馬斯染色所揭示的(圖1C)。
對從四位不同患者的結(jié)腸癌中純化的細胞角蛋白進行的Western印跡分析和考馬斯染色揭示了HMab COU-1反應(yīng)性和非反應(yīng)性的蛋白帶的相似形式。還從使用相同的純化方法從三個個體中獲得的正常結(jié)腸上皮中分離了細胞角蛋白，以便對結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中的K8/K18的性質(zhì)進行比較。使用一組抗-K8和抗-K18抗體，通過Western印跡分析，檢查來自兩種來源的組織勻漿物和純化的細胞角蛋白制劑(QFF洗脫物)。在分析來自癌和正常上皮的大致相同數(shù)量的細胞角蛋白時，在用抗-K18抗體，CYK-90染色之后觀察到了相同強度的蛋白帶(在42-46kDa范圍內(nèi))，所述抗體能識別K18的C-末端部分的線性表位(圖2)。相反，在用COU-1對相同的制劑進行染色時，在來自結(jié)腸癌組織的細胞角蛋白制劑中，有分子量42-46kDa的三條帶能染色，但是，來自正常結(jié)腸上皮的細胞角蛋白不能染色(圖2)。
為了確定存在于結(jié)腸癌組織中的不同的K8/K18-樣蛋白的性質(zhì)，使用了純化的細胞角蛋白制劑的每一條蛋白帶的改進了的分離。因此，來自不同結(jié)腸癌組織的純化的細胞角蛋白制劑分別是在大的14％的SDS-PAGE凝膠上分離的，將所述蛋白印跡到濾膜上，并且進行考馬斯染色。將所述印跡條與抗-K8抗體M20，抗-K18抗體CY-90，或COU-1一起溫育。圖3A表示結(jié)腸癌組織樣品的典型的印跡，通過考馬斯染色觀察到了大約10條不同的帶。在這種增強的分離中，5條帶表現(xiàn)出明確的COU-1反應(yīng)性。不能被COU-1染色的其他的帶用抗-K8抗體，抗-K18抗體或這兩種抗體染色(圖3A)。
對所有的10條帶進行N-末端測序。如圖3B所示，所述帶相當于不同形式的K8，K18和K19，只有一條帶是作為遷移抑制因子相關(guān)的蛋白8(MRP8，又被稱為鈣視網(wǎng)膜蛋白)鑒定的，它是一種鈣結(jié)合蛋白，能夠與細胞角蛋白結(jié)合(40)。正如通過始于23號殘基至76號殘基，而不是始于預期的1號殘基的鑒定的氨基酸序列所證實的，大部分帶是N-末端截短的K8或K18。
K8的氨基末端截短相當于23，40，66和76號殘基，而K18的截短相當于50和68號殘基。顯然，K8和K18截短存在于三種不同結(jié)腸癌的相同殘基上，表明所述截短是由特殊的蛋白酶導致的。
對所述裂解位點周圍的序列分析提示，至少有兩種不同的蛋白酶負責所述裂解，這兩種蛋白酶中包括一種胰蛋白酶樣蛋白酶。由COU-1識別的帶是N-末端截短的K8和K18。不過，有趣的是，并不是所有N-末端截短的K8和K18蛋白都能由COU-1識別。例如，在缺少了前22個氨基酸的N-末端截短的K8蛋白上，沒有觀察到COU-1結(jié)合，也沒有觀察到抗體與完整的K8或K18的反應(yīng)。后兩種觀察是通過分別用抗K8和抗K18抗體染色進行的(圖3A中的1號和3號帶)，而不是通過N-末端測序觀察的，因為所述蛋白是N-末端封閉的(K18包括位于它的N-末端乙?；z氨酸)。
用重組K8和K18片段對COU-1表位作圖為了詳細研究由COU-1識別的表位性質(zhì)，用一組重組N-或C-末端缺失的K8和K18片段或以GST-融合蛋白形式表達的完整K8和K18對該表位進行作圖。所述片段的性質(zhì)如圖4所示。
首先，通過SDS-PAGE分離上述組的K8和K18片段，并且印跡到PVDF膜上。隨后對所述Western印跡進行的分析驚人地證實了所述COU-1抗體不能結(jié)合任何獨立的K8或K18片段。所述COU-1抗體也不能結(jié)合完整的K8或K18分子(圖5B和6B)。
在每一種實驗中，都包括MCF7細胞裂解物作為正對照，在42-46kDa的分子量上提供了陽性反應(yīng)帶。為了確保所述K8和K18片段的均勻表達，對含有所述片段組的凝膠進行平行電泳，并且對用于Western印跡的所述凝膠用考馬斯藍進行染色(圖6A)。另外，用抗GST抗體對SDS-PAGE-分離的K8/GST或K18/GST融合蛋白的印跡進行染色(圖5A)。所述結(jié)果證實了不同融合蛋白的大致均勻的表達，并且COU-1的信號的缺乏，不是由于細胞角蛋白片段的低的表達水平或蛋白的不完全轉(zhuǎn)移。
另外，分別測試了K8和K18的Mabs對所述組的K8或K18片段的結(jié)合。如圖5D所示，抗K18 Mab能與K18(1-356)，K18(1-385)和完整的K18強烈起反應(yīng)，但是不能與K18(1-312)起反應(yīng)，這表明它的表位位于312-356區(qū)。然后，檢測細胞角蛋白K8和K18復合物，驗證所述復合物是否能由COU-1識別。在用COU-1染色之前，使成組的K18片段的Western印跡與完整的純化的K8一起溫育，并洗掉未結(jié)合的K8。COU-1能強烈地結(jié)合由完整的K8和K18片段K18(1-213)-K18(1-385)之間形成的復合物。相反，COU-1只能微弱的結(jié)合完整的K8/K18(1-187)和完整的K8/完整的K18，并且，沒有發(fā)現(xiàn)與完整的K8/K18(1-65)和完整的K8/K18(1-124)的結(jié)合(圖5C)。
同樣，將含有所述組的K8片段的印跡與完整的K18一起溫育，然后用COU-1染色。COU-1能強烈地結(jié)合在完整的K18和K8片段K8(1-213)-K8(1-385)之間形成的復合物。相反，COU-1只能微弱地結(jié)合完整的K8/完整的K18，而沒有發(fā)現(xiàn)與K8(1-65)/完整的K18復合物結(jié)合(圖6C)。
N-末端測序表明，來自結(jié)腸癌患者的K8和K18蛋白都是截短的。進行實驗，以便鑒定由COU-1結(jié)合的K8/K18異型表位。同時，制備了含有COU-1表位周圍的C-末端缺失的片段，K18(1-72)，K18(1-124)，K18(1-187)和完整的K18的Western印跡。然后，將所述印跡與COU-1表位周圍的K8片段之一，K8(1-85)，K8(1-129)或K8(1-233)，或完整的K8蛋白一起溫育。在允許K8-K18復合物形成之后，將所述印跡與COU-1抗體一起溫育。
如圖7(A-C)所示，在K18(1-124)/完整的K8或K18(1-124)/K8(1-233)復合物上，由COU-1識別的表位不是暴露的，或者僅僅是很少暴露的。相反，觀察到了COU-1對K18(1-124)/K8(1-129)復合物的強烈結(jié)合。沒有觀察到COU-1與含有K8(1-85)或K18(1-72)的任何異型復合物的結(jié)合。
綜上所述，以上結(jié)果證實了由COU-1識別的表位涉及K8區(qū)85-129和K18區(qū)72-124。如圖4和8所示，該區(qū)包括N-末端頭部結(jié)構(gòu)域的C-末端部分，以及第一個螺旋結(jié)構(gòu)域的N-末端部分，即K8和K18的α螺旋桿狀結(jié)構(gòu)域的1A。
所述結(jié)果還證實了該表位在完整的K8和K18的異型復合物上只能是較差的暴露的，即使在完整的K8與K18(1-124)復合時也是如此。當所述α螺旋桿的第一個結(jié)構(gòu)域A1不是處在它的正常卷曲螺旋結(jié)構(gòu)狀態(tài)時，發(fā)現(xiàn)了COU-1表位。這種現(xiàn)象可能是通過截短引起的，這種截短除去了現(xiàn)有結(jié)合的重要的接觸點，留下處在非折疊狀態(tài)的K8/K18復合物的COU-1結(jié)合區(qū)。
顛倒上述組合，以便K8(1-85)，K8(1-129)，K8(1-233)和完整的K8的C-末端缺失的片段的Western印跡與COU-1表位周圍的K18片段K18(1-72)，K18(1-124)，K18(1-187)和完整的K18一起溫育。然后將所述印跡與COU-1抗體一起溫育。如圖7(D-F)所示，當K8(1-129)與K18(1-72)，K18(1-124)，和K18(1-187)或完整的K18復合時，由COU-1識別的表位是以相同的程度暴露的。同樣，在含有K8(1-85)的任何異型復合物上都沒有觀察到COU-1結(jié)合。
用由一組與完整的K8和K18組合的N-末端缺失的K8和K18組成的異型復合物檢測COU-1結(jié)合，使用異型Western印跡測定。該片段缺少了前129個氨基酸或更多個氨基酸，正如在圖4中詳細示出的。不過，在上述任何N-末端缺失異型K8/K18復合物上都沒有觀察到COU-1結(jié)合，這表明COU-1表位位于N-末端129個氨基酸內(nèi)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。所述對照表明，N-末端缺失的片段能夠由鼠抗K8和抗K18 Mabs很好地識別。
所述N-末端測序數(shù)據(jù)和重組作圖數(shù)據(jù)表明，在K8的前65個氨基酸和K18的前49個氨基酸缺失時，COU-1表位是很好地暴露的。
作為GST融合蛋白，制備了兩種其他的N-末端缺失的片段，K8(66-483)和K18(50-430)。圖9表示與K18(50-430)(A)或完整的K18(B)一起溫育的完整的K8和K8(66-483)的印跡。圖9還表明與K8(66-483)(C)或完整的K8一起溫育的K18(50-430)和完整的K18的印跡。與完整的K8/K18(50-430)或完整的K8/完整的K18復合物相比，對于K8(66-483)/K18(50-430)和K8(66-483)/完整的K18復合物來說，觀察到了明顯更強的COU-1結(jié)合。
進行了其他研究，以便確定在癌細胞中觀察到的K8和K18的N-末端裂解是否可能是由腺病毒(adenovirus)感染引起的。腺病毒L3 23-kDa蛋白酶能促進K18的N-末端結(jié)構(gòu)域的裂解，而在腺病毒感染的HeLa細胞中，K8保持完整(41，42)。這種裂解導致了K18的頭部結(jié)構(gòu)域的1-73區(qū)的消除，以及將細胞角蛋白網(wǎng)絡(luò)解離成球狀小體。進行實驗，以便檢查由腺病毒感染導致的所述分解，是否會導致能允許COU-1結(jié)合的構(gòu)象的改變。
以前的數(shù)據(jù)表明，COU-1抗體不能結(jié)合來自HeLa細胞的K8/K18。通過SDS-PAGE純化并且分離來自用腺病毒感染的HeLa細胞的細胞角蛋白，證實了分子量為41kDa的一條帶，與以前的報導吻合。使COU-1與腺病毒感染的HeLa細胞的Western印跡溫育，沒有導致染色(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，這表明存在于腺癌中的細胞角蛋白片段不是腺病毒感染的結(jié)果。
似乎明確的是，COU-1表位只在形成異型K8/K18復合物時存在。所述表位不存在于獨立的K8和K18分子上。不過，剩下的問題是，為什么與SDS-分離的癌細胞裂解物的Western印跡結(jié)合的COU-1會在K8/K18復合物業(yè)已解離的情況下出現(xiàn)。一種可能的解釋是，在所述培養(yǎng)步驟期間，不同細胞角蛋白的一部分與所述膜解離，并且隨后仍然和所述膜結(jié)合的它的互補細胞角蛋白形成高親和力的異型復合物。
為了檢驗這種假設(shè)，將結(jié)腸癌細胞系colon137的裂解物的Western印跡分成兩份。其中的一半在與抗體溫育之前用乙醇固定，而另一半在不固定的情況下按常規(guī)方法處理。在固定的和未固定的印跡上用抗-K18抗體(CY-90)觀察到了染色，而與COU-1的染色僅出現(xiàn)在未固定過的印跡上。
早先的免疫組織化學研究業(yè)已表明，組織切片的乙醇固定對COU-1抗原沒有作用。檢測了癌裂解物的斑點印跡，以便在固定或不固定的情況下檢測癌相關(guān)表位。在進行和不進行固定的情況下都觀察到了用COU-1的染色，證實了COU-1表位不受乙醇處理的影響?？傊?，所述初步假設(shè)似乎是正確的，即細胞角蛋白的異源二聚體形成是在Western印跡顯影期間發(fā)生的，并且由部分截短的細胞角蛋白導致的異源二聚體的形成是COU-1表位的形成所必需的。
還通過ELISA測定了COU-1與不同重組異型K8/K18復合物的結(jié)合。將K8或完整的K8的純化的重組片段與純化的K18或完整的K18的重組片段以1∶1的摩爾比混合，以便在尿素中制備異型復合物。然后用PBS透析所述樣品，以便形成所述異型復合物，并且以5μg/ml的濃度在ELISA平板上包衣。將完整的K8與K18(1-124)，K18(1-187)，K18(1-213)，和完整的K18組合。另外，將完整的K18與K8(1-65)，K8(1-85)，K8(1-129)，和K8(1-233)組合。
在該ELISA測定中，COU-1以各種強度與所有的復合物結(jié)合，K8(1-65)/完整的K18和完整的K8(1-85)/完整的K18復合物除外。以上數(shù)據(jù)與來自Western印跡分析的結(jié)果吻合。圖10表示COU-1在三種異型復合物上的滴定，證實了比完整的K8/K18復合物明顯更強的與片段K8/K18的結(jié)合。
