專利名稱：軟骨植入物的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種軟骨植入物的制造方法，其包括在三維結(jié)構(gòu)的基材中植入并培養(yǎng)軟骨細(xì)胞。
背景技術(shù)：
軟骨組織的自行修復(fù)能力相當(dāng)有限，一旦軟骨組織受到損傷，僅能憑借纖維軟骨進(jìn)行十分有限的自然修復(fù)，而纖維軟骨的生化性質(zhì)、機(jī)械性質(zhì)與生理性質(zhì)均不及正常軟骨，因此受損的軟骨組織易于發(fā)生退行性改變。
目前針對(duì)軟骨再生的療法包括碳填充物、骨膜、軟骨膜、軟骨下骨鉆孔術(shù)以及自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)。然而大多數(shù)療法無(wú)法獲得較自然修復(fù)更好的軟骨的力學(xué)性質(zhì)或生理性質(zhì)。臨床上對(duì)療效更佳的治療選擇的需要，導(dǎo)致了利用分離的軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞開發(fā)活體外制造軟骨植入物的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種軟骨植入物。
本發(fā)明的一個(gè)方面的特征是通過在一種三維基材中植入軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞以制造一種軟骨植入物的方法。此基材含有任意重繞的I型膠原蛋白的α-螺旋單體(randomly rewound α-helicalmonomersof type I collagen)，并且可選擇性地進(jìn)一步含有任意重繞的II型膠原蛋白的α-螺旋單體。將此細(xì)胞基材構(gòu)建體置于培養(yǎng)基中。間葉干細(xì)胞可通過在培養(yǎng)基中加入分化因子，以誘導(dǎo)其分化為軟骨細(xì)胞。當(dāng)軟骨細(xì)胞于基材中增殖與分化時(shí)，其將分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，例如蛋白多糖與II型膠原蛋白，直到形成軟骨植入物。
軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞、I型膠原蛋白與II型膠原蛋白可由二至三種不同的動(dòng)物來(lái)源制備。例如人類的軟骨細(xì)胞可與牛的I型膠原蛋白與II型膠原蛋白聯(lián)合使用。軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞與基材可放置于一旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)以提供適合軟骨形成的微環(huán)境。
本發(fā)明還包括根據(jù)前述方法所制得的軟骨植入物。此軟骨植入物含有包覆于三維結(jié)構(gòu)基質(zhì)(即軟骨植入物的細(xì)胞外成分)中的軟骨細(xì)胞。此基質(zhì)的組成成分不同于前述之基材，例如因?yàn)榻到獾木壒?，基質(zhì)含有較少量的任意重繞的I型膠原蛋白α-螺旋單體，并且含有其所包覆的軟骨細(xì)胞所合成的II型膠原蛋白?；|(zhì)包覆的軟骨細(xì)胞包括基質(zhì)內(nèi)部與附著于基質(zhì)表面的軟骨細(xì)胞。
本發(fā)明提供了可用于有效地制造低免疫原性的軟骨植入物的方法。本發(fā)明一些實(shí)施方案的細(xì)節(jié)將在下述說(shuō)明書中進(jìn)行闡明。本發(fā)明的其他特征、目的與優(yōu)勢(shì)可由本說(shuō)明書與權(quán)利要求書而得知。
具體實(shí)施例方式
的描述本發(fā)明的特征為制造軟骨植入物的方法。具體而言，是將軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞包覆于含有任意重繞的I型膠原蛋白的α-螺旋單體的三維結(jié)構(gòu)基材中，此細(xì)胞-膠原蛋白構(gòu)建體可在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)成軟骨植入物。
