專利名稱：用總狀花升麻的提取物作為雌激素型的對(duì)器官有選擇性而無(wú)趨子宮作用的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及總狀花升麻(Cimicifuga racemosa)的提取物和鳶尾黃素作為雌激素型的對(duì)器官有選擇性的藥物。
背景技術(shù)：
形成于卵巢的17-β-雌二醇(以后提到的雌二醇都是指生理學(xué)上的17-β-雌二醇)[以后同樣也以E2表示]一般對(duì)該器官有促進(jìn)增殖作用。除可以控制女性(月經(jīng))周期外，在其缺乏時(shí)，它對(duì)骨骼的新陳代謝有內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的影響，也防止血管內(nèi)皮的動(dòng)脈粥樣斑塊形成。
在絕經(jīng)期，由于卵巢功能的停止，雌二醇的水平下降。這將減弱增殖的過(guò)程，對(duì)于下丘腦則將造成促性腺素釋放激素(GnRH)脈沖發(fā)生器活動(dòng)的增強(qiáng)。(促性腺激素釋放激素脈沖發(fā)生器是位于下丘腦的定時(shí)器，它也是黃體生成素(LH)的定時(shí)器，定時(shí)脈沖式的，LH分泌和甾族化合物影響其分泌的量幅和頻率。)對(duì)于更年期的婦女，其結(jié)果是被刺激的LH分泌將造成所謂的“熱潮紅(hot flush)”，即易發(fā)怒。
由于血液中雌二醇未達(dá)足夠高的水平，破骨細(xì)胞的活動(dòng)和骨骼組織破裂占優(yōu)勢(shì)地位，伴隨骨骼破裂，折斷危險(xiǎn)的增高。同時(shí)，也有很長(zhǎng)一段時(shí)間將經(jīng)歷血管系統(tǒng)中粥樣斑塊形成的危險(xiǎn)和由此增加的梗塞形成的風(fēng)險(xiǎn)。
總狀花升麻和射干的提取物兩者都已知是普通藥物，能用于減輕圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后的功能紊亂。迄今為止，通過(guò)事實(shí)的驗(yàn)證，這兩種植物藥物的提取物除了對(duì)人類(lèi)眾多器官(特別是腦、卵巢、骨骼、血管系統(tǒng))都有有益的作用外，還有雌性激素型作用。雌激素型作用作用于子宮、陰道、乳房組織和肝，其結(jié)果是不利的。然而，令人不快的是，至今這種原可用于在雌激素不足情況下對(duì)器官有選擇性的預(yù)防或治療的植物藥物，在現(xiàn)有的技術(shù)水平下無(wú)法實(shí)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是以這種技術(shù)狀況出發(fā)完成有雌激素型作用的植物藥物，且其作用是器官選擇性，對(duì)于子宮來(lái)說(shuō)是沒(méi)有或只有很小的作用。
本發(fā)明的一個(gè)目的，就是提供總狀花升麻的提取物作為雌激素型的對(duì)器官有選擇性而無(wú)子宮作用的藥物的用途。
在體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)中，驚人地發(fā)現(xiàn)含有機(jī)溶劑或含超臨界CO2的鳶尾科(特別是射干)和總狀花升麻提取物兩者都可對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和血管系統(tǒng)器官選擇性的作用，而不存在對(duì)子宮的作用-所謂的趨子宮作用。按發(fā)明使用這種提取物被適用于制備以定配方的藥物，選擇性治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。
它們也適用于制備以定配方的藥物，選擇性治療和/或預(yù)防心血管疾病，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化。
它們也適用于制備以定配方的藥物，選擇性治療和/或預(yù)防圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)期后的精神植物性(psychovegetative)疾病(如熱潮紅)。
此外還發(fā)現(xiàn)，從射干中分離的鳶尾黃素組份與整個(gè)提取物基本呈現(xiàn)相同的作用。

鳶尾黃素除了射干，其他鳶尾科如德國(guó)鳶尾(Iris germanica)，鳶尾(I.illyrica)，(illrica)，和野鳶尾(I.dichotoma)中同樣也發(fā)現(xiàn)了這種組份。
從分類(lèi)學(xué)說(shuō)，射干可以如下分類(lèi)


對(duì)于生產(chǎn)提取物來(lái)說(shuō)，這些植物的根莖、葉梗、葉和/或花瓣是較好的。
