專利名稱：組織工程血管的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療脈管疾病的組織工程血管。具體地講，本發(fā)明提供了由支架 和一種或多種細(xì)胞、細(xì)胞片層、細(xì)胞裂解液、組織糜及生物反應(yīng)器處理制備的組織工程血 管，用于修復(fù)或置換受損或病變的原生血管。
背景技術(shù)：
心血管相關(guān)疾病是發(fā)達(dá)國(guó)家的首要死亡原因。僅在美國(guó)，每34秒就會(huì)發(fā)生一起心 血管死亡事件，與心血管疾病相關(guān)的花費(fèi)為大約2500億美元。目前治療脈管疾病的方法 包括化療方案、血管成形術(shù)、支架插入法、重建手術(shù)、旁路移植術(shù)、病變組織切除法或者切斷 術(shù)。不幸的是，對(duì)于許多患者而言，此類治療方式的成功率很有限，并且部分患者病癥或癥 狀會(huì)惡化。這些疾病通常需要重建和更換血管。目前，最常用的血管更換來(lái)源為自體同源的 動(dòng)脈和靜脈。然而，此類自體同源脈管供給不足，或者并不適用，特別是患有脈管疾病或先 前已做過(guò)手術(shù)的患者。由諸如聚四氟乙烯(PTFE)和滌綸之類的材料制成的合成移植物是常用的血管替 代物。盡管這種替代物比較常用，但合成材料并不適用于小直徑移植物或血液流量低的區(qū) 域。已證實(shí)存在一些與材料相關(guān)的問(wèn)題，例如狹窄、血栓栓塞、鈣沉積和感染。因此，臨床需要有利于組織侵潤(rùn)以便修復(fù)/再生病變或受損組織的生物相容性的 和可生物降解的結(jié)構(gòu)基質(zhì)。通常，修復(fù)受損或病變血管組織的臨床方法不能基本恢復(fù)它們 的原有功能。因此，迫切需要一種可避免出現(xiàn)與目前臨床方法相關(guān)的常見(jiàn)問(wèn)題的組織修復(fù) /再生替代方法。組織工程的出現(xiàn)可提供修復(fù)和再生受損/病變組織的替代方法。組織工程策略已 研究了將生物材料與細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、生物活性物質(zhì)和生物反應(yīng)器處理結(jié)合使用，以開(kāi)發(fā)最 終可恢復(fù)或改善組織功能的生物替代物。已大量研究了可移植和可重塑的支架材料作為組 織模板、導(dǎo)管、屏障物和儲(chǔ)器。具體地講，泡沫和紡織物形式的合成和天然材料已在體外和 體內(nèi)用于重建/再生生物組織，以及遞送誘導(dǎo)組織生長(zhǎng)的試劑。已成功地在體外制備了此類組織工程血管(TEBV)并已用于動(dòng)物模型。然而，臨床 成功案例還非常有限。無(wú)論支架和目標(biāo)組織的組成如何，模板必須具有一些基本特性。支架必須是生物 相容的，具有足以抵抗手術(shù)時(shí)所施加的物理力的機(jī)械性能、足以允許細(xì)胞侵入或生長(zhǎng)的多 孔性，并且易于消毒，能夠通過(guò)侵入組織進(jìn)行重塑，而且在新組織形成時(shí)是可降解的。此外， 可用機(jī)械手段、固定裝置或粘結(jié)劑將支架固定在周圍的組織上。迄今為止，單獨(dú)使用或組合 使用的常規(guī)材料都缺乏上述標(biāo)準(zhǔn)中的一者或多者。因此，需要能解決常規(guī)材料的潛在缺陷的支架。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了一種組織工程血管(TEBV)，其由生物相容的可生物吸收性支架以及 一種或多種細(xì)胞、細(xì)胞片層、細(xì)胞裂解液、組織糜構(gòu)成，并且采用或未采用生物反應(yīng)器處理 培養(yǎng)。此類組織工程血管可用于修復(fù)或置換受損或病變的原生血管。在一個(gè)實(shí)施例中，組 織工程血管由生物相容的可生物吸收性支架和細(xì)胞構(gòu)成。在另一個(gè)實(shí)施例中，組織工程血 管由生物相容的可生物吸收性支架和細(xì)胞片層構(gòu)成。