同時實時生物特異性相互作用分析(BIAcore)測定COU-1與不同的重組異型K8/K18復合物結(jié)合的動力學參數(shù)。COU-1表現(xiàn)出與K8(1-124)/完整的K18和K8(1-124)/K18(1-124)的異型復合物的高親和力結(jié)合。K8(1-124)/完整的K18的動力學參數(shù)為kon＝1.7×105M-1s-1，koff＝1.2×10-4s-1，推導的結(jié)合常數(shù)(Ka)和解離常數(shù)為(Kd)為1.4×109M-1和7.1×10-1M。COU-1與K8(1-124)/K18(1-124)的結(jié)合稍低一些，kon＝2.8×105M-1s-1，koff＝3×10-4s-1，推導的Ka為9.5×108M-1，而Kd為1.5×10-9M。相反，COU-1表現(xiàn)出與完整的K8/完整的K18的結(jié)合低大約100倍，kon＝9.1×103M-1s-1，koff＝5.0×10-5s-1，Ka和Kd分別為1.8×107M-1和5.5×10-8M。
截短的異型K8/K18復合物的細胞分布為了評估與截短的K8/K18異型復合物相比，正常K8和K18的細胞分布，用COU-1和Mab M20(抗-K8)或Mab CY-90(抗-K18)對乳腺和結(jié)腸癌細胞系MCF-7和BrCa01進行共同染色，并且通過高分辨聚焦顯微術(shù)分析(圖11和12)。Mabs M20和CY-90都能對形成復雜的相互連接網(wǎng)絡(luò)的中間絲的長纖維染色。所述纖維來自核周環(huán)，從這里，所述長絲似乎與細胞核表面連接，并且延伸通過細胞質(zhì)，止于細胞質(zhì)膜。相反，COU-1表現(xiàn)出斑點狀式樣，通過對短纖維片段和桿狀顆粒的染色，表明了分解的中間絲。
檢查細胞簇內(nèi)的MCF7細胞的染色形式，只有外周的，新形成的繁殖細胞對COU-1是強陽性的，而所有細胞是由抗-K18和抗-K8Mabs染色的(圖11)。在所述細胞簇的增殖細胞內(nèi)，COU-1染色必須在朝向遠離所述細胞簇的細胞外表面上是明顯的。相反，Mabs M20和CY-90能對整個細胞中的中間絲網(wǎng)絡(luò)染色。通過重疊用COU-1和Mab M20或Mab CY-90染色的圖象確定，所述斑點狀COU-1染色，似乎與完整的中間絲網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)(圖12)。
因此，僅在癌上皮中鑒定了N-末端截短形式的K8/K18復合物，而完整的K8/K18復合物出現(xiàn)在正常的和癌簡單腺上皮中。細胞角蛋白K8和細胞角蛋白K18在不同癌癥患者的相同部位的裂解，表明了有特異性蛋白酶起作用。所述裂解位點位于K8的22和40號氨基酸，而在K18上位于50號氨基酸，它們都包括(S/F/V)XSR↓X(S/V)(SEQ ID NO50)共有序列，這提示決定所述裂解的酶是胰蛋白樣蛋白酶(圖8)。對所述裂解位點附近的氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)了位于K8上的另一個位點，它具有相同的通用序列(氨基酸32，GSR↓I(SEQID NO64))，但是沒有裂解。這提示位于所述底物的P3或P1′位置上的氨基酸也能影響通過這種蛋白酶的識別。
共有序列在K8和K18的三個其余的裂解位點上是不明顯的(TAV↓T(SEQ ID NO51)，SPL↓V(SEQ ID NO52)，TGI↓A(SEQ IDNO53))。需要更不嚴格的識別條件的蛋白酶或若干不同的蛋白酶可能決定所述裂解。一種這樣的蛋白酶可能是彈性蛋白酶型蛋白酶，它在P1位置上能接受纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸。
細胞角蛋白K8和K18片段的裂解，不大可能出現(xiàn)在出于若干種原因從組織樣品中純化細胞角蛋白期間。首先，所有時間都存在五種酶抑制劑的混合物。其次，在使用相同的純化條件從正常結(jié)腸上皮中純化細胞角蛋白之后，沒有觀察到細胞角蛋白片段。第三，只能識別截短形式的K8/K18的HMab COU-1在對組織樣品進行基本處理和馬上固定時，能夠在癌上皮中檢測它的表位，而不能在正常上皮中檢測。
與以前的觀點相反，細胞角蛋白網(wǎng)絡(luò)在上皮細胞中的維持是一種動態(tài)過程，它涉及通過組裝和解散中間維管束經(jīng)常進行重建(45)。生物素標記的細胞角蛋白的顯微注射或用熒光標記過的細胞角蛋白進行的轉(zhuǎn)染，業(yè)已證實了擴散材料在細胞外周的向內(nèi)的流動，它是以斑點形式和細的長絲形式朝向細胞質(zhì)深處移動的，其中，它與其他長絲和長絲維管束結(jié)合(46)。盡管這一過程同時發(fā)生在正常和惡性腫瘤上皮細胞中，由本發(fā)明提供的結(jié)果表明了第二種降解途徑在癌細胞中的特異性存在。
同樣根據(jù)本發(fā)明，由結(jié)腸癌患者的具腫瘤淋巴結(jié)克隆的人類抗體COU-1能特異性地識別N-末端截短形式的K8和K18，此時，以上兩種細胞角蛋白形成了異型復合物。以前對COU-1的分析表明了COU-1與K18的選擇性反應(yīng)(35，48)，或與修飾過的K18的特異性反應(yīng)(31，32，49)。業(yè)已報導了與細胞程序死亡相關(guān)的K18的蛋白水解裂解(56)，不過，細胞程序死亡蛋白酶天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3，-6和-7的裂解位點位于保守的L1-2接頭和C-末端尾部結(jié)構(gòu)域上，并且相當遠離N-末端裂解位點，正如我們在有生活力的腫瘤組織中業(yè)已研究的(56)。最近，報導了抗體(M30)能識別僅在細胞程序死亡癌細胞中暴露而不在有生活力的或壞死細胞中暴露的腫瘤表位(57)。在所述C-末端尾部結(jié)構(gòu)域通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3，-6或-7裂解成26，22和19kDa的片段之后而釋放時，所述新表位就變得暴露。在結(jié)腸癌細胞中出現(xiàn)的裂解位點同樣不同于報導過的有關(guān)腺病毒感染的HeLa細胞中的裂解位點，其中，除去了K18的N-末端73個氨基酸(41，42)。令人吃驚的是，沒有發(fā)現(xiàn)COU-1與來自感染過的HeLa細胞的裂解過的K8/K18異型復合物的結(jié)合，而COU-1能結(jié)合K8/K18復合物，其中，除去了K18的最靠N-末端的67個氨基酸。這提示盡管所述裂解位點似乎是緊密的，另外除去6個氨基酸有可能導致構(gòu)象改變，這種改變能抑制COU-1的結(jié)合。
某些證據(jù)表明了，K8/K18是與細胞遷移和入侵緊密相關(guān)的。K8/K18的N-末端裂解可能影響所述過程。另外，缺少的K8/K18的N-末端頭部結(jié)構(gòu)域包括若干重要的磷酸化位點，包括K18上的ser52，它與絲重構(gòu)和區(qū)室定位相關(guān)，并且與對于14-3-3蛋白的結(jié)合來說重要的第二個磷酸化位點相關(guān)(58，59)。在K8中，磷酸化位點ser23業(yè)已與促分裂原活化相關(guān)(60)。
本文所使用的縮略語包括K8，細胞角蛋白8；K18，細胞角蛋白18；IF，中間絲；HMab，人單克隆抗體；FCS，胎牛血清；AP，堿性磷酸酶；QFF，Q-Sepharose fast flow；ELISA，酶聯(lián)免疫吸附測定；PBS，磷酸緩沖的鹽溶液；TBS，Tris-緩沖的鹽溶液；PVDF，聚偏二氟乙烯膜；FITC，熒光素異硫氰酸酯。
實施例3克隆能結(jié)合癌相關(guān)表位的抗體片段為了進一步開發(fā)可用于檢測癌癥的抗體，克隆了編碼部分抗體的核酸，并且通過噬菌體展示選擇篩選與本發(fā)明的癌相關(guān)表位的結(jié)合。所述核酸編碼人Fab和其他片段。
材料和方法抗體。
所述人單克隆IgM抗體COU-1，是由雜交瘤細胞系B9165分泌的，它是通過將人的類淋巴母細胞細胞系WI-L2-729-HF2和從患者結(jié)腸癌的患者的腸系膜淋巴結(jié)中獲得的淋巴細胞融合而產(chǎn)生的，如上文所述。還可參見Borup-Christensen，P.，Erb，K.，Jensenius，J.C.，Nielsen，B.& Svehag，S.-E.(1986)Int.J.Cancer 37，683-688。所述人-人雜交瘤細胞系，是在無蛋白培養(yǎng)基中生長的補充了SSR3血清替代物(Medicult，Copenhagen，丹麥)的RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO，Grand Island，N.Y.)。COU-1抗體是在瓊脂糖-結(jié)合的鼠單克隆抗-人μ鏈抗體(HB57，美國典型保藏物保藏中心，Rockville，MD)上，通過親和層析從細胞培養(yǎng)物上清液中純化的。用pH10.5的0.1M二乙胺洗脫所述抗體，然后通過FPLC分級分離。將從正常人血清中純化的IgM(Cappel，Cochranville，PA)用作對照。
所述人單克隆IgM抗體16.88是從R.McCabe博士那里獲得的。參見Haspel等，(1985)Cancer Res.45，3951-3961。業(yè)已將這種抗體成功地用于人類的腫瘤成像。參見Steis等(1990)J.Clin.Oncol.8，476-490；Boven等(1991)Eur.J.Cancer 27，1430-1436；Rosenblum等(1994)Cancer Immunol.Immunother.39，397-400)。兩種鼠單克隆抗體，直接抗正常細胞角蛋白8的M20和直接抗正常細胞角蛋白18的CY-90是從Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)獲得的。
可變重鏈和輕鏈的PCR擴增和克隆通過胍鹽方法用B9165雜交瘤細胞系制備總RNA。在逆轉(zhuǎn)錄之后，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用一組家族特異性引物擴增μ(Fd區(qū))和κ鏈，使用描述于以下文獻中的方法Persson等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2432-2436。用限制酶SacI和XbaI裂解擴增的輕鏈DNA，并且與用SacI/XbaI-線性化的pComb3載體連接3小時時間，如在以下中所描述6的Burton等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，10134-10137，和Barbas等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，7978-7982。純化連接的材料，并且通過電穿孔轉(zhuǎn)化入200μl大腸桿菌XL1-Blue細胞。在轉(zhuǎn)化之后，讓所述細胞生長過夜，并且制備噬菌粒DNA。
然后，用限制酶SpeI和XhoI消化PCR擴增的重鏈和分離的含有所述輕鏈的噬菌粒DNA。連接所述重鏈噬菌粒片段，并且用于轉(zhuǎn)化XL1-Blue。在37℃下，讓Fab文庫在SOC培養(yǎng)基中生長1小時，然后添加含有羧芐青霉素(50μg/ml)和四環(huán)素(10μg/ml)的SB培養(yǎng)基。3小時之后，添加輔助噬菌體VCS-M13(1012噬斑形成單位)，并且再搖晃所述培養(yǎng)物2小時之間。添加卡那霉素(70μg/ml)，并且在30℃下溫育所述培養(yǎng)物過夜。通過在4℃下離心(4000×g，20分鐘)使所述上清液清晰。添加5％聚乙二醇和0.15M NaCl，并且在冰上溫育30分鐘。然后通過第二輪離心，使噬菌體沉淀。將噬菌體沉淀物重新懸浮在含有1％(w/v)牛血清清蛋白(BSA)的pH7.4的磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)中，并且以10,000×g的速度離心3分鐘，以便使碎片沉淀。
通過淘選富集抗原結(jié)合性噬菌體。B9165抗體文庫的淘選，是用描述于以下文獻中的方法進行的Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，10134-10137。簡單地講，在4℃下，用超聲波處理過的存在于pH8.6的0.1M碳酸氫鹽緩沖液中的結(jié)腸癌細胞系(colo137)的裂解物，對微量滴定孔進行包衣過夜。參見Ditzel等(1992)Eur.J.Nucl.Med.19，409-417。在37℃下，用含有3％BSA的PBS封閉1小時之后，將存在于PBS中的50μl噬菌體懸浮液添加到每一個孔中，并且溫育2小時。通過用含有0.05％(w/v)Tween 20(PBS-Tween)(Merck，Darmstadt，F(xiàn)RG)的PBS劇烈洗滌10次，除去未結(jié)合的噬菌體。用pH2.2的0.2M甘氨酸/HCl洗脫富集了所述抗原結(jié)合性Fabs的結(jié)合噬菌體。通過感染大腸桿菌，擴增洗脫的噬菌體，并且通過用VCS-M13輔助噬菌體超感染回收。將所述淘選方法進行兩次。從最后一輪淘選中分離噬菌粒DNA，用NheI和SpeI裂解，并且重新連接。該步驟切除了cpIII基因，得到了能產(chǎn)生可溶性Fab片段的載體。
