專利名稱：基因修飾的組織工程血管的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建基因修飾的組織工程血管。
背景技術(shù)：
目前各種血管移植物，以人體自身血管為佳。但人體自身非必需血管的長(zhǎng)度和直徑極為有限，有些患者有全身血管病變甚至無合適的自體血管移植物。對(duì)于大血管，雖然PTFE(聚四氟乙烯)等人工血管可在一定程度上滿足臨床需要，但不能降解，一直作為異物存在人體內(nèi)，且抑制血管細(xì)胞的再生功能。PTFE等人工血管的抗凝血機(jī)理是讓血液在人工血管內(nèi)壁形成一層血栓膜，因此這種人工血管的內(nèi)徑通常不能小于6mm，否則會(huì)引起血管阻塞，直徑小于6mm的小血管病變，仍無滿意的人工血管替代物。目前臨床血管移植物仍盡量取用自身動(dòng)、靜脈。雖然自體動(dòng)脈移植物有著無可比擬的優(yōu)良效果，自體靜脈移植物仍然是冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)選用最多的血管移植物，但是由于來源少，其順應(yīng)性不匹配及移植前后各種因素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，大多數(shù)搭橋血管發(fā)生內(nèi)膜增生，最終導(dǎo)致血管狹窄閉塞，靜脈橋的遠(yuǎn)期通暢率低，又是困擾心臟外科醫(yī)生的一個(gè)難題。
另外人工血管用于急性血管損傷治療或用于一些不能提供合適種子細(xì)胞的病人，構(gòu)建的人工血管不能用自體細(xì)胞種植需要耐受同種移植。冠脈搭橋需要小直徑血管，但直徑小于6mm的人工血管移植6個(gè)月后血栓率高達(dá)40％，仍無滿意的人工血管替代物。用人工材料構(gòu)建小直徑血管不易成型，同時(shí)很難做到順應(yīng)性相匹配。因而如何改善移植血管的力學(xué)特性及生物相容性，防止血管閉塞，是構(gòu)建小直徑血管面臨的主要問題。
組織工程血管研究的關(guān)鍵問題是種子細(xì)胞和支架材料。種子細(xì)胞包括成體血管細(xì)胞和干細(xì)胞等。在支架材料方面，血管組織工程最終研制的產(chǎn)品是具有三維形狀和空間結(jié)構(gòu)的血管，因此在培育細(xì)胞時(shí)，必須提供具有特定三維結(jié)構(gòu)的立體血管支架材料，使接種細(xì)胞能定位、貼附、局域化生長(zhǎng)增殖，同時(shí)材料可使細(xì)胞在支架空間分布排列有序，分化具有特定功能并合成適當(dāng)?shù)募?xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)形成的組織或器官與三維支架形狀一致，組織工程血管移植體內(nèi)時(shí)支架材料還兼有力學(xué)支持功能，抗血流壓力等。目前組織工程血管使用的支架材料包括天然材料和人工合成材料，人工合成材料主要有兩種，一種為不可降解材料如聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯等，另一種為可降解材料如聚乙二醇酸、聚丙醇酸等及上述材料的共聚物。由于這類物質(zhì)具有低毒、無免疫反應(yīng)、安全性較好且有很好的生物相容性的特性得到廣泛應(yīng)用。人工材料盡管有許多優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些問題，人工合成材料的生物相容性、生物活性、生物降解性及與宿主血管力學(xué)匹配等方面還存在一些缺點(diǎn)，且在孔隙率及孔徑大小等方面的仿生制作還有一定難度，同時(shí)某些人工材料(如聚乳酸等)大量使用時(shí)在體內(nèi)降解過程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)堆積，不利于細(xì)胞的附著、分裂、增殖；同時(shí)親水性差，細(xì)胞吸附力較弱，機(jī)械強(qiáng)度不足。另外作為合成類高分子材料缺乏細(xì)胞識(shí)別信號(hào)，其昂貴的價(jià)格也限制了其廣泛應(yīng)用。因此，支架材料已成為妨礙組織工程血管研究進(jìn)程的主要問題。
因血管替代治療并不能改變機(jī)體的內(nèi)部致病環(huán)境，Ratliff等觀察了115例，用作冠狀動(dòng)脈搭橋的大隱靜脈，發(fā)現(xiàn)移植物動(dòng)脈粥樣硬化(GAS)病變者占99％。說明盡管進(jìn)行了替代治療，但由于移植過程中的損傷、及機(jī)體的內(nèi)部致病環(huán)境仍然存在，極有可能再度導(dǎo)致移植血管發(fā)生再狹窄，從而導(dǎo)致移植失敗。盡管目前有構(gòu)建小直徑血管的報(bào)道，但都局限在血管表面進(jìn)行修飾加強(qiáng)細(xì)胞種植，對(duì)血管移植后發(fā)生的內(nèi)膜增生血管再狹窄閉塞尚沒有好的辦法解決。