在另一個(gè)實(shí)施例中，組織工程血管由 生物相容的可生物吸收性支架和細(xì)胞裂解液構(gòu)成。在又一個(gè)實(shí)施例中，組織工程血管由生 物相容的可生物吸收性支架和組織糜構(gòu)成。此外，可將細(xì)胞、細(xì)胞片層、細(xì)胞裂解液和組織 糜的多種組合與生物相容的可生物吸收性支架相結(jié)合來(lái)形成組織工程血管。這些組織工程 血管可在采用或不采用生物反應(yīng)器處理的條件下培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施例中，組織工程血管通 過(guò)與生物活性劑組合而得到加強(qiáng)。


圖1。在培養(yǎng)物中培養(yǎng)3天和7天后，源于人臍帶的細(xì)胞(hUTC)在血管移植生物 材料上的附著和生長(zhǎng)。A 3天后的PDO-ESS支架；B 7天后的PDO-ESS支架；C 3天后的 PDO/膠原-ESS支架；D 7天后的PDO/膠原-ESS支架。所有圖象均放大40倍。圖2。在培養(yǎng)物中培養(yǎng)3天和7天后，平滑肌細(xì)胞(UASMC)在血管移植生物材料上 的細(xì)胞附著和生長(zhǎng)的代表性實(shí)例。A :3天后的100mg/ml PDO-ESS支架；B :7天后的IOOmg/ ml PDO-ESS 支架；C :3 天后的 140mg/mlPD0_ESS 支架；D :7 天后的 140mg/ml PD0-ESS 支架。 所有圖象均放大40倍。圖3。在培養(yǎng)物中培養(yǎng)3天和7天后，內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在血管移植生物材料上的 細(xì)胞附著和生長(zhǎng)的代表性實(shí)例。A :3天后的100mg/ml PDO-ESS支架；B :7天后的100mg/ml PDO-ESS 支架；C :3 天后的 140mg/mlPD0-ESS 支架；D :7 天后的 140mg/ml PD0-ESS 支架。所 有圖象均放大40倍。圖4。細(xì)胞對(duì)裂解產(chǎn)物增強(qiáng)的PDO-ESS支架的附著。給PDO-ESS支架加載兩種不 同濃度的hUTC細(xì)胞裂解液并凍干。然后將細(xì)胞(50，000/支架)接種到支架上，培養(yǎng)3天 和7天，然后進(jìn)行活/死細(xì)胞染色。(A) 3天后的對(duì)照支架；(B) 7天后的對(duì)照支架；(C) 3天 后的用18mg/ml細(xì)胞裂解液增強(qiáng)的支架；(D) 7天后的用18mg/ml細(xì)胞裂解液增強(qiáng)的支架； (E) 3天后的用5. 2mg/ml細(xì)胞裂解液增強(qiáng)的支架；(F) 7天后的用5. 2mg/ml細(xì)胞裂解液增強(qiáng) 的支架。所有圖象均放大40倍。圖5。在用細(xì)胞裂解液增強(qiáng)的PDO-ESS支架上培養(yǎng)的細(xì)胞的DNA含量。給PDO-ESS 支架加載兩種不同濃度(低濃度=5.2mg/ml，高濃度=18mg/ml)的hUTC細(xì)胞裂解液并凍 干。然后將細(xì)胞(50，000/支架)接種到支架上，培養(yǎng)3天，然后分析細(xì)胞的DNA含量。洗 滌樣品，用木瓜蛋白酶消化，并使用CyQuant NF測(cè)定試劑盒進(jìn)行DNA定量。圖6。與大鼠SMC培養(yǎng)M小時(shí)的涂覆有PBS或hUTC細(xì)胞裂解液的管狀支架顯示， 通過(guò)活/死細(xì)胞染色和H&E圖象表明涂覆有細(xì)胞裂解液的支架具有更多的細(xì)胞附著。