基材可以僅包含I型膠原蛋白，或同時(shí)包含I型膠原蛋白與II型膠原蛋白。I型膠原蛋白為本發(fā)明的軟骨植入物提供結(jié)構(gòu)上的支撐。I型膠原蛋白是骨胳、皮膚以及肌腱的基本組成成分，也是成熟瘢痕(cicatrix)，即疤痕(scar)，中的主要膠原蛋白類型。I型膠原蛋白可從肌腱組織中提取并純化(Lai，美國(guó)專利No.5,876,444，1999年)。II型膠原蛋白則是軟骨的主要膠原蛋白類型，II型膠原蛋白可以幫助保持軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞的增殖與分化能力，II型膠原蛋白可以按如下所述由軟骨組織中提取并純化。
本發(fā)明之方法中，I型膠原蛋白與II型膠原蛋白的α-螺旋單體在基材中任意重繞。由此基材中所包覆并生長(zhǎng)的軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞所形成的軟骨植入物具有出乎意外的低免疫原性。任意重繞的I型膠原蛋白或II型膠原蛋白的α-螺旋單體可按如下所述的方法制備(1)將I型或II型膠原蛋白溶解于酸性溶液以解開其三股螺旋結(jié)構(gòu)，并且利用蛋白酶部分消化；以及(2)使解開的I型或II型膠原蛋白的α-螺旋單體任意重新纏繞，參見美國(guó)專利No.5,876,444號(hào)。當(dāng)制備含有I型或II型膠原蛋白之基材時(shí)，II型與I型的比值優(yōu)選地介于重量比1∶1～1∶2(例如1∶1.2，1∶1.5與1∶1.7)的范圍間。當(dāng)解開的I型或II型膠原蛋白的α-螺旋單體混合時(shí)，I型膠原蛋白單體可與II型膠原蛋白單體一起纏繞形成雜合寡聚物(hybridoligomers)。
軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞可分別從關(guān)節(jié)軟骨與骨髓中分離出來(lái)，細(xì)胞培養(yǎng)至接近匯合(subconfluence)，然后種植于前述之基材中。使用的細(xì)胞數(shù)量與基材量可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)或依照下述實(shí)施例來(lái)確定。將此細(xì)胞基材構(gòu)建體置于培養(yǎng)基中使其生長(zhǎng)，若使用間葉干細(xì)胞來(lái)制造軟骨植入物，則培養(yǎng)基內(nèi)應(yīng)加入分化因子(例如IL-1與地塞米松)以誘導(dǎo)間葉干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞。此構(gòu)建體系可培養(yǎng)于一旋轉(zhuǎn)震蕩的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。出乎意外的是，此構(gòu)建體置于旋轉(zhuǎn)震蕩的培養(yǎng)瓶中較置于靜態(tài)培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)迅速得多。軟骨植入物的形成需要數(shù)周。軟骨植入物可放置于一密封、無(wú)菌的含有組織培養(yǎng)基的箱子內(nèi)，于室溫中保存數(shù)天，再運(yùn)送、塑型以及植入患者身上。當(dāng)軟骨植入物運(yùn)送至患者處但不會(huì)立即使用時(shí)，可繼續(xù)于前述環(huán)境下儲(chǔ)存數(shù)天。
本發(fā)明的特征還包含根據(jù)前述方法所制得的軟骨植入物。即使此軟骨植入物是利用不同動(dòng)物來(lái)源的軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞、I型膠原蛋白與II型膠原蛋白所制備的，此軟骨植入物用于修復(fù)軟骨缺損時(shí)(例如動(dòng)關(guān)節(jié)(diarthrotic joints)以及椎間盤)，仍具有低免疫原性，例如由兔子關(guān)節(jié)軟骨所分離出的軟骨細(xì)胞，可與由大鼠尾巴所分離出的I型膠原蛋白以及兔子軟骨的II型膠原蛋白互相混合以產(chǎn)生軟骨植入物。出乎意外地，此植入物可用來(lái)修復(fù)兔子膝關(guān)節(jié)的軟骨缺損。