對(duì)于射干和其組份的基本植物化學(xué)描述可見(jiàn)于Ms.A.Nenninger(LMUMünchen，1997)的論文題為“射干一種TCM藥用植物和其它Irisarten的植物化學(xué)和藥理學(xué)調(diào)查(Phytochemische und pharmakologische Untersuchungen vonBelamcanda sinensis，einer Arzneipflanze der TCM und anderer Irisarten)”。
本發(fā)明中的藥物，即由總狀花升麻和射干及其他鳶尾科制得的藥物和以鳶尾黃素為基礎(chǔ)的藥物，首次可用作骨骼、心血管系統(tǒng)和大腦的全雌激素受體促效劑。


本發(fā)明更詳盡的優(yōu)勢(shì)和特征可由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及后面的圖例描述圖1總狀花升麻有機(jī)相和水相的比較。一種典型雌激素受體-配體的結(jié)合測(cè)試的替換圖。起始濃度為17.66mg/ml，按1∶2，1∶4，等稀釋，直到1∶64；圖2先加入LH血漿，2小時(shí)后，靜脈注射射干提取物、E2和載體。射干提取物與E2對(duì)于降低被升高的血漿LH水平的作用相似；圖3對(duì)于卵巢切除的大鼠進(jìn)行7天的皮下處理后，總狀花升麻和E2對(duì)子宮重量(圖3a)和血液中LH水平的作用(圖3b)；(平均值+SEM(均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差)，n＝8，*＝p＜0.05 vs.聚乙二醇化合物作為載體)；圖3a)子宮重量；圖3b)血液中的LH濃度；圖4a)對(duì)于卵巢切除的大鼠進(jìn)行7天的皮下處理后，總狀花升麻和E2的作用；(平均值+SEM，n＝8，*＝p＜0.05vs.聚乙二醇化合物作為載體)下丘腦視葉前區(qū)域?qū)2-受體的mRNA的表達(dá)；圖4b)對(duì)于卵巢切除的大鼠進(jìn)行7天的皮下給藥后，子宮內(nèi)對(duì)于IGF1和C3的mRNA的表達(dá)；圖4c)對(duì)于卵巢切除的大鼠進(jìn)行7天的皮下給藥后，對(duì)于其骨骼中膠原1(Coll1)和骨鈣蛋白的mRNA的表達(dá)。
最佳實(shí)施方式關(guān)于總狀花升麻和射干的雌激素作用的實(shí)驗(yàn)證明一系列不同復(fù)雜程度的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)過(guò)程的不同階段來(lái)示范選擇性雌激素的作用。
1.體外實(shí)驗(yàn)1.1對(duì)于總狀花升麻的體外實(shí)驗(yàn)體外可由直接針對(duì)17-β-雌二醇(＝E2)的抗體來(lái)識(shí)別組合物中雌激素型結(jié)構(gòu)。
總狀花升麻的提取物由殘留液中蒸發(fā)。由二氯甲烷和水間的相分布，濃縮了不同極性的物質(zhì)。由豬子宮的雌激素受體蛋白的體外實(shí)驗(yàn)可測(cè)得兩相組份的結(jié)合親和力。豬子宮胞質(zhì)的雌激素受體是由標(biāo)準(zhǔn)步驟分離得，用于配體的替換實(shí)驗(yàn)。
在此也發(fā)現(xiàn)了，雌激素型的結(jié)構(gòu)如分離于總狀花升麻的，在性質(zhì)上是不親水性的，而是親油性的，因?yàn)樗鼈兛梢越柚袡C(jī)溶劑的抽提而被提取。在有機(jī)萃取相中的該物質(zhì)與抗體的結(jié)合能力較在水相中留下的物質(zhì)強(qiáng)約10倍。
在雌二醇受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)中這兩相間差別就更大了。在無(wú)細(xì)胞制備中，與雌二醇結(jié)合的物質(zhì)的相似性必須高到足以與雌二醇受體發(fā)生選擇性的競(jìng)爭(zhēng)性的相互作用。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，相反有機(jī)相與受體有很強(qiáng)的結(jié)合能力，水相確無(wú)任何結(jié)合受體的活性。
結(jié)果顯示于圖1。
1.2對(duì)于射干的體外實(shí)驗(yàn)由其他研究可知，射干的提取物也有可由抗17-β-雌二醇的抗體識(shí)別并可和17-β-雌二醇受體(參看Nenninger loc.cit)結(jié)合的組份。然而，奇怪的是，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)這些提取物對(duì)不同器官系統(tǒng)有不同的雌激素作用，特別是它們沒(méi)有趨子宮作用。