B9165 Fab和完整的抗體的ELISA分析。通過冷凍-解凍方法，以細菌上清液形式制備Fabs，使用披露于以下文獻中的方法Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，10134-10137；和Barbas等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，7978-7982。
為了評估特異性，在ELISA系統(tǒng)中篩選上清液和純化的Fabs對結(jié)腸癌細胞(Colon137)，BSA(Sigma)，卵清蛋白(Sigma)，重組HIV-1gp120(EB)(Intracel，Issaquah，WA)和人胎盤DNA(Sigma)的超聲處理物的結(jié)合。在4℃下，用存在于pH8.6的0.1M碳酸氫鹽緩沖液中的50μl抗原(1-10μg/ml)，對ELISA孔(Costar)進行包衣過夜。在37℃下，讓PBS中的DNA在ELISA孔上干燥。用PBS洗滌所述孔2次，通過在37℃下用存在于PBS中的3％的BSA填充所述孔進行封閉1小時，并且在37℃下與人Fab樣品或完整的人IgM抗體一起溫育2小時。用PBS-Tween和結(jié)合的Fab洗滌平板10次，并且用在PBS中稀釋500倍的堿性磷酸酶(AP)標記過的山羊抗-人IgG F(ab′)2(Pierce Chemical Co，Rockford，IL)檢測結(jié)合的Fab，或者用在PBS中稀釋1000倍的堿性磷酸酶-標記過的兔抗-人κ-鏈(Sigma)檢測結(jié)合的Fab。用對-磷酸硝基苯酯(Sigma)(1mg/ml，1mM MgCl2，10％(w/v)二乙醇胺，pH9.6)觀察結(jié)合的抗體，并且在405nm波長下讀數(shù)。
Fab的純化。用作過某些改進的描述于以下文獻中的方法純化重組B9165 FabDitzel等(1995)J.ImmunoL.154，895-908。簡單地講，將含有合適的克隆的大腸桿菌接種到含有羧芐青霉素(50μg/ml)，四環(huán)素(10μg/ml)和MgCl2(20mM)的超級營養(yǎng)液的1L培養(yǎng)物中，并且在37℃下?lián)u晃生長6小時。然后用2mM異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導蛋白表達，并且在30℃下繼續(xù)生長過夜。通過親和層析，從細菌上清液中純化可溶性Fab，使用與蛋白Gγ結(jié)合基質(zhì)(Pharmacia)交聯(lián)的抗人IgG F(ab′)2(Pierce)的山羊抗體。用PBS洗滌所述柱，并且用0.2M甘氨酸/HCl，pH2.2洗脫結(jié)合的Fab，并且馬上用1M Tris/HCl，pH9.0中和。
核苷酸測序。測序是在373A自動DNA測序儀(ABI，F(xiàn)osterCity，Ca)上進行的，使用Taq熒光雙脫氧終止循環(huán)測序試劑盒(ABI)。用于闡明輕鏈序列的引物是SEQKb引物(5′-ATAGAAGTTGTTCAGCAGGCA-3′，SEQ ID NO41)，它能與(+)鏈雜交，以及KEF引物(5′-GAATTCTAAACTAGCTAGTTCG-3′，SEQ ID NO42)，它能與(-)鏈雜交。對于重鏈來說，使用了與(-)鏈結(jié)合的CMHD引物(5′-CAAGGGCTTGAGTGGATGGGA-3′，SEQ ID NO43)和T3引物(5′-ATTAACCCTCACTAAAG-3′，SEQ ID NO44)。
通過聚焦激光掃描顯微術(shù)分析。在含有10％FBS的Iscove′s改進的Dulbecco′s培養(yǎng)基中生長人結(jié)腸癌細胞系(H3619和colo137)，以及乳腺癌細胞系(MCF-7和H3396)，并且讓它在37℃下，在5％CO2中與有腔室的蓋玻片(Nunc，Kamstrup，丹麥)貼壁48小時，以便形成單層。如下文所述，使用一級COU-1抗體，B9165Fab，鼠抗-細胞角蛋白8，鼠抗-細胞角蛋白18，和HuMab 16.88進行實驗。除了B9165 Fab(30μg/ml)之外，所有抗體都是在10μg/ml的濃度下檢測的。
1)細胞內(nèi)染色。在-20℃下，用甲醇透化H3619和colo137細胞5分鐘，用正常山羊血清封閉，然后在室溫下與一級抗體一起溫育1小時。然后用培養(yǎng)基洗滌所述細胞3次，并且在室溫下分別用由PBS稀釋1∶100和1∶50倍的FITC-標記過的山羊抗-人κ-鏈抗體(Southern biotech)或FITC-標記過的山羊抗-小鼠IgG(BioSource)一起溫育1小時。
2)表面染色。在4℃下將活的H3619細胞與COU-1抗體一起溫育2小時，用冰冷培養(yǎng)基洗滌3次，并且在4℃下與二級FITC-標記過的抗體一起溫育1小時。
3)內(nèi)在化。在37℃下將活的H3619和colo137細胞與COU-1抗體或B9165 Fab一起培養(yǎng)6小時，然后洗滌3次，并且用甲醇在-20℃下透化5分鐘。用正常的山羊血清封閉細胞，并且在室溫下與二級FITC-標記過的抗體一起溫育1小時。對于所有實驗來說，在一級和二級抗體溫育之后，洗滌所述細胞，在室溫下用PBS配制的2％的低聚甲醛固定15分鐘，洗滌2次，并且封固在抗退色制劑(30mM二硫赤蘚糖醇∶PBS∶甘油，2∶9∶1)中。通過聚焦激光掃描顯微術(shù)評估細胞染色。作為對照，所有實驗都在去掉所述一級抗體的情況下進行。
免疫組織化學分析。組織樣本是從進行手術(shù)切除的結(jié)腸直腸癌患者體內(nèi)獲得的。正常的結(jié)腸組織是從離開腫瘤部位大約15厘米的切除物上采集的。在4℃下，在96％的醇中固定組織6小時。然后，對組織進行石蠟包埋，并且切割成5微米的切片。在二甲苯中對切片進行脫石蠟，通過分級的醇進行再水合，并且用PBS-Tween洗滌。在室溫下，在潮濕培養(yǎng)箱中，將切片與100μl濃度均為0.5-10μg/ml的鼠單克隆抗體，人單克隆IgM抗體或正常多克隆人IgM一起溫育2小時。洗滌載玻片，并且在室溫下與在含有10％(w/v)牛血清清蛋白的PBS中稀釋過的AP-標記過的兔抗-人IgM(Dako，Glostrup，丹麥)，辣根過氧化物酶(HRP)標記過的兔抗-人IgM(Dako)或HRP-標記過的兔抗-小鼠IgG(Dako)一起溫育1小時。在洗滌之后，通過用生色底物(0.6mg二氨基聯(lián)苯胺/ml PBS，含有0.01％H2O2)和具有0.2mg萘酚-AS-Mx磷酸(Sigma)，1mg固紅TR鹽(Sigma)，20μg二甲基甲酰胺/ml 0.1M Tris/HCl，1M左旋咪唑，pH8.2顯影觀察HRP。用Mayer′s蘇木精對所述切片進行對染，在二甲苯中脫水，并且封固在Aquamount中(Gurr，Poole，英國)。染色強度劃分成以下等級(-)不染色，(+)弱染色，(++)中等染色，(+++)強染色。
結(jié)果能夠結(jié)合癌相關(guān)表位的HuMab的噬菌體展示表達和測序。RNA是從B9165細胞系中提取的，并且通過PCR使用3′家族特異性引物和5′恒定引物擴增來自相應(yīng)的cDNA的重(μ，F(xiàn)d區(qū))鏈和輕(κ鏈)基因。然后將所述輕鏈和重鏈產(chǎn)物依次克隆到M13噬菌體表面表達載體pComb3上，以便制備具有2×106個成員的文庫。在COU-1抗原陽性結(jié)腸癌細胞系(colon137)的超聲處理物上選擇所述噬菌體文庫2次。將來自最后一輪選擇的洗脫的噬菌體用于感染大腸桿菌XLI-blue細胞。用所述細胞制備DNA，并且通過NheI/SpeI消化除去基因III片段，并且連接。利用重建的噬菌粒轉(zhuǎn)化XLI-Blue，以便產(chǎn)生能分泌可溶性Fab片段的克隆。檢測過的80個獨立Fab表達克隆中的三個的上清液，在ELISA中表現(xiàn)出與colon 137裂解物的結(jié)合，并且不能與卵清蛋白結(jié)合。
鑒定了這三種克隆的序列。序列分析表明，B9165雜交瘤細胞輕鏈屬于VKIII家族，并且它與作為最接近的種系(圖13)的L6具有97％(269/276)的核苷酸同源性。B9165輕鏈包括相當于30號密碼子插入的額外的絲氨酸。輕鏈J片段表現(xiàn)出與種系JK5片段具有95％(36/38)的核苷酸同源性。另外，序列分析表明，所述重鏈屬于VHI家族，與重鏈種系DP-7具有98％的核苷酸同源性。重鏈J片段表現(xiàn)出與種系JH6b片段具有96％(53/55)核苷酸同源性。COU-1的D片段表現(xiàn)出與D2種系D片段具有最密切的同源性，具有一個具有完全同源性的16個核苷酸的片段。
在ELISA測定中，用完整的COU-1抗體和正常的多克隆IgM同時檢測了純化的B9165Fab對結(jié)腸癌細胞的裂解物(colo137)和不相關(guān)的抗原的結(jié)合。B9165 Fab和COU-1表現(xiàn)出與colon137裂解物的強的結(jié)合，但是對包括BSA，卵清蛋白，人DNA和HIV-1gp120在內(nèi)的一組其他抗原不能結(jié)合(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。相反，正常的人IgM不能結(jié)合任何抗原。對于B9165 Fab來說，飽和所需要的濃度(20μg/ml)明顯高于完整抗體的(1μg/ml)，并且類似于以前用化學衍生的半單聚體片段測定的結(jié)果，它的Ka為2×106M-1(Ditzel，H.，Erb，K.，Leslie，G.& Jensenius，J.C.(1993)Hum.Antibod.Hybridomas 4，86-93)。
COU-1能優(yōu)先結(jié)合惡性癌細胞。使用間接免疫過氧化物酶和堿性磷酸酶技術(shù)研究了在結(jié)腸和直腸腺癌的組織活體檢查中的COU-1識別的抗原的亞細胞定位。在較高的放大倍數(shù)下，觀察到了COU-1對中間絲的獨特的纖維狀染色。在小細胞團或單個細胞中，在外周部分觀察到了強的染色，它可能與細胞表面結(jié)合。另外，觀察到了與相鄰細胞之間的連接區(qū)結(jié)合的增強的染色。在八種結(jié)腸或直腸癌中的五個中的相鄰的正常結(jié)腸隱蔽的上皮細胞中沒有觀察到染色。在其他三種癌癥中，除了癌組織的強染色之外，在相鄰的形態(tài)學正常的結(jié)腸組織的地方，觀察到了由陰性細胞包圍的少數(shù)獨立細胞弱的染色。盡管這些結(jié)腸上皮在形態(tài)學上看上去是正常的，但這可能不是事實。鼠抗細胞角蛋白8抗體和抗細胞角蛋白18抗體(未示出)能夠?qū)ο噜彽恼＝Y(jié)腸上皮和結(jié)腸癌組織產(chǎn)生強的染色。不過，COU-1只能與惡性腫瘤細胞起反應(yīng)，而不能與正常上皮起反應(yīng)。在表3中提供了COU-1，鼠抗細胞角蛋白8和18，以及16.88的染色水平的比較。16.88抗體表現(xiàn)出對結(jié)腸癌細胞的強染色，弱染色僅僅出現(xiàn)在正常結(jié)腸上皮的某些區(qū)域，不過，另外可染色平滑肌纖維，還觀察到了肌上皮衍生的結(jié)締組織(表5)。
表5乙醇固定的惡性腫瘤組織和正常組織的抗體反應(yīng)性的比較。
比較了所述抗體對肝臟中的結(jié)腸轉(zhuǎn)移瘤和周圍正常肝臟組織的染色。COU-1能夠?qū)D(zhuǎn)移瘤產(chǎn)生強的染色，而沒有觀察到大部分肝細胞的染色。位于門管周區(qū)域的一些肝細胞是弱陽性的。類似地，所述16.88抗體不能對所述肝細胞的大部分染色。不過，肌上皮結(jié)締組織能被16.88染色，但是不能被COU-1染色。這兩種人抗體都能對膽管染色。鼠抗細胞角蛋白8和18(未示出)抗體，能夠以相同的強度對轉(zhuǎn)移瘤和正常肝細胞強烈染色。所述染色朝向小葉中心區(qū)減弱。發(fā)現(xiàn)了鼠Mabs對與肝細胞的細胞膜結(jié)合的特別強的染色。
因此，將噬菌體展示和細菌表達用于克隆，并且進一步表征來自能表達人單克隆抗體COU-1的雜交瘤細胞系的Fab和其他抗體片段?？寺〉腂9165 Fab的結(jié)合特征與以前有關(guān)半單聚體片段的報導非常類似，所述片段是通過化學還原和烷基化產(chǎn)生的(Ditzel，H.，Erb，K.，Leslie，G.& Jensenius，J.C.(1993)Hum.Antibod.Hybridomas4，86-93)。序列分析表明，重鏈和輕鏈可變區(qū)具有最低的體細胞突變，與密切相關(guān)的種系V基因分別具有98％和97％的核苷酸同源性。這一結(jié)果與COU-1是IgM抗體這一事實吻合，并且表明了通過定點誘變進行明顯的親和力成熟是可行的。
