專利名稱：Timp－4基因作為制備臨床治療心血管和疤痕修復藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種T1MP-4基因生物藥的用途，特別是涉及一種TIMP-4基因作為制備臨床治療心血管和疤痕修復藥中的應用，臨床預防治療冠心病球囊導管擴張成型術(PTCA)后再狹窄藥的應用。
背景技術：
眾所周知，冠心病是嚴重危害人類健康的疾病之一。在美國一年內(nèi)死于此病的人數(shù)約為40萬-60萬人。在中國，冠心病的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，其發(fā)病率由70年代萬分之10-20，90年代發(fā)展到約10％，其速度上升之快，罹患人數(shù)之多，足見該病的嚴重性。冠心病的病理基礎，是供應心臟的冠狀動脈血管粥樣硬化所致的管腔狹窄，從而導致單位時間內(nèi)供給心腸所需的血液供應量減少，造成急性心肌梗(AMI)及心絞痛(Ad)。80年代隨著科技進步，對此病的診治水平也有很大提高，其中冠心病球囊導管擴張成型術(以下簡稱PTCA)就是一種被廣泛采用的治療方法。美國一年約20萬人做此種手術治療。在中國，目前每年約有2-5萬人做此種手術治療。盡管如此，其PTCA術后約30％的血管再狹窄卻一直困擾著醫(yī)生和病人這無疑增加了病人的風險性同時也加重了病人的經(jīng)濟負擔。
血管狹窄形成要具備多個因素，其最重要的因言之一就是血管劈內(nèi)皮完整性遭破壞后，受損的血管組織刺激血液中血小板以及白細胞等量釋放活性物質，從而啟動了血管壁修復系統(tǒng)；同時，受損的血管壁分泌大量的MMP酶促使以梭形細胞為主的纖維結締組織增生，這一非正常的修復過程見圖3。
PCTA術是通過向球囊擴張導管的球囊內(nèi)加壓，從而壓迫狹窄血管腔內(nèi)凸起的附壁物質使其縮小或去除，從而達到治療血管狹窄所致疾病的目的。與此同時，在此手術過程中也使血管內(nèi)壁受損，導致血管內(nèi)皮細胞的缺失，管壁的膠原組織裸露，因而啟動上述血管修復程序。一般在手術后6小時后開始的14天內(nèi)，機體的平滑肌MMP在酶的作用下，迅速向受損血管壁區(qū)域呈向心移動，并逐步轉變成核形細胞，使血管壁增淳，管腔變窄，使病人不得不面臨再次手術。
早在1991年美國的分子生物學家率先提出了TIMPS概念；并對該家族的TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3功能進行了深入研究。以后陸續(xù)可見到有關一TIMPS與腫瘤的浸潤及轉移相互作用關系的論文發(fā)表。
五年前(1996年初)，本申請人首次成功克隆出TIMP-4基因(見圖1)，并對TIMP-4在腫瘤生物學方面的功能作了詳盡研究，參見文獻1″Molecular Cloning andCharacterization of Human Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 4″，John Greeneet al.，The Journal of Biological Chemistry，Vol.271，No.48，pp.30375-30380，1996.
本發(fā)明的目的在于克服已有技術的缺點和不足，為了減輕病人的痛苦，提高冠心病球囊導管擴張成型術成功率，防止PTCA術后血管再狹窄給病人造成再次手術治療痛苦，從而提供一種TIMP-4基因作為制備臨床治療心血管和疤痕修復藥中的應用，特別是作為制備臨床預防治療冠心病球囊導管擴張成型術后再狹窄藥的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明提供的一種TIMP-4基因作為制備臨床治療心血管和疤痕修復藥中的應用、作為制備臨床預防治療冠心病球囊導管擴張成型術后再狹窄的藥的應用；該藥含有如圖1所示的TIMP-4基因的cDNA完整序列，把TIMP-4基因裝入哺乳類動物細胞特異表達載體pcI-neo亞克隆成PCINTIMP-4(見圖3)，將PCINTIMP-4作為一種基因藥物，它用于預防治療心臟血管疾病，和TIMP-4基因生物藥用于所有經(jīng)血管介入檢查治療引起的血管內(nèi)皮系統(tǒng)非正常修復所致的血管腔狹窄；將PCINTIMP-4以電導介入技術，轉染到皮膚、肌肉，血管等組織中，肌肉或皮下注射TIMP-4基因，以及血管內(nèi)局部實藥的給藥途徑。