以下實(shí)施例僅供說(shuō)明，而非以任何方式限制本發(fā)明所公開之范疇，相信不需進(jìn)一步闡述，本領(lǐng)域技術(shù)人員均能依據(jù)本文之描述充分實(shí)施本發(fā)明，本文中所引用的著作均以全文引入作為參考。軟骨植入物的制備(1)I型膠原蛋白的提取與純化I型膠原蛋白提取與純化自新西蘭白兔的肌腱或大鼠尾巴的肌腱(Lai，美國(guó)專利No.5,876,444，1999年)，將肌腱解剖、切片，以及用冷的蒸餾水清洗數(shù)次以去除血漿蛋白，之后用0.5M NaCl于50mMTris-HCl、pH7.4提取，于4℃持續(xù)攪拌隔夜，抽出上清液，利用冷的蒸餾水清洗剩余物數(shù)次以去除鹽分，之后于0.5M HOAc、pH2.5中于4℃培養(yǎng)隔夜以獲得水相提取物，加入鹽溶液(0.9M NaCl)使提取物沉淀，將沉淀物以13,000 rpm離心30分鐘后，以0.05M HOAc溶解以獲得含有膠原蛋白的溶液。于24小時(shí)至48小時(shí)期間內(nèi)分別在含有膠原蛋白的溶液中加入兩次另一種鹽溶液(0.02M Na2HPO4)以得到沉淀，將沉淀物離心后以50mM HOAc溶解，如此可得到另一種含有膠原蛋白的溶液，將其以5mM HOAc透析并且冷凍干燥。
(2)II型膠原蛋白之提取與純化II型膠原蛋白的制備依據(jù)改良的Miller方法(Methods Enzymol.8233-64)。將兔子軟骨切片并用0.5M NaCl與20mM EDTA于0.05M的Tris緩沖液(pH7.4)清洗，用4M鹽酸胍移除糖蛋白后，用0.5M醋酸與1mg/ml胃蛋白酶溶解提取物。加入0.9M NaCl以沉淀膠原蛋白，用70％酒精清洗數(shù)次以充分去除酸與鹽分，之后溶于1M NaCl與0.05M Tris緩沖液(pH7.4)。增加NaCl到3.5M以獲得沉淀，將上清液移去，加入4.5M NaCl以沉淀II型膠原蛋白，將沉淀物用70％酒精清洗數(shù)次后，再次溶解于10mM之醋酸到最終濃度為2～4mg/ml。
(3)分離與培養(yǎng)軟骨細(xì)胞由新生的新西蘭白兔之關(guān)節(jié)軟骨分離出軟骨細(xì)胞(Lai，DoctoralThesis of Medical Sciences，F(xiàn)aculty of Medicine，Harvard University，1993)，將組織切片隔夜培養(yǎng)于含有1mg/ml透明質(zhì)酸酶與1mg/ml膠原蛋白酶的Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)中。離心后，用含有10％胎牛血清(FBS)、50μg/ml硫酸慶大霉素、100單位/ml的青霉素G鈉、100μg/ml硫酸鏈霉素and 0.25μg/ml二性霉素B的DMEM重新溶解細(xì)胞沉淀物。每10厘米培養(yǎng)皿接種5×105個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5％二氧化碳濃度之培養(yǎng)箱，每隔3到4天換一次培養(yǎng)基，并讓細(xì)胞生長(zhǎng)至接近匯合。
(4)制備軟骨植入物I型與II型膠原蛋白均用伽瑪射線滅菌并分別溶于5mM HOAc，膠原蛋白系用胃蛋白酶部分消化以移去端肽(參見例如美國(guó)專利No.5,876,444)。將含有I型膠原蛋白之溶液與含有II型膠原蛋白之溶液溫和混合均勻，視需要將溶液加熱至30～40℃以助混合，II型與I型膠原蛋白的重量比為1∶1～1∶2之間。
取(1-10)×106個(gè)軟骨細(xì)胞1毫升與另外含有2～4mg/ml I型與II型膠原蛋白的溶液1毫升互相混合。軟骨細(xì)胞分別接種于24個(gè)兔子基材(即，基材內(nèi)含有兔子的I型膠原蛋白與兔子的II型膠原蛋白)與24個(gè)大鼠基材(即，基材內(nèi)含有大鼠的I型膠原蛋白與兔子的II型膠原蛋白)，將混合物置于6孔或24孔的培養(yǎng)盤直到形成聚合物。將軟骨細(xì)胞-膠原蛋白之構(gòu)建體繼續(xù)培養(yǎng)于含有特定養(yǎng)份與藥物的DMEM中，特定養(yǎng)分包括10～20％的胎牛血清、HAM’s F-12K、0.3～0.5mM脯氨酸、50～70mg/L維生素C，特定藥物包括50μg/ml硫酸慶大霉素、100單位/毫升的青霉素G鈉、100μg/ml硫酸鏈霉素以及0.25μg/ml二性霉素B，培養(yǎng)于37℃、5％二氧化碳濃度之培養(yǎng)箱。
