專利名稱：重組人糖原磷酸化酶同工酶bb和應(yīng)用甲醇酵母制備的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用DNA技術(shù)生產(chǎn)基因工程蛋白藥物，尤其是設(shè)計(jì)一種應(yīng)用甲醇酵母生產(chǎn)重組人糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)及其生產(chǎn)方法和它的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心血管病已成為國(guó)人首要死因之一，尤其是對(duì)高節(jié)奏工作的中老年人造成嚴(yán)重威脅，其中病死率最高的是急性心肌梗死(AMI)。AMI致死的重要原因是早期診斷困難而延誤了治療時(shí)期。盡管目前心電圖(ECG)檢查及血清酶學(xué)檢測(cè)可以診斷AMI，但仍有50％的AMI因不具備典型癥狀，或ECG和血清酶檢測(cè)無(wú)典型變化，在AMI發(fā)作的早期被漏診而失掉搶救時(shí)機(jī)。臨床生化學(xué)家一直不斷尋找靈敏特異的心肌損傷指標(biāo)。糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase)已知有三種主要同工酶，即GPBB(腦，心肌型)，GPMM(肌型)，GPLL(肝型)。GPBB除腦細(xì)胞外，大量存于心肌細(xì)胞中。近年發(fā)現(xiàn)GPBB是AMI早期診斷新的靈敏特異指際，與其它目前臨床應(yīng)用的心肌標(biāo)記物(如CK-MB、cTnT、cTnI，肌紅蛋白等)比較，GPBB更具特異性和高敏感性。如AMI發(fā)作時(shí)，患者出現(xiàn)胸痛癥狀后，2-4小時(shí)內(nèi)，GPBB即在外圍血中明顯增高，較其它心肌標(biāo)記物更早出現(xiàn)且更敏感。GPBB還有助于不穩(wěn)定心絞痛、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)(CABG)并發(fā)癥的早期診斷，尤其對(duì)于CABG并發(fā)癥更是目前唯一早期增高的生化指際。現(xiàn)已證實(shí)GPBB對(duì)病人的病情發(fā)展過(guò)程即隨診和予后判斷均有重要意義，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。
GPBB作為糖原分解的關(guān)鍵酶，是心肌細(xì)胞中肌漿網(wǎng)結(jié)構(gòu)(SR)中糖原分解復(fù)合物的特定成分，而這種復(fù)合物的結(jié)合和分解取決于心肌的氧及血液供給狀態(tài)。正常條件下，糖原磷酸化酶復(fù)合物與SR牢固結(jié)合，不易分解。但當(dāng)心肌細(xì)胞缺血，缺氧時(shí)，這種糖原分解的關(guān)鍵酶GPBB即可加速其分解過(guò)程。糖原降解過(guò)程可被GPa(同工酶的磷酸化活性形式)和GPb(非磷酸化活性形式)及AMP依賴形式所共同催化。缺血發(fā)生后，有利于結(jié)合型GPb向GPa轉(zhuǎn)化(非活性型向活性型轉(zhuǎn)化)，從而加速糖原分解過(guò)程，亦是使GP成為可溶性二聚體的先決條件。GPBB的釋放依賴于糖原的降解，繼而隨著缺血伴有的細(xì)胞膜通透性改變，大量釋放入血液中。這就是AMI時(shí)GPBB快速釋放入血的主要機(jī)理。此外，心肌細(xì)胞缺氧、缺血時(shí)，可影響線粒體內(nèi)呼吸鏈酶系的活性，各種遞氫體所帶的氫不能通過(guò)呼吸鏈氧化成水，也使氧化磷酸化進(jìn)程受到影響，心肌細(xì)胞內(nèi)ATP的生成大為減少，而ADP與無(wú)機(jī)磷酸鹽增多。但心肌活動(dòng)仍繼續(xù)消耗ATP，因而高能磷酸化合物的儲(chǔ)備急劇減少。ADP與無(wú)機(jī)磷酸鹽增多，將促進(jìn)磷酸化酶的活性，于是心肌細(xì)胞內(nèi)糖原分解和利用加速，導(dǎo)致GPBB加速釋放入血，使血漿GPBB合量急劇增加。從人類心臟組織中直接分離到高度純化GPBB的實(shí)驗(yàn)技術(shù)并不復(fù)雜，但心臟組織來(lái)源有限，所以該蛋白成品(天然抗原)的價(jià)格昂貴，無(wú)法應(yīng)用于臨床實(shí)際。aGPBB這種新型診斷試劑，迄今國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道和相應(yīng)的新產(chǎn)品上市。