專利名稱：溶菌酶及相關衍生物純品或原液用于海水、淡水養(yǎng)殖中疾病的預防和治療的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種溶菌酶及相關衍生物純品或原液用于海水、淡水養(yǎng)殖魚類、螃蟹類、蝦類疾病的預防和治療。
背景技術：
近年來，我國海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展非常迅猛。估計全國海水養(yǎng)殖魚水面積在100萬畝以上。根據(jù)國家農業(yè)部統(tǒng)計，我國海水養(yǎng)殖魚1995年的產量為15萬噸。但是海水魚病的發(fā)生已成為海水養(yǎng)殖魚發(fā)展的巨大障礙，養(yǎng)殖魚一旦發(fā)生感染流行，其死亡率一般在50～80％，甚至絕收。而且養(yǎng)殖魚場受病菌污染后，一段時間內不能再用。另外，一些海水養(yǎng)殖魚的病原菌是人畜共患病菌，如我國東南沿海以創(chuàng)傷弧菌最常見。創(chuàng)傷弧菌廣泛分布在河口與海水中，主要感染軟體動物貝類如牡蠣，及魚中鰻鱺等。人食入帶菌的生牡蠣、病魚或擦傷而感染，免疫力低下者可引起敗血癥。所以海水養(yǎng)殖魚病的防治是海水養(yǎng)殖魚進一步發(fā)展的保證。目前對我國海水養(yǎng)殖魚業(yè)危害最大的病源菌是弧菌，其中包括創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、河弧菌、鰻弧菌等，此外還有海洋曲橈菌、鏈球菌、愛德華菌等。迄今國際上已有8項魚類弧菌滅活疫苗及其制備方法獲得日本、美國專利，但是還未見廣譜性海魚弧菌疫苗問世。在國內，1995年成功制備了創(chuàng)傷海魚滅活疫苗，其免疫保護率僅達40％左右。由此可見，滅活疫苗的免疫保護率不高，莢膜多糖與蛋白偶聯(lián)疫苗雖然免疫效果較好，但提取困難，難以大批量生產推廣應用。而且，由于引起海水養(yǎng)殖魚病的病原菌種類較多，免疫預防困難，因此目前對魚病的預防與治療還是主要采用化學藥物防治。其中最常用的方法是在魚飼料中添加抗生素，該方法雖有效，但存在以下弊病。首先抗生素在魚體內殘留，對食入者體內正常菌群構成影響，微量的抗生素易誘導耐藥菌產生，因此許多國家明令禁止進口、銷售殘留抗生素的魚及肉類等；其次抗生素的長期使用，可在魚體內誘生具有耐藥菌的致病菌，隨食物鏈進入人體造成感染性疾病，抗生素難以治療；最后抗生素還會對周圍環(huán)境造成影響。溶菌酶對人體和動物細胞無毒性作用，并且廣泛存在于自然界動物、植物和微生物中。利用酵母系統(tǒng)表達人溶菌酶該方法已申請專利(專利申請?zhí)?0 1 10463.2)。構建表達氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶，其成本低，生產量大，可實現(xiàn)工業(yè)化生產。而且生產基因工程表達人溶菌酶過程中形成的富含人溶菌酶的酵母細胞裂解物不僅具有殺菌活性，而且本身也是飼料中良好的氮源添加劑。溶菌酶除可以直接裂解細菌，還可以作為免疫調節(jié)劑調節(jié)中性粒細胞的作用，保護炎癥部位的正常組織，在調節(jié)炎癥反應中起負反饋作用(Leo IG，etal.J.Clin.Invist.1979；64222)。它可能通過與多形核粒細胞膜表面的多糖部分結合，抑制多形核粒細胞向炎癥部位移動，并可衰減炎癥部位由多形核粒細胞所產生的超氧化物的作用，保護機體在炎癥反應時由于免疫應答過度而發(fā)生的組織損傷。溶菌酶還可與其他生物活性蛋白共同作用，充分發(fā)揮抗菌作用，如補體、乳轉鐵蛋白等。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種溶菌酶及相關衍生物純品或原液用于海水、淡水養(yǎng)殖魚類、螃蟹類、蝦類疾病的預防和治療，溶菌酶是人、動物，包括魚類細胞產生的一種抗菌物質，因溶菌酶在魚體內本身即具有，所以使用溶菌酶代替常用的抗生素即解決了魚病的預防與治療問題又避免了抗生素在魚體內的殘留問題和使用抗生素帶來的耐藥菌誘生的問題。