專利名稱：抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物和它的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，確切地說它是抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物和它的制備方法及其應用。
背景技術：
抱莖苦荬菜是菊科抱莖苦荬菜[Ixeris sonchifia(Bge.)Hance]一年生草本植物的全草，又名苦碟子。盛產(chǎn)于我國東北、華北等地。《現(xiàn)代中藥學大辭典》記載，抱莖苦荬菜味苦、辛，具清熱解毒、排毒、止痛之功效。民間主要用于治療闌尾炎、扁桃體炎、無名腫痛等癥。全世界苦荬菜屬植物共有50余種，主要分布于中國、日本、朝鮮越南以及前蘇聯(lián)等地。我國共有苦荬菜屬植物20余種。
苦荬菜屬植物在我國有悠久的藥用歷史，主要藥理作用有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及心血管等方面的活性，馮玉書[中草藥通訊1979(3)31、沈陽藥學院學報.1981，1323]等人證明，抱莖苦荬菜的提取物具有增加冠脈流量，增加心肌營養(yǎng)性血流量，降低心肌耗氧量，改善心肌循環(huán)等作用；對血液系統(tǒng)能顯著抑制血小板聚集功能，明顯增加纖溶酶的活性，而這些作用是防治血栓閉塞性疾病的基礎。抱莖苦荬菜的提取物無論在有氧、不同程度缺氧以及無氧條件下，均能使心肌乳酸含量顯著降低，減輕或防止心肌細胞酸中毒，有利于心肌細胞功能的恢復[沈陽藥學院學報.1982，1630]；同時降低心肌代謝，增加側(cè)枝循環(huán)，改善心肌缺氧，使心肌供血有明顯改善。近年柳曉琳[錦州醫(yī)學院學報2002，2，23(1)]等對苦碟子抗腫瘤作用進行了研究以小鼠移植性肉瘤180(S180)和艾氏腹水瘤(EAC)為模型，觀察苦碟子的抗腫瘤作用，并分別計算出抑瘤率和生命延長率。結(jié)果不同劑量的苦碟子對小鼠肉瘤S180的抑制率分別為39.86％，38.14％和35.73％(與對照組相比差異有顯著性，P＜0.01)，苦碟子也能延長荷艾氏腹水瘤(EAC)小鼠的存活期，生命的延長率分別為41.27％，29.78％和17.88％(高劑量組和中等劑量組與對照組相比差異有顯著性，P＜0.01)。
從二十世紀八十年代以來，各國學者對苦荬菜屬植物的化學成分進行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)其化學成分比較復雜，主要含倍半萜內(nèi)酯類、三萜類及黃酮類化合物，此外還含有香豆素、木質(zhì)素、維生素、氨基酸、糖等類型化合物。
倍半萜類化合物分布在植物界和微生物界，多以揮發(fā)油的形式存在，倍半萜的含氧衍生物多具有較強的香氣和生物活性。倍半萜類是分子中由3個異戊二烯單位構成、含15個碳原子的化合物。按其結(jié)構碳環(huán)數(shù)分為無環(huán)型、單環(huán)型、二環(huán)型、三環(huán)型和四環(huán)型等。按倍半萜的含氧基分為倍半萜醇、醛、內(nèi)酯等。倍半萜內(nèi)酯類化合物具有抗炎、解痙、抑菌、強心、降血脂、抗原蟲和抗腫瘤等活性，因此成為大家關注的熱點，研究很快，在苦荬菜屬植物中分離得到大約有70多個倍半萜內(nèi)酯類化合物，其骨架類型主要有愈創(chuàng)木烷內(nèi)酯型、美蘭烷內(nèi)酯型、吉馬烷內(nèi)酯型和桉烷內(nèi)酯型等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物和它的制備方法及其應用，它可以制成各種單方藥物制劑，還可制成緩釋或控釋藥物制劑，可制成腔腸給藥、噴霧給藥、透皮吸收或口服的藥物制劑；可制成注射制劑或輸液制劑；也可用于與其它藥物(含中藥提取物或有效成分)組成復方藥物制劑，以上藥物制劑可用于制備治療各種腫瘤和癌癥的藥物。
該組合物主要含有抱莖苦荬菜內(nèi)酯A-1(I)葡萄糖苷和抱莖苦荬菜內(nèi)酯B-1(II)葡萄糖苷。抱莖苦荬菜內(nèi)酯組合物中I和II的含量大于10％，小于98％，其中I和II的比例為10～1∶1～10?；衔颕、II可以通過水解R1上的葡萄糖基獲得抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元組合物。所涉及的化合物中內(nèi)酯環(huán)可以在堿性下開環(huán)成化合物III、IV，通過對其中R1和R2的修飾(如烷基化、酯化、胺基化、糖基化和/或成鹽)，或?qū)ζ涮脊羌懿扇∵€原，加成等反應制成各種衍生物以改善其活性和/或物理性質(zhì)。
1本發(fā)明組合物的制備(1)本發(fā)明涉及抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷及其組合物的制備方法，其具體特征步驟如下(a)抱莖苦荬菜全草(菊科植物)切碎經(jīng)水煮或含水醇回流提取后得提取液(a)。
(b)將提取液(a)濃縮并過濾，濾液經(jīng)有機溶劑萃取，除去油和親脂性物質(zhì)，將水層濃縮真空干燥，得到干粉(b)。
(c)將干粉(b)用水溶解，通過反向吸附樹脂柱，除去水溶性雜質(zhì)，再用醇水洗脫，得到洗脫液(c)。
(d)洗脫液(c)經(jīng)濃縮，真空干燥，得到干粉(d)。
(e)干粉(d)經(jīng)硅膠拌樣，氧化鋁柱層析，有機溶劑洗脫，洗脫液濃縮，真空干燥，得到干粉(e)。
(f)干粉(e)經(jīng)硅膠拌樣，硅膠柱層析，有機溶劑洗脫，洗脫液濃縮，真空干燥，得到本發(fā)明所述抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷組合物。
(g)將所述組合物最終通過HPLC分離，分別得到二種化合物的純品，它們是化合物I和化合物II。
(2)本發(fā)明中涉及抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元及其組合物的制備方法，其具體特征步驟如下(a)將本發(fā)明所述組合物用酸或酶水解，得水解物(a)。
(b)水解物(a)經(jīng)硅膠拌樣，硅膠柱層析，有機溶劑洗脫，洗脫液濃縮，真空干燥，得到本發(fā)明所述抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元及其組合物。
2組合物的組成純化與定量分析2.1所述組合物通過HPLC分離純化，分別得到二種化合物的純品。檢測結(jié)果如下所述抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷各組分通過HPLC檢測(色譜柱DiamonsilTMC18 5μ 200×4.6mm；波長270nm；流動相甲醇-水(38∶62)(見附圖2，附圖3)2.2用純化的化合物I和II為對照品分別繪制液相工作標準曲線(以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標)如下表1 兩種組分標準曲線