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)對(duì)AMI不能做到快速、準(zhǔn)確、低成本、廣譜的早期診斷的缺陷，提供一種對(duì)AMI的早期診斷具有敏感性和特異性，且使用成本低的應(yīng)用甲醇酵母生產(chǎn)的重組人糖原磷酸化酶同工酶BB及其生產(chǎn)方法和它的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明應(yīng)用DNA技術(shù)生產(chǎn)基因工程蛋白藥物，尤其是應(yīng)用甲醇酵母生產(chǎn)重組人糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)免疫顯性片段的步驟如下①按酵母嗜好的密碼子人工合成糖原磷酸化酶同工酶BB免疫顯性片段的編碼基因，融合于酵母表達(dá)調(diào)控元件，構(gòu)建甲醇酵母高表達(dá)工程菌；②甲醇酵母工程菌高密度發(fā)酵表達(dá)；③采用超濾、葡剩糖凝膠層析、離子梯度凝膠層析等純化技術(shù)的順序組合，純化回收GPBB；④應(yīng)用該蛋白質(zhì)產(chǎn)生抗GPBB抗體。
基因工程和微生物工程技術(shù)的興起為合成和生產(chǎn)外源蛋白展示出廣闊的前景。本發(fā)明采用真核表達(dá)系統(tǒng)甲醇酵母(Pichia pastoris巴斯德畢赤酵母，Pp)來(lái)表達(dá)該蛋白。Pp是近年發(fā)展起來(lái)的新一代酵母表達(dá)系統(tǒng)，較其它蛋白表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等，均有明顯的優(yōu)點(diǎn)(1)具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶基因(AOX1)啟動(dòng)子，可高效嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；(2)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工和修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有很高的生物活性；(3)表達(dá)量高，可高密度發(fā)酵培養(yǎng)，且營(yíng)養(yǎng)要求低，生長(zhǎng)快，培養(yǎng)基廉價(jià)便于工業(yè)化生產(chǎn)；(4)表達(dá)的蛋白可分泌至胞外，而Pp自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，十分有利于純化；(5)糖基化程度適當(dāng)，對(duì)人體無(wú)明顯的抗原性，適合于臨床治療用途。因此，本發(fā)明從cDNA文庫(kù)中篩選出GPBB序列，并針對(duì)其是真核蛋白(全長(zhǎng)約2.5Kb)，選擇采用Pp表達(dá)系統(tǒng)。為了更高效表達(dá)該目的蛋白，選擇其分布在細(xì)胞外靠近C末端的區(qū)域即免疫顯性片段(即編碼具免疫原性GPBB的核苷酸序列，約占120bp)，再根據(jù)酵母基因使用密碼子的嗜好性，定點(diǎn)突變重新構(gòu)建該片段的序列，直接人工合成這個(gè)目的基因，并克隆到分泌型表達(dá)載體質(zhì)粒pPIC9K多克隆位點(diǎn)上構(gòu)建成重組表達(dá)載體質(zhì)粒；再制備成能分泌具免疫原性GPBB的更高效表達(dá)的基因工程酵母菌株，高密度培養(yǎng)該菌株，純化并得到重組蛋白質(zhì)。


圖1為GPBB基因優(yōu)化設(shè)計(jì)圖。
圖2為核苷酸序列和氨基酸序列圖譜；其中(a)為核苷酸序列，(b)為氨基酸序列。
圖3為基因合成的電泳圖譜；其中1為148bp基因，2為PGEM 7Z Marker。
具體實(shí)施例方式酵母密碼子的嗜好性與基因表達(dá)量相關(guān)，即在酵母中表達(dá)量較高的基因往往采用的是酵母所偏愛(ài)的密碼子。有研究表明在用甲醇酵母表達(dá)植酸酶時(shí)，把在酵母中使用頻率為零的精氨酸密碼子突變?yōu)槭褂妙l率較高的密碼子，表達(dá)水平提高了37倍。為了使GPBB免疫顯性片段在甲醇酵母中的更高效表達(dá)，本發(fā)明在人工合成DNA時(shí)將GPBB基因序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，如圖1、2所示把酵母中使用頻率較低的密碼子改變?yōu)榻湍赶矏?ài)的密碼子，同時(shí)考慮整個(gè)基因序列C+G/A+T比例平衡，避免產(chǎn)生后續(xù)克隆操作時(shí)需要的酶切位點(diǎn)。然后將突變后的GPBB片段克隆到分泌型表達(dá)載體質(zhì)粒pPIC9K多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建人GPBB的表達(dá)載體質(zhì)粒。本發(fā)明所指的基因序列設(shè)計(jì)還可以有許多變動(dòng)和延伸，而不僅限于圖1所示序列。將人工合成的序列連接在載體的方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟悉的。