包括所述測定實施方案和實施例的以上說明，是用于說明本發(fā)明的，而不是被作為限定。在不超出本發(fā)明的真實構(gòu)思和范圍的前提下，可以進行多種其他的改變和改進。
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Asn Leu Arg Arg Gln Leu Glu Thr Leu Gly Gln Glu Lys Leu Lys Leu145 150 155 160Glu Ala Glu Leu Gly Asn Met Gln Gly Leu Val Glu Asp Phe Lys Asn165 170 175Lys Tyr Glu Asp Glu Ile Asn Lys Arg Thr Glu Met Glu Asn Glu Phe180 185 190Val Leu Ile Lys Lys Asp Val Asp Glu Ala Tyr Met Asn Lys Val Glu195 200 205Leu Glu Ser Arg Leu Glu Gly Leu Thr Asp Glu Ile Asn Phe Leu Arg210 215 220Gln Leu Tyr Glu Glu Glu Ile Arg Glu Leu Gln Ser Gln Ile Ser Asp225 230 235 240Thr Ser Val Val Leu Ser Met Asp Asn Ser Arg Ssr Leu Asp Met Glu245 250 255Ser Ile Ile Ala Glu Val Lys Ala Gln Tyr Glu Asp Ile Ala Asn Arg260 265 270Ser Arg Ala Glu Ala Glu Ser Met Tyr Gln Ile Lys Tyr Glu Glu Leu275 280 285Gln Ser Leu Ala Gly Lys His Gly Asp Asp Leu Arg Arg Thr Lys Thr290 295 300Glu Ile Ser Glu Met Asn Arg Asn Ile Ser Arg Leu Gln Ala Glu Ile305 310 315 320Glu Gly Leu Lys Gly Gln Arg Ala Ser Leu Glu Ala Ala Ile Ala Asp325 330 335Ala Glu Gln Arg Gly Glu Leu Ala Ile Lys Asp Ala Asn Ala Lys Leu340 345 350Ser Glu Leu Glu Ala Ala Leu Gln Arg Ala Lys Gln Asp Met Ala Arg355 360 365Gln Leu Arg Glu Tyr Gln Glu Leu Met Asn Val Lys Leu Ala Leu Asp370 375 380Ile Asp Ile Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Pro385 390 395 400Leu Glu Ser Gly Met Gln Asn Met Ser Ile His Thr Lys Thr Thr Gly405 410 415Gly Tyr Ala Gly Gly Leu Ser Ser Ala Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Pro420 425 430Gly Leu Ser Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Phe Gly Ser Gly Ala Gly Ser435 440 445Ser Ser Phe Ser Arg Thr Ser Ser Ser Arg Ala Val Val Val Lys Lys450 455 460Ile Glu Thr Arg Asp Gly Lys Leu Val Ser Glu Ser Ser Asp Val Leu465 470 475 480
Pro Lys<210>2<211>429<212>PRT<213>智人<400>2Ser Phe Thr Thr Arg Ser Thr Phe Ser Thr Asn Tyr Arg Ser Leu Gly1 5 10 15Ser Val Gln Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Arg Pro Val Ser Ser Ala Ala20 25 30Ser Val Tyr Ala Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Arg Ile Ser Val Ser35 40 45Arg Ser Thr Ser Phe Arg Gly Gly Met Gly Ser Gly Gly Leu Ala Thr50 55 60Gly Ile Ala Gly Gly Leu Ala Gly Met Gly Gly Ile Gln Asn Glu Lys65 70 75 80Glu Thr Met Gln Ser Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp Arg85 90 95Val Arg Ser Leu Glu Thr Glu Asn Arg Arg Leu Glu Ser Lys Ile Arg100 105 110Glu His Leu Glu Lys Lys Gly Pro Gln Val Arg Asp Trp Ser His Tyr115 120 125Phe Lys Ile Ile Glu Asp Leu Arg Ala Gln Ile Phe Ala Asn Thr Val130 135 140Asp Asn Ala Arg Ile Val Leu Gln Ile Asp Asn Ala Arg Leu Ala Ala145 150 155 160Asp Asp Phe Arg Val Lys Tyr Glu Thr Glu Leu Ala Met Arg Gln Ser165 170 175Val Glu Asn Asp Ile His Gly Leu Arg Lys Val Ile Asp Asp Thr Asn180 185 190Ile Thr Arg Leu Gln Leu Glu Thr Glu Ile Glu Ala Leu Lys Glu Glu195 200 205Leu Leu Phe Met Lys Lys Asn His Glu Glu Glu Val Lys Gly Leu Gln210 215 220Ala Gln Ile Ala Ser Ser Gly Leu Thr Val Glu Val Asp Ala Pro Lys225 230 235 240Ser Gln Asp Leu Ala Lys Ile Met Ala Asp Ile Arg Ala Gln Tyr Asp245 250 255
Glu Leu Ala Arg Lys Asn Arg Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Trp Ser Gln260 265 270Gln Ile Glu Glu Ser Thr Thr Val Val Thr Thr Gln Ser Ala Glu Val275 280 285Gly Ala Ala Glu Thr Thr Leu Thr Glu Leu Arg Arg Thr Val Gln Ser290 295 300Leu Glu Ile Asp Leu Asp Ser Met Arg Asn Leu Lys Ala Ser Leu Glu305 310 315 320Asn Ser Leu Arg Glu Val Glu Ala Arg Tyr Ala Leu Gln Met Glu Gln325 330 335Leu Asn Gly Ile Leu Leu His Leu Glu Ser Glu Leu Ala Gln Thr Arg340 345 350Ala Glu Gly Gln Arg Gln Ala Gln Glu Tyr Glu Ala Leu Leu Asn Ile355 360 365Lys Val Lys Leu Glu Ala Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Arg Leu Leu Glu370 375 380Asp Gly Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp Ser Ser Asn Ser385 390 395 400Met Gln Thr Ile Gln Lys Thr Thr Thr Arg Arg Ile Val Asp Gly Lys405 410 415Val Val Ser Glu Thr Asn Asp Thr Lys Val Leu Arg His420 425<210>3<211>44<212>PRT<213>智人<400>3Ala Val Arg Thr Gln Glu Lys Glu Gln Ile Lys Thr Leu Asn Asn Lys1 5 10 15Phe Ala Ser Phe Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Lys20 25 30Met Leu Glu Thr Lys Trp Ser Leu Leu Gln Gln Gln35 40<210>4<211>53<212>PRT<213>智人
<400>4Ala Gly Met Gly Gly Ile Gln Asn Glu Lys Glu Thr Met Gln Ser Leu1 5 10 15Asn Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp Arg Val Arg Ser Leu Glu Thr20 25 30Glu Asn Arg Arg Leu Glu Ser Lys Ile Arg Glu His Leu Glu Lys Lys35 40 45Gly Pro Gln Val Arg50<210>5<211>398<212>PRT<213>智人<400>5Ala Val Arg Thr Gln Glu Lys Glu Gln Ile Lys Thr Leu Asn Asn Lys1 5 10 15Phe Ala Ser Phe Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Lys20 25 30Met Leu Glu Thr Lys Trp Ser Leu Leu Gln Gln Gln Lys Thr Ala Arg35 40 45Ser Asn Met Asp Asn Met Phe Glu Ser Tyr Ile Asn Asn Leu Arg Arg50 55 60Gln Leu Glu Thr Leu Gly Gln Glu Lys Leu Lys Leu Glu Ala Glu Leu65 70 75 80Gly Asn Met Gln Gly Leu Val Glu Asp Phe Lys Asn Lys Tyr Glu Asp85 90 95Glu Ile Asn Lys Arg Thr Glu Met Glu Asn Glu Phe Val Leu Ile Lys100 105 110Lys Asp Val Asp Glu Ala Tyr Met Asn Lys Val Glu Leu Glu Ser Arg115 120 125Leu Glu Gly Leu Thr Asp Glu Ile Asn Phe Leu Arg Gln Leu Tyr Glu130 135 140Glu Glu Ile Arg Glu Leu Gln Ser Gln Ile Ser Asp Thr Ser Val Val145 150 155 160Leu Ser Met Asp Asn Ser Arg Ser Leu Asp Met Glu Ser Ile Ile Ala165 170 175Glu Val Lys Ala Gln Tyr Glu Asp Ile Ala Asn Arg Ser Arg Ala Glu180 185 190Ala Glu Ser Met Tyr Gln Ile Lys Tyr Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ala195 200 205
