專利名稱：生物活性物質(zhì),制備生物活性物質(zhì)的方法及其使用方法
背景本發(fā)明涉及骨骼和組織修復(fù)領(lǐng)域，特別涉及用于骨骼和組織修復(fù)的物質(zhì)，制備該物質(zhì)的方法及使用該物質(zhì)的方法。
損傷后的骨骼和其他組織的置換和修復(fù)通常需要進(jìn)行外科手術(shù)程序。在美國和歐洲每年有多于300,000例髖關(guān)節(jié)假體被移植。另外，10％的人遭受牙周疾病，30％的人在他/她一生中需要牙移植。其他外科手術(shù)程序包括軟骨修復(fù)和軟組織整形手術(shù)。因此非常需要制造一種用于組織修復(fù)或重建的支架物質(zhì)，特別是可省略許多導(dǎo)入過程的需要的可注射物質(zhì)。這種物質(zhì)應(yīng)該是生物兼容的，即，沒有細(xì)胞毒性或在機(jī)體內(nèi)引起不利反應(yīng)，優(yōu)選地是具有生物活性的，即，提供動(dòng)員組織構(gòu)建所需的細(xì)胞活性必需的發(fā)育信號(hào)。另外優(yōu)選地它們是可再吸收的，和能夠經(jīng)受住修復(fù)過程中由日常活動(dòng)所施加的壓力。
對(duì)于用于組織修復(fù)的支架已建議有幾種不同的方法。目前可用于硬組織修復(fù)的物質(zhì)，例如脫礦質(zhì)骨，羥基磷灰石，磷酸三鈣和其他無機(jī)物質(zhì)與生物衍生的具有生物活性的支架不是一樣有效。如在美國專利號(hào)5,939,323中公開的已將透明質(zhì)酸用作支架物質(zhì)。另一種方法是如在美國專利號(hào)4,490,984和美國專利號(hào)5,480,644中公開的已使用基于膠原的物質(zhì)。但是，由于其較差的機(jī)械性能，難以預(yù)測(cè)的降解速率，和對(duì)膠原來說，其免疫原性反應(yīng)的危險(xiǎn)及潛在污染的危險(xiǎn)使得這些物質(zhì)潛在的用途和應(yīng)用范圍中受到限制。
膜，薄膜和含有絲心蛋白(蠶絲的一種蛋白成分)的織物，已被建議作為動(dòng)物組織和器官生長的基質(zhì)物質(zhì)。特別地，PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 01/25403描述了從水溶液中形成絲心蛋白膜模型(cast)。這些膜在加入生長培養(yǎng)基和各種細(xì)胞類型的容器中進(jìn)行模塑，絲心蛋白膜可支持細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞，上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的生長。絲心蛋白膜和薄膜也由Tsukada等在Journal of Polymer SciencePart BPolymer Physics 32961-968，1994；及由Motta等“Third International Symposium on Frontiers inBiomedical Polymers Including Polymer Therapeutics From Laboratoryto Clinical Practice”，摘要，Shigha，日本，1999年5月公開。PCT申請(qǐng)WO 02/29141描述了通過用甲酸處理絲心蛋白繭而制備絲心蛋白非機(jī)織織物。該絲心蛋白非機(jī)織織物可用于培養(yǎng)細(xì)胞，如角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。在體內(nèi)使用這種絲心蛋白膜，薄膜或非機(jī)織織物作為用于組織修復(fù)的支架的一個(gè)缺陷是為了將這些物質(zhì)放在待重建部位需要導(dǎo)入性外科手術(shù)程序。
因此，迫切需要一種用于體外和體內(nèi)的生物活性支架物質(zhì)，特別是生物兼容的，具有生物活性的，可再吸收的物質(zhì)。進(jìn)一步需要一種易于應(yīng)用到待重建部位的具有生物活性的支架物質(zhì)，優(yōu)選地不需要導(dǎo)入性外科手術(shù)程序。
發(fā)明概述以上所討論的和現(xiàn)有技術(shù)的其他缺陷和不足通過含有絲心蛋白溶液或混懸液的組合物來克服或減低。絲心蛋白溶液和混懸液是生物兼容的，具有生物活性，而且是可再吸收的。其中一個(gè)特別有利的特征是絲心蛋白溶液或混懸液可通過注射施用于所需部位，這將利用導(dǎo)入性外科手術(shù)程序的降到最小。