2.3所述化合物I和II組合物通過HPLC檢測(色譜柱DiamonsilTMC18 5μ 200×4.6mm；波長270nm；流動相甲醇-水(38∶62))給出兩個峰(見附圖1)，峰1(10.5min)是化合物I，峰2(12.4 min)是化合物II。
2.4所述化合物I和II苷元組合物通過HPLC檢測(色譜柱DiamonsilTMC18 5μ 200×4.6mm；波長270nm；流動相甲醇-水(41∶59))給出兩個峰(見附圖4)，峰1(23.8min)是化合物I苷元，峰2(26.2min)是化合物II苷元。
抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷是抱莖苦荬菜提取物主要有用成分，可以通過特定的工藝過程，標化只含有抱莖苦荬菜內(nèi)酯A-1(I)葡萄糖苷和抱莖苦荬菜內(nèi)酯B-1(II)葡萄糖苷組分的組合物，抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷組合物中I和II的含量大于10％，小于98％，其中I和II的比例為I(10～1)∶II(1～10)。從而為抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物的單方制劑和復方制劑的現(xiàn)代化提供了可靠的物質(zhì)基礎。
3本組合物成分的結(jié)構鑒定3.1對HPLC分離得到的抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷組合物的二種組分經(jīng)UV、IR、1H-NMR、13C-NMR和MS光譜鑒定結(jié)構如下化合物I為白色針狀結(jié)晶，EI-MS給出分子離子峰為424[M]+，提示分子量為424，結(jié)合1H-NMR，13C-NMR確定分子式為C21H28O9。IR(KBr)cm-13400(-OH)為一寬而強的吸收峰；1771及1662處的強峰表明有兩種不同類型的羰基吸收峰，其中1771為典型的飽和五元γ-內(nèi)酯羰基吸收峰；1640為雙鍵吸收峰。13C-NMR中顯示共有21個碳信號。除去高場的6個葡萄糖碳原子峰，有15個低場碳信號。結(jié)合IR譜推測化合物I為倍半貼內(nèi)酯類化合物。
化合物II為白色針狀結(jié)晶，EI-MS給出分子離子峰為422[M]+，提示分子量為422，結(jié)合1H-NMR，13C-NMR確定分子式為C21H26O9。IR(KBr)cm-13400(-OH)為一寬而強的吸收峰；1769及1670處的強峰表明有兩種不同類型的羰基吸收峰，其中1769為典型的飽和五元γ-內(nèi)酯羰基吸收峰；1640為雙鍵吸收峰。13C-NMR中顯示共有21個碳信號。除去高場的6個葡萄糖碳原子峰，有15個低場碳信號。結(jié)合IR譜推測化合物I為倍半貼內(nèi)酯類化合物。
1H-NMR信號歸屬