A20基因?qū)儆阡\指蛋白家族，在抗炎癥方面有相關(guān)報(bào)道，但目前國(guó)內(nèi)外未見任何將A20基因應(yīng)用于血管組織工程研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種同時(shí)具有良好力學(xué)性能及抗血栓形成、血管再狹窄的基因修飾的組織工程血管，用于臨床上修復(fù)血管缺損或血管搭橋。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的而采用的技術(shù)方案是這樣的，即一種基因修飾的組織工程血管，其特征是采用如下的方法制備1、血管支架材料獲取由異種或同種血管去除抗原性和細(xì)胞成分，保留血管的天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)制成，或直接采用人工合成材料制成；2、血管表面修飾在血管腔表面修飾由可生物降解的控制生長(zhǎng)因子釋放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生長(zhǎng)因子蛋白和A20基因質(zhì)粒DNA組成的表面修飾混合物；其配比關(guān)系按重量百分比為可生物降解的控制生長(zhǎng)因子釋放的抗凝血高分子材料70-90％，粘附短肽0.3-1％，生長(zhǎng)因子蛋白為0.003-0.008％，A20基因質(zhì)粒DNA為0.001-0.003％，余量為去離子水。充分混合成水溶液，灌注到處理好的異種或同種血管腔或人工合成材料制成的血管腔內(nèi)，經(jīng)紫外光反應(yīng)將其交聯(lián)在血管腔表面，真空干燥備用；3、平滑肌細(xì)胞種植完成血管腔表面修飾后，再在血管中膜上接種平滑肌細(xì)胞；4、內(nèi)皮細(xì)胞種植平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)好后，在血管腔的表面再種植A20基因修飾的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
在上述制備方法中，步驟1中所述的人工合成材料可采用不可降解材料如聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯，或可降解材料如聚乙二醇酸、聚丙醇酸等及上述材料的共聚物；在步驟2中的可生物降解的控制生長(zhǎng)因子釋放的抗凝血高分子材料為N-磺酸-光交聯(lián)-殼聚糖硫酸酯；粘附短肽為Gly-Arg-Gly-Asp、或Arg-Gly-Asp、生長(zhǎng)因子蛋白為內(nèi)皮生長(zhǎng)因子或內(nèi)皮生長(zhǎng)因子加少量的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；本發(fā)明解決的主要問題是血管的力學(xué)特性和生物相容性，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1.在基因修飾組織工程血管方面，A20基因具有抗血栓形成、血管再狹窄功能，本發(fā)明通過基因工程方法和組織工程相結(jié)合在種子細(xì)胞轉(zhuǎn)入或超表達(dá)A20基因，則既能對(duì)抗血管搭橋病人血液中的損傷因子對(duì)移植血管內(nèi)皮的損傷，抑制平滑肌細(xì)胞的病理性增殖，同時(shí)能有效抑制急性血管替代治療所面臨的同種移植損傷。
2.制備的血管支架，其抗原性較弱，有良好的組織親和性和結(jié)合力，其天然的孔隙結(jié)構(gòu)、大小和形態(tài)端正，為種子細(xì)胞的粘附、增殖、分化提供天然的三維生長(zhǎng)空間結(jié)構(gòu)。這種材料來源豐富，制作簡(jiǎn)便，易于塑形，并在功能適應(yīng)性、組織相容性、理化性能、生物降解性、造價(jià)等方面優(yōu)于人工合成材料。
3.抗凝血及控制生長(zhǎng)因子釋放的N-磺酸-光交聯(lián)-殼聚糖硫酸酯表面修飾劑由光交聯(lián)的殼聚糖(Az-CH-LA)磺化和硫酸酯化合成，因而具有很強(qiáng)的親水性和抗凝性，經(jīng)紫外光照射可迅速變成不易溶解柔韌的水凝膠，能控制藥物的釋放。而目前常見合成的類肝素體N-磺酸-殼聚糖硫酸酯具有抗凝性但不具有控制藥物釋放的功能。目前國(guó)內(nèi)外尚未見同時(shí)具有控制藥物釋放及抗凝的殼聚糖合成報(bào)道。因此本發(fā)明將光交聯(lián)殼聚糖(Az-CH-LA)材料化學(xué)改性成類肝素體結(jié)構(gòu)以形成全新的能用于與血液相接觸的生物材料類肝素體N-磺酸-光交聯(lián)-殼聚糖硫酸酯，則一方面可控制生長(zhǎng)因子或藥物的釋放，另一方面具有抗凝血性能，同時(shí)具有可降解性?？捎糜诒景l(fā)明構(gòu)建的血管、人工血管、其他組織工程血管及血管內(nèi)支架的表面修飾。