本發(fā)明所指的甲醇酵母表達(dá)載體質(zhì)粒特指穿梭型質(zhì)粒，它包括以下各種元件(1)大腸桿菌來(lái)源的質(zhì)粒復(fù)制元件，如Co1E1。
(2)大腸桿菌篩選標(biāo)記，如Amplcillin抗性基因(Amp)。
(3)甲醇酵母表達(dá)調(diào)控元件，特別是指可誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控元件。如甲醇酵母來(lái)源的AOX1基因啟動(dòng)子5’AOX1、轉(zhuǎn)錄終止子(TT)3’AOX1。
(4)甲醇酵母分泌表達(dá)信號(hào)α因子(MFα)信號(hào)肽。
(5)多克隆位點(diǎn)。
(6)甲醇酵母篩選標(biāo)記如酵母HiS4基因，Kanamycin抗性基因。
(7)能在甲醇酵母染色體特異位點(diǎn)上重組整合的特異序列，如AOX1的5’、3’序列，HIS4的5’、3’序列。
(8)其它來(lái)源于大腸桿菌和酵母的連接片段。
外源基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞可以用電轉(zhuǎn)化方法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法等。表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌DH5、GS115和KM71等，篩選陽(yáng)性克隆子，用于保持、擴(kuò)增質(zhì)粒以及用于酶切、測(cè)序等分析檢測(cè)。
篩選高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化過(guò)程有時(shí)會(huì)產(chǎn)生多拷貝的整合，一般占轉(zhuǎn)化子的1％-10％。這是因?yàn)橐粋€(gè)拷貝整合到染色體上以后，整合位點(diǎn)依然存在，則另外的拷貝又可整合上去。在一般情況下，甲醇酵母中外源基因的拷貝數(shù)越高，則表達(dá)量越大。多拷貝常產(chǎn)生非常高的表達(dá)量。而篩選確定高拷貝數(shù)菌株的方法中，利用表達(dá)載體帶有卡那霉素(kanamycin)抗性基因，在酵母中表現(xiàn)為G418抗性，而非卡那霉素抗性的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出一套快速簡(jiǎn)便的篩選高拷貝的方法，其作用是可以用含有梯度濃度的G418的YPD-G418板篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。
工程菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。外源蛋白在酵母中的表達(dá)分兩步，即菌體生長(zhǎng)和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。第一階段，先在以甘油為碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌體，達(dá)到一定OD值后(詳見(jiàn)實(shí)施例)，此為菌種生長(zhǎng)階段。第二階段，甲醇誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。離心棄上清，菌體懸浮于以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，每隔一定時(shí)間加一次甲醇，以彌補(bǔ)甲醇的消耗。具體表達(dá)條件如通氣狀況、pH值、培養(yǎng)基的組成等詳見(jiàn)實(shí)施例。
發(fā)酵結(jié)束后除去細(xì)菌體，收集上清液。甲醇酵母為分泌表達(dá)，目的蛋白質(zhì)出現(xiàn)在上清液中。去除細(xì)菌可采用離心、壓濾、超濾等方法。上清經(jīng)超濾脫鹽、濃縮后即可進(jìn)行純化工作。
目的蛋白質(zhì)純化可采用離子交換層析、疏水層析、分子篩層析、親和層析等方法，以親和層析所得到的蛋白質(zhì)純度最高。濃縮后目的蛋白質(zhì)在上清液中濃度較高，可以采用親和層析方法純化GPBB。但是采用其它方法純化目的蛋白質(zhì)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。
以下通過(guò)非限定性的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一一、重組GPBB工程菌的構(gòu)建1.目的基因人工合成和重組表達(dá)載體的構(gòu)建選用酵母偏愛(ài)的密碼子改造人GPBB基因。所改造的GPBB基因可以是其全部或者部分，在實(shí)際改造時(shí)，對(duì)其優(yōu)化，我們選擇GPBB與其它幾個(gè)同工酶不同源，但是免疫顯性片段部分進(jìn)行改造。