人溶菌酶在體內、外均具有明顯的殺滅細菌的活性，可單獨使用，用于細菌感染的預防和治療；也可以與抗生素合用，能明顯降低抗生素的最低殺菌濃度，從而治療細菌感染時與溶菌酶合用也可減低抗生素的用量，減低抗生素在動物體內的殘留量。海水養(yǎng)殖魚細菌性疾病的癥狀多樣，有皮膚紅斑潰爛、皮膚粘膜出血水腫、魚腮出血、腸道水腫充血等等，病菌在魚體內分布廣泛，可從魚腮、腸、脾、腎及粘液中分離得到。研究表明病菌可經口、腮、皮膚粘膜等多途徑感染魚，也可經多種途徑預防和治療。
本發(fā)明的技術方案是溶菌酶及其衍生物純品或原液按如下重量份數(shù)比加入飼料中，用于海水、淡水養(yǎng)殖魚、螃蟹類、蝦類疾病的預防和治療是以飼料經口途徑或全身浸泡的方式給藥；將溶菌酶及其衍生物純品0.1克～5克加入1000公斤重量飼料中經口服給藥，將0.1～5份重量溶菌酶及其衍生物發(fā)酵液加入100份重量飼料中經口服給藥；將0.1～5份溶菌酶及其衍生物純品和0.0001～0.05份抗生素加入100份重量飼料中經口服給藥，溶菌酶100毫克～500毫克/噸水的比例進行浸泡法預防和治療疾病。用于海水、淡水養(yǎng)殖業(yè)的常見疫病弧菌包括創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、河弧菌、鰻弧菌等、海洋曲橈菌、鏈球菌、愛德華菌引起的疾病預防和治療；溶菌酶包括雞溶菌酶、基因工程表達的人溶菌酶、基因工程表達的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶、基因工程表達或化學合成突變體人溶菌酶和生產溶菌酶過程中形成的富含溶菌酶的酵母細胞或大腸桿菌細胞裂解物原液。
本發(fā)明的積極效果是解決了海水、淡水養(yǎng)殖魚類、螃蟹類、蝦類疾病的預防和治療中抗生素在魚體內的殘留和使用抗生素帶來的耐藥菌誘生的問題，減少海水、淡水魚類、螃蟹類、蝦類養(yǎng)殖過程中的病原菌感染率，降低抗生素在海水、淡水魚類、螃蟹類、蝦類養(yǎng)殖中的存溜，增強海水、淡水養(yǎng)殖魚類、螃蟹類、蝦類的品質，提高海水、淡水養(yǎng)殖魚類、螃蟹類、蝦類的經濟效益。
具體實施例方式實驗例1溶菌酶體內殺菌實驗一、材料1.菌株溶藻弧菌2.動物BALB/c小鼠二、方法溶藻弧菌感染BALB/c小鼠實驗將105～109CFU(菌落形成單位)的對數(shù)生長期的溶藻弧菌分別經腹腔接種于6周齡的BALB/c小鼠，觀察結果，計算死亡率。
溶菌酶保護活性的鑒定將1×109對數(shù)生長期的溶藻弧菌腹腔接種于6周齡的BALB/c小鼠作為感染對照，溶菌酶保護組在接種細菌同時，注入不同劑量的溶菌酶，觀察7天結果，計算保護力，保護率％＝[(實驗組成活率-對照組成活率)/對照組死亡率]×100％。三、結果溶藻弧菌感染BALB/c小鼠的致死實驗 用105～109CFU溶藻弧菌感染BALB/c小鼠，結果從106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多發(fā)生在3天之內，4天以后基本穩(wěn)定，不再死亡。其中108CFU溶藻弧菌感染BALB/c小鼠死亡較為規(guī)律，109CFU溶藻弧菌感染BALB/c小鼠3天內全部死亡。我們采用109CFU溶藻弧菌進行溶菌酶抗溶藻弧菌感染BALB/c小鼠被動保護實驗。
用四個不同劑量溶菌酶對BALB/c小鼠進行溶藻弧菌感染的保護鑒定，連續(xù)觀察7天，結果對照組BALB/c小鼠2天內全部死亡，保護組死亡時間略有推遲，在2-3天。3天不死亡的BALB/c小鼠在7天內不再死亡。四個不同劑量溶菌酶均具有被動保護抵抗溶藻弧菌感染的活性，其中30萬單位/公斤時保護率達80％。