Gly Lys His Gly Asp Asp Leu Arg Arg Thr Lys Thr Glu Ile Ser Glu210 215 220Met Asn Arg Asn Ile Ser Arg Leu Gln Ala Glu Ile Glu Gly Leu Lys225 230 235 240Gly Gln Arg Ala Ser Leu Glu Ala Ala Ile Ala Asp Ala Glu Gln Arg245 250 255Gly Glu Leu Ala Ile Lys Asp Ala Asn Ala Lys Leu Ser Glu Leu Glu260 265 270Ala Ala Leu Gln Arg Ala Lys Gln Asp Met Ala Arg Gln Leu Arg Glu275 280 285Tyr Gln Glu Leu Met Asn Val Lys Leu Ala Leu Asp Ile Asp Ile Ala290 295 300Thr Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Pro Leu Glu Ser Gly305 310 315 320Met Gln Asn Met Ser Ile His Thr Lys Thr Thr Gly Gly Tyr Ala Gly325 330 335Gly Leu Ser Ser Ala Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Pro Gly Leu Ser Tyr340 345 350Ser Leu Gly Ser Ser Phe Gly Ser Gly Ala Gly Ser Ser Ser Phe Ser355 360 365Arg Thr Ser Ser Ser Arg Ala Val Val Val Lys Lys Ile Glu Thr Arg370 375 380Asp Gly Lys Leu Val Ser Glu Ser Ser Asp Val Leu Pro Lys385 390 395<210>6<211>359<212>PRT<213>智人<400>6Ala Gly Met Gly Gly Ile Gln Asn Glu Lys Glu Thr Met Gln Ser Leu1 5 10 15Asn Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp Arg Val Arg Ser Leu Glu Thr20 25 30Glu Asn Arg Arg Leu Glu Ser Lys Ile Arg Glu His Leu Glu Lys Lys35 40 45Gly Pro Gln Val Arg Asp Trp Ser His Tyr Phe Lys Ile Ile Glu Asp50 55 60Leu Arg Ala Gln Ile Phe Ala Asn Thr Val Asp Asn Ala Arg Ile Val65 70 75 80
Leu Gln Ile Asp Asn Ala Arg Leu Ala Ala Asp Asp Phe Arg Val Lys85 90 95Tyr Glu Thr Glu Leu Ala Met Arg Gln Ser Val Glu Asn Asp Ile His100 105 110Gly Leu Arg Lys Val Ile Asp Asp Thr Asn Ile Thr Arg Leu Gln Leu115 120 125Glu Thr Glu Ile Glu Ala Leu Lys Glu Glu Leu Leu Phe Met Lys Lys130 135 140Asn His Glu Glu Glu Val Lys Gly Leu Gln Ala Gln Ile Ala Ser Ser145 150 155 160Gly Leu Thr Val Glu Val Asp Ala Pro Lys Ser Gln Asp Leu Ala Lys165 170 175Ile Met Ala Asp Ile Arg Ala Gln Tyr Asp Glu Leu Ala Arg Lys Asn180 185 190Arg Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Trp Ser Gln Gln Ile Glu Glu Ser Thr195 200 205Thr Val Val Thr Thr Gln Ser Ala Glu Val Gly Ala Ala Glu Thr Thr210 215 220Leu Thr Glu Leu Arg Arg Thr Val Gln Ser Leu Glu Ile Asp Leu Asp225 230 235 240Ser Met Arg Asn Leu Lys Ala Ser Leu Glu Asn Ser Leu Arg Glu Val245 250 255Glu Ala Arg Tyr Ala Leu Gln Met Glu Gln Leu Asn Gly Ile Leu Leu260 265 270His Leu Glu Ser Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ala Glu Gly Gln Arg Gln275 280 285Ala Gln Glu Tyr Glu Ala Leu Leu Asn Ile Lys Val Lys Leu Glu Ala290 295 300Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Arg Leu Leu Glu Asp Gly Glu Asp Phe Asn305 310 315 320Leu Gly Asp Ala Leu Asp Ser Ser Asn Ser Met Gln Thr Ile Gln Lys325 330 335Thr Thr Thr Arg Arg Ile Val Asp Gly Lys Val Val Ser Glu Thr Asn340 345 350Asp Thr Lys Val Leu Arg His355<210>7<211>23<212>PRT<213>智人
<400>7Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys1 5 10 15Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Ser20<210>8<211>5<212>PRT<213>智人<400>8Ser Tyr Tyr Met His1 5<210>9<211>14<212>PRT<213>智人<400>9Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly1 5 10<210>10<211>17<212>PRT<213>智人<400>10Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln1 5 10 15Gly<210>11<211>32<212>PRT<213>智人
<400>11Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met Glu1 5 10 15Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>12<211>16<212>PRT<213>智人<400>12Asp Gln Val Val Val Ala Ala Thr Leu Ser Asn Tyr Gly Met Asp Val1 5 10 15<210>13<211>14<212>PRT<213>智人<400>13Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr1 5 10<210>14<211>21<212>PRT<213>智人<400>14Glu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Cys20<210>15<211>12<212>PRT<213>智人
<400>15Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>16<211>15<212>PRT<213>智人<400>16Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr1 5 10 15<210>17<211>7<212>PRT<213>智人<400>17Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr1 5<210>18<211>32<212>PRT<213>智人<400>18Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>19<211>9<212>PRT<213>智人<400>19Gln Gln Gly Thr Asn Trp Gly Ile Ala1 5
<210>20<211>11<212>PRT<213>智人<400>20Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys Arg1 5 10<210>21<211>19<212>PRT<213>智人<400>21Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr1 5 10 15Leu Ser Cys<210>22<211>7<212>PRT<213>智人<400>22Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5<210>23<211>32<212>PRT<213>智人<400>23Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys20 25 30<210>24<211>10
<212>PRT<213>智人<400>24Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Pro Tyr Thr1 5 10<210>25<211>9<212>PRT<213>智人<400>25Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile1 5<210>26<211>19<212>PRT<213>智人<400>26Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr1 5 10 15Ile Asn Cys<210>27<211>17<212>PRT<213>智人<400>27Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu1 5 10 15Ala<210>28<211>15<212>PRT<213>智人
<400>28Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr1 5 10 15<210>29<211>7<212>PRT<213>智人<400>29Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1 5<210>30<211>13<212>PRT<213>智人<400>30Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr1 5 10<210>31<211>19<212>PRT<213>智人<400>31Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Gly1 5 10 15Tyr Tyr Cys<210>32<211>9<212>PRT<213>智人<400>32Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met1 5