還公開了一種制備絲心蛋白混懸液的方法，其包含將絲心蛋白溶液從約-20℃加熱到約50℃，從而得到絲心蛋白混懸液。另一種制備絲心蛋白混懸液的方法包含用有效制備絲心蛋白混懸液的試劑處理絲心蛋白溶液。有效試劑包含酸，醇，蛋白水解酶，可生物兼容的聚合物，或包含前述試劑的至少一種或多種的組合。
還公開了一種組織構(gòu)建方法，其包含對(duì)待構(gòu)建部位給藥有效量的絲心蛋白溶液或混懸液以刺激細(xì)胞增殖，優(yōu)選組織生長。優(yōu)選地通過注射進(jìn)行給藥。本領(lǐng)域中熟練人員可通過以下詳細(xì)描述和附圖理解上述討論的和其他特征和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡述目前參照示范圖，其中在幾個(gè)附圖中的相同元素所用的標(biāo)號(hào)相同


圖1是組織修復(fù)過程中多組分支架的示意圖。
圖2是通過向絲心蛋白—水溶液中加入檸檬酸水溶液而制備的絲心蛋白混懸液的環(huán)境掃描電鏡顯微照片。
圖3是通過向絲心蛋白—水溶液中加入甘油而制備的絲心蛋白混懸液的環(huán)境掃描電鏡顯微照片。
圖4是在室溫下干燥組合物后，絲心蛋白組合物混懸液的光學(xué)顯微照片，該絲心蛋白組合物混懸液包含植入到絲心蛋白基質(zhì)中的羥基磷灰石/(聚)交酯核/殼顆粒。
圖5是在室溫下干燥組合物后，絲心蛋白組合物混懸液在更高放大倍數(shù)下的光學(xué)顯微照片，該絲心蛋白組合物混懸液包含植入到絲心蛋白基質(zhì)中的羥基磷灰石/(聚)交酯核/殼顆粒。
圖6是在冷凍干燥組合物后，絲心蛋白組合物混懸液的光學(xué)顯微照片，該絲心蛋白組合物混懸液包含植入到絲心蛋白基質(zhì)中的羥基磷灰石/(聚)交酯核/殼顆粒。
圖7是在冷凍干燥組合物后，絲心蛋白組合物混懸液在更高放大倍數(shù)下的光學(xué)顯微照片，該絲心蛋白組合物混懸液包含植入到絲心蛋白基質(zhì)中的羥基磷灰石/(聚)交酯核/殼顆粒。
圖8是在兔腿節(jié)鉆孔并用可注射的絲心蛋白混懸液填充的腔中進(jìn)行移植一個(gè)月后(A)和用作對(duì)照的空腔(B)的組織學(xué)比較。
圖9是在第二只兔腿節(jié)鉆孔并用可注射的絲心蛋白混懸液填充的腔中移植一個(gè)月后(A)和用作對(duì)照的空腔(B)的組織學(xué)比較。
圖10所示的是舊骨骼和圖9中舉例說明的移植物的絲心蛋白混懸液填充的腔中形成的新骨骼的分界面。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述絲心蛋白是一種已知含有18種不同的氨基酸的組合的多肽，其中甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸和酪氨酸大約占多肽鏈的90％。一般認(rèn)為絲心蛋白由兩個(gè)主鏈組成，所述主鏈由二硫鍵連接并具有約為350,000道爾頓(H-鏈)和25,000道爾頓(L-鏈)的分子量。絲心蛋白的已有研究表明由絲心蛋白衍生的制造的產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和形態(tài)高度依賴于制備它們所使用的工藝條件。此處已經(jīng)有利地發(fā)現(xiàn)可通過使用各種技術(shù)從絲心蛋白溶液產(chǎn)生新型的絲心蛋白混懸液，而且如此產(chǎn)生的絲心蛋白混懸液可用于組織構(gòu)建，包括在機(jī)體的正常部位(例如，未損傷的部位)和由于例如損傷或衰老而需要修復(fù)和/或重建的部位形成組織。此處所用的“絲心蛋白溶液”是指實(shí)質(zhì)上具有一個(gè)相的組合物，也就是說，組合物包含一種可充分溶解絲心蛋白的溶劑。當(dāng)重量比大于95％，優(yōu)選地大于98％，最優(yōu)選地大于99％的絲心蛋白在溶液中時(shí)，則表明絲心蛋白充分溶解。另外，此處所用的“絲心蛋白混懸液”是指具有兩相或多相(即，多相物質(zhì))的組合物，其中至少一個(gè)相包含一種溶劑，而且至少一個(gè)相包含絲心蛋白。沒有所依據(jù)的理論，絲心蛋白混懸液可以各種形式存在，例如，膠體，乳液，微團(tuán)，溶膠或凝膠的形式。
為了描述此處的絲心蛋白混懸液，參考使用了“絲心蛋白包含體(fibroin occlusions)”，“絲心蛋白凝膠”“絲心蛋白乳膏”和“絲心蛋白糊”，它們以易觀察到的物理特性如表觀粘度和相對(duì)粘度為特征?！敖z心蛋白包含體”是指在水平表面可流動(dòng)的絲心蛋白混懸液。包含體通常是混濁的，即表現(xiàn)出一定的不透明性。在水平表面上可以流動(dòng)，表示當(dāng)在水平表面沉淀時(shí)，1立方厘米的混懸液樣品基本上立即變形。由于沒有所依據(jù)的理論，包含體可以膠體，特別是溶膠形式存在，其在溶劑的連續(xù)相中包含尺寸為10-9-10-6米的固體顆粒分散體。