為方便操作，在目的基因兩端加上EcoR I酶切位點(diǎn)。其核酸和氨基酸序列見(jiàn)圖1。將人工合成基因以EcoRI酶切處理，體外連接到同樣酶切處理的甲醇酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K，構(gòu)建成GPBB重組表達(dá)質(zhì)粒，見(jiàn)圖2，〔圖2中的圖(a)中的黑體字母部分為rGPBB末端保守序列，其余部分為添加的便于處理的基因序列〕。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌DH5α，經(jīng)酶切、PCR、DNA測(cè)序等驗(yàn)證過(guò)程，從中篩選一個(gè)結(jié)構(gòu)完全正確的轉(zhuǎn)化子GP1，擴(kuò)增并提取GP1的重組質(zhì)粒pPIC9K-GP1(如圖3所示)。
2、工程菌株的制備將5-10微克的重組質(zhì)粒pPIC9K-GP1體外以Sal I酶切線性化，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化甲醇酵母受體菌GS115。用MD平板篩選His4+轉(zhuǎn)化子，從中篩選多拷貝整合轉(zhuǎn)化子；1轉(zhuǎn)化子細(xì)胞分別涂板到含0.5、1、2、4、8或16mg/mlG418的YPD平板，在16mg/mlG418的YPD平板上篩選到3個(gè)克??；RGP1。
其具體步驟如下(I)轉(zhuǎn)化DNA的制備(用堿性溶菌小量制備法抽提質(zhì)粒DNA)①?gòu)倪^(guò)夜培養(yǎng)的菌液中取1.5ml于1.5ml離心管中，12000×g離心1分鐘，棄去上清。
②加100μl溶液I使沉淀重懸于溶液I中。
③加200μl溶液II劇烈振蕩5次，置冰上3min。
④加150μl溶液III溫和振蕩5次，置冰上10～30min⑤離心5min后去上青400μl于新的1.5ml離心管。
⑥加1ml 95％乙醇并混勻離心15min。
⑦倒去乙醇用1.5ml 70％乙醇洗滌冰風(fēng)干。
⑧將所得的DNA溶于20～100μl水或TE中。
(II)質(zhì)粒DNA的線性化①用Sac I酶消化處理質(zhì)粒pPIC9K-rGP和表達(dá)載體pPIC9K。
②用瓊脂凝膠電泳來(lái)分析一小段消化產(chǎn)物來(lái)檢驗(yàn)是否完全消化③用25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶異戊醇抽提消化產(chǎn)物并用乙醇沉淀消化的DNA。
④將DNA溶解于10～20μl的TE緩沖液中，保存于-20℃中備轉(zhuǎn)化用。
(III)酵母細(xì)胞制備①500ml三角瓶，加入100μ1新鮮YPD培養(yǎng)液，分別接種100～500μl取三個(gè)GS115、KM71和SMD1168，培養(yǎng)過(guò)夜，直至OD＝1.3-1.5②在4℃，離心力為1500×g下，離心細(xì)胞5min。
③用200ml冰無(wú)菌水重懸沉淀。
④重復(fù)步驟②用100ml冰無(wú)菌水重懸淀淀⑤重復(fù)步驟②用20ml 1M冰山梨醇重懸沉淀⑥重復(fù)步驟②用0.3ml 1M冰山梨醇重懸沉淀直至體積約為0.5ml。
(IV)電轉(zhuǎn)化①取上述細(xì)胞80μl和5～20μg的溶解于TE緩沖液中的線性DNA混合，將它們轉(zhuǎn)移到0.2cm冰預(yù)冷過(guò)的電穿孔小杯中。
②讓小杯中的細(xì)胞在冰上孵化5min。
③根據(jù)Bio-Rad Gene Pulser公司提供的參數(shù)充電電壓1500V，電容25μF，電阻200Ω來(lái)電擊細(xì)胞。
④立即往小杯中加入1ml 1M冰山梨醇，轉(zhuǎn)移電擊后的產(chǎn)物于無(wú)菌的1.5ml離心管中。
⑤將其分成200～600ul等分涂布于MD板上。
(V)篩選多拷貝①在|MD板上加1～2ml無(wú)菌水，用涂布棒將所有酵母菌落溶于水中。
②測(cè)其OD600值(1 OD60＝5×10 7個(gè)細(xì)胞/ml)。
③稀釋上述菌液，分別取約105個(gè)細(xì)胞涂布于2.0、3.0的YPD-G418板上。
④將YPD-G418板置于30℃烘箱中培養(yǎng)，G418耐受菌將在2～5天出現(xiàn)。
⑤挑取G418耐受菌，純化，并用30％甘油冷凍保存。
(VD PCR篩選甲醇酵母克隆根據(jù)Linder et al(1996)應(yīng)用PCR簡(jiǎn)單直接的檢驗(yàn)酵母的克隆。
①取10μl酵母液于1.5ml離心管。
③加5μl的5U/μl溶菌酶，并在35℃孵育10min。
③-80℃冰凍樣品10min。