首先將軟骨細(xì)胞-膠原蛋白構(gòu)建體于靜置狀態(tài)下在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3～5天后，將其中一半，即12個(gè)軟骨細(xì)胞-兔子基材構(gòu)建體與12個(gè)軟骨細(xì)胞-大鼠基材構(gòu)建體，移至培養(yǎng)瓶中以8-16rpm旋轉(zhuǎn)并加一定程度的震蕩，另一半則繼續(xù)留在靜置的培養(yǎng)瓶中。每2～4天更換一次培養(yǎng)基，軟骨細(xì)胞-膠原蛋白構(gòu)建體在2至4個(gè)星期后逐漸形成軟骨植入物。
將4個(gè)軟骨細(xì)胞-膠原蛋白構(gòu)建體，即1個(gè)在靜置培養(yǎng)瓶中的軟骨細(xì)胞-兔子基材構(gòu)建體、1個(gè)在靜置培養(yǎng)瓶中的軟骨細(xì)胞-大鼠基材構(gòu)建體、1個(gè)在旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)瓶中的軟骨細(xì)胞-兔子基材構(gòu)建體，以及1個(gè)在旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)瓶中的軟骨細(xì)胞-大鼠基材構(gòu)建體，于1，2，3，4周移出。將這些構(gòu)建體大致檢查后用10％福爾馬林固定，包埋于石臘中并以厚度為5-10微米(Sacura Sledge microtome)切片。組織切片利用蘇木精/伊紅染色，并觀察成軟骨性分化(chondrogenicdifferentiation)。
(5)免疫組織化學(xué)分析組織切片與第一抗體(抗II型膠原蛋白及抗硫酸軟骨素)或與對(duì)照組的空白血清共同孵育。II型膠原蛋白為細(xì)胞外基質(zhì)的軟骨特異性成分，硫酸軟骨素則為軟骨蛋白多糖的主要成分。此抗原-第一抗體復(fù)合物進(jìn)一步與辣根過氧化物酶綴合的第二抗體共同孵育，II型膠原蛋白與硫酸軟骨素的含量則通過測(cè)定與3，3’二氨基聯(lián)苯胺(DAB)形成第三抗原-抗體復(fù)合物后顯色以判定。
表1概括描述了組織化學(xué)結(jié)果。表1軟骨細(xì)胞-膠原蛋白構(gòu)建體的軟骨生成

出乎意外地，在旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)瓶的軟骨細(xì)胞-大鼠基材構(gòu)建體在第一周呈現(xiàn)少許的軟骨生成，而在兩周后呈現(xiàn)肥厚的軟骨生成。在旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)瓶的軟骨細(xì)胞-兔子基材構(gòu)建體與在靜置培養(yǎng)瓶的軟骨細(xì)胞-大鼠基材構(gòu)建體在兩周內(nèi)呈現(xiàn)少許的軟骨生成，而在三周后呈現(xiàn)肥厚的軟骨生成。至于在靜置培養(yǎng)瓶的軟骨細(xì)胞-兔子基材構(gòu)建體則在三周后仍未呈現(xiàn)軟骨生成的現(xiàn)象，不過在第四周則有少許肥厚的軟骨生成。
一般而言，相對(duì)于靜置培養(yǎng)，在旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)瓶的構(gòu)建體有較多的腔隙(lacunae)形成于軟骨細(xì)胞的周圍，所有類型的軟骨細(xì)胞-膠原蛋白構(gòu)建體多數(shù)均能在四星期內(nèi)形成近似軟骨的外觀。免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示所有的肥厚的軟骨細(xì)胞-膠原蛋白構(gòu)建體均含有II型膠原蛋白與硫酸軟骨素。軟骨修復(fù)(1)軟骨缺損與植入術(shù)本實(shí)驗(yàn)使用36只雄性新西蘭白兔，每只體重約為2.5公斤，平均年齡為4個(gè)月大。對(duì)兔子肌肉注射一氯胺酮(100毫克/毫升，0.65毫升/公斤體重)與甲苯噻嗪(20毫克/毫升，0.30毫升/公斤體重)的混合物使其麻醉昏迷，先剔除接近膝蓋部位的皮膚上的毛發(fā)，之后用碘酊清洗，利用髕骨內(nèi)側(cè)法(parapatellar medial method)以接近膝關(guān)節(jié)，將髕骨分離并使用4毫米鉆孔機(jī)將關(guān)節(jié)軟骨鉆孔，形成一個(gè)4毫米的圓形深層缺損，于股骨內(nèi)髁形成一孔洞，此圓錐形缺損深度為4毫米，并且延伸進(jìn)入骨髓腔的海綿骨。為避免產(chǎn)生干擾效應(yīng)(confounder effect)，一半的兔子在右膝關(guān)節(jié)產(chǎn)生缺損，另一半的兔子則在左膝關(guān)節(jié)產(chǎn)生缺損。