此處所用的“絲心蛋白凝膠”是指具有類似凝膠物理性質(zhì)，例如可塑性，彈性或一定程度的剛性的絲心蛋白混懸液。根據(jù)制備凝膠的方法，凝膠可以是不透明或(半)透明的。與包含體形成對(duì)比，當(dāng)放置在水平表面上時(shí)，凝膠不容易流動(dòng)。但是，當(dāng)施加熱或機(jī)械壓力，例如壓力時(shí)，即，當(dāng)凝膠是可逆時(shí)，凝膠可以流動(dòng)或變形。沒有所依據(jù)的理論，絲心蛋白凝膠可包含分散在溶劑中的三維網(wǎng)絡(luò)的絲心蛋白。
此處所用的“絲心蛋白乳膏”是指比絲心蛋白包含體更粘稠的絲心蛋白混懸液。它通常是白色的，而且其在水平表面上實(shí)質(zhì)上是非流動(dòng)性的。在水平表面上實(shí)質(zhì)性非流動(dòng)，它表示在水平面沉淀1分鐘內(nèi)，1立方厘米的絲心蛋白乳膏樣品未明顯地變形。和絲心蛋白凝膠一樣，當(dāng)對(duì)該物質(zhì)施加熱或機(jī)械壓力時(shí)絲心蛋白乳膏可變形。
此處所用的“絲心蛋白糊”是指粘度很高，當(dāng)放在水平表面山時(shí)不流動(dòng)的絲心蛋白混懸液。在水平表面上不流動(dòng)，它表示在水平表面上沉淀1小時(shí)內(nèi)1立方厘米的絲心蛋白糊樣品將未明顯變形。但在機(jī)械壓力下該糊是可以變形的。
備選地，可根據(jù)通過特定尺寸的孔隙(即針頭的孔隙)該混懸液的可注射能力來描述各種類型的絲心蛋白混懸液。絲心蛋白包含體或凝膠可用手通過小針孔，例如直徑約為584微米的20-規(guī)格的注射針頭很容易地進(jìn)行注射。絲心蛋白乳膏粘度更大，因此可用手通過更大的針孔，例如直徑約為838微米的18-規(guī)格的注射針頭很容易地進(jìn)行注射。糊不容易用手進(jìn)行注射，除非用很大孔的注射針頭，即直徑大于約2毫米的那些?？梢岳斫鈱⒔z心蛋白混懸液分為包含體(occlusion)，凝膠，乳膏或糊只是為了方便描述使用絲心蛋白混懸液。
絲心蛋白混懸液可在體外或體內(nèi)制備。體外制備絲心蛋白混懸液可包含用有效制備混懸液的試劑，例如熱，蛋白酶，酸，醇或可生物兼容的聚合物處理絲心蛋白溶液。備選地，可向動(dòng)物注射或另外給藥絲心蛋白溶液而在體內(nèi)制備絲心蛋白混懸液。沒有所依據(jù)的理論，認(rèn)為當(dāng)對(duì)動(dòng)物機(jī)體中的一個(gè)部位給藥后，絲心蛋白溶液可以很快地消耗多余水分，從而產(chǎn)生混懸液，為例如凝膠形式。絲心蛋白混懸液也可以在體內(nèi)改變形式。例如，絲心蛋白包含體在體內(nèi)給藥動(dòng)物機(jī)體的一個(gè)部位后，可以轉(zhuǎn)變形成絲心蛋白凝膠。
絲心蛋白的便利來源是來自于家蠶(Bombyx mori)的繭，其含有絲心蛋白和絲膠蛋白。絲是由蜘蛛和不同的昆蟲，其中眾所周知的是蠶(特別是家蠶)所產(chǎn)生的纖維狀蛋白。絲纖維已用作縫合線，但已發(fā)現(xiàn)編織的絲縫合線經(jīng)常產(chǎn)生非免疫性的異物反應(yīng)，甚至在手術(shù)多年后引發(fā)肉芽瘤(Kurosaki等，Nippon Ika Daigaku Zasshi 6641-44，1999)。然而，已證實(shí)觀察到的非免疫性的異物反應(yīng)是由天然絲中存在絲膠蛋白產(chǎn)生的，純的絲心蛋白不引發(fā)免疫反應(yīng)。
優(yōu)選地，將絲心蛋白進(jìn)行純化以除去毒素或其他物質(zhì)如可在機(jī)體中引起不利反應(yīng)的絲膠蛋白。大部分的絲膠蛋白可通過例如脫膠，即在98℃，存在或不存在十二烷基磺酸鈉的情況下在碳酸鈉中洗滌而除去。
然后將純化的絲心蛋白溶解于溶劑中，例如每單位體積含有約10％重量的絲心蛋白的溴化鋰水溶液。絲心蛋白溶液可以任選地包含其他組分，例如緩沖劑(buffers)和其他不顯著影響絲心蛋白結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的添加劑。絲心蛋白可進(jìn)一步被純化，優(yōu)選地大于約90％，更優(yōu)選地大于約95％，最優(yōu)選地大于約99％重量。溴化鋰通過用蒸餾水透析而除去，其他雜質(zhì)可通過過濾除去。純化后，可將絲心蛋白進(jìn)行冷凍干燥，得到粉末并存貯。然后通過用熱，蛋白酶，酸，醇或可生物兼容的聚合物處理從純化的絲心蛋白溶液而制備絲心蛋白混懸液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過對(duì)絲心蛋白溶液進(jìn)行熱處理可產(chǎn)生絲心蛋白混懸液。