4.血管支架本身具有良好細(xì)胞誘異性，進(jìn)一步復(fù)合表面修飾物質(zhì)后，為種子細(xì)胞粘附、增殖及發(fā)揮抗凝血功能提供好的微環(huán)境。本發(fā)明中表面修飾有以下優(yōu)點(diǎn)，合成的抗凝血高分子材料N-磺酸-光交聯(lián)-殼聚糖硫酸酯一方面可控制生長(zhǎng)因子的釋放，另一方面交聯(lián)在血管表面在內(nèi)皮種子細(xì)胞不足或細(xì)胞脫落時(shí)不會(huì)引起血栓形成，交聯(lián)的粘附短肽可促進(jìn)離體和在體的細(xì)胞粘附，內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白可離體誘導(dǎo)種子細(xì)胞生長(zhǎng)及在體誘導(dǎo)血液中內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管表面粘附分化(或質(zhì)粒DNA)A20基因可有效對(duì)抗各種因素對(duì)血管損傷。本發(fā)明通過表面修飾在急性血管替代或取病人內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量不足時(shí)，可以直接將血管移植到病人體內(nèi)，N-CM-光交聯(lián)殼聚糖抗凝表面不會(huì)導(dǎo)致血液凝固，交聯(lián)的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和粘附肽可誘導(dǎo)血液中的內(nèi)皮祖細(xì)胞和臨近內(nèi)皮細(xì)胞補(bǔ)充在移植血管內(nèi)皮丟失或尚未種植部位。交聯(lián)的A20基因DNA便于粘附分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞吸取，迅速形成具有抗動(dòng)脈粥樣硬化功能的小直徑血管。這種方法也可在體誘導(dǎo)血液中的內(nèi)皮祖細(xì)胞粘附分化生長(zhǎng)成內(nèi)皮細(xì)胞，而不必離體分離培養(yǎng)，這樣可大大提高組織工程效率。尚未見任何報(bào)道有這些設(shè)想或?qū)嶒?yàn)結(jié)果。
5.利用上述的良好支架材料，種植平滑肌細(xì)胞，再離體種植內(nèi)皮種子細(xì)胞或在體誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞種植，成為有生命的基因修飾組織工程血管，可廣泛用于臨床上修復(fù)血管損傷。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步說明。
1.血管支架材料獲取無菌條件下取新鮮異種(如豬血管)或同種血管，去除其上所附軟組織，無菌PBS沖洗血管，去除血栓凝塊，無菌包裝放入-80℃保存。復(fù)溫于37℃用0.1mol/L PMSF溶液處理1--3小時(shí)，抗生素低滲及高滲緩沖液分別處理3--5小時(shí)，每1小時(shí)換液一次；無菌蒸餾水浸洗干凈，在保持37℃、5％CO2用0.03％--0.05％胰蛋白酶處理16--24小時(shí)，每8小時(shí)換液一次，無菌蒸餾水浸洗干凈；用0.005％---0.01％RNA酶消化1--3小時(shí)，無菌蒸餾水浸洗干凈，0.006％--0.01％DNA酶消化1--3小時(shí)，無菌蒸餾水浸洗干凈，0.005％--0.01％脂質(zhì)酶消化2--4小時(shí)，無菌抗生素蒸餾水浸洗干凈。15--20GY γ射線輻射處理10--15分鐘消毒并清除剩余血管基質(zhì)膠原蛋白、彈性蛋白的抗原性，最后獲得血管支架。
將上述方法獲得的血管支架運(yùn)用形態(tài)學(xué)方法檢測(cè)可見處理血管細(xì)胞已去除，血管基質(zhì)纖維較前疏松，但分布完整，未見纖維斷裂，彈力纖維及膠原纖維含量未見明顯變化，處理前與處理后血管長(zhǎng)度及內(nèi)徑相差不顯著。壓力容積實(shí)驗(yàn)對(duì)其順應(yīng)性進(jìn)行檢測(cè)與處理前對(duì)照，處理前后血管的壓力容積曲線與拋物線的上升支非常接近，動(dòng)脈P-V數(shù)據(jù)用二次拋物線關(guān)系式V＝aP2+bP+c進(jìn)行擬合，其相關(guān)系數(shù)均大于0.95，說明擬合效果良好，所對(duì)應(yīng)動(dòng)脈順應(yīng)性的計(jì)算方法C＝dv/dp＝2ap+b。得處理后血管順應(yīng)性下降，但相差不顯著(P＞0.05)，其中在壓力為100mmHg時(shí)，處理前后的順應(yīng)性分別為6.25±0.42，5.80±0.67(×10-4ml/mmHg)，相差不顯著(P＞0.05)。用Western blot檢測(cè)表明未處理前豬血管MHC抗原、異種移植超急性排斥反應(yīng)α-Gal抗原都有較強(qiáng)表達(dá)，處理后未見表達(dá)。