表2.抗創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體免疫保護實驗結果Tab2.protertion of lysozyme against V. alginolyticusDose(u/kg) NO.testNo.death Protective rate(％)30×10420 4 8015×10420 5 757.5×10420 7 653.75×10420 11 450 15 15 0實驗例2溶菌酶保護牙鲆魚的抗感染實驗一、材料1.菌株創(chuàng)傷弧菌2.動物牙鮃魚二、方法溶菌酶保護牙鲆魚的抗感染實驗 用溶菌酶作為添加劑制成飼料喂養(yǎng)牙鲆魚苗，正常飼料喂養(yǎng)作對照組。將1×109對數(shù)生長期的創(chuàng)傷弧菌腹腔分別接種于保護組和對照組牙鲆魚苗。觀察結果，計算保護力。免疫保護率％＝[(實驗組成活率-對照組成活率)/對照組死亡率]×100％三、結果溶菌酶保護牙鲆魚的抗感染保護實驗結果表明用創(chuàng)傷弧菌感染牙鲆魚苗后，用溶菌酶作為添加劑制成飼料喂養(yǎng)牙鲆魚苗組保護率可達65％。正常飼料喂養(yǎng)的對照組全部死亡。
實施例3溶菌酶與抗生素的協(xié)同抗菌作用一、材料1.菌株臨床分離株400余株，由成都抗生素工業(yè)研究所提供。2.緩沖液pH7.2 10mMTris-Cl緩沖液3.LB培養(yǎng)基4.克拉霉素，羅紅霉素二、方法溶菌酶與克拉霉素、羅紅霉素分別(1∶1)聯(lián)合使用，方法一(試管法)用pH7.2 10mM Tris-Cl緩沖液將金黃色葡萄球菌(或大腸桿菌)配成107-108CFU/mL左右濃度的菌液，并分別將其加入到不同華試管中，每管2mL不同華試管中分別加入不同劑量的人溶菌酶(100μg-1mg)37℃過夜；其中一管取20μL以10倍稀釋法稀釋后，取100μL涂于LB培養(yǎng)基，經37℃培養(yǎng)過夜，并觀察結果，計算原始管中細菌總數(shù)。另一管加入100μL 10％SDS(終濃度0.5％)后，搖勻并經肉眼觀察濁度變化或用分光度計進行比濁(640)。溶菌酶溶菌效果＝(對照管中細菌總數(shù)-實驗管中細菌總數(shù))/對照管中細菌總數(shù)× 100％方法二(平板法)用pH7.2 10mM Tris-Cl緩沖液配制1％的瓊脂糖高壓滅菌后，冷卻至40℃，加入細菌至106傾倒平板，用打孔器在平板上打孔，在孔中加入不同濃度的溶菌酶溶液(0-100mg/ml)，經37℃孵箱孵育4-6小時后，在LB營養(yǎng)瓊脂高壓滅菌后，冷卻至40℃，覆蓋于上述瓊脂糖平板上，將該平板至于紫外燈下照射20分鐘。(LB營養(yǎng)瓊脂覆蓋于含菌的瓊脂糖平板過程中，瓊脂糖表面的游離細菌會混入營養(yǎng)瓊脂中，其中沖到營養(yǎng)瓊脂表面的細菌，由于氧氣的作用，生長速度非?？?，形成菌膜，影響瓊脂糖與營養(yǎng)瓊脂層之間細菌生長情況的觀察，故用紫外燈照射殺死營養(yǎng)瓊脂表面的細菌)37℃孵箱培養(yǎng)過夜。觀察瓊脂糖與營養(yǎng)瓊脂層之間細菌生長情況，測量不同濃度溶菌酶形成的抑菌圈的直徑，抑菌圈的直徑》加樣孔直徑4mm者為最低有效殺菌濃度。(對于有鞭毛，運動活躍的細菌，會影響抑菌圈的形成，可考慮加入0.01％石炭酸抑制其運動。)三、結果溶菌酶與克拉霉素、羅紅霉素分別(1∶1)聯(lián)合使用，可使克拉霉素、羅紅霉素對其抗菌活性增效2-16倍以上，個別菌株增效倍數(shù)在1000倍。
本研究所用的臨床分離耐藥株共30株，分別為金黃色葡萄球菌8株、肺炎克雷伯氏菌6株、綠膿假單胞桿菌3株、大腸桿菌7株、鮑鰻桿菌1株、粘質沙雷氏菌1株、變形桿菌3株、甲型鏈球菌1株。抑菌實驗結果表明本研究所用的30株臨床分離耐藥菌，均對基因工程表達的人溶菌酶敏感，基因工程表達的人溶菌酶對實驗菌株的最低抑菌濃度針對不同菌存在差異，有效抑菌濃度范圍在50μg-1mg/ml之間。同時發(fā)現(xiàn)基因工程表達的人溶菌酶對不同菌的最低抑菌濃度之間的差異主要存在于相同菌的不同菌株之間，而對不同菌之間以及革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌之間，由于實驗菌株數(shù)量較少，未發(fā)現(xiàn)存在明顯差異。