利用上述之軟骨植入物修復(fù)缺損，其中12只兔子以軟骨細(xì)胞-兔子基材(CRBTCM)處理，另外12只兔子以軟骨細(xì)胞-大鼠基材(CRTTCM)處理，至于剩下的12只兔子，則作為手術(shù)對(duì)照組不以任何植入物處理，未實(shí)施手術(shù)的膝關(guān)節(jié)則視為完整的膝關(guān)節(jié)對(duì)照組。
在手術(shù)后1、2或3周觀察軟骨修復(fù)狀態(tài)，每次犧牲每組三只兔子，膝蓋關(guān)節(jié)系整塊移除并且于顯微鏡下觀察，股骨的末端用福爾馬林固定、脫鈣，并在垂直于缺損處的方向作矢狀切面解剖，從缺損處的中央切取切片，之后將標(biāo)本用蘇木精/伊紅染色并于顯微鏡下觀察。
(2)顯微鏡觀察正常關(guān)節(jié)軟骨呈現(xiàn)半透明的白色與淺黃色的外觀，覆蓋股骨髁的關(guān)節(jié)末端，未進(jìn)行植入術(shù)的手術(shù)所形成的缺損成凹陷狀，于第四周時(shí)由亮白色的組織填充，缺損的邊界可以明顯的區(qū)分出來(lái)，在第12周時(shí)，缺損的表面成為不規(guī)則形并呈現(xiàn)纖維化現(xiàn)象。
出乎意料地，CRBTCM與CRTTCM組中，手術(shù)處理的膝蓋均未發(fā)現(xiàn)任何骨關(guān)節(jié)炎，例如骨刺、軟骨侵蝕、關(guān)節(jié)囊膜增生等的跡象。手術(shù)后4周缺損部位由白色不透明的組織填充，于12周后兩組均呈現(xiàn)類似軟骨的組織覆蓋于手術(shù)部位，修補(bǔ)的組織外觀呈半透明而且邊緣與健康的組織形成一體。
(3)組織學(xué)手術(shù)對(duì)照組一個(gè)月后發(fā)現(xiàn)在傷處與臨近區(qū)域的軟骨呈現(xiàn)輕微退化、纖維化與片段化之現(xiàn)象，缺損處由成纖維細(xì)胞結(jié)合稀疏的內(nèi)生成軟骨細(xì)胞來(lái)修復(fù)。2個(gè)月后，在傷處與臨近區(qū)域的軟骨呈現(xiàn)中度至重度的軟骨退化、纖維化與片段化之現(xiàn)象，缺損處由成纖維細(xì)胞結(jié)合部分內(nèi)生的成軟骨細(xì)胞來(lái)修復(fù)。三個(gè)月后將缺損的軟骨下骨剝除，并且以纖維組織覆蓋。
CRBTCM與CRTTCM組在一個(gè)月后，缺損處意外地大多以成軟骨細(xì)胞填充，軟骨細(xì)胞的形態(tài)從圓形到多角形不等，成軟骨細(xì)胞穿透到軟骨下骨層。兩組均發(fā)現(xiàn)在植入處底部有輕微的炎癥反應(yīng)。
兩個(gè)月后，相對(duì)于第一個(gè)月有更多纖維軟骨產(chǎn)生，并且，在CRTTCM組比CRBTCM組發(fā)現(xiàn)有更多的纖維軟骨。此外，在CRTTCM組發(fā)現(xiàn)于植入處有中度炎癥反應(yīng)，然而在CRBTCM組的植入處只有輕微的炎癥反應(yīng)。
在3個(gè)月后，于CRTTCM組與CRBTCM組的缺損處均被類似的纖維狀軟骨修復(fù)，并且軟骨植入物與周圍的正常軟骨組織相比較薄。在缺損的邊緣，軟骨植入物與周圍的健康組織形成一體，兩組均未發(fā)現(xiàn)有炎癥反應(yīng)。
其它實(shí)施方案本說(shuō)明書中描述的所有特征可以任何方式相互組合。本說(shuō)明書中的每一種特征可以由達(dá)到相同的、相等的或相似的目的之另一種特征取代。因此，除非另有說(shuō)明，每一個(gè)描述的特征僅僅是這一類相當(dāng)?shù)幕蛳嗨频南盗刑卣鞯囊粋€(gè)實(shí)施例。