本發(fā)明的藥采用ETS方法首先從人類乳脂指組織中克隆簽定出TIMP-4蛋白(見參見文獻1)，人類TIMP-4蛋白基因的完整序列含有118個堿基對，表達的TIMP-4蛋白由225個氨基酸組成(如圖1所示的)。然后應用亞克隆技術，選取ECORl和Xhol內(nèi)切酶，切割含有TIMP-4基因的擴增質粒后得到完整序列的TIMP-4基因，在將其裝入到入哺乳類動物的特異表達載體中(如圖3)；將此載體以電導介入技術經(jīng)皮膚轉染到哺乳類動物的肌細胞中，具體電導介入條件是電壓100-150伏，單側腿部肌肉內(nèi)注射TIMP-4基因質粒300-1000μg/Kg。在肌細胞內(nèi)TIMP-4基因經(jīng)轉錄翻譯后形成特定功能的特異性TIMP-4蛋白，即TIMP-4基因生物藥。TIMP-4基因在進入肌肉內(nèi)6小時，在血中開始出現(xiàn)，7天后達到最高，14天后消退。
TIMP-4蛋白的225個氨基酸分成兩個功能基團，即氨基功能端和羧基功能端，氨功能端承擔抑制MMP酶、抑制平滑肌移動及向梭形細胞分化的多種生物功能。羧基功能端主要參與TIMP-4蛋白自細胞膜內(nèi)向細胞膜外分泌的功能。
本發(fā)明的T1MP-4基因所表達的蛋白，通過抑制MMP酶的活性，達到抑制平滑肌細胞遷移并減少平滑肌細胞變成梭形細胞。TIMP-4基因蛋白特異性限斷MMP酶，降低血管平滑肌的遷移。TIMP-4基因蛋白特異性阻斷MMP酶，阻斷平滑肌細胞轉變成梭形細胞。TIMP-4基因蛋白特異性阻斷MMP酶，抑制血管平滑肌細胞的增生。
TIMP-4基因藥的應用能有效防治腦動脈瘤導管治療后的再狹窄，對臨床預防治療PTCA術后再狹窄。
TIMP-4基因有效防治在病理變化過程中有TIMP-4參與的所有疾病，如慢性延性肝炎，大面積燒傷后的疤痕修復以及關節(jié)炎等。
本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明涉及的TIMPS家族包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4，他們所表達的蛋白是一組特異性的抑制MMP酶的生物酶，是一種公認的MMP酶阻止劑，由于T1MP-4基因是T1MPs基因家族中的重要成員，其蛋白具有強烈的待異性抑制MMP酶的作用，達到抑制平滑肌細胞遷移并減少平滑肌細胞變成梭形細胞，起到抑制和減緩纖維結締組織向血管腔內(nèi)的增生作用；所以該TIMP-4能抑制上述血管腔內(nèi)的不正常的修復過程，保證血管內(nèi)皮系統(tǒng)獲得充分的正常修復同期。這一特點保障了PTCA術后的受損血管壁，有充分時間進行正常內(nèi)皮修復，預防了血管再狹窄；從而本發(fā)明提供了一種TIMP-4基因作為制備臨床治療心血管和疤痕修復藥中的應用，特別是作為制備臨床預防治療冠心病球囊導管擴張成型術后再狹窄藥的重要的應用。
(二)對施行冠心病球囊導管擴張成型術后的病人，給予TIMP-4基因藥物能有效防治PTCA術后的血管再狹窄，提高了PTCA手術成功率。
(三)此技術可預防所有經(jīng)血管介入檢查治療后，所引起的血管內(nèi)皮受損，從而導致的血管腔內(nèi)皮系統(tǒng)的非正常修復過程。
(四)TIMP-4基因能有效防治腦動脈瘤導管治療后的再狹窄。
(五)TIMP 4基因有效防治在病理變化過程中有TIMP-4參與的所有疾病，如慢性延性肝炎，大面積燒傷后的疤痕修復以及關節(jié)炎等。
(六)TIMP-4基因電導從技術，將替代被廣泛應用的“血管支架”技術方法。
(七)TIMP-4基因電導介入技術，是一種經(jīng)濟、簡便、安全的基因治療技術。