實驗例4.溶菌酶體內殺菌實驗(一)一、材料1.菌株溶藻弧菌2.動物BALB/c小鼠二、方法溶藻弧菌感染BALB/c小鼠實驗將105～109CFU(菌落形成單位)的對數(shù)生長期的溶藻弧菌分別經腹腔接種于6周齡的BALB/c小鼠，觀察結果，計算死亡率。
溶菌酶保護活性的鑒定將1×109對數(shù)生長期的溶藻弧菌腹腔接種于6周齡的BALB/c小鼠作為感染對照，溶菌酶保護組在接種細菌同時，注入不同劑量的溶菌酶，觀察7天結果，計算保護力，保護率％＝[(實驗組成活率-對照組成活率)/對照組死亡率]×100％。三、結果溶藻弧菌感染BALB/c小鼠的致死實驗 用105～109CFU溶藻弧菌感染BALB/c小鼠，結果從106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多發(fā)生在3天之內，4天以后基本穩(wěn)定，不再死亡。其中108CFU溶藻弧菌感染BALB/c小鼠死亡較為規(guī)律，109CFU溶藻弧菌感染BALB/c小鼠3天內全部死亡。我們采用109CFU溶藻弧菌進行溶菌酶抗溶藻弧菌感染BALB/c小鼠被動保護實驗。
用四個不同劑量溶菌酶對BALB/c小鼠進行溶藻弧菌感染的保護鑒定，連續(xù)觀察7天，結果對照組BALB/c小鼠2天內全部死亡，保護組死亡時間略有推遲，在2-3天。3天不死亡的BALB/c小鼠在7天內不再死亡。四個不同劑量溶菌酶均具有被動保護抵抗溶藻弧菌感染的活性，其中30萬單位/公斤時保護率達80％。
表1.抗溶藻弧菌單克隆抗體免疫保護實驗結果Tab2.protertion of lysozyme against V.alginolyticusDose(u/kg) NO.testNo.death Protective rate(％)30×10420 4 8015×10420 5 757.5×10420 7 653.75×10420 11 450 15 15 0實驗例5溶菌酶體內殺菌實驗(二)一、材料1.菌株鏈球菌2.動物BALB/c小鼠二、方法鏈球菌感染BALB/c小鼠實驗將105～109CFU(菌落形成單位)的對數(shù)生長期的溶藻弧菌分別經腹腔接種于6周齡的BALB/c小鼠，觀察結果，計算死亡率。
溶菌酶保護活性的鑒定 將2×108對數(shù)生長期的鏈球菌腹腔接種于6周齡的BALB/c小鼠作為感染對照，溶菌酶保護組在接種鏈球菌同時，注入不同劑量的溶菌酶，觀察7天結果，計算保護力，保護率％＝[(實驗組成活率-對照組成活率)/對照組死亡率]×100％。三、結果鏈球菌感染BALB/c小鼠的致死實驗用105～109CFU鏈球菌感染BALB/c小鼠，結果從106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多發(fā)生在3天之內，4天以后基本穩(wěn)定，不再死亡。其中5×107～5×108CFU鏈球菌感染BALB/c小鼠死亡較為規(guī)律，109CFU鏈球菌感染BALB/c小鼠3天內全部死亡。我們采用2×108CFU鏈球菌進行溶菌酶抗鏈球菌感染BALB/c小鼠被動保護實驗。
用四個不同劑量溶菌酶對BALB/c小鼠進行鏈球菌感染的保護鑒定，連續(xù)觀察7天，結果對照組BALB/c小鼠3天內全部死亡，保護組死亡時間略有推遲，在3-5天。5天不死亡的BALB/c小鼠在7天內不再死亡。四個不同劑量溶菌酶均具有被動保護抵抗鏈球菌感染的活性，其中30萬單位/公斤時保護率達85％。