2.血管表面修飾2.1.表面修飾物之一的可生物降解的控制生長(zhǎng)因子釋放的抗凝血高分子材料實(shí)質(zhì)上是將光交聯(lián)殼聚糖進(jìn)行磺化和硫酸酯化后得到的N-磺酸-光交聯(lián)-殼聚糖硫酸酯。實(shí)施例為①、用6-O-磺化光交聯(lián)殼聚糖(6-O-SM-Az-CH-LA)的合成將純化的光交聯(lián)殼聚糖(Az-CH-LA)溶解在2％甲酸溶液中，然后在室溫下逐滴加入適量的1mol/L的CuSO4.5H2O溶液，攪拌15--20小時(shí)后，過濾后依次用水、丙酮和乙醚洗滌。將所得產(chǎn)物完全分散在干燥的DMF溶液中，然后將溶解在DMF中的SO3.Pyridine溶液按1∶4的比例(1∶4＝殼聚糖分子重復(fù)單元與SO3.Pyridine之間的摩爾比)在低溫下滴加到溶液中，攪拌1--3小時(shí)后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)和50℃下加熱攪拌15--小時(shí)。將冷卻后的溶液用NaHCO3調(diào)到pH值為8.2，加入適量的水透析3--5天。將所得溶液用色譜的方法除掉銅離子后，冷凍干燥(這步的產(chǎn)率為80％)等到產(chǎn)品。②、將上一步得到的6-O-磺酸光交聯(lián)殼聚糖溶解在一定量的水中，然后加入適量的Na2CO3和SO3.NMe3復(fù)合物，用氮?dú)獗Ｗo(hù)，在70℃下攪拌15--20小時(shí)。等反應(yīng)完成后，在去離子水中透析25--35小時(shí)，在稀NaoH溶液中透析4--6小時(shí)，最后在去離子水中透析3--5天，冷凍干燥得最終產(chǎn)品。15--20Gy Y射線輻射處理15--20分鐘消毒備用。
2.2.A20基因質(zhì)粒DNA的制備用腫瘤壞死因子TNF刺激培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞3--5小時(shí)，可刺激A20基因表達(dá)。抽提細(xì)胞中RNA，設(shè)計(jì)引物上游5’-AGTTGTCCCATTCGTCATTCC-3’，下游5’-TTTGAGCAATATGCGGAAAGC-3’，用RT-PCR方法克隆A20基因cDNA，帶A末端DNA克隆載體pUCm-T Vector(編號(hào)BS434從上海生物工程有限公司購(gòu)買)，將A20基因cDNA與pUCm-T Vector進(jìn)行連接，運(yùn)用x-gal染色，藍(lán)白斑篩選出成功連接的菌落，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒DNA，用EcoR I和BamH I進(jìn)行酶切，得到大量包含EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)的A20基因cDNA片段。綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-N1(catalog#6085-1從美國(guó)基因有限公司購(gòu)買)包括4.7kb，此載體包括多個(gè)酶切位點(diǎn)可以插入外源片段，其中本實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用載體多克隆位點(diǎn)中的631處的EcoR I位點(diǎn)和661bp處的BamH I位點(diǎn)，用EcoR I和BamH I雙酶切線性化pEGFP-N1載體，再用連接酶將含EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)的A20基因cDNA片段克隆到綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-N1，篩選出陽(yáng)性菌落，擴(kuò)增抽提得到包含A20基因的真核表達(dá)載體pEGFPA20-N1。
2.3.將無菌條件下合成表面修飾混合物。其配比關(guān)系為N-磺酸-光交聯(lián)-殼聚糖硫酸酯70-90％(w/v)，Gly-Arg-Gly-Asp(GRGD)0.3-1％，內(nèi)皮生長(zhǎng)因子為0.003-0.008％，A20基因質(zhì)粒DNA為0.001-0.003％，其余用水補(bǔ)足。混合成水溶液，充分混合處理后灌注到處理好的血管腔，經(jīng)紫外光反應(yīng)將其交聯(lián)在血管腔表面，真空干燥備用。此種修飾方法也可應(yīng)用生物降解材料合成的血管支架內(nèi)及人工血管腔表面及血管內(nèi)支架表面進(jìn)行修飾。
經(jīng)上述步驟進(jìn)行表面修飾后的血管，經(jīng)掃描電鏡檢測(cè)可見血管內(nèi)腔全部由表面修飾物覆蓋，并附著均勻。