下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細的說明圖1是TIMP-4基因的cDNA完整序列圖2是TIMP-4蛋白所表達的二級結構圖3是PCINTIMP-4載體的基因示意4是受損血管壁修復示意5A是正常頸動脈血管，管腔通暢管壁各層薄厚均勻；圖5B是實驗對照組大鼠頸動脈血管，管腔內(nèi)壁大量梭形向腔內(nèi)隆起，幾乎將血管壁完全閉塞；圖5C是實驗治療組，頸動脈血管管腔僅見平滑肌輕度增生，血管腔約10％狹窄，即90％的管腔內(nèi)內(nèi)頸通暢；圖6是用Western bl ot法檢測大鼠血液中TIMP-4蛋白的濃度，黑色條紋代表陽性，無黑色條紋代表陰性；黑色條紋的深淺、粗細代表濃度的差異，也就是黑色條紋越深、越款代表濃度越高；其中圖6A是實驗治療組TIMP-4蛋白血漿濃度1號代表術前一天，2號代表術后2天，3號代表術后7天，4號代表術后10天，4號代表術后10天，5號代表術后14天，6號代表術后21天，7號代表術后28天；其中圖5B是實驗對照組，全部呈陰性；具體實施方式
實施例1(一)構建哺乳類動物的特異表達載體1.完整序列TIMP-4基因的獲得(1)將擴增載體轉化到大腸桿菌中(DH52)；(2)在平皿中挑選鑒定陽性菌株；(3)將陽性菌株放入LB培養(yǎng)基中，在37℃條件下200rpm搖蕩培養(yǎng)約12小時；(4)從培養(yǎng)的菌株中提取擴增載體；(5)用ECOR1和Xhol內(nèi)切酶切割擴增載體后，在1.2％的Agar膠中分離DNA片段；(6)從步驟(5)的Agar膠中提取完整序列的TIMP-4基因；2.構建完成PCINTIMP-4(1)用ECOR1和Xhol內(nèi)切酶切割pCl-neo載體(購自Promega Corporation)；(2)走膠純化得到線形的pCl-neo載體；(3)T4 Ligase將1∶1摩爾比的線形的pCl-neo和全長TIMP-4基因連接在一起；(4)培養(yǎng)鑒定后得到PCINTIMP-4陽性克??；(5)大量培養(yǎng)陽性菌，提取后得到所需數(shù)量的PCINTIMP-4載體(二)PCINTIMP-4在哺乳類動物體內(nèi)表達成TIMP-4蛋白。
權利要求
1，TIMP-4基因作為制備臨床預防治療冠心病球囊導管擴張成型術后再狹窄藥中的應用。
2，TIMP-4基因作為制備臨床預防治療經(jīng)血管介入檢查治療引起的血管內(nèi)皮系統(tǒng)非正常修復所致的血管腔狹窄藥中的應用。
3，TIMP-4基因作為制備臨床防治腦動脈瘤導管治療后的再狹窄藥中的應用。
4，TIMP-4基因作為制備臨床治療大面積燒傷后的疤痕修復藥中的應用。
5，按權利要求1、2、3或4所述的任一項TIMP-4基因作為制備臨床治療心血管和疤痕修復的藥中的應用，其特征是所述的藥含有TIMP-4基因的cDNA完整序列，和把TIMP-4基因裝入哺乳類細胞特異表達載體PcI-neo亞克隆成PCINTIMP-4。
6，按權利要求1、2、3或4所述的任一項TIMP-4基因作為制備臨床預防治療冠心病球囊導管擴張成型術后再狹窄藥的應用，其特征是所述的給藥方式是將PCINTIMP-4以電導介入技術，轉染到皮膚、肌肉，血管等組織中。
7，按權利要求6所述的任一項TIMP-4基因作為制備臨床預防治療冠心病球囊導管擴張成型術后再狹窄藥的應用，其特征是所述的電導介入條件0電壓100-150伏，單側腿部肌肉內(nèi)注射TIMP-4基因質粒300-1000μg/Kg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種TIMP－4基因作為制備臨床治療心血管和疤痕修復藥中的應用藥的應用。該TIMP－4基因生物藥含有如圖1所示的TIMP－4基因的cDNA完整序列，和圖3所示的PCINTIMP－4載體的基因，把TIMP－4基因裝入哺乳類細胞特異表達載體PcI－neo亞克隆成PCINTIMP－4。由于TIMP－4基因其蛋白具有強烈的待異性抑制MMP酶的作用，達到抑制平滑肌細胞遷移并減少平滑肌細胞變成梭形細胞，起到抑制和減緩纖維結締組織向血管腔內(nèi)的增生作用；所以該TIMP－4能抑制上述血管腔內(nèi)的不正常的修復過程，保證血管內(nèi)皮系統(tǒng)獲得充分的正常修復同期。這一特點保障了PTCA術后的受損血管壁，有充分時間進行正常內(nèi)皮修復，預防了血管再狹窄，特別是作為制備臨床預防治療冠心病球囊導管擴張成型術后再狹窄藥的重要的應用。
文檔編號A61K48/00GK1398639SQ0210430
公開日2003年2月26日 申請日期2002年2月19日 優(yōu)先權日2001年2月19日
發(fā)明者王明生, 劉宣力 申請人:王明生, 劉宣力