2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)卵巢切除的大鼠雌激素作用證據(jù)雖然與受體E2的結(jié)合是非常選擇性的，但并不能說(shuō)下一步細(xì)胞內(nèi)過(guò)程是被促進(jìn)或是抑制的，亦即該物質(zhì)是促效劑還是拮抗劑。這種特性只能在適合的細(xì)胞系統(tǒng)或完整的動(dòng)物上測(cè)得。
卵巢切除的大鼠可作為更年期后的婦女模型，此時(shí)的婦女內(nèi)分泌雌激素量降低。外部提供的17-β-雌二醇或有雌激素型作用的物質(zhì)的結(jié)果是，產(chǎn)生對(duì)雌激素敏感的解剖形態(tài)學(xué)參數(shù)修復(fù)，如子宮重量的增加；角質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生，例如陰道上皮的空斑上皮細(xì)胞；或激素的變化，如受處理動(dòng)物血液中LH水平的降低。
以下所有的實(shí)驗(yàn)都是以重量在240-280g之間的卵巢切除的Sprague-Dawley大鼠(＝ovx大鼠)進(jìn)行的。
2.1射干的一次加藥對(duì)于射干提取物的雌激素型作用的開(kāi)始非?？臁⑤d體、雌二醇和射干提取物一次靜脈注射給藥ovx大鼠剛完，在E2和射干作用下搏動(dòng)都停止。隨著藥值的發(fā)展，與先前的值和用聚乙二醇化合物處理的對(duì)照動(dòng)物相比，對(duì)血清中LH水平的抑制非常顯著。聚乙二醇化合物是以聚乙氧基蓖化麻油衍生物為基礎(chǔ)的乳化劑。
圖2顯示了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
注射了射干提取物六小時(shí)后，與對(duì)照組相比，動(dòng)物子宮的內(nèi)子宮VEGF、IGF1和C3的基因表達(dá)沒(méi)有變化，而注射雌二醇的對(duì)于這三種雌激素調(diào)節(jié)蛋白的基因表達(dá)有了很顯著的增加。任何這些處理對(duì)細(xì)胞色素C氧化酶(CCO)基因的組成型表達(dá)都無(wú)顯著影響。
這些發(fā)現(xiàn)表明，射干的組份對(duì)下丘腦的雌激素接受結(jié)構(gòu)的GnRH脈沖發(fā)生器有抑制作用，及由此產(chǎn)生的雌激素競(jìng)爭(zhēng)作用。據(jù)此，腦垂體的LH的分泌被射干和雌二醇的組份顯著的抑制了。與雌二醇相比，射干的組份沒(méi)有趨子宮作用。雌二醇能顯著地對(duì)VEGF、IGF1和C3的基因表達(dá)起向上的調(diào)節(jié)，而未被觀察到射干有這種作用。
靜脈注射射干提取物作用的急性實(shí)驗(yàn)實(shí)施例。
實(shí)驗(yàn)前一天，對(duì)24只大鼠(即8只/組)乙醚麻醉下頸靜脈導(dǎo)管插管。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，每10分鐘取一次血樣共六次。當(dāng)?shù)诹螛悠啡⊥旰螅杆俜謩e靜脈注射62.5mg的射干提取物或10μg的17-β-雌二醇(E2)或1ml含5％聚乙二醇化合物的等滲壓的NaCl，再每10分鐘取血樣，一次共兩小時(shí)。在靜脈加藥的6小時(shí)后，將大鼠斷頭、采血、割除子宮、稱重并在液氮下深度冰凍。
2.2鳶尾黃素酮的一次加藥在單加藥鳶尾黃素酮后，可測(cè)量到血液中LH水平受時(shí)間發(fā)展影響和雌二醇型免疫反應(yīng)性。在E2放射免疫分析(E2-RIA)測(cè)定，20分鐘后，動(dòng)物血液中鳶尾黃素的濃度與100pg相當(dāng)量的雌二醇相應(yīng)。
鳶尾黃素酮觸發(fā)LH迅速地減少。直到靜脈注射與雌二醇精確相應(yīng)的鳶尾黃素60分鐘后，完成了LH的動(dòng)力學(xué)減少，但減少并不進(jìn)一步下去反而緩慢增加。
實(shí)施例參考Harms和Ojeda(Harms PG；Ojeda SR大鼠頸靜脈慢性插導(dǎo)管的一種迅速且簡(jiǎn)單的操作.J.Appl.Physiol.(1974)36391-392)的技術(shù)，將導(dǎo)管置于在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前24小時(shí)已乙醚麻醉的OVX大鼠的頸外靜脈。將管的一端置于勁部的一個(gè)皮膚囊內(nèi)。為了在采血樣時(shí)不接觸動(dòng)物，用硅膠管將導(dǎo)管延長(zhǎng)。導(dǎo)管和硅膠管都用含50IU/ml的肝素的林格溶液沖洗。