④建立50微升熱啟動(dòng)PCR體系10×反應(yīng)緩沖液 5μl25mM MgCl25μl25mM dNTP 1μl5′AOX1引物(10pmo1/μl)1μl3′AOX1引物(10pmol/μl)1μl無(wú)菌水 31.5μl細(xì)胞裂解液 5μl5U/μl Taq酶 0.5μl總體積 50μl混勻置于PCR儀95℃溫育5min(加入0.5μl的5U/μl Taq酶)進(jìn)行如下30循環(huán)95℃變性 1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，最終72℃延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳分析。
3、搖瓶表達(dá)在50ml離心管中倒入10mlBMGY培養(yǎng)液，挑取3.0YPD-G418板上的單克隆。在28～30℃搖床中培養(yǎng)，直至OD600＝2-6(大約16～18小時(shí))。在4℃，離心力為1500g，離心9分鐘。去上清，加入10ml BMGY+1％CA(酷氮氨基酸)培養(yǎng)液，重懸后繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)后，同前離心(離心條件4℃，離心力為1500g，離心9分鐘)，去上清，加入10ml BMMY+1％CA培養(yǎng)液，重懸后繼續(xù)培養(yǎng)。每培養(yǎng)24小時(shí)，往50ml離心管中添加5微升100％甲醇，保持誘導(dǎo)。培養(yǎng)5天后取出，同前離心(離心條件4℃，離心力為1500離心力為1500×g下，離心9分鐘)，去沉淀，在-80℃儲(chǔ)存上清，直至準(zhǔn)備測(cè)定。
各種培養(yǎng)基配方Y(jié)PD培養(yǎng)液(1L)10g yeast extract+20g trypton+20g agar+900ml H2O(高壓滅菌)10×D 20g葡萄糖+100ml H2O(高壓滅菌)混合搖勻。YPD-G418板配YPD 20ml，高壓滅菌，若濃度為2.0，加入0.4ml G418，若濃度為3.0，加入0.6ml G418，立即倒平板。MD板(1L)15g agar+H2O 800ml，高壓滅菌，冷卻至60℃左右，加入用濾膜過(guò)濾滅菌的100ml 10×YNB、2ml500×B、100ml 10×D，立即倒板，密封好，可在4℃保存幾個(gè)月。
BMGY和BMMY培養(yǎng)液取10g酵母提取物，20g胰蛋白胨于700ml水中，高壓滅菌。冷卻至室溫后加入100ml 1MpH＝6.0磷酸緩沖液、100ml 10×YNB及2ml 500×B。
若配制BMGY，加入100ml 10×G，若配制BMMY，則加入100ml 10×M，4℃保存。
LB培養(yǎng)液(1L)5g酵母提取物+10g trypton+10g NaCl，加水至1000ml，高壓滅菌。
實(shí)施例二高密度表達(dá)rGPBB將保存的RGP1于平板上活化，轉(zhuǎn)接于YPD液體培養(yǎng)基，30℃、300rpm振蕩培養(yǎng)至OD600＝20作為種子液上發(fā)酵罐。
發(fā)酵培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基，配方如下六偏磷酸鈉25g/L，CaSO4·2H2O 176g/L，K2SO418.2g/L，MgSO47.28g/L，EDTA0.925g/L，甘油40g/L，PTMI 4.35ml/L，(NH4)2SO49g/L，泡敵0.02％。
其中PTMI的配方為CuSO4·5H2O 6g/L，NaI 0.08g/L，MnSO4·2H2O 3g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，硼酸0.02g/L，CoCl30.5g/L，ZnCl220g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 65g/L，生物素 0.2g/L，硫酸5ml。
發(fā)酵過(guò)程采用二步生長(zhǎng)法。起始生長(zhǎng)以甘油為碳源，溫度30℃，pH5、0，空氣流量為30L/分鐘，溶氧40％，經(jīng)過(guò)18～24小時(shí)培養(yǎng)，菌濃度達(dá)到OD600＝100，補(bǔ)甘油約4小時(shí)，甘油補(bǔ)液濃度500g/L，補(bǔ)液速度2ml/分鐘，同時(shí)設(shè)定pH在4小時(shí)內(nèi)降至pH3，補(bǔ)料完畢菌濃度為OD600＝160，此為甘油批培養(yǎng)階段。誘導(dǎo)表達(dá)階段，甲醇補(bǔ)料至濃度為0.5％～5％，溶氧控制為30％，誘導(dǎo)至54小時(shí)以上表達(dá)到達(dá)最高峰，放罐，此菌濃度OD600≥300。
菌體生長(zhǎng)曲線及誘導(dǎo)表達(dá)曲線見(jiàn)圖。
實(shí)施例三rGPPP純化離心收集發(fā)酵上清，或以30000～50000截留量的超濾膜收集發(fā)酵上清。上清經(jīng)1000～10000截留量的外壓式中空纖維柱超濾濃縮、脫鹽。濃縮上清直接經(jīng)親和層析純化。應(yīng)用固相化的抗體(抗GPBB抗體)，通過(guò)常規(guī)的一步法可將GPBB純化1000～10000倍。該方法可分為三個(gè)主要步驟①抗體的固相化；③抗原與含抗體的介質(zhì)結(jié)合；③洗脫抗原。