13C-NMR信號歸屬


由此得到化合物I的結(jié)構為

R1葡萄糖基即為抱莖苦荬菜內(nèi)酯A-1(I)葡萄糖苷，分子式為C21H28O9。由此得到化合物II的結(jié)構為

R1葡萄糖基即為抱莖苦荬菜內(nèi)酯B-1(II)葡萄糖苷，分子式為C21H26O9。3.2對HPLC分離得到的抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元組合物的二種組分經(jīng)UV、IR、1H-NMR、13C-NMR和MS光譜鑒定結(jié)構如下化合物I為白色針狀結(jié)晶，EI-MS給出分子離子峰為262[M]+，提示分子量為262，結(jié)合1H-NMR，13C-NMR確定分子式為C15H18O4。IR(KBr)cm-13400(-OH)為一寬而強的吸收峰；1771及1662處的強峰表明有兩種不同類型的羰基吸收峰，其中1771為典型的飽和五元γ-內(nèi)酯羰基吸收峰；1640為雙鍵吸收峰。13C-NMR中顯示共有15個碳信號。結(jié)合IR譜推測化合物I為倍半貼內(nèi)酯類化合物。化合物II為白色針狀結(jié)晶，EI-MS給出分子離子峰為260[M]+，提示分子量為260，結(jié)合1H-NMR，13C-NMR確定分子式為C15H16O4。IR(KBr)cm-13400(-OH)為一寬而強的吸收峰；1769及1670處的強峰表明有兩種不同類型的羰基吸收峰，其中1769為典型的飽和五元γ-內(nèi)酯羰基吸收峰；1640為雙鍵吸收峰。13C-NMR中顯示共有15個碳信號。結(jié)合IR譜推測化合物I為倍半貼內(nèi)酯類化合物。由1H-NMR信號歸屬