圖7。接種培養(yǎng)11天后，預(yù)先涂覆有hUTC細(xì)胞裂解液的接種有hUTC的PDO片的 H&E染色。盡管僅將細(xì)胞接種到一個(gè)側(cè)面上，但細(xì)胞可在整個(gè)支架中遷移和滲透。盒子？圖8。滾壓管草圖示出了活-死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)的取樣區(qū)域。在靜態(tài)培養(yǎng)中，位置 lc2為管的底部，a和b為管的側(cè)面，ld2為管的頂部。圖9。來(lái)自接種有rSMC的片層(50微米厚)的滾壓PDO管的H&E染色。圖10。在2mm管狀支架上接種hUTC。將直徑為2mm的PD0-ESS管狀支架㈧和 涂覆有鼠尾I型膠原的PDO-ESS管狀支架(B)固定至LumeGen生物反應(yīng)器室，并通過(guò)在內(nèi) 腔中填充5. 5X IO5個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行接種。然后以0. 4rpm將該室旋轉(zhuǎn)過(guò)夜， 通過(guò)活/死細(xì)胞染色進(jìn)行分析。所有圖象均放大100倍。圖11。在管狀支架上接種大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。將PDO-ESS管狀支架(A)和 PDO/膠原-ESS管狀支架(B)固定至LumeGen生物反應(yīng)器室，并通過(guò)在內(nèi)腔中填充2X IO6 個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行接種。然后以0. 4rpm將該室旋轉(zhuǎn)過(guò)夜，通過(guò)活/死細(xì)胞染 色進(jìn)行分析。所有圖象均放大100倍。圖12。管狀支架上的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞暴露于流體流，或進(jìn)行7天的靜態(tài)培 養(yǎng)。將約5cm長(zhǎng)的PDO-ESS管狀支架固定至LumeGen生物反應(yīng)器室，并通過(guò)在內(nèi)腔中填充 2X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行接種。然后以0.4rpm將該室旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。第二天，將 管狀支架連接至LumeGen生物反應(yīng)器，并暴露于流速為lOml/min的流體2小時(shí)。然后通過(guò) 活/死細(xì)胞染色分析一個(gè)管狀支架。(A)管的左側(cè)。(B)管的右側(cè)。將另一個(gè)管狀支架再 靜態(tài)孵育7天，然后通過(guò)活/死細(xì)胞染色進(jìn)行分析。(C)管的左側(cè)。(D)管的右側(cè)。所有圖 象均放大100倍。圖13。管狀支架上的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞暴露于動(dòng)態(tài)或靜態(tài)培養(yǎng)條件。將約 5cm長(zhǎng)的PDO-ESS管狀支架固定至LumeGen生物反應(yīng)器室，通過(guò)在內(nèi)腔中填充2X IO6個(gè)細(xì) 胞/毫升的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行接種。然后以0.4rpm將該室旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。第二天，將管狀支架連 接至LumeGen生物反應(yīng)器，并在流速為20ml/min、頻率為IHz的范圍為120_80mm Hg的脈動(dòng) 壓力的條件下暴露于流體3天。在靜態(tài)條件下將另一個(gè)管狀支架培養(yǎng)相同的時(shí)間周期。然 后通過(guò)活/死細(xì)胞染色分析兩個(gè)管狀支架。(A)靜態(tài)培養(yǎng)管的左側(cè)。(B)靜態(tài)培養(yǎng)管的右 側(cè)。(C)動(dòng)態(tài)條件下培養(yǎng)的管的左側(cè)。(D)動(dòng)態(tài)條件下培養(yǎng)的管的右側(cè)。所有圖象均放大 100 倍。圖14。圖象顯示大鼠肌組織糜以不同量的組織均勻分布在管狀構(gòu)造體上。圖15。培養(yǎng)72小時(shí)后，圖象顯示組織糜仍附著在管狀支架上。圖16。將大鼠平滑肌細(xì)胞接種(靜態(tài))在PDO管上持續(xù)4天，然后在生物反應(yīng)器 中保持10天(H&E染色)