例如，為了生產(chǎn)凝膠，將絲心蛋白溶液在約-20℃保持約2到約24小時(shí)，然后加熱到約40℃到50℃。改變熱處理的條件可產(chǎn)生上述各種性質(zhì)的混懸液，這可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)特定施用進(jìn)行選擇。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過用在特定氨基酸之間進(jìn)行特異切割的蛋白酶處理絲心蛋白溶液可產(chǎn)生絲心蛋白混懸液。這類蛋白酶包括但不限定于來源于灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)的蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰凝乳蛋白酶等。不受理論的束縛，假定蛋白酶處理可通過降低絲心蛋白聚合物的平均分子量而產(chǎn)生混懸液?？蛇x擇特定的氨基酸序列以產(chǎn)生具有所需分子量和氨基酸序列的片段。片段大小可被剪切，以滿足特定施用的特定要求，例如生物活性及絲心蛋白物質(zhì)的降解速率。特定平均分子量的選擇依賴于多種因素，包括末端用途，所需粘度，其他成分的添加，分子量分配，載體類型等。蛋白酶處理后絲心蛋白的平均分子量約為200到約0.1千道爾頓(Kd)，優(yōu)選地約為50到約0.2Kd，更優(yōu)選地約為20到約0.5Kd。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過用酸處理絲心蛋白溶液而制備絲心蛋白混懸液。不受理論的束縛，認(rèn)為通過將絲心蛋白溶液的pH降到其等電點(diǎn)以下，則溶劑中的絲心蛋白溶混性將被降低，從而促進(jìn)混懸液的形成。酸是能夠?qū)⒔z心蛋白的pH降到其等電點(diǎn)pH3.8以下(即低于或約等于pH3.7)的酸。優(yōu)選的酸是檸檬酸，抗壞血酸，乳酸，前述酸的組合等。加入酸的量足以將溶液pH降到所需pH，這可被本領(lǐng)域中的技術(shù)人員容易地確定。
備選地，可用醇處理絲心蛋白溶液而制備絲心蛋白混懸液。不受理論的束縛，認(rèn)為醇可改變絲心蛋白的構(gòu)象，從而促進(jìn)混懸液的形成。優(yōu)選地醇可與溶劑混合，并且可以是例如甘油，乙二醇，乙醇，異丙醇及包含前述醇一種或幾種的混合物。優(yōu)選的醇是甘油。當(dāng)加入到絲心蛋白溶液中時(shí)，加入醇的量約為總體積的約10體積％到約50體積％。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過用一種或多種可生物兼容的多聚物，例如聚乙二醇，聚環(huán)氧乙烷，聚乙烯吡咯烷酮等與絲心蛋白溶液混合而制備更粘稠的絲心蛋白溶液。可生物兼容的聚合物應(yīng)以約2到約20％重量的量與絲心蛋白溶液混合。
可使用各種添加劑以改善絲心蛋白溶液和混懸液的功效，例如，具有生理活性例如診斷或治療活性的生理活性試劑。因此，活性試劑可包括用于在體內(nèi)檢測(cè)被釋放試劑位置的可檢測(cè)標(biāo)記(例如放射性標(biāo)記)。活性試劑也包括用于治療疾病或健康狀況的治療試劑。生理活性試劑包括，例如抗生素或其他抑制感染的化合物；治療骨質(zhì)疏松癥的治療試劑，其他作用于骨和骨架的因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)及其它刺激組織生長，骨再生或傷口愈合的細(xì)胞因子等。生理活性試劑也可以是細(xì)胞，例如取自患者的一個(gè)部位并在絲心蛋白混懸液中培養(yǎng)的細(xì)胞。
抗生素的例子包括四環(huán)素，氨基糖苷類，青霉素類，頭孢菌素類，磺胺類藥物，氯霉素琥珀酯鈉，紅霉素，萬古霉素，林可霉素，氯林肯霉素，制霉菌素，兩性霉素B，金剛胺(amantidine)，皰疹凈，對(duì)-氨基水楊酸，異煙肼，利福平，放線菌素D(antinomycin D)，光輝霉素，柔紅霉素，氯已定(chlorexidine)，阿霉素，博來霉素，長春堿，長春新堿，甲基芐肼，咪唑羧基酰胺(imidazole carboxamide)等。
示例性治療骨質(zhì)疏松癥的治療試劑及其他作用于骨和骨架的因子的包括鈣，阿侖磷酸鈉(alendronate)，骨Gla肽，甲狀旁腺素及其活性片段，組蛋白H4-相關(guān)的骨形成和增殖肽及其突變體，衍生物和類似物。