3.平滑肌細(xì)胞種植，在自行構(gòu)建血管培養(yǎng)系統(tǒng)中，原代培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞擴(kuò)增傳代后取3-6代，以濃度3×106cell/ml注射到血管腔，保持管腔內(nèi)一直有一定壓力進(jìn)行培養(yǎng)。另一種平滑肌細(xì)胞種植方法是用同樣數(shù)量細(xì)胞采用間隔相同的點(diǎn)微注射到血管中膜，在血管細(xì)胞化生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。
上述步驟種植的平滑肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)檢測(cè)將種植了平滑肌細(xì)胞的血管中膜用0.1％硝酸銀液灌注30秒，日光下顯色30min，再用顯微器械分離鋪片，常規(guī)脫水透明封片，數(shù)碼顯微相機(jī)照相。同時(shí)HE方法對(duì)種植平滑肌的血管進(jìn)行染色，結(jié)果銀染可見血管腔平滑肌細(xì)胞形態(tài)正常，密集排列，沿血管長(zhǎng)軸分布，說明在上述條件下，血管成功進(jìn)行了平滑肌細(xì)胞化。HE染色顯示血管中膜的平滑肌細(xì)胞形態(tài)正常，呈梭型，密集排列，沿血管長(zhǎng)軸分布。說明在血管基質(zhì)材料上成功進(jìn)行了平滑肌細(xì)胞化
4.內(nèi)皮細(xì)胞種植，轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增傳代后取3-6代，以濃度3×106cell/ml注射到血管腔，粘附90--120min后，在2--4天的內(nèi)皮細(xì)胞種植培養(yǎng)過程中，腔內(nèi)流速逐漸從0.033到0.1ml/s增高，在血管壁相應(yīng)的剪切應(yīng)力約為1×10-2N/m2到4×10-2N/m2之間，構(gòu)建基因修飾的組織工程血管。
上述步驟種植的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)光鏡及電鏡檢測(cè)，可見血管腔內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常，密集排列，沿血管長(zhǎng)軸分布，說明在上述條件下，血管成功進(jìn)行了內(nèi)皮化，銀染也表明內(nèi)皮細(xì)胞成功種植在血管基質(zhì)上。熒光顯微鏡顯示種植在血管基質(zhì)材料上的的內(nèi)皮細(xì)胞能分泌細(xì)胞外基質(zhì)。表明內(nèi)皮細(xì)胞可在血管基質(zhì)上正常生長(zhǎng)。
對(duì)上述步驟后獲得的血管進(jìn)行周向張力檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)中對(duì)構(gòu)建好的轉(zhuǎn)基因組織工程血管逐步加增加力刺激，當(dāng)靜水壓達(dá)到2000mmHg時(shí)仍未見血管破裂，說明構(gòu)建的血管抗脹裂強(qiáng)度/靜水壓大于2000mmHg。
備擇方案，在不能獲取足夠數(shù)量的人內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，可按前述方法制備血管支架并表面修飾后，也可僅在中膜種植平滑肌細(xì)胞，血管內(nèi)腔主要誘導(dǎo)在體血液中內(nèi)皮祖細(xì)胞和臨近內(nèi)皮細(xì)胞種植。
下面舉例進(jìn)行說明，但本發(fā)明的應(yīng)用不僅在于此。
實(shí)施例1。一種基因修飾的組織工程血管制備，按步驟上述(1)方法制備豬血管或異體血管基質(zhì)材料，按步驟(2)進(jìn)行表面修飾后，按(3)種植猴平滑肌細(xì)胞，按步驟(4)種植內(nèi)皮細(xì)胞。
獲得的血管可見種植的平滑肌細(xì)胞形態(tài)良好，血管內(nèi)皮細(xì)胞分布完整，順血管長(zhǎng)軸分布。移植到猴頸總動(dòng)脈，12個(gè)月后進(jìn)行檢測(cè)。見血管內(nèi)皮細(xì)胞分布完好，形態(tài)正常，血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)正常，順血管長(zhǎng)軸分布，血管保持通暢，沒有血管內(nèi)膜增生及血栓形成。