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開(kāi)了一種組織工程血管(TEBV)，其由生物相容的可生物吸收性支架以及 一種或多種細(xì)胞、細(xì)胞片層、細(xì)胞裂解液、組織糜構(gòu)成，并且采用或未采用生物反應(yīng)器處理 培養(yǎng)。此類組織工程血管可用于修復(fù)或置換受損或病變的原生血管。在組織工程中，身體 對(duì)支架的重吸收速率優(yōu)選接近組織置換支架的速率。也就是說(shuō)，相對(duì)于組織置換支架的速 率，支架的重吸收速率必須使得對(duì)支架所需的結(jié)構(gòu)完整性(如強(qiáng)度)能夠維持所需的時(shí)間長(zhǎng)度。如果支架降解，并且吸收速率過(guò)度快于支架被其中生長(zhǎng)的組織置換的速率，那么支架 會(huì)表現(xiàn)出強(qiáng)度減小并且可能會(huì)發(fā)生裝置失效。那么，可能會(huì)需要進(jìn)行另外的手術(shù)以取出失 效的支架并修復(fù)受損的組織。因此有利的是，本發(fā)明的裝置使生物降解性、重吸收性、隨時(shí) 間推移的結(jié)構(gòu)完整性以及利于組織向內(nèi)生長(zhǎng)的能力等性能保持平衡，其中每種性能都是組 織再生或修復(fù)所期望的、有用的或必需的。較于現(xiàn)有技術(shù)的裝置此類裝置可提供協(xié)同改善?？偲饋?lái)講，有利的是對(duì)用于制備支架的合適可生物降解聚合物進(jìn)行構(gòu)造以使其具 有適于預(yù)期應(yīng)用的機(jī)械性能，可保持足夠的完整性直至組織向內(nèi)生長(zhǎng)并愈合，不會(huì)引起最 低程度的炎性反應(yīng)或毒性反應(yīng)，能夠承受長(zhǎng)期的血液動(dòng)力學(xué)應(yīng)力而不會(huì)發(fā)生材料失效，既 能抗血栓形成又能抗感染，并可在達(dá)成其目的后在體內(nèi)被代謝，易于加工成待形成的所需 終產(chǎn)品，具有可接受的儲(chǔ)存壽命，而且易于消毒?？缮锝到獾纳锵嗳菪灾Ъ芸梢杂商烊坏目缮锝到饩酆衔?、改性的天然可生 物降解聚合物或合成的可生物降解聚合物構(gòu)成，包括均聚物、共聚物和嵌段聚合物、直鏈或 支鏈的聚合物、鏈段聚合物或無(wú)規(guī)聚合物，以及它們的組合。尤其適用的合成可生物降解性 聚合物為脂族聚酯，其包括但不限于丙交酯(其包括乳酸D-丙交酯、L-丙交酯和內(nèi)消旋丙 交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、ε-己內(nèi)酯、對(duì)二氧雜環(huán)己酮(1，4_ 二氧雜環(huán)己-2-酮)和 三亞甲基碳酸酯(1，3_二氧雜環(huán)己-2-酮)的均聚物和共聚物。在一個(gè)實(shí)施例中，聚合物為 聚(對(duì)二氧雜環(huán)己酮)、聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLA/PGA)共聚物(95/5、85/15、10/90摩 爾-摩爾％)和聚(乙交酯-co-己內(nèi)酯)(PGA/PCL)65/35共聚物，以及聚(丙交酯-co-己 內(nèi)酯)(PLA/PCL) (60/40摩爾-摩爾％ )共聚物。合適的天然聚合物包括但不限于膠原、去端肽膠原(atelocollagen)、彈性蛋白和 纖維蛋白以及它們的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，天然聚合物為膠原。在另一個(gè)實(shí)施例中，天然 聚合物的組合為非細(xì)胞網(wǎng)膜基質(zhì)。支架的維度反映了所需的范圍，其與一種或多種細(xì)胞、細(xì)胞片層、細(xì)胞裂解液、組 織糜以及生物反應(yīng)器處理相結(jié)合將可置換較小直徑的受損或病變靜脈或動(dòng)脈血管。所需的 維度包括但不限于內(nèi)徑(優(yōu)選為3-7mm，最優(yōu)選為4-6mm)；壁厚度(優(yōu)選為0. 1-lmm，最優(yōu) 選為0. 2-0. 7mm)；和長(zhǎng)度(優(yōu)選為l-20cm，最優(yōu)選為2-lOcm)。下表示出了我們的PDO構(gòu) 造體的性質(zhì)與天然脈管的性質(zhì)的一致性。尺寸物理性質(zhì)