示例性細(xì)胞因子包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGFs)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)，血小板衍生生長因子(PDGFs)，表皮生長因子(EGFs)，結(jié)締組織激活肽(CTAPs)，生骨因子(osteogenic factor)及這類生長因子的生物活性類似物，片段和衍生物。特別優(yōu)選的是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)超基因家族的成員，它們是多功能調(diào)節(jié)蛋白。TGF超基因家族成員包括β轉(zhuǎn)化生長因子(例如TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3)；骨形成蛋白(例如BMP-1，BMP-2，BMP-3，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-8，BMP-9)；肝素結(jié)合生長因子(例如成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，表皮生長因子(EGF)，血小板衍生生長因子(PDGF)，胰島素樣生長因子(IGF))；抑制素(例如抑制素A，抑制素B)；生長分化因子(例如GDF-1)；和活化素(活化素A，活化素B，活化素AB)。生長因子可分離自天然或自然來源，例如分離自哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或通過合成而制備，例如用重組DNA技術(shù)或通過各種化學(xué)過程來制備。另外，可以使用這些因子的類似物，片段或衍生物，只要它們表現(xiàn)出天然分子的至少某些生物活性。例如，這些類似物可通過表達(dá)通過位點(diǎn)特異的突變或其他遺傳工程技術(shù)改變的基因而進(jìn)行制備。
生理活性試劑也可以是分化或未分化的細(xì)胞。例如，可遞送間充質(zhì)干細(xì)胞到組織中，以產(chǎn)生與該組織相同類型的細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞是未分化的，因此由于存在活性劑或局部組織環(huán)境的作用(化學(xué)，物理等)，可分化形成各種類型的新細(xì)胞。分化的間充質(zhì)干細(xì)胞的例子包括成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。成骨細(xì)胞可被遞送到骨缺陷部位以產(chǎn)生新的骨；軟骨細(xì)胞可被遞送到軟骨缺陷部位以產(chǎn)生新的軟骨；成纖維細(xì)胞可被遞送到任何需要新的結(jié)締組織的部位以產(chǎn)生膠原蛋白；等。這些細(xì)胞或基因的來源可以是同種異體的或異源的。例如，細(xì)胞可以來自于不同于已被遺傳改變的宿主物種的一種物種。
生理活性試劑可簡單地加入到絲心蛋白溶液和混懸液中或與另一種成分共價(jià)連接。備選地，生理活性試劑可以以可控釋放的方式加入。一種可控釋放的制劑包含分散或以包封在緩慢降解的，無毒非抗原性的聚合物例如共聚(乳酸/乙醇酸)中，如Kent等在美國專利號(hào)4,675,189中所述。另一種緩慢釋放制劑對(duì)熟練工作人員來說是很顯然的。參見，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson編輯.，Marcel Dekker，Inc.，紐約，1978，和R.W.Baker，Controlled Release of Biologically Active Agents，John Wiley& Sons，紐約，1987。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，絲心蛋白溶液和混懸液可以包含影響諸如孔隙率和生物降解因素的設(shè)計(jì)大小和化學(xué)組成的有機(jī)，無機(jī)和/或蛋白包含體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲心蛋白溶液和/或混懸液可進(jìn)一步包含顆粒，例如可在凝膠中建立額外孔隙率的核/殼顆粒，從而在注射后形成支架。
能夠協(xié)助骨生長和形成的有機(jī)或無機(jī)顆粒的例子包括，例如羥基磷灰石，磷酸三鈣，海洋動(dòng)物衍生的顆粒，例如珊瑚和脫乙酰殼多糖等。
優(yōu)選的形成孔的顆粒是核/殼顆粒，其中無機(jī)核由可生物降解的有機(jī)殼包裹。這種顆粒可同時(shí)用作臨時(shí)支持結(jié)構(gòu)和定形支架的內(nèi)部基質(zhì)。殼的可控生物降解可對(duì)絲心蛋白支架提供額外的孔隙率。核/殼顆粒將在下面進(jìn)行詳細(xì)描述。