<210>33<211>9<212>PRT<213>智人<400>33Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile1 5<210>34<211>104<212>PRT<213>智人<400>34Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr1 5 10 15Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp20 25 30Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala35 40 45Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe65 70 75 80Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Pro Tyr Thr Phe85 90 95Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile100<210>35<211>108<212>PRT<213>智人<400>35Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr1 5 10 15Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys20 25 30Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu35 40 45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Val Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr85 90 95Pro Pro Met Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile100 105<210>36<211>354<212>DNA<213>智人<400>36ggggctgagg tgaagaagcc tggggcgtca gtgaaggttt cctgcaaggc atctggatac 60accttcagca gctactatat gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg120atgggaataa tcaaccctag tggtggtagc acaagctacg cacagaagtt ccagggcaga180gtcaccatga ccagggacac gtccacgaac acagtctaca tggagctgag cagcctgaga240tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg agagatcagg tggtggtagc tgctactttg300tccaactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354<210>37<211>321<212>DNA<213>智人<400>37gagctcaccc agtctccagg caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc 60tgcagggcca gtcagagtgt tagtagcagc tacttagcct ggtaccagca gaaacctggc120caggctccca ggctcctcat ctatgatgca tccaacaggg ccactggcat cccagccagg180ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa240gattttgcag tttattactg tcagcagggt accaactggg ggatcgcctt cggccaaggg300acacgactgg atattaaacg a 321<210>38<211>313<212>DNA<213>智人<400>38acgcagtctc caggcaccct gtctttgtct ccaggggaaa gagccaccct ctcctgtagg60
gccagtcaga gtgttagcag cagctactta gcctggtacc agcagaaacc tggccaggct120cccaggctcc tcatctatgg tgcatccagc agggccactg gcatcccaga caggttcagt180ggcagtgggt cagggacaga cttcactctc accatcagca gactggagcc tgaagatttt240gcagcgtatt actgtcagca gtatggtaac tcacctccgt acacttttgg ccaggggacc300aagctggaga tca 313<210>39<211>324<212>DNA<213>智人<400>39acccagtctc cagactccct ggctgtgtct ctgggcgaga gggccaccat caactgcaag 60tccagccaga gtcttttata cagctccaac aataagaact acttagcttg gtaccagcag120aaaccaggac agcctcctaa gttgctcatt tactgggcat ctacccggga atccggggtc180cctgaccgat tcagtggcag cgggtctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg240caggctgaag atgtggcagg ttattactgt cagcaatatt atagtactcc tccgatgttc300ggccaaggga ccaaggtgga aatc 324<210>40<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>共有序列<221>SITE<222>1，4<223>Xaa＝任何氨基酸<400>40Xaa Ser Arg Xaa1<210>41<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>41atagaagttg ttcagcaggc a 21<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>42gaattctaaa ctagctagtt cg 22<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>43caagggcttg agtggatggg a 21<210>44<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>44attaaccctc actaaag 17<210>45<211>1724<212>DNA<213>智人
<400>45ttcggcaatt cctacctcca ctcctgcctc caccatgtcc atcagggtga cccagaagtc 60ctacaaggtg tccacctctg gcccccgggc cttcagcagc cgctcctaca cgagtgggcc 120cggttcccgc atcagctcct cgagcttctc ccgagtgggc agcagcaact ttcgcggtgg 180cctgggcggc ggctatggtg gggccagcgg catgggaggc atcaccgcag ttacggtcaa 240ccagagcctg ctgagcccct tgtccctgga ggtggacccc aacatccagg ccgtgcgcac 300ccaggagaag gagcagatca agaccctgaa caacaagttt gcctccttca tagacaaggt 360acggttcctg gagcagcaga acaagatgct ggagaccaag tggagcctcc tgcagcagca 420gaagacggct cgaagcaaca tggacaacat gttcgagagc tacatcaaca accttaggcg 480gcagctggag actctgggcc aggagaagct gaagctggag gcggagcttg gcaacatgca 540ggggctggtg gaggacttca agaacaagta tgaggatgag atcaataagc gtacagagat 600ggagaacgaa tttgtcctca tcaagaagga tgtggatgaa gcatacatga acaaggtaga 660gctggagtct cgcctggaag ggctgaccga cgagatcaac ttcctcaggc agctgtatga 720agaggagatc cgggagctgc agtcccagat ctcggacaca tctgtggtgc tgtccatgga 780caacagccgc tccctggaca tggagagcat cattgctgag gtcaaggcac agtacgagga 840tattgccaac cgcagccggg ctgaggctga gagcatgtac cagatcaagt atgaggagct 900gcagagcctg gctgggaagc acggggatga cctgcggcgc acaaagactg agatctcaga 960gatgaaccgg aacatcagcc ggctccaggc tgagattgag ggcctcaaag gccagagggc1020ttccctggag gccgccattg cagatgccga gcagcgtgga gagctggcca ttaaggatgc1080caacgccaag ttgtccgagc tggaggccgc cctgcagcgg gccaagcagg acatggcccg1140gcagctgcgt gagtaccagg agctgatgaa cgtcaagctg gccctggaca tcgacatcgc1200cacctacagg aagctgctgg agggcgagga gagcccgctg gagtctggga tgcagaacat1260gagtattcat acgaagacca ccggcggcta tgcgggtggt ttgagctcgg cctatgggga1320cctcacagac cccggcctca gctacagcct gggctccagc tttggctctg gcgcgggctc1380cagctccttc agccgcacca gctcctccag ggccgtggtt gtgaagaaga tcgagacacg1440tgatgggaag ctggtgtctg agtcctctga cgtcctgccc aagtgaacag ctgcggcagc1500ccctcccagc ctacccctcc tgcgctgccc cagagcctgg gaaggaggcc gctatgcagg1560gtagcactgg gaacaggaga cccacctgag gctcagccct agccctcagc ccacctgggg1620agtttactac ctggggaccc cccttgccca tgcctccagc tacaaaacaa ttcaattgct1680tttttttttt ttggtcccaa aataaaacct cagctagctc tgcc 1724<210>46<211>1412<212>DNA<213>智人<400>46cggggtcgtc cgcaaagcct gagtcctgtc ctttctctct ccccggacag catgagcttc 60accactcgct ccaccttctc caccaactac cggtccctgg gctctgtcca ggcgcccagc120tacggcgccc ggccggtcag cagcgcggcc agcgtctatg caggcgctgg gggctctggt180tcccggatct ccgtgtcccg ctccaccagc ttcaggggcg gcatggggtc cgggggcctg240gccaccggga tagccggggg tctggcagga atgggaggca tccagaacga gaaggagacc300
atgcaaagcc tgaacgaccg cctggcctct tacctggaca gagtgaggag cctggagacc 360gagaaccgga ggctggagag caaaatccgg gagcacttgg agaagaaggg accccaggtc 420agagactgga gccattactt caagatcatc gaggacctga gggctcagat cttcgcaaat 480actgtggaca atgcccgcat cgttctgcag attgacaatg cccgtcttgc tgctgatgac 540tttagagtca agtatgagac agagctggcc atgcgccagt ctgtggagaa cgacatccat 600gggctccgca aggtcattga tgacaccaat atcacacgac tgcagctgga gacagagatc 660gaggctctca aggaggagct gctcttcatg aagaagaacc acgaagagga agtaaaaggc 720ctacaagccc agattgccag ctctgggttg accgtggagg tagatgcccc caaatctcag 780gacctcgcca agatcatggc agacatccgg gcccaatatg acgagctggc tcggaagaac 840cgagaggagc tagacaagta ctggtctcag cagattgagg agagcaccac agtggtcacc 900acacagtctg ctgaggttgg agctgctgag acgacgctca cagagctgag acgtacagtc 960cagtccttgg agatcgacct ggactccatg agaaatctga aggccagctt ggagaacagc1020ctgagggagg tggaggcccg ctacgcccta cagatggagc agctcaacgg gatcctgctg1080caccttgagt cagagctggc acagacccgg gcagagggac agcgccaggc ccaggagtat1140gaggccctgc tgaacatcaa ggtcaagctg gaggctgaga tcgccaccta ccgccgcctg1200ctggaagatg gcgaggactt taatcttggt gatgccttgg acagcagcaa ctccatgcaa1260accatccaaa agaccaccac ccgccggata gtggatggca aagtggtgtc tgagaccaat1320gacaccaaag ttctgaggca ttaagccagc agaagcaggg taccctttgg ggagcaggag1380gccaataaaa agttcagagt tcattggatg tc 1412<210>47<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>相關(guān)可變輕鏈CDR1片段和結(jié)合實體的結(jié)構(gòu)式<221>SITE<222>1<223>Xaa＝任何堿性氨基酸<221>SITE<222>2<223>Xaa＝任何脂族或極性氨基酸<221>SITE<222>3，5，9，10<223>Xaa＝絲氨酸