與異種移植血管(直接從豬到猴)與同種移植血管進(jìn)行比較。可見異種移植血管可見管腔全部閉塞，血管內(nèi)有血栓形成，血管壁內(nèi)膜破壞，未見增生，血管壁有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而同種移植血管6個(gè)月后血管閉塞，血管內(nèi)膜呈典型移植物動(dòng)脈粥樣硬化病理改變，可見均勻彌漫性內(nèi)膜增厚，病灶規(guī)則，呈向心性輪環(huán)狀，病灶內(nèi)富含泡沫細(xì)胞，炎癥反應(yīng)十分明顯，纖維形成不充分，鈣化不明顯，在增厚的內(nèi)膜中間有一小的圓形空隙，內(nèi)被血栓充填，說明在血管狹窄到一定程度后，導(dǎo)致血栓形成，血管閉塞。而同種移植1個(gè)月的血管HE染色可見血管未閉塞，內(nèi)膜層增厚，內(nèi)皮下出現(xiàn)淡染的空泡細(xì)胞，中膜明顯增生，平滑肌細(xì)胞排列紊亂并向內(nèi)膜突起，呈斑塊狀結(jié)構(gòu)，有些部位中膜有明顯的鈣化形成，鈣化區(qū)周圍出現(xiàn)泡沫樣細(xì)胞。有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，經(jīng)免疫組化檢測(cè)可見血管外膜層有不同程度的CD4陽(yáng)性細(xì)胞。Tunnel檢測(cè)表明同種移植血管血管內(nèi)膜層基本未見凋亡細(xì)胞，而中膜層、外膜層可見大量的凋亡細(xì)胞。血管HE染色血管內(nèi)膜層增厚部分經(jīng)Brdu為單抗檢測(cè)都為Brdu陽(yáng)性細(xì)胞，免疫熒光經(jīng)α-actin為單抗檢測(cè)確定增生的內(nèi)膜層細(xì)胞為α-actin陽(yáng)性細(xì)胞。說明增生的內(nèi)膜層主要是增殖的平滑肌細(xì)胞。
而本方法構(gòu)建的基因修飾的組織工程血管移植12個(gè)月后HE染色基本未見血管內(nèi)膜層增厚及明顯的平滑肌細(xì)胞增生，血管形態(tài)正常，各層結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，未見鈣化區(qū)及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，免疫組化檢測(cè)未見血管有CD4表達(dá)。血管基本未見凋亡細(xì)胞。血管移植后HE染色未見血管內(nèi)膜增厚，免疫熒光用Brdu、α-actin為單抗檢測(cè)內(nèi)膜層未見紅色熒光。說明內(nèi)膜層未見增殖的平滑肌細(xì)胞，與HE染色結(jié)果相吻合。以上結(jié)果說明本發(fā)明通過基因工程方法和組織工程相結(jié)合在種子細(xì)胞轉(zhuǎn)入或超表達(dá)A20基因，則既能對(duì)抗血管搭橋病人血液中的損傷因子對(duì)移植血管內(nèi)皮的損傷，抗血栓形成，抑制平滑肌細(xì)胞的病理性增殖，抗血管再狹窄。同時(shí)能有效抑制急性血管替代治療所面臨的同種移植損傷。
實(shí)施例2、能在體誘導(dǎo)內(nèi)皮化的基因修飾組織工程血管制備，按上述步驟(1)方法制備相應(yīng)管徑的豬血管或異體血管基質(zhì)材料，按步驟(2)進(jìn)行表面修飾后，按(3)種植大鼠平滑肌細(xì)胞，不種植內(nèi)皮細(xì)胞。移植到大鼠頸總動(dòng)脈，6個(gè)月后進(jìn)行檢測(cè)，見血管保持通暢，掃描電鏡檢測(cè)，血管已完全內(nèi)皮化，沒有血管內(nèi)膜增生及血栓形成。而對(duì)照組未經(jīng)表面修飾及基因修飾的血管未見內(nèi)皮層形成，血管腔狹窄，血管內(nèi)膜增生，一部分血管全部閉塞。
實(shí)施例3。一種基因修飾的組織工程血管制備，按實(shí)施(1)方法制備豬血管或同種血管基質(zhì)材料，按(2)進(jìn)行表面修飾后，按(3)、(4)種植人平滑肌細(xì)胞，同種內(nèi)皮細(xì)胞。用于透析病人未見血栓形成，而對(duì)照組有血栓形成。
權(quán)利要求
1.一種基因修飾的組織工程血管，其特征是采用如下的方法制備(1)、血管支架材料獲取由異種或同種血管去除抗原性和細(xì)胞成分，保留血管的天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)制成，或直接采用人工合成材料制成；(2)、血管表面修飾在血管腔表面修飾由可生物降解的控制生長(zhǎng)因子釋放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生長(zhǎng)因子蛋白和A20基因質(zhì)粒DNA組成的表面修飾混合物；其配比關(guān)系按重量百分比為可生物降解的控制生長(zhǎng)因子釋放的抗凝血高分子材料70-90％，粘附短肽0.3-1％，生長(zhǎng)因子蛋白為0.003-0.008％，A20基因質(zhì)粒DNA為0.001-0.003％，余量為去離子水。充分混合成水溶液，灌注到處理好的異種或同種血管腔或人工合成材料制成的血管腔內(nèi)，經(jīng)紫外光反應(yīng)將其交聯(lián)在血管腔表面，真空干燥備用；(3)、平滑肌細(xì)胞種植完成血管腔表面修飾后，再在血管中膜上接種平滑肌細(xì)胞；(4)、內(nèi)皮細(xì)胞種植平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)好后，在血管腔的表面再種植A20基因修飾的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