(I)基質(zhì)固相化抗體的制備①抗體溶液對(duì)0.1mol/L pH7.4磷酸緩沖液透析，4℃，過(guò)夜；②將20ml濕潤(rùn)的凝膠小珠移入燒結(jié)玻璃漏斗；用3～5個(gè)柱體積的重蒸餾水洗，然后再以0.1mol/L pH7.4磷酸緩沖液洗兩次；③將凝膠移入適當(dāng)?shù)臒?，在通風(fēng)櫥內(nèi)，分別加入50ml重蒸餾水，10ml 1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)，及20ml 25％戊二醛；④燒杯加蓋，放入37℃恒溫振蕩器中，緩慢振蕩過(guò)夜；⑤將凝膠轉(zhuǎn)移到燒結(jié)玻璃漏斗中，用20～40倍于凝膠體積的0.1mol/L pH7.4磷酸緩沖液充分洗滌，以除去多余的戊二醛，得到活化的凝膠；⑥每10ml活化的凝膠，加入含10-20mg抗體的10ml 0.1mol/L pH7.4磷酸緩沖液；⑦上述混合物在37℃，用攪拌器緩慢攪拌18h；⑧混合物轉(zhuǎn)入50ml離心管中，離心(4℃，300×g離心20分)，收集凝膠，再加10-20ml PBS離心洗滌，直至其上清液的A280nm＜0.05；⑨取凝膠，加入50ml含0.1mol/L甘氨酸的0.1mol/L磷酸緩沖液，室溫放置2小時(shí)，以中和殘余的醛基。然后在300×g離心20分，棄上清；⑩將含有固相化抗體的凝膠裝入適當(dāng)?shù)膶游鲋?，依次用洗脫緩沖液及PBS洗滌，開(kāi)始使用。也可以在含0.1g/L疊氮鈉的PBS中，4℃長(zhǎng)期保存。
(II)rGPBB與含抗體的固相化介質(zhì)結(jié)合①將層析柱與蠕動(dòng)泵及部分收集器連接，如無(wú)此類設(shè)備可用手工操作；②將含待純化rGPBB的混合物緩慢上樣(大約10ml/h)，如果混合物的體積大于柱體積，可將混合物過(guò)柱后再循環(huán)上樣；③室溫或4℃孵育1～2小時(shí)，參照抗原的穩(wěn)定性來(lái)選擇溫度；④在4℃，用PBS洗柱。直至其流出液A280nm＜0.05。
(III)rGPBB洗脫①在4℃，用0.2mol/L pH2.8鹽酸-甘氨酸緩沖液洗脫rGPBB，按1～2ml/管收集洗脫液。測(cè)定每一管的A280nm；②當(dāng)A280nm＜0.05時(shí)，先后用2mol/L pH2.2鹽酸-甘氨酸緩沖液及含0.1g/L疊氮鈉的PBS洗柱；③含有rGPBB組分的各管，每管按100～200μl/ml加入1mol/L K2HPO4，以中和其酸性；④用SDS-PAGE或功能檢測(cè)法(如RIA，ELISA)檢測(cè)，以確定各管有無(wú)rGPBB的存在；⑤將含有rGPBB的各管合并，在4℃對(duì)PBS透析。如果需要，可對(duì)rGPBB液進(jìn)行濃縮。
4.親和層析條件的選擇(1)支持物與抗原或抗體結(jié)合后，還可能有多余的活性基團(tuán)，為了封閉這些殘留基團(tuán)，必須用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)或三乙醇胺過(guò)一次柱，以封閉活性基團(tuán)。
(2)去掉未結(jié)合及結(jié)合不牢固的蛋白質(zhì)。先用0.2mol/L NaHCO3(含0.1mol/LNaCl，pH9.0)洗脫2～3個(gè)柱體積，再用解脫劑處理一次親和層析柱。
(3)解脫劑有許多種。常用的有0.2mol/L pH2.8甘氨酸-鹽酸緩沖液、0.1mol/L pH2.4甘氨酸緩沖液、7mol/L脲、5mol/L NaI、3mol/L硫氰酸鉀(或鈉)、1mol/L乙酸、6mol/L鹽酸胍、0.2mol/L KCL等。作為抗原抗體解脫劑，最多用的是3mol/L硫氰酸鉀(或鈉)及0.1mol/L pH2.4甘氨酸緩沖液。
純化后的目的蛋白質(zhì)因含量低，失去保護(hù)作用，應(yīng)及時(shí)凍干保存，亦可放-20℃保存。
實(shí)施例四抗體制備抗體分單克隆抗體和多克隆抗體兩種。本實(shí)施例以多克隆抗體制備為例說(shuō)明，但是制備單克隆抗體的技術(shù)也是本專業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。
(1)抗原是rGPBB純化品，該純品在12.5％的PAG電泳后，僅出現(xiàn)一條區(qū)帶，即認(rèn)為可用于免疫抗原純品。
(2)免疫 動(dòng)物的選擇通常選擇壯年、成熟且健壯的豚鼠、雞、兔、山羊、綿羊、馬等動(dòng)物。一般多用大白兔。免疫時(shí)，取完全佐劑3份加入含抗原的緩沖液1份，混勻，振搖或研磨，使其成為乳化狀態(tài)，因?yàn)楹琒DS很易促使其乳化成油包水抗原乳化復(fù)合物，注射入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)一定要保持乳化狀態(tài)。抗原用量視抗原分子量不同及免疫原性及免疫動(dòng)物不同而有一定差異，無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和固定模式。一般是每兔(約2kg重)或每羊(約20kg重)第1次注射抗原1mg，以后逐次增加抗原量，最多每次不超過(guò)3mg。