13C-NMR信號歸屬

由此得到化合物I的結(jié)構為

即為抱莖苦荬菜內(nèi)酯A-1(I)，分子式為C15H18O4。由此得到化合物II的結(jié)構為 即為抱莖苦荬菜內(nèi)酯B-1(II)，分子式為C15H16O4。4體外抗癌活性4.1細胞株人宮頸癌細胞HeLa，人黑色素瘤細胞A375-S2，小鼠肺上皮癌細胞L929。
4.2方法MTT法測定細胞生長抑制率.光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。熒光顯微鏡觀察觀察細胞核變化和用瓊脂糖電泳法測定細胞凋亡典型的DNA斷裂.測定對正常人外周血細胞的影響.
4.3抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷組合物對細胞生長的抑制作用抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷組合物抑制HeLa，A375-S2，L929細胞的生長呈時間劑量依賴性。經(jīng)抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷組合物處理后的細胞表現(xiàn)出典型的凋亡特征細胞皺縮，胞質(zhì)空泡化，染色質(zhì)濃集，邊聚，出現(xiàn)凋亡小體。瓊脂糖電泳檢測表明抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷組合物導致L929細胞DNA片段化，并對人外周血細胞(PBMC)的影響較小。內(nèi)酯苷組合物(◆)和陽性對照品順鉑(■)(24h，n＝4)抑制曲線表明(見附圖5)樣品能促進細胞凋亡，抑制細胞生長。本實驗，A375-S2細胞(A)，HeLa細胞(B)和L929細胞(C)經(jīng)1，10，50，100，200，500，1000μg/ml濃度的樣品處理24h后，細胞增殖受到影響，在250μg/ml濃度下，增殖抑制率超過50％。因此，實驗結(jié)果表明，樣品對于A375-S2，HeLa和L929細胞都顯示出了一定的增殖抑制活性。
4.4抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元組合物對細胞生長的抑制作用抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元組合物抑制HeLa，A375-S2，L929細胞的生長呈時間劑量依賴性。經(jīng)抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元組合物處理后的細胞表現(xiàn)出典型的凋亡特征細胞皺縮，胞質(zhì)空泡化，染色質(zhì)濃集，邊聚，出現(xiàn)凋亡小體。瓊脂糖電泳檢測表明抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元組合物導致L929細胞DNA片段化，并對人外周血細胞(PBMC)的影響較小.并通過實驗表明苷元對于三種腫瘤細胞有更強的抑制活性。
內(nèi)酯苷元組合物(◆24h，■48h)和陽性對照品順鉑(▲24h，×48h)(24h，48h，n＝3)
抑制曲線表明(見附圖6)苷元能促進細胞凋亡，抑制細胞生長。A375-S2細胞(A)，Hela細胞(B)和L929細胞(C)經(jīng)1，10，50，100，200μg/ml濃度的樣品處理24h和48h后，細胞增殖受到影響，在24h，較低劑量50μg/ml濃度下，增殖抑制率均已超過50％，48h后，10μg/ml的劑量以下，抑制率既達到50％。因此，實驗結(jié)果表明，苷元對于三種腫瘤細胞的抑制活性要明顯高于內(nèi)酯苷的抑制活性。
本發(fā)明的優(yōu)點是提供了一種新的抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物和它的制備方法及其應用，并可以制成各種單方藥物制劑，還可制成緩釋或控釋藥物制劑，可制成腔腸給藥、噴霧給藥、透皮吸收或口服的藥物制劑；可制成注射制劑或輸液制劑；也可用于與其它藥物(含中藥提取物或有效成分)組成復方藥物制劑，以上藥物制劑可用于制備治療各種腫瘤和癌癥的藥物。