2.一種基因修飾的組織工程血管，其特征是采用如下的方法制備(1)、血管支架材料獲取由異種或同種血管去除抗原性和細(xì)胞成分，保留血管的天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)制成，或直接采用人工合成材料制成；(2)、血管表面修飾在血管腔表面修飾由可生物降解的控制生長(zhǎng)因子釋放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生長(zhǎng)因子蛋白和A20基因質(zhì)粒DNA組成的表面修飾混合物；其配比關(guān)系按重量百分比為可生物降解的控制生長(zhǎng)因子釋放的抗凝血高分子材料70-90％，粘附短肽0.3-1％，生長(zhǎng)因子蛋白為0.003-0.008％，A20基因質(zhì)粒DNA為0.001-0.003％，余量為去離子水。充分混合成水溶液，灌注到處理好的異種或同種血管腔或人工合成材料制成的血管腔內(nèi)，經(jīng)紫外光反應(yīng)將其交聯(lián)在血管腔表面，真空干燥備用；(3)、平滑肌細(xì)胞種植完成血管腔表面修飾后，再在血管中膜上接種平滑肌細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因修飾的組織工程血管，其特征是在其制備方法的步驟1中所述的人工合成材料可采用不可降解材料為聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯，或可降解材料如聚乙二醇酸、聚丙醇酸等及上述材料的共聚物；在步驟2中的可生物降解的控制生長(zhǎng)因子釋放的抗凝血高分子材料為N-磺酸-光交聯(lián)-殼聚糖硫酸酯；粘附短肽為Gly-Arg-Gly-Asp、或Arg-Gly-Asp、生長(zhǎng)因子蛋白為內(nèi)皮生長(zhǎng)因子或內(nèi)皮生長(zhǎng)因子加少量的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因修飾的組織工程血管，其特征是其制備方法步驟(1)中血管支架材料獲取的采用以下方式在無菌條件下取新鮮異種(如豬血管)或同種血管，去除其上所附軟組織，無菌PBS沖洗血管，去除血栓凝塊，無菌包裝放入-80℃保存。復(fù)溫于37℃用0.1mol/L PMSF溶液處理1--3小時(shí)，抗生素低滲及高滲緩沖液分別處理3--5小時(shí)，每1小時(shí)換液一次；無菌蒸餾水浸洗干凈，在保持37℃、5％CO2用0.03％--0.05％胰蛋白酶處理16--24小時(shí)，每8小時(shí)換液一次，無菌蒸餾水浸洗干凈；用0.005％---0.01％RNA酶消化1--3小時(shí)，無菌蒸餾水浸洗干凈，0.006％--0.01％DNA酶消化1--3小時(shí)，無菌蒸餾水浸洗干凈，0.005％--0.01％脂質(zhì)酶消化2--4小時(shí)，無菌抗生素蒸餾水浸洗干凈。15--20GY γ射線輻射處理10--15分鐘消毒并清除剩余血管基質(zhì)膠原蛋白、彈性蛋白的抗原性，最后獲得血管支架。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因修飾的組織工程血管，其特征是其制備方法步驟(2)中可生物降解的控制生長(zhǎng)因子釋放的抗凝血高分子材料制備是將光交聯(lián)殼聚糖進(jìn)行磺化和硫酸酯化后得到的N-磺酸-光交聯(lián)-殼聚糖硫酸酯，具體方法為①、6-O-磺化光交聯(lián)殼聚糖(6-O-SM-Az-CH-LA)的合成將純化的光交聯(lián)殼聚糖(Az-CH-LA)溶解在2％甲酸溶液中，然后在室溫下逐滴加入適量的1mol/L的CuSO4.5H2O溶液，攪拌15--20小時(shí)后，過濾后依次用水、丙酮和乙醚洗滌。將所得產(chǎn)物完全分散在干燥的DMF溶液中，然后將溶解在DMF中的SO3.Pyridine溶液按1∶4的比例(1∶4＝殼聚糖分子重復(fù)單元與SO3.Pyridine之間的摩爾比)在低溫下滴加到溶液中，攪拌1--3小時(shí)后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)和50℃下加熱攪拌15--小時(shí)。將冷卻后的溶液用NaHCO3調(diào)到pH值為8.2，加入適量的水透析3--5天。將所得溶液用色譜的方法除掉銅離子后，冷凍干燥(這步的產(chǎn)率為80％)等到產(chǎn)品；②、將上一步得到的6-O-磺酸光交聯(lián)殼聚糖溶解在一定量的水中，然后加入適量的Na2CO3和SO3.NMe3復(fù)合物，用氮?dú)獗Ｗo(hù)，在70℃下攪拌15--20小時(shí)。等反應(yīng)完成后，在去離子水中透析25--35小時(shí)，在稀NaoH溶液中透析4--6小時(shí)，最后在去離子水中透析3--5天，冷凍干燥得最終產(chǎn)品。