(3)免疫途徑及方法免疫部位可分別選用皮內(nèi)、皮下或淋巴結(jié)。第1次免疫采用皮內(nèi)結(jié)合皮下多點(diǎn)注射，常注射在背部或腿部。許多作者介紹在后足蹠皮下或皮內(nèi)注射，因?yàn)樗淖懵涞氐年P(guān)系很易造成感染，使第1次免疫失效，并使動(dòng)物行走不便，造成傷害。整個(gè)免疫過(guò)程以2～3個(gè)月為宜。一般是第1次免疫后的3～4周再進(jìn)行第2次免疫，不完全佐劑為乳化劑。2周后加強(qiáng)1次(不完全佐劑)，2周后又加強(qiáng)1次(不完全佐劑或完全佐劑)，1周后再免疫1次。待最后一次免疫后的7～10天，取靜脈血測(cè)試抗體效價(jià)(試血)，效價(jià)達(dá)到要求后即可一次性放血，采用頸動(dòng)脈放血，得抗血清。
(4)抗血清的保存免疫成功的動(dòng)物放血過(guò)程，所有用具均嚴(yán)格消毒，并按無(wú)菌操作方式進(jìn)行放血?？寡宓姆栏瘎┮?.05％疊氮鈉為宜；也可采用加入20％～30％無(wú)菌甘油保存的方法。若時(shí)間較長(zhǎng)，不用可采用-20℃低溫保存。一般在0～8℃保存1年，抗體效價(jià)幾乎無(wú)改變，保存2年，其效價(jià)稍有降低?？贵w切忌反復(fù)凍融，否則抗體效價(jià)很快降低，以頸動(dòng)脈一次性放血為宜。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于①按酵母使用頻率高的密碼子人工合成糖原磷酸化酶同工酶BB的編碼基因，融合于酵母表達(dá)調(diào)控元件，構(gòu)建甲醇酵母高表達(dá)工程菌；②甲醇酵母工程菌高密度發(fā)酵表達(dá)；③采用超濾、葡聚糖凝膠層析、離子梯度凝膠層析、親和層析等純化技術(shù)的順序組合，純化回收GPBB。
2.根據(jù)權(quán)要求1所述的應(yīng)用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于重組人糖原磷酸化酶同工酶BB構(gòu)建甲醇酵母高表達(dá)工程菌的方法為人工合成優(yōu)化的重組人糖原磷酸化酶同工酶BB編碼基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體，選用酵母使用頻率較高的密碼子改造人GPBB基因。
3.根據(jù)權(quán)要求2所述的應(yīng)用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于在人工合成DNA時(shí)將GPBB基因序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，把酵母中使用頻率較低的密碼子突變?yōu)榻湍甘褂妙l率較高的密碼子，然后將突變后的GPBB片段克隆到表達(dá)載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建人GPBB的表達(dá)載體質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)要求3所述的應(yīng)用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于將人工合成基因以限制性內(nèi)切酶酶切處理，體外連接到同樣酶切處理的甲醇酵母表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建成GPBB重組表達(dá)質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)要求4所述的應(yīng)用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于甲醇酵母表達(dá)載體質(zhì)粒，穿梭型質(zhì)粒，它包括以下各種元件(1)大腸桿菌來(lái)源的質(zhì)粒復(fù)制元件，(2)大腸桿菌篩選標(biāo)記，(3)甲醇酵母表達(dá)調(diào)控元件，特別是可誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控元件，(4)甲醇酵母分泌表達(dá)信號(hào)α因子信號(hào)肽，(5)多克隆位點(diǎn)，(6)甲醇酵母篩選標(biāo)記，(7)能在甲醇酵母染色體特異位點(diǎn)上重組整合的特異序列，(8)其它來(lái)源于大腸桿菌和酵母的連接片段。