優(yōu)選的核是無機(jī)核。無機(jī)核的組成，大小和形狀可根據(jù)不同用途的需求進(jìn)行改變。例如，核可以是羥基磷灰石，磷酸三鈣或海洋動(dòng)物衍生的顆粒，例如珊瑚和脫乙酰殼多糖，從而協(xié)助骨生長。核的最大直徑可以從約1納米到約500微米，可以是球狀，板狀，纖維狀等。
在核上可任選放置一層反應(yīng)層，從而增強(qiáng)核與聚合物殼的附著作用。合適的反應(yīng)層依賴于核與殼的組成，并且在本領(lǐng)域中是已知的。特別有用的一類化合物包括反應(yīng)性的鈦酸鹽，鋯酸鹽和硅烷，例如，γ-環(huán)氧丙氧丙基三乙氧基硅。
殼可包含至少一種可生物降解的聚合物。一種或多種聚合物的組成和分子量可進(jìn)行選擇，從而達(dá)到以下所述的合適生物降解速率。殼的合適的可生物降解聚合物的組合物包含一個(gè)或多個(gè)聚乳酸，聚乙醇酸，聚已酸內(nèi)酯，聚碳酸三甲酯，聚二丙烯酸乙二醇酯類，聚酐類，聚原酸酯類，聚膦嗪(polyphosphazines)類，聚縮醛類，聚酯類，聚脲類，聚碳酸酯類，聚氨基甲酸酯類，聚α-羥酸類，聚酰胺類，聚氨基酸類和其他具有合適的生物降解速率且是可生物兼容的可生物降解聚合物或共聚物。
可生物降解的聚合物可以是預(yù)聚物或在核上沉積的時(shí)間進(jìn)行聚合?？缮锝到獾木酆衔飳涌捎帽绢I(lǐng)域中已知的方法，例如通過在稀釋的反應(yīng)單體或聚合物的有機(jī)溶劑中制備核顆粒漿，將其限制在反應(yīng)層或核本身。在一個(gè)實(shí)例方案中，殼的單體或聚合物可被化學(xué)修飾，從而包含末端基團(tuán)，例如在機(jī)體內(nèi)與細(xì)胞相互作用的肽，例如，在刺激組織修復(fù)或骨再生方面有活性的末端基團(tuán)。例如這種末端基團(tuán)可包括含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的肽，信號(hào)分子和許多前述的生理活性試劑，例如，骨形態(tài)發(fā)生蛋白。
選擇可生物降解的殼以在支架的臨時(shí)機(jī)械穩(wěn)定性和發(fā)展額外的內(nèi)部多孔性間提供一種平衡。核/殼組分的體積比可從約95/5到5/95進(jìn)行廣泛改變，優(yōu)選的核/殼比例是20/80。
當(dāng)聚合物在核上吸附后，可任選地加入懸浮固體的穩(wěn)定劑。核/殼漿可以與包含少量，例如約0.5重量％到約3重量％的高分子量聚乙二醇或聚乙烯醇的稀釋水溶液混合。
當(dāng)核/殼顆粒形成為淤漿時(shí)，該淤漿可與鈣源，和任選地與磷酸源(phosphate source)混合，從而在形成的顆粒的聚合物殼的外部形成包被。提供鈣和任選磷酸源的前體的例子是鈣鹽(例如醋酸鈣)的緩沖的水-醇溶液，鈣鹽和磷酸酯或配制的血漿流體。摻入鈣離子的外包被可作為具有生物活性的絲心蛋白基質(zhì)的界面。
得到的核/殼顆粒在水相中以相對(duì)穩(wěn)定的混懸液存在。干燥后，例如冷凍干燥，顆?？杀惠p輕研磨成核/殼粉末。一旦形成，隨后可將核/殼與絲心蛋白溶液或混懸液混合?；旌衔锏乃靠蛇M(jìn)行調(diào)整，從而維持流動(dòng)性。顆粒與絲心蛋白溶液或混懸液的相對(duì)數(shù)量根據(jù)特定應(yīng)用進(jìn)行改變。典型地，溶液或混懸液可包含約10體積％到約50體積％(體積百分比)，優(yōu)選約30體積％到約50體積％的顆粒相。
一旦形成，可將絲心蛋白溶液和/或混懸液在體內(nèi)用作用于組織構(gòu)建的支架，或給藥動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，如兔，狗，貓，馬，人等用于組織構(gòu)建。此處所用的“組織構(gòu)建”意圖包括在未損傷部位，例如在整形手術(shù)中，形成硬組織或軟組織，或在損傷部位進(jìn)行修復(fù)或重建。
如果絲心蛋白混懸液是包含體或凝膠形式，則優(yōu)選絲心蛋白混懸液通過注射給藥至組織構(gòu)建體部位。用于注射的絲心蛋白凝膠是可逆的凝膠，即，在例如使用熱或機(jī)械壓力下，可回復(fù)為粘度更低的狀態(tài)的凝膠。機(jī)械壓力可包括在注射過程中施加到凝膠上的壓力。備選地，如果絲心蛋白混懸液以乳膏或糊形式存在，則絲心蛋白混懸液可通過例如外科手術(shù)放置或通過涂敷(即局部給藥)放置在組織構(gòu)建部位(即需要進(jìn)行組織修復(fù)的部位)。沒有所依據(jù)的理論，認(rèn)為無論何種給藥方式，一旦使用，則絲心蛋白混懸液可形成基質(zhì)或支架，其可允許用于組織構(gòu)建的細(xì)胞的滲透和生長。