圖1為本發(fā)明抱莖苦荬菜提取的二種內(nèi)酯苷組分HPLC2為本發(fā)明抱莖苦荬菜內(nèi)酯A-1(I)葡萄糖苷HPLC3為本發(fā)明抱莖苦荬菜內(nèi)酯B-1(II)葡萄糖苷HPLC4為本發(fā)明化合物I和II苷元成分HPLC5為本發(fā)明抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷組合物對腫瘤細胞A375-S2(A)的抑制曲線圖6為本發(fā)明抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷組合物對腫瘤細胞HeLa(B)的抑制曲線圖7為本發(fā)明抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷組合物對腫瘤細胞L929(C)的抑制曲線圖8為本發(fā)明抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元組合物對腫瘤細胞A375-S2(A)的抑制曲線圖9為本發(fā)明抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元組合物對腫瘤細胞HeLa(B)的抑制曲線圖10為本發(fā)明抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元組合物對腫瘤細胞L929(C)的抑制曲線具體實施方式
實施例1干燥抱莖苦荬菜全草切片10Kg，用水煮沸提取2次，每次2小時，提取液過濾后通過反向吸附樹脂柱，再用醇水洗脫，洗脫液濃縮后用氧化鋁柱層析，得富含抱莖苦荬菜內(nèi)酯A-1(I)葡萄糖苷和抱莖苦荬菜內(nèi)酯B-1(II)葡萄糖苷組分的組合物，最后經(jīng)硅膠柱層析得到本專利所述的組合物(以下簡稱本組合物)150g。
本組合物通過水解R1上的葡萄糖基獲得抱莖苦賣菜內(nèi)酯苷元組合物。
本組合物及其苷元組合物，內(nèi)酯環(huán)可以在堿性下開環(huán)成化合物III、IV，通過對其中R1和R2的修飾(如烷基化、酯化、胺基化、糖基化和/或成鹽)，或?qū)ζ涮脊羌懿扇∵€原，加成等反應可制成各種衍生物。
本組合物或其衍生物50g，與微晶纖維素45g及硬脂酸鎂5g混合，混合物用于打片，每片重0.2g，每片含本組合物0.1g。結(jié)合癥狀，每次服1-2片，每日2-3次。
本組合物或其衍生物50g，與玉米淀粉50g，加水制成軟材，過12目篩造粒，干燥，制得顆粒，裝入膠囊，每粒膠囊內(nèi)容物重0.2g，含本組合物0.1g。結(jié)合癥狀，每次服1-2片，每日2-3次。
本組合物或其衍生物5g，與右旋糖苷-40或山犁醇20g及磷酸緩沖適量混合，用于注射用水溶解，通過注射劑的通用操作過程，制成注射劑每支5ml，含本組合物0.05g。結(jié)合癥狀，每次用1-4支，與注射氯化鈉等輸液混合使用，每日1次。
本組合物或其衍生物5g，與右旋糖苷-40或山犁醇20g及磷酸緩沖適量混合，用于注射用水溶解，通過注射劑的通用操作過程，灌裝，凍干，制成凍干注射劑每支含本組合物0.05g。結(jié)合癥狀，每次用1-4支，與注射氯化鈉等輸液混合使用，每日1次。
權利要求
1.抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物，其特征在于該組合物主要含有抱莖苦荬菜內(nèi)酯A-1(I)葡萄糖苷和抱莖苦荬菜內(nèi)酯B-1(II)葡萄糖苷。 R1葡萄糖基化合物I 化合物II
2.一種如權利要求1所述的抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物，其特征在于抱莖苦荬菜內(nèi)酯組合物中I和II的含量大于10％，小于98％，其中I和II的比例為10～1∶1～10。
3.一種如權利要求1所述的抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物，其特征在于化合物I、II可以通過水解R1上的葡萄糖基獲得抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元組合物。
4.一種如權利要求1所述的抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物，其特征在于所涉及的化合物中內(nèi)酯環(huán)可以在堿性下開環(huán)成化合物III、IV，通過對其中R1和R2的修飾，烷基化、酯化、胺基化、糖基化和/或成鹽，或?qū)ζ涮脊羌懿扇∵€原，加成等反應制成各種衍生物以改善其活性和/或物理性質(zhì)。 化合物III 化合物IV
5.一種如權利要求1所述的抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物的制備方法，其特征在于(1)抱莖苦荬菜全草切碎經(jīng)水煮或含水醇回流提取后得提取液；(2)濃縮或回收溶劑并過濾，濾液經(jīng)有機溶劑萃取或通過反向吸附樹脂，除去水溶性雜質(zhì)；(3)洗脫液經(jīng)濃縮，濃縮物用氧化鋁柱層析得富含苞莖苦賣菜內(nèi)酯組分；(4)將(3)中富含抱莖苦荬菜內(nèi)酯組分最后經(jīng)硅膠柱層析得到所述的化合物I和II及其組合物。
6.根據(jù)權利要求5所述的抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物的制備方法，其特征在于將得到的組合物用酸或酶水解，水解物經(jīng)硅膠柱層析得到抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元及其組合物
7.一種如權利要求1所述的抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物的應用，其特征在于上述組合物可用于制備各種治療腫瘤和癌癥的制劑。
8.根據(jù)權利要求7所述的抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物的應用，其特征在于所述的制劑為各種單方和復方藥物制劑，還可制成緩釋或控釋藥物制劑和注射劑或輸液制劑。
9.根據(jù)權利要求7所述的抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物的應用，其特征在于所述藥物制劑可制成腔腸給藥、噴霧給藥、透皮吸收或口服的藥物制劑。
10.根據(jù)權利要求7所述的抱莖苦荬菜內(nèi)酯及其衍生物組合物的應用，其特征在于所述的組合物適合與其它藥物組成復方藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及從抱莖苦荬菜中提取分離得到的含有活性化合物抱莖苦荬菜內(nèi)酯A－1(I)葡萄糖苷和抱莖苦荬菜內(nèi)酯B－1(II)葡萄糖苷組合物及其相關的衍生物及其制備方法。抱莖苦荬菜內(nèi)酯組合物中I和II的含量大于10％，小于98％，其中I和II的比例為10～1∶1～10?；衔颕、II可以通過水解R1上的葡萄糖基獲得抱莖苦荬菜內(nèi)酯苷元組合物。將抱莖苦荬菜全草切碎，經(jīng)水煮，濃縮回收過濾，再經(jīng)氧化鋁柱層析后，最后，經(jīng)鋁膠柱層析得上述組合物。上述組合物及其衍生物適用于制成各種單方藥物制劑，可制成緩釋或控釋藥物制劑；以上藥物制劑可用于治療各種腫瘤和癌癥。
文檔編號A61K31/7042GK1473837SQ0313384
公開日2004年2月11日 申請日期2003年7月2日 優(yōu)先權日2003年7月2日
發(fā)明者游松, 趙曉丹, 劉艷秋, 賈嫻, 呂顯剛, 梁士民, 游 松 申請人:沈陽藥科大學