6.根據(jù)權(quán)要求5所述的應(yīng)用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于利用表達(dá)載體帶有抗生素的抗性基因，設(shè)計(jì)出一套快速簡(jiǎn)便的篩選高拷貝的方法，用含有梯度濃度的抗生素培養(yǎng)篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。
7.根據(jù)權(quán)要求6所述的應(yīng)用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于外源蛋白在酵母中的表達(dá)分兩個(gè)階段，第一階段，菌種生長(zhǎng)階段，先在以甘油為碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌體，達(dá)到一定OD值；第二階段，發(fā)酵階段，離心棄上清，菌體懸浮于以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，每隔一定時(shí)間加一次甲醇，以彌補(bǔ)甲醇的消耗；發(fā)酵結(jié)束后采用離心或壓濾或超濾的方法除去細(xì)菌體，收集上清液；上清液經(jīng)超濾脫鹽、濃縮后采用離子交換層析或疏水層析或分子篩層析或親和層析的方法進(jìn)行純化處理。
8.根據(jù)權(quán)要求4所述的應(yīng)用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、PCR、DNA測(cè)序驗(yàn)證過(guò)程，從中篩選一個(gè)結(jié)構(gòu)完全正確的轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)增并提取含轉(zhuǎn)化子的重組質(zhì)粒。
9.根據(jù)要求2所述的應(yīng)用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于將人GPBB基因3’末端與肌型和肝型兩種同工酶不同源部分進(jìn)行改造。
10.根據(jù)上述權(quán)利要求所述的方法制備的重組人糖原磷酸化酶同工酶BB，其特征在于基因片段是人GPBB基因3’末端，包含111個(gè)核苷酸，其所編碼的氨基酸序列為IRNIACSGKFSSDRTITEYAREIWGVEPSDLQIPPPNIPRD。
11.一種重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的應(yīng)用，其特征在于將權(quán)利要求1-10所述的應(yīng)用甲醇酵母所制備的重組人糖原磷酸化酶同工酶BB應(yīng)用于生產(chǎn)抗GPBB抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及應(yīng)用甲醇酵母生產(chǎn)重組人糖原磷酸化酶同工酶BB及其生產(chǎn)方法和它的應(yīng)用。提供一種對(duì)AMI的早期診斷具有敏感性和特異性，且使用成本低的應(yīng)用甲醇酵母生產(chǎn)的重組人糖原磷酸化酶同工酶BB及其生產(chǎn)方法和它的應(yīng)用。本發(fā)明的方法為①按酵母嗜好的密碼子人工合成糖原磷酸化酶同工酶BB免疫顯性片段的編碼基因，融合于酵母表達(dá)調(diào)控元件，構(gòu)建甲醇酵母高表達(dá)工程菌；②甲醇酵母工程菌高密度發(fā)酵表達(dá)；③采用超濾、葡聚糖凝膠層析、離子梯度凝膠層析等純化技術(shù)的順序組合，純化回收GPBB；④應(yīng)用該蛋白質(zhì)產(chǎn)生抗GPBB抗體。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶基因(A0X1)啟動(dòng)子，可高效嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；(2)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工和修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有很高的生物活性；(3)表達(dá)量高，可高密度發(fā)酵培養(yǎng)，且營(yíng)養(yǎng)要求低，生長(zhǎng)快，培養(yǎng)基廉價(jià)便于工業(yè)化生產(chǎn)；(4)表達(dá)的蛋白可分泌至胞外，而Pp自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，十分有利于純化；(5)糖基化程度適當(dāng)，對(duì)人體無(wú)明顯的抗原性，適合于臨床治療用途。
文檔編號(hào)A61P9/10GK1456664SQ03128128
公開(kāi)日2003年11月19日 申請(qǐng)日期2003年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月6日
發(fā)明者高健民, 王滔 申請(qǐng)人:福建師范大學(xué)