可以以適于注射或其他給藥方式的形式向從業(yè)者提供絲心蛋白溶液和混懸液。當(dāng)與顆粒混合時(shí)，在用單注射器或雙注射器技術(shù)注射時(shí)，可選擇絲心蛋白溶液和混懸液的特征。在單注射器技術(shù)中，顆粒與絲心蛋白溶液或混懸液的相對(duì)數(shù)量根據(jù)用途由從業(yè)者提供，然后混合，并放置在具有針頭的常規(guī)單注射器中并注射。備選地，顆粒與絲心蛋白溶液或混懸液可在單獨(dú)藥包中提供，在放入注射器前在混合室中進(jìn)行混合。使用這種在放置期間允許各種混合的設(shè)備使從業(yè)者具有能夠改變支架組成，從而更好地在給定部位(例如骨或軟組織)匹配性質(zhì)的改變。對(duì)兩組分的水含量進(jìn)行選擇，從而使其允許進(jìn)行快速混合和注射。
在應(yīng)用中，絲心蛋白溶液和混懸液以各種目的對(duì)人或動(dòng)物給藥，例如為了填充空腔，代替丟失的組織或?yàn)榱诉M(jìn)行軟組織或關(guān)節(jié)修復(fù)。絲心蛋白溶液或混懸液以例如注射或局部施用方式(即作為乳膏應(yīng)用于皮膚)進(jìn)行給藥。沒有可依據(jù)的理論，對(duì)溶液的情況，認(rèn)為溶液可以快速將多余水分分散到機(jī)體中，直到在注射物質(zhì)與周圍體液之間建立準(zhǔn)平衡為止，從而在體內(nèi)產(chǎn)生可形成支架的混懸液。對(duì)包含體的情況，認(rèn)為一旦放入機(jī)體中，則包含體可發(fā)生諸如溶膠—凝膠轉(zhuǎn)換的變化，從而產(chǎn)生可以是支架形式的凝膠。在所有情況下，優(yōu)選是一旦注射，物質(zhì)是多孔的。
沒有可依據(jù)的理論，認(rèn)為當(dāng)注射的絲心蛋白溶液或混懸液包含核/殼顆粒時(shí)，則多聚殼隨時(shí)間的降解可在混懸液中產(chǎn)生額外的多孔，即，以凝膠的形式，形成增強(qiáng)組織修復(fù)所需細(xì)胞的滲透和生長的支架。例如，一旦注射，絲心蛋白可以含有一個(gè)包裹核/殼顆粒分散體的凝膠形式的三維網(wǎng)格(或蜂房)。圖1所示的是組織修復(fù)過程中假設(shè)的三維網(wǎng)格的示意圖。絲心蛋白1被細(xì)胞滲透和核/殼顆粒2發(fā)生至少部分降解。核/殼顆粒聚合物的大小和狀態(tài)控制支架的額外多孔。新形成的組織3可在孔中進(jìn)行組織。絲心蛋白基質(zhì)的組成和形態(tài)是控制生物活性的主要因素。
多孔的絲心蛋白支架可促進(jìn)細(xì)胞貼附，增殖和活化，該支架在愈合過程中緩慢降解。另外，絲心蛋白的降解可產(chǎn)生分子量為約20千道爾頓或更小的肽，它們可釋放到周圍的生物流體中，從而增強(qiáng)周圍細(xì)胞的代謝活性。沒有可依據(jù)的理論，進(jìn)一步推測(cè)通過暴露最終與生長因子，藥物分子和介導(dǎo)細(xì)胞貼附的特異肽相互作用的特異活性位點(diǎn)，熱或蛋白酶處理可增加絲心蛋白的生物降解率。
上述絲心蛋白溶液和混懸液可應(yīng)用于例如各種骨和組織修復(fù)程序。示例性程序包括但不限定于矯形的，上頜面，牙齒和一般外科手術(shù)程序，例如腫瘤切除和整形手術(shù)。例如，絲心蛋白溶液和混懸液可應(yīng)用于通過粘結(jié)進(jìn)行骨折修復(fù)，通過重建受損骨骼而進(jìn)行骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎中的骨骼復(fù)原。這些物質(zhì)也可用作骨粘固粉(例如對(duì)于假肢)，以填充或增加組織，以改變組織大小或形狀，在牙周袋，用作為牙齒和關(guān)節(jié)移植物的穩(wěn)定劑，以及作為髖關(guān)節(jié)，膝關(guān)節(jié)和其他假體和骨骼間所產(chǎn)生裂隙的填料，從而使假體固定，并促進(jìn)骨再生。例如，絲心蛋白溶液和混懸液也可用于填充牙周患者牙齒周圍形成的孔洞，從而允許部分骨再生，并盡可能降低細(xì)菌感染；和填充骨骼和移植物之間，例如髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)移植物之間的縫隙。填充這種縫隙可潛在地導(dǎo)致假體穩(wěn)定，并增加假體的服務(wù)時(shí)間。絲心蛋白溶液和混懸液也可用于填充組織缺陷，例如那些由骨腫瘤手術(shù)和重建手術(shù)引起的組織缺陷，并增強(qiáng)骨和組織修復(fù)，例如，誘導(dǎo)鈣沉淀，或成骨細(xì)胞增殖和活性，從而形成新形成的骨組織。