<221>SITE<222>6，16，17<223>Xaa＝任何脂族氨基酸<221>SITE<222>8，15<223>Xaa＝任何極性氨基酸<221>SITE<222>(4)...(4)<223>Xaa＝谷氨酰胺<221>SITE<222>(7)...(7)<223>Xaa＝任何脂族氨基酸或無氨基酸<221>SITE<222>(11)...(11)<223>Xaa＝任何極性氨基酸或無氨基酸<221>SITE<222>(12)...(12)<223>Xaa＝任何極性氨基酸或無氨基酸<221>SITE<222>(14)...(14)<223>Xaa＝任何極性氨基酸或無氨基酸<221>SITE<222>(13)...(13)<223>Xaa＝任何堿性氨基酸或無氨基酸<400>47Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa<210>48<211>7<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>相關(guān)的可變輕鏈CDRR片段和結(jié)合實體的結(jié)構(gòu)式<221>SITE<222>1<223>Xaa＝任何酸性、非極性、或芳族氨基酸<221>SITE<222>2<223>Xaa＝丙氨酸<221>SITE<222>3<223>Xaa＝絲氨酸<221>SITE<222>4，7<223>Xaa＝任何極性氨基酸<221>SITE<222>5<223>Xaa＝任何堿性氨基酸<221>SITE<222>(6)...(6)<223>Xaa＝任何酸性或脂族氨基酸<400>48Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5<210>49<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>相關(guān)的可變輕鏈CDR3片段和結(jié)合實體的結(jié)構(gòu)式
<221>SITE<222>1，2<223>Xaa＝谷氨酰胺<221>SITE<222>3<223>Xaa＝酪氨酸<221>SITE<222>4，9<223>Xaa＝任何非極性、極性、或芳族氨基酸<221>SITE<222>5，6<223>Xaa＝任何極性氨基酸<221>SITE<222>7，8<223>Xaa＝脯氨酸<221>SITE<222>(10)...(10)<223>Xaa＝任何極性氨基酸或無氨基酸<400>49Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10<210>50<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>共有序列<221>SITE<222>1<223>Xaa＝絲氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸
<221>SITE<222>2，5<223>Xaa＝任何氨基酸<221>SITE<222>6<223>Xaa＝絲氨酸或纈氨酸<400>50Xaa Xaa Ser Arg Xaa Xaa1 5<210>51<211>4<212>PRT<213>智人<400>51Thr Ala Val Thr1<210>52<211>4<212>PRT<213>智人<400>52Ser Pro Leu Val1<210>53<211>4<212>PRT<213>智人<400>53Thr Gly Ile Ala1
<210>54<211>10<212>PRT<213>智人<400>54Ser Tyr Thr Ser Gly Pro Gly Ser Arg Ile1 5 10<210>55<211>10<212>PRT<213>智人<400>55Val Gly Ser Ser Asn Phe Arg Gly Gly Leu1 5 10<210>56<211>10<212>PRT<213>智人<400>56Thr Val Asn Gln Ser Leu Leu Ser Pro Leu1 5 10<210>57<211>10<212>PRT<213>智人<400>57Val Leu Glu Val Asp Pro Asn Ile Gln Ala1 5 10<210>58<211>15<212>PRT<213>智人
<400>58Ser Thr Ser Phe Arg Gly Gly Met Gly Ser Gly Gly Leu Ala Thr1 5 10 15<210>59<211>20<212>PRT<213>智人<400>59Ala Gly Gly Leu Ala Gly Met Gly Gly Ile Gln Asn Glu Lys Glu Thr1 5 10 15Met Gln Ser Leu20<210>60<211>10<212>PRT<213>智人<400>60Phe Gly Pro Gly Val Ala Phe Arg Ala Pro1 5 10<210>61<211>8<212>PRT<213>智人<400>61Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala1 5<210>62<211>105<212>PRT<213>智人<400>62Ser Ile Arg Val Thr Gln Lys Ser Tyr Lys Val Ser Thr Ser Gly Pro1 5 10 15
Arg Ala Phe Ser Ser Arg Ser Tyr Thr Ser Gly Pro Gly Ser Arg Ile20 25 30Ser Ser Ser Ser Phe Ser Arg Val Gly Ser Ser Asn Phe Arg Gly Gly35 40 45Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Ala Ser Gly Met Gly Gly Ile Thr Ala50 55 60Val Thr Val Asn Gln Ser Leu Leu Ser Pro Leu Val Leu Glu Val Asp65 70 75 80Pro Asn Ile Gln Ala Val Arg Thr Gln Glu Lys Glu Gln Ile Lys Thr85 90 95Leu Asn Asn Lys Phe Ala Ser Phe Ile100 105<210>63<211>94<212>PRT<213>智人<400>63Ser Phe Thr Thr Arg Ser Thr Phe Ser Thr Asn Tyr Arg Ser Leu Gly1 5 10 15Ser Val Gln Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Arg Pro Val Ser Ser Ala Ala20 25 30Ser Val Tyr Ala Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Arg Ile Ser Val Ser35 40 45Arg Ser Thr Ser Phe Arg Gly Gly Met Gly Ser Gly Gly Leu Ala Thr50 55 60Gly Ile Ala Gly Gly Leu Ala Gly Met Gly Gly Ile Gln Asn Glu Lys65 70 75 80Glu Thr Met Gln Ser Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu85 90<210>64<211>4<212>PRT<213>智人<400>64Gly Ser Arg Ile權(quán)利要求
1.分離的癌相關(guān)表位，包括兩種獨立的多肽，細胞角蛋白8多肽，和細胞角蛋白18多肽，其中，所述細胞角蛋白8多肽基本由SEQID NO3或SEQ ID NO5組成，而所述細胞角蛋白18多肽基本由SEQID NO4或SEQ ID NO6組成。
2.如權(quán)利要求1的分離的多肽，其中，所述細胞角蛋白8多肽短于大約475個氨基酸，而所述細胞角蛋白18多肽短于大約425個氨基酸。
3.如權(quán)利要求1的分離的表位，其中，所述癌相關(guān)表位是在腺癌細胞的絲狀細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)中檢測的，不過在正常細胞中基本上檢測不到。
4.如權(quán)利要求1的分離的表位，其中，所述癌相關(guān)表位是在結(jié)腸腺癌，卵巢腺癌，腎臟腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原細胞瘤睪丸癌細胞的絲狀細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)中檢測的。
5.一種用于預防或治療腺癌的疫苗組合物，含有癌相關(guān)表位，所述表位包括兩種獨立的多肽，細胞角蛋白8多肽和細胞角蛋白18多肽，其中，所述細胞角蛋白8多肽基本由SEQ ID NO3或SEQ ID NO5組成，而所述細胞角蛋白18多肽基本由SEQ ID NO4或SEQ ID NO6組成。
6.如權(quán)利要求5的疫苗組合物，其中，所述細胞角蛋白8多肽短于大約475個氨基酸，而所述細胞角蛋白18多肽短于大約425個氨基酸。
7.如權(quán)利要求5的疫苗組合物，其中，所述腺癌是結(jié)腸腺癌，卵巢腺癌，腎臟腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌或非精原細胞瘤睪丸癌。
8.一種分離的結(jié)合實體多肽，它能夠結(jié)合癌相關(guān)表位，所述表位包括兩種獨立的多肽，細胞角蛋白8多肽和細胞角蛋白18多肽，其中，所述細胞角蛋白8多肽基本由SEQ ID NO3或SEQ ID NO5組成，而所述細胞角蛋白18多肽基本由SEQ ID NO4或SEQ ID NO6組成。
9.如權(quán)利要求8的分離的結(jié)合實體多肽，其中，所述細胞角蛋白8多肽短于大約475個氨基酸，而所述細胞角蛋白18多肽短于大約425個氨基酸。
10.如權(quán)利要求8的分離的結(jié)合實體多肽，其中，所述結(jié)合實體多肽短于大約425個氨基酸。
11.如權(quán)利要求8的分離的結(jié)合實體多肽，其中，所述結(jié)合實體多肽短于大約200個氨基酸。
12.如權(quán)利要求8的分離的結(jié)合實體多肽，其中，所述結(jié)合實體多肽是抗體。
13.如權(quán)利要求8的分離的結(jié)合實體多肽，其中，所述結(jié)合實體多肽能夠檢測腺癌細胞中絲狀細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)中的癌相關(guān)表位，但是基本上不能在正常細胞的絲狀結(jié)構(gòu)中檢測。
14.如權(quán)利要求8的結(jié)合實體，其中，所述結(jié)合實體多肽能夠在結(jié)腸腺癌，卵巢腺癌，腎臟腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原細胞瘤睪丸癌細胞的絲狀細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)中檢測癌相關(guān)表位。
15.如權(quán)利要求8的結(jié)合實體，其中，所述結(jié)合實體多肽基本由其氨基酸序列與SEQ ID NO7-35中任意一個至少具有98％同源性的多肽組成。
16.如權(quán)利要求8的結(jié)合實體，其中，所述結(jié)合實體基本由具有SEQ ID NO7-35或SEQ ID NO47-49中任意一個的多肽組成。