15--20Gy Y射線輻射處理15--20分鐘消毒備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因修飾的組織工程血管，其特征是其制備方法步驟(2)中A20基因質(zhì)粒DNA的制備如下用腫瘤壞死因子TNF刺激培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞3--5小時(shí)，可刺激A20基因表達(dá)。抽提細(xì)胞中RNA，設(shè)計(jì)引物上游5’-AGTTGTCCCATTCGTCATTCC-3’，下游5’-TTTGAGCAATATGCGGAAAGC-3’，用RT-PCR方法克隆A20基因cDNA，帶A末端DNA克隆載體pUCm-T Vector(編號(hào)BS434)，將A20基因cDNA與pUCm-T Vector進(jìn)行連接，篩選出成功連接的菌落，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒DNA，用EcoR I和BamH I進(jìn)行酶切，得到大量包含EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)的A20基因cDNA片段；綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-N1(catalog #6085-1)包括4.7kb，此載體包括多個(gè)酶切位點(diǎn)可以插入外源片段，其中本實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用載體多克隆位點(diǎn)中的631處的EcoR I位點(diǎn)和661bp處的BamH I位點(diǎn)，用EcoRI和BamH I雙酶切線性化pEGFP-N1載體，再用連接酶將含EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)的A20基因cDNA片段克隆到綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-N1，篩選出陽(yáng)性菌落，擴(kuò)增抽提得到包含A20基因的真核表達(dá)載體質(zhì)粒pEGFPA20-N1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因修飾的組織工程血管，其特征是其制備方法步驟(3)中平滑肌細(xì)胞種植方式如下在自行構(gòu)建血管培養(yǎng)系統(tǒng)中，原代培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞擴(kuò)增傳代后取3-6代，以濃度3×106cell/ml注射到血管腔，保持管腔內(nèi)一直有一定搏動(dòng)壓力進(jìn)行培養(yǎng)；另一種平滑肌細(xì)胞種植方法是用同樣數(shù)量細(xì)胞采用間隔相同的點(diǎn)微注射到血管中膜，在血管細(xì)胞化生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因修飾的組織工程血管，其特征是其制備方法步驟(4)中內(nèi)皮細(xì)胞種植方法如下轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增傳代后取3-6代，以濃度3×106cell/ml注射到血管腔，粘附90--120min后，在2--4天的內(nèi)皮細(xì)胞種植培養(yǎng)過程中，腔內(nèi)流速逐漸從0.033到0.1ml/s增高，在血管壁相應(yīng)的剪切應(yīng)力約為1×10-2N/m2到4×10-2N/m2之間，構(gòu)建出基因修飾的組織工程血管。
全文摘要
本發(fā)明涉及的基因修飾的組織工程血管的特征是采用如下的方法制備(1)、血管支架材料獲??；(2)、血管表面修飾在血管腔表面修飾由可生物降解的控制生長(zhǎng)因子釋放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生長(zhǎng)因子蛋白和A20基因質(zhì)粒DNA組成的表面修飾混合物；(3)、平滑肌細(xì)胞種植；(4)、內(nèi)皮細(xì)胞種植。所述組織工程血管具有良好力學(xué)性能及抗血栓形成、抗血管再狹窄等性能，用于臨床上修復(fù)血管缺損或血管搭橋。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1491728SQ0313572
公開日2004年4月28日 申請(qǐng)日期2003年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月29日
發(fā)明者朱楚洪, 應(yīng)大君, 糜建紅 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)