權(quán)利要求
1.一種用于組織工程血管的管狀構(gòu)造體，所述構(gòu)造體包括包含聚(對(duì)二氧雜環(huán)己酮) 的支架和一種或多種細(xì)胞、細(xì)胞片層、細(xì)胞裂解液和組織糜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的管狀構(gòu)造，其中所述支架還包含膠原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的管狀構(gòu)造，其中所述細(xì)胞選自內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維 細(xì)胞、人臍帶源細(xì)胞以及它們的組合。
4.一種用于制備組織工程血管的方法，所述方法包括以下步驟a.提供包含聚(對(duì)二氧雜環(huán)己酮)的管狀支架；b.在所述支架上接種一種或多種細(xì)胞，所述細(xì)胞選自內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì) 胞和人臍帶源細(xì)胞；以及c.在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述接種有細(xì)胞的支架。
5.一種用于制備組織工程血管的方法，所述方法包括以下步驟a.提供包含聚(對(duì)二氧雜環(huán)己酮)的管狀支架；b.用人臍帶源細(xì)胞片層包裹所述支架；以及c.在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述包裹有細(xì)胞片層的支架。
6.一種用于制備組織工程血管的方法，所述方法包括以下步驟a.提供包含聚(對(duì)二氧雜環(huán)己酮)的管狀支架；b.用肌肉組織糜和內(nèi)皮組織糜涂敷所述支架；以及c.在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述組織糜支架。
7.一種用于制備組織工程血管的方法，所述方法包括以下步驟a.提供包含聚(對(duì)二氧雜環(huán)己酮)的管狀支架；b.用細(xì)胞裂解液涂敷所述支架；然后c.將所述支架凍干。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所述方法還包括以下步驟a.將一種或多種細(xì)胞和組織糜涂敷至所述細(xì)胞裂解液支架上；以及b.在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述具有一種或多種細(xì)胞和組織糜的細(xì)胞裂解液支架。
9.一種用于制備組織工程血管的方法，所述方法包括以下步驟a.提供包含聚(對(duì)二氧雜環(huán)己酮)的支架；b.在所述支架片上接種細(xì)胞；c.將所述接種的片卷成管；以及d.在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述管。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了使用組織工程血管為患有脈管疾病的患者修復(fù)和再生血管的組合物和方法。
文檔編號(hào)A61L27/36GK102076366SQ200980125918
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日
發(fā)明者A·戈謝夫斯基, A·西達(dá), C·H·方, C·楊, D·C·科爾特, I·春, K·庫(kù)珀, S·達(dá)納拉 申請(qǐng)人:伊西康公司