17.如權(quán)利要求8的結(jié)合實體，其中，所述結(jié)合實體是由包括SEQID NO36-39中任意一個的核酸編碼的。
18.一種用于檢測癌癥的試劑盒，包括裝有能結(jié)合癌相關(guān)表位的結(jié)合實體多肽的容器，其中，所述癌相關(guān)表位包括兩種獨立的多肽，細胞角蛋白8多肽和細胞角蛋白18多肽，并且，其中，所述細胞角蛋白8多肽基本由SEQ ID NO3或SEQ ID NO5組成，而所述細胞角蛋白18多肽基本由SEQ ID NO4或SEQ ID NO6組成。
19.如權(quán)利要求18的試劑盒，其中，所述細胞角蛋白8多肽短于大約475個氨基酸，而所述細胞角蛋白18多肽短于大約425個氨基酸。
20.如權(quán)利要求18的試劑盒，其中，所述結(jié)合實體多肽短于大約425個氨基酸。
21.如權(quán)利要求18的試劑盒，其中，所述結(jié)合實體多肽短于大約200個氨基酸。
22.如權(quán)利要求18的試劑盒，其中，所述結(jié)合實體多肽是抗體。
23.如權(quán)利要求18的試劑盒，其中，所述癌是腺癌。
24.如權(quán)利要求18的試劑盒，其中，所述癌是結(jié)腸腺癌，卵巢腺癌，腎臟腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌或非精原細胞瘤睪丸癌。
25.如權(quán)利要求18的試劑盒，其中，所述結(jié)合實體多肽還包括一種標記或診斷成像劑。
26.如權(quán)利要求18的試劑盒，其中，所述結(jié)合實體多肽還包括硫酸鋇，碘醋胺酸，碘番酸，碘泊酸鈣，泛影酸鈉，泛影葡胺，甲泛葡胺，丁酰碘番酸鈉，氟-18，碳-11，碘-123，锝-99m，碘-131，銦-111，氟，釓，熒光素，異硫氰酸鹽，羅丹明，藻紅蛋白，藻藍蛋白，別藻藍蛋白，鄰苯二醛，熒光胺，魯米那，異魯米那，熒光素，熒光素酶或水母發(fā)光蛋白。
27.如權(quán)利要求18的試劑盒，其中，所述結(jié)合實體基本由其氨基酸序列與SEQ ID NO7-35中任意一個至少具有98％同源性的多肽組成。
28.如權(quán)利要求18的試劑盒，其中，所述結(jié)合實體基本由具有SEQID NO7-35或SEQ ID NO47-49中任意一個的多肽組成。
29.如權(quán)利要求18的試劑盒，其中，所述結(jié)合實體是由包括SEQID NO36-39中任意一個的核酸編碼的。
30.一種治療組合物，包括結(jié)合實體多肽和可以藥用的載體，其中，所述結(jié)合實體多肽能夠結(jié)合癌相關(guān)表位，所述表位包括兩種獨立的多肽，細胞角蛋白8多肽和細胞角蛋白18多肽，其中，所述細胞角蛋白8多肽包括SEQ ID NO3或SEQ ID NO5，而所述細胞角蛋白18多肽包括SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
31.如權(quán)利要求30的治療組合物，其中，所述細胞角蛋白8多肽短于大約475個氨基酸，而所述細胞角蛋白18多肽短于大約425個氨基酸。
32.如權(quán)利要求30的治療組合物，其中，所述結(jié)合實體多肽短于大約425個氨基酸。
33.如權(quán)利要求30的治療組合物，其中，所述結(jié)合實體多肽短于大約200個氨基酸。
34.如權(quán)利要求30的治療組合物，其中，所述結(jié)合實體多肽是抗體。
35.如權(quán)利要求30的治療組合物，其中，所述結(jié)合實體能夠結(jié)合腺癌細胞的絲狀細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)中的癌相關(guān)表位，但基本上不能結(jié)合正常細胞的絲狀結(jié)構(gòu)中的表位。
36.如權(quán)利要求30的治療組合物，其中，所述結(jié)合實體能夠結(jié)合結(jié)腸腺癌，卵巢腺癌，腎臟腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原細胞瘤睪丸癌細胞的絲狀細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)中的癌相關(guān)表位。
37.如權(quán)利要求30的治療組合物，其中，所述結(jié)合實體基本由其氨基酸序列與SEQ ID NO7-35中任意一個具有至少98％同源性的多肽組成。
38.如權(quán)利要求30的治療組合物，其中，所述結(jié)合實體基本由具有SEQ ID NO7-35或SEQ ID NO47-49中任意一個的多肽組成。
39.如權(quán)利要求30的治療組合物，其中，所述結(jié)合實體是由包括SEQ ID NO36-39中任意一個的核酸編碼的。
40.一種用于治療腺癌的組合物，包括能裂解Xaa1SR↓Xaa4(SEQID NO40)的蛋白酶的抑制劑，以及可以藥用的載體，其中，Xaa1是絲氨酸，苯丙氨酸或纈氨酸，而Xaa4是絲氨酸或纈氨酸。
41.如權(quán)利要求40的治療組合物，其中，所述蛋白酶是胰蛋白酶-樣蛋白酶。
42.如權(quán)利要求40的治療組合物，其中，所述抑制劑是大豆胰蛋白酶抑制劑，α-2-巨球蛋白，α-1-抗胰蛋白酶，抑蛋白酶肽，胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑，玉米胰蛋白酶抑制劑，西葫蘆胰蛋白酶抑制劑或人淀粉樣β-蛋白前體抑制劑。
43.如權(quán)利要求40的治療組合物，其中，所述腺癌是結(jié)腸腺癌，卵巢腺癌，腎臟腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌或非精原細胞瘤睪丸癌。
44.一種檢測腺癌的方法，包括讓結(jié)合實體多肽與檢測樣品接觸，并且檢測所述結(jié)合實體多肽是否與包括兩種獨立多肽，細胞角蛋白8多肽和細胞角蛋白18多肽的表位結(jié)合，其中，所述細胞角蛋白8多肽基本由SEQ ID NO3或SEQ ID NO5組成，而所述細胞角蛋白18多肽基本由SEQ ID NO4或SEQ ID NO6組成。
45.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述細胞角蛋白8多肽短于大約475個氨基酸，而所述細胞角蛋白18多肽短于大約425個氨基酸。
46.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述結(jié)合實體多肽短于大約425個氨基酸。
47.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述結(jié)合實體多肽短于大約200個氨基酸。
48.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述結(jié)合實體多肽是抗體。
49.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述結(jié)合實體基本由其氨基酸序列與SEQ ID NO7-35中任意一個具有至少98％同源性的多肽組成。
50.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述結(jié)合實體基本由具有SEQID NO7-35或SEQ ID NO47-49中任意一個的多肽組成。
51.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述結(jié)合實體是由包括SEQ IDNO36-39中任意一個的核酸編碼的。
52.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述腺癌是結(jié)腸腺癌，卵巢腺癌，腎臟腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌或非精原細胞瘤睪丸癌。
53.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述結(jié)合實體還包括一種標記或診斷成像劑。
54.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述結(jié)合實體還包括硫酸鋇，碘醋胺酸，碘番酸，碘泊酸鈣，泛影酸鈉，泛影葡胺，甲泛葡胺，丁酰碘番酸鈉，氟-18，碳-11，碘-123，锝-99m，碘-131，銦-111，氟，釓，熒光素，異硫氰酸鹽，羅丹明，藻紅蛋白，藻藍蛋白，別藻藍蛋白，鄰苯二醛，熒光胺，魯米那，異魯米那，熒光素，熒光素酶或水母發(fā)光蛋白。
55.一種治療或預防哺乳動物癌癥的方法，包括給所述哺乳動物施用治療有效量的與抗腫瘤劑偶聯(lián)的結(jié)合實體多肽；其中結(jié)合實體多肽能結(jié)合包括兩種獨立的多肽的癌相關(guān)表位，所述獨立的多肽為細胞角蛋白8多肽，和細胞角蛋白18多肽；并且，其中，所述細胞角蛋白8多肽包括SEQ ID NO3或SEQ ID NO5，而所述細胞角蛋白18多肽包括SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
56.如權(quán)利要求55的方法，其中，所述細胞角蛋白8多肽短于大約475個氨基酸，而所述細胞角蛋白18多肽短于大約425個氨基酸。
57.如權(quán)利要求55的方法，其中，所述結(jié)合實體多肽短于大約425個氨基酸。
58.如權(quán)利要求55的方法，其中，所述結(jié)合實體多肽短于大約200個氨基酸。
59.如權(quán)利要求55的方法，其中，所述結(jié)合實體多肽是抗體。
60.如權(quán)利要求55的方法，其中，所述抗-腫瘤制劑是放射性碘酸化化合物，毒素，細胞抑制藥物或細胞裂解藥物。
61.如權(quán)利要求55的方法，其中，所述抗-腫瘤制劑是氨魯米特，硫唑嘌呤，硫酸博來霉素，白消安，卡氮芥，苯丁酸氮芥，順鉑，環(huán)磷酰胺，環(huán)孢菌素，cytarabidine，氮烯咪胺，放線菌素D，正定霉素，阿霉素，紫杉酚，足葉乙甙，氟尿嘧啶，干擾素-α，環(huán)己亞硝脲，巰基嘌呤，氨甲蝶呤，米托坦，鹽酸甲基芐肼，硫鳥嘌呤，硫酸長春堿，硫酸長春新堿，美洲商陸抗-病毒蛋白，霍亂毒素，百日咳毒素，蓖麻毒蛋白，gelonin，相思豆毒素，白喉外毒素，假單胞菌外毒素或鈷-60。
62.如權(quán)利要求55的方法，其中，所述結(jié)合實體包括其氨基酸序列與SEQ ID NO20-35中任意一個具有至少98％同源性的多肽。
63.如權(quán)利要求55的方法，其中，所述結(jié)合實體包括具有SEQ IDNO7-35或SEQ ID NO47-49中任意一個的多肽。
64.如權(quán)利要求55的方法，其中，所述結(jié)合實體是由包括SEQ IDNO36-39中任意一個的核酸編碼的。
65.一種鑒定突變型結(jié)合實體的方法，包括將編碼具有SEQ ID NO20-35中任意一個的多肽的核酸與編碼展示蛋白的核酸融合，以便制備編碼融合蛋白的重組核酸；對編碼所述融合蛋白的重組核酸進行誘變，以便制備編碼突變?nèi)诤系鞍椎耐蛔兒怂?；表達所述突變?nèi)诤系鞍?；和選擇能結(jié)合包括兩種獨立多肽的癌相關(guān)表位的突變?nèi)诤系鞍?，第一種多肽包括細胞角蛋白8的SEQ ID NO3，第二種多肽包括細胞角蛋白18的SEQ ID NO4。
66.如權(quán)利要求65的方法其中，所述結(jié)合實體是CDR或Fab片段。
67.如權(quán)利要求65的方法，其中，所述展示蛋白是噬菌體展示蛋白，逆轉(zhuǎn)錄病毒展示蛋白，或核糖體展示蛋白。
68.將如權(quán)利要求30的治療組合物用于制備用來治療和/或預防哺乳動物癌癥的藥物的用途。
69.將如權(quán)利要求40的治療組合物用于制備用來治療和/或預防哺乳動物癌癥的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了兩種多肽組成的癌相關(guān)表位，其中，第一種多肽來自細胞角蛋白K8，而第二種多肽來自細胞角蛋白K18。所述癌相關(guān)表位在惡性轉(zhuǎn)化期間，特別是在結(jié)腸，乳腺，卵巢，腎臟，肺和睪丸組織的惡性轉(zhuǎn)化期間變得暴露。所述癌相關(guān)表位的暴露，是通過裂解并且除去細胞角蛋白K8和K18的N－末端肽產(chǎn)生的。本發(fā)明還提供了在癌組織中高達10M－1的癌相關(guān)表位，比正常組織中細胞角蛋白K8/K18復合物高出100倍。本發(fā)明提供了癌相關(guān)表位，結(jié)合實體，抗體以及使用所述表位，結(jié)合實體和抗體檢測和治療癌癥的方法。
文檔編號A61K39/395GK1639185SQ03805148
公開日2005年7月13日 申請日期2003年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月3日
發(fā)明者H·迪策爾, J·C·詹森紐斯 申請人:斯克里普斯研究學院