100μl的血樣都是以10分鐘為間隔從每個(gè)動(dòng)物上采取的，以同樣體積的林格/肝素溶液補(bǔ)充。在第六次的取樣后，靜脈注射1.0ml各自的測(cè)試溶液。測(cè)試溶液為2％的聚乙二醇化合物(＝載體溶液)，鳶尾黃素(7mg/ml載體)，17-β-雌二醇(10μ g/ml載體)。在接下的140分鐘，每10分鐘取一次血樣。
將如上所得的血樣置于放了10μl肝素-losung(5000IU/ml，liquemin)的0.5ml的Eppendorf反應(yīng)管內(nèi)，10000*g離心10分鐘，然后將它們?cè)?20℃貯存，直到放射免疫測(cè)定。
催乳素(Prolaktin)和LH的RIA都是以國(guó)家衛(wèi)生研究所NIH(Bethesda，Maryland，USA)的抗血清、對(duì)照物、分離劑(iodisation)的制劑為基礎(chǔ)。通過(guò)DPC(Bad Nauheim)的RIA可測(cè)得雌二醇和交叉反應(yīng)的異黃酮的濃度。
2.3加藥7天中射干提取物的作用在每天的皮下用藥后的7天中，測(cè)定再次加藥雌二醇、射干提取物和載體對(duì)于切除卵巢的大鼠的總重、子宮的重量、激素的水平以及子宮和骨骼的基因活性的作用。
用聚乙二醇化合物和射干處理的動(dòng)物的平均體重沒(méi)有區(qū)別，而E2處理的動(dòng)物的體重則顯著減輕了。同樣用聚乙二醇化合物和射干處理的動(dòng)物子宮的重量也沒(méi)有顯著的區(qū)別，而E2處理的動(dòng)物的子宮的重量比原來(lái)的三倍還多。
LH的血清水平，在射干處理的動(dòng)物上的降低是輕微的，但與聚乙二醇化合物對(duì)照相比，降低是有顯著性的，而用雌二醇處理的減少更很顯著的。
處理的一周后，在子宮的mRNA提取物中，雌二醇明顯上升了VEGF的基因表達(dá)，到達(dá)對(duì)照值的149％。對(duì)于射干提取物，表達(dá)的提高是輕微的，無(wú)顯著性的。對(duì)于細(xì)胞色素C氧化酶(＝CCO)的非雌激素調(diào)節(jié)的組成型基因則沒(méi)有影響。
對(duì)股骨頭提取物測(cè)定了膠原-1A1、骨鈣蛋白、IGF1和TGFβ-mRNA的表達(dá)。與射干一樣，雌二醇對(duì)這四種基因的表達(dá)都有顯著的抑制而對(duì)組成型基因CCO沒(méi)有影響。
在7天的處理后，雌二醇與射干的不同作用就很明顯了。射干提取物通過(guò)抑制GnRH脈沖發(fā)生器和骨骼中的四種雌激素調(diào)節(jié)基因的表達(dá)對(duì)腦垂體的LH分泌有雌激素競(jìng)爭(zhēng)性影響。形成對(duì)比的是，射干提取物對(duì)子宮無(wú)雌激素影響，即子宮的重量和雌激素調(diào)節(jié)的VEGF基因都沒(méi)有受到影響。而雌二醇確造成了子宮的膨脹和VEGF的激活。
七天期內(nèi)每天皮下注射作用的亞急性實(shí)驗(yàn)的實(shí)施例8只動(dòng)物每測(cè)試組(共24只)每天在早上8:00-9:00分別皮下注射62.5mg的射干提取物和10μg的雌二醇或溶劑(5％聚乙二醇化合物，1ml)。在最后加藥的6小時(shí)后，將大鼠斷頭，切除得每只大鼠的主動(dòng)脈、子宮和左股骨頭，清洗，在液氮下冰凍。
由血樣測(cè)得了LH和雌二醇的免疫反應(yīng)性。
2.4總狀花升麻的反復(fù)加藥盡早在卵巢切除術(shù)后的14天，動(dòng)物通過(guò)每天一次早上皮下注射劑量為62.5mg的總狀花升麻/大鼠或8μg的雌二醇/大鼠分別進(jìn)行測(cè)試，共7天。這兩種物質(zhì)都溶解在5％的聚乙二醇化合物中，對(duì)照組動(dòng)物只接受載體。
在將大鼠斷頭后，為獲得mRNA而制備腦、子宮和股骨。通過(guò)RIA可測(cè)得動(dòng)物血液的LH濃度。通過(guò)半定量的逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)可測(cè)得上述確定器官的雌激素調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。
用雌二醇處理的動(dòng)物子宮的重量是用總狀花升麻和載體處理的三倍還多，而后二者基本上它們的平均值沒(méi)有區(qū)別。這就意味著總狀花升麻的組份對(duì)動(dòng)物的子宮沒(méi)有影響。對(duì)于陰道也是一樣，用總狀花升麻和載體處理的動(dòng)物的上皮組織沒(méi)有角質(zhì)化發(fā)生，而雌二醇處理的動(dòng)物則情況相反。