表2.抗鏈球菌單克隆抗體免疫保護實驗結果Tab2.protertion of lysozyme against StreptococcusDose(u/kg) NO.testNo.death Protective rate(％)30×10420 3 8515×10420 5 757.5×1042010 503.75×1042011 450 1515 0實驗例6溶菌酶保護牙鲆魚的抗感染實驗(一)一、材料1.菌株創(chuàng)傷弧菌2.動物牙鮃魚二、方法溶菌酶保護牙鲆魚的抗感染實驗用溶菌酶作為添加劑制成飼料喂養(yǎng)牙鲆魚苗，正常飼料喂養(yǎng)作對照組。將1×109對數(shù)生長期的創(chuàng)傷弧菌腹腔分別接種于保護組和對照組牙鲆魚苗。觀察結果，計算保護力。免疫保護率％＝[(實驗組成活率-對照組成活率)/對照組死亡率]×100％三、結果溶菌酶保護牙鲆魚的抗感染保護實驗結果表明用創(chuàng)傷弧菌感染牙鲆魚苗后，用溶菌酶作為添加劑制成飼料喂養(yǎng)牙鲆魚苗組保護率可達65％。正常飼料喂養(yǎng)的對照組全部死亡。
實驗例7溶菌酶保護牙鲆魚的抗感染實驗(二)一、材料1.菌株愛德華菌2.動物牙鮃魚二、方法溶菌酶保護牙鲆魚的抗感染實驗用溶菌酶作為添加劑制成飼料喂養(yǎng)牙鲆魚苗，正常飼料喂養(yǎng)作對照組。將5×108對數(shù)生長期的愛德華菌腹腔分別接種于保護組和對照組牙鲆魚苗。觀察結果，計算保護力。免疫保護率％＝[(實驗組成活率-對照組成活率)/對照組死亡率]×100％三、結果溶菌酶保護牙鲆魚的抗感染保護實驗結果表明用愛德華菌感染牙鲆魚苗后，用溶菌酶作為添加劑制成飼料喂養(yǎng)牙鲆魚苗組保護率可達80％。正常飼料喂養(yǎng)的對照組全部死亡。
權利要求
1.溶菌酶及其衍生物純品或原液用于海水、淡水養(yǎng)殖中的弧菌的預防和治療。
2.溶菌酶及其衍生物純品或原液用于海水、淡水養(yǎng)殖中海洋曲橈菌預防和治療。
3.溶菌酶及其衍生物純品或原液用于海水、淡水養(yǎng)殖中鏈球菌預防和治療。
4.溶菌酶及其衍生物純品或原液用于海水、淡水養(yǎng)殖中愛德華菌預防和治療。
5.溶菌酶及其衍生物純品或原液用于海水、淡水養(yǎng)殖中疾病的預防和治療是以飼料經口途徑或全身浸泡的方式給藥；將溶菌酶及其衍生物純品0.1克～5克加入1000公斤重量飼料中經口服給藥，將0.1～5份重量溶菌酶及其衍生物發(fā)酵液加入100份重量飼料中經口服給藥；將0.1～5份溶菌酶及其衍生物純品和0.0001～0.05份抗生素加入100份重量飼料中經口服給藥，溶菌酶100毫克～500毫克/噸水的比例進行浸泡法預防和治療疾病。
6.根據(jù)權利要求5所述的溶菌酶用于預防治療細菌感染引起海水、淡水養(yǎng)殖類疾病的藥用組合物。
7.根據(jù)權利要求6所述的溶菌酶可以協(xié)同一種有效劑量的抗生素用于預防治療細菌感染引起海水、淡水養(yǎng)殖類疾病的藥用組合物。
8.根據(jù)權利要求1、2、3、4所述的溶菌酶包括雞溶菌酶、基因工程表達的人溶菌酶、基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶、基因工程表達或化學合成突變體人溶菌酶和生產溶菌酶過程中形成的富含溶菌酶和酵母細胞或大腸桿菌細胞裂解物原液。
9.根據(jù)權利要求6中所述的藥用組合物中的抗生素包括氨基糖苷類、大環(huán)內酯類、頭胞菌素類。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種溶菌酶及相關衍生物純品或原液用于海水、淡水養(yǎng)殖類疾病的預防和治療。溶菌酶或溶菌酶與抗生素合用，用于治療海水、淡水養(yǎng)殖魚類、螃蟹類、蝦類，由弧菌、海洋曲橈菌、鏈球菌、愛德華菌引起的疾病。減少海水、淡水魚類、螃蟹類、蝦類養(yǎng)殖過程中的病原菌感染率，降低抗生素在海水、淡水魚類、螃蟹類、蝦類養(yǎng)殖中的存畄，增強海水、淡水養(yǎng)殖魚類、螃蟹類、蝦類的品質，提高海水、淡水養(yǎng)殖魚類、螃蟹類、蝦類的經濟效益。
文檔編號A61K38/43GK1451436SQ0311131
公開日2003年10月29日 申請日期2003年3月26日 優(yōu)先權日2003年3月26日
發(fā)明者張華 , 安米, 安獻祿, 李元 申請人:長春奇龍生物技術研究所