根據(jù)上文詳述，本領(lǐng)域人員能夠輕易了解本發(fā)明的基本特征，并且在不脫離本發(fā)明的主旨和范疇前提下對(duì)本發(fā)明做出各種變動(dòng)和修改使其適用于各種用途和條件。所以，其它實(shí)施方案也屬于下述權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種軟骨植入物的制造方法，其包括將軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞植入含有任意重繞的I型膠原蛋白的α-螺旋單體的三維結(jié)構(gòu)基材中；及于所述基材中生長(zhǎng)軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞；由此制得軟骨植入物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的基材進(jìn)一步含有任意重繞的II型膠原蛋白的α-螺旋單體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中的II型膠原蛋白被部分消化。
4.權(quán)利要求3的方法，其中的I型膠原蛋白被部分消化。
5.權(quán)利要求2的方法，其中的I型膠原蛋白被部分消化。
6.權(quán)利要求2的方法，其中軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞、I型膠原蛋白與II型膠原蛋白是從二種或三種不同的動(dòng)物來(lái)源而制備的。
7.權(quán)利要求2的方法，其中軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞與基材被置于一旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中的I型膠原蛋白被部分消化。
9.權(quán)利要求1的方法，其中的軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞與I型膠原蛋白是從不同的動(dòng)物來(lái)源而制備的。
10.權(quán)利要求1的方法，其中的軟骨細(xì)胞或間葉干細(xì)胞與基材被置于一旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
11.一種軟骨植入物的制造方法，其包括將軟骨細(xì)胞植入含有任意重繞的I型膠原蛋白的α-螺旋單體的三維結(jié)構(gòu)基材中；及于所述基材中生長(zhǎng)軟骨細(xì)胞；由此制得軟骨植入物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中的基材可進(jìn)一步含有任意重繞的II型膠原蛋白的α-螺旋單體。
13.權(quán)利要求12的方法，其中II型膠原蛋白被部分消化。
14.權(quán)利要求13的方法，其中I型膠原蛋白被部分消化。
15.權(quán)利要求12的方法，其中I型膠原蛋白被部分消化。
16.一種軟骨植入物，其包括軟骨細(xì)胞；及三維基質(zhì)，所述基材含有任意重繞的II型膠原蛋白的α-螺旋單體；其中的軟骨細(xì)胞被植入所述基質(zhì)內(nèi)。
17.權(quán)利要求16的軟骨植入物，其中的基質(zhì)可進(jìn)一步含有任意重繞的II型膠原蛋白的α-螺旋單體。
18.權(quán)利要求17的軟骨植入物，其中的II型膠原蛋白被部分消化。
19.權(quán)利要求18的軟骨植入物，其中的I型膠原蛋白被部分消化。
20.權(quán)利要求17的軟骨植入物，其中的I型膠原蛋白被部分消化。
21.權(quán)利要求17的軟骨植入物，其中的軟骨細(xì)胞、I型膠原蛋白與II型膠原蛋白是從兩種到三種不同的動(dòng)物來(lái)源而制備的。
22.權(quán)利要求16的軟骨植入物，其中的I型膠原蛋白被部分消化。
23.權(quán)利要求22的軟骨植入物，其中的軟骨細(xì)胞與I型膠原蛋白是從不同的動(dòng)物來(lái)源而制備的。
24.權(quán)利要求16的軟骨植入物，其中的軟骨細(xì)胞與I型膠原蛋白是從不同的動(dòng)物來(lái)源而制備的。
全文摘要
一種制造軟骨植入物的方法，包括將軟骨細(xì)胞與間葉干細(xì)胞植入三維結(jié)構(gòu)的基材并使所述細(xì)胞在其中生長(zhǎng)，此基材含有任意重繞的I型膠原蛋白的α－螺旋單體。
文檔編號(hào)A61L27/38GK1443576SQ0310427
公開日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2003年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月11日
發(fā)明者賴文福, 湯家潤(rùn), 陳建志 申請(qǐng)人:臺(tái)北生物科技股份有限公司