LH的水平在用載體處理的動(dòng)物上保持的相當(dāng)高，而用雌二醇和總狀花升麻處理的則被顯著地降低了。
圖3a)和圖3b)顯示了結(jié)果。
子宮重量(濕重)

血液的LH濃度


作為雌激素作用的另一標(biāo)記，測(cè)定了雌激素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)的mRNA的激活。用到的是子宮、骨骼(股骨)和下丘腦的視葉前區(qū)的組織。
在下丘腦中，總狀花升麻和E2都刺激雌激素受體α的mRNA的表達(dá)(圖4a)。對(duì)于骨組織來(lái)說(shuō)也一樣，總狀花升麻的表現(xiàn)如一種雌激素，與雌二醇相似，減少了骨骼特異的膠原1和骨鈣蛋白基因的mRNA的表達(dá)(圖4b)。
與此形成對(duì)比的是，觀察到總狀花升麻對(duì)子宮的雌激素調(diào)節(jié)基因沒(méi)有影響。只有雌二醇增加了IGF1的mRNA和補(bǔ)體因子C3(圖4c)。
這些發(fā)現(xiàn)證明總狀花升麻的組份選擇性地作用于單個(gè)器官其提取物雌激素地作用于下丘腦(E2受體α的表達(dá)和LH的釋放)和骨骼(由膠原1和骨鈣蛋白的基因表達(dá)可證明)。但與雌二醇不同的是，因?yàn)樵谧訉m的重量和IGF1和C3的基因表達(dá)上缺乏作用，總狀花升麻確對(duì)子宮沒(méi)有作用。
通過(guò)體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)可確定，總狀花升麻和射干的提取物有雌激素作用。但驚人的是，這些藥物的提取物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼和血管器官有選擇性的作用，但對(duì)子宮則無(wú)作用，由此它們非常適用于雌激素缺乏的預(yù)防和治療同時(shí)對(duì)子宮內(nèi)膜沒(méi)有負(fù)影響。
射干中的鳶尾黃素也有等同的效果。
因此這是首次使有雌激素型作用而無(wú)趨子宮作用的藥物成為可用。
該類(lèi)似的藥物可用于治療和/或預(yù)防心血管疾病(特別是動(dòng)脈粥樣硬化)、骨質(zhì)疏松癥和圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)期后的植物性的混亂(如熱潮紅)。
在應(yīng)用的類(lèi)型中，口腔、靜脈和皮下的應(yīng)用都是很好的。
權(quán)利要求
1.總狀花升麻的提取物的用途，其特征在于，用于生產(chǎn)雌激素型的對(duì)器官有選擇性的藥物，該藥物沒(méi)有趨子宮作用或作用可忽略，但附帶的條件是這種藥物不用于減輕圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)期后疾病。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，該提取物用于生產(chǎn)已定劑型的藥物，以選擇性治療和/或預(yù)防心血管疾病。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述心血管疾病是動(dòng)脈粥樣硬化。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，該提取物用于生產(chǎn)已定劑型的藥物，以選擇性治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，該提取物用于生產(chǎn)已定劑型的藥物，以選擇性治療和/或預(yù)防更年期疾病。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述更年期疾病是熱潮紅。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于用鳶尾科和總狀花升麻的提取物和鳶尾黃素作為一種雌激素型對(duì)器官有選擇性的藥物，來(lái)選擇性治療和/或預(yù)防心血管疾病，特別是動(dòng)脈粥樣硬化，骨質(zhì)疏松和更年期疾病，例如預(yù)防或減輕熱潮紅。事實(shí)上沒(méi)有觀察到趨子宮作用。
文檔編號(hào)A61K36/8965GK1509712SQ0314549
公開(kāi)日2004年7月7日 申請(qǐng)日期1999年3月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月19日
發(fā)明者W·武特克, H·哈里, V·克里斯托夫, B·施彭格勒, M·波珀, W 武特克, 碭窶, 鎪雇蟹 申請(qǐng)人:白奧諾里卡股份公司