含有核/殼顆粒的絲心蛋白溶液和混懸液在骨修復(fù)中是特別有用的。沒有可依據(jù)的理論，認(rèn)為在這種情況下，骨修復(fù)過程可能如下所述發(fā)生。第一個(gè)降解的組分可能是核/殼顆粒的攙雜鈣離子的殼，從而使體液擴(kuò)散到富含鈣離子的水層中，其作為可生物降解的殼和包裹的絲心蛋白網(wǎng)格的界面區(qū)。絲心蛋白基質(zhì)的多孔和通過殼降解產(chǎn)生的額外多孔使成骨細(xì)胞在多孔支架中滲透，其與支架的具有生物活性的網(wǎng)格相互作用和啟動(dòng)新的組織和骨生長。第二步可能是反應(yīng)層的生物降解，如果存在，例如，通過將可生物降解的殼連接到礦物核的-SiO-鍵上的水合作用，如此將可再吸收的礦物核引入剩余水凝膠的流體中。修復(fù)過程伴隨著絲心蛋白的生物降解過程，并產(chǎn)生新的骨。至少在骨再生的第一個(gè)階段期間，合成的支架(composite scaffold)可維持三維的機(jī)械穩(wěn)定的高表面區(qū)的網(wǎng)格的機(jī)械穩(wěn)定性。
絲心蛋白溶液和混懸液的一個(gè)特別有利的特征是通過修飾具有生物活性的基質(zhì)和核/殼可生物降解的顆粒，可以很方便地改變物質(zhì)的形態(tài)和機(jī)械性質(zhì)，從而滿足特定應(yīng)用的需要。設(shè)想不同于絲心蛋白的具有生物活性的可生物降解的凝膠和聚合物也可與此處所述的核/殼顆粒聯(lián)合使用形成支架。
絲心蛋白溶液，混懸液和組合物可誘導(dǎo)如成骨細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，周細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞等類型細(xì)胞的增殖。由于絲心蛋白溶液和混懸液可增強(qiáng)許多類型細(xì)胞的增殖，因此它們也用于骨組織之外的組織，例如，整形手術(shù)后的軟組織的重建，人工皮膚應(yīng)用，軟骨修復(fù)等。
通過以下非限定實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例l絲心蛋白的純化通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，首先將家蠶的蠶繭進(jìn)行脫膠。膠狀的絲膠蛋白通過在碳酸鈉(Na2CO3)水溶液中反復(fù)洗滌而去除，如下所述。蠶繭首先在1.1g/l(克/升)Na2CO3水溶液中98℃洗滌1小時(shí)，然后在含有0.4g/l Na2CO3的水溶液98℃漂洗1小時(shí)。然后將蠶繭在溫度從98℃降到室溫下在蒸餾水中反復(fù)洗滌，從而得到無絲膠蛋白的絲心蛋白。粗絲心蛋白在水中的量是10g/l。然后將脫膠的絲心蛋白以最初組分100g絲心蛋白/l溶液在65℃在9.3摩爾的溴化鋰(LiBr)水溶液中溶解3小時(shí)。當(dāng)溶解完成時(shí)，通過加入蒸餾水將水溶液稀釋到5％重量/體積絲心蛋白。剩余的雜質(zhì)和未溶解的纖維通過用孔徑n.1的過濾器過濾除去。然后用截留分子量為3500的再生纖維素膜通過對(duì)蒸餾水進(jìn)行72小時(shí)的透析而從絲心蛋白混合物中除去鹽。透析的絲心蛋白最終濃度為1-2％純絲心蛋白。
實(shí)施例2通過對(duì)絲心蛋白水溶液進(jìn)行熱處理制備混懸液將絲心蛋白水溶液(20ml(毫升))傾注到在-20℃到50℃溫育2到24小時(shí)的聚苯乙烯膠囊中。將在-20℃溫育的溶液加熱至和維持在室溫，直至發(fā)生凝膠化。其他保持在從4℃到50℃的恒定溫度下的絲心蛋白溶液發(fā)生凝膠化所需的溫育時(shí)間是2到24小時(shí)。由熱重量分析測(cè)定的凝膠中的水含量從95到98重量％變化?；鞈乙旱木恍砸蕾囉谒鼈儨赜臅r(shí)間和溫度。因此，證實(shí)絲心蛋白的流變學(xué)特性可通過熱處理而進(jìn)行改變。
實(shí)施例3絲心蛋白的酶處理用各種與特定氨基酸的肽鍵位點(diǎn)反應(yīng)的蛋白酶處理水性絲心蛋白混合物。其目標(biāo)是降低平均分子量，增加生物降解速率，并暴露出與介導(dǎo)細(xì)胞貼附因子特異的肽，生長因子和藥物分子最終相互作用的特異活性位點(diǎn)。對(duì)以下酶進(jìn)行研究蛋白酶(來源于灰色鏈霉菌)該酶在谷氨酸的羧基位點(diǎn)水解肽鍵。已表明具有谷氨酸的末端基團(tuán)的絲心蛋白的肽鏈阻止形成有規(guī)則的絲心蛋白β結(jié)構(gòu)。該酶反應(yīng)在酶-底物濃度為50μl/1ml(微升/毫升)下進(jìn)行，37℃反應(yīng)1小時(shí)后，溶液變成白色，且更加粘稠。形成的溶膠是一種能夠形成凝膠的可注射物質(zhì)。加熱至50℃將酶滅活。由電泳分析所測(cè)定的絲心蛋白肽鏈中谷氨酸含量約為1％。存在顯著的具有比處理前絲心蛋白混合物中存在的低的分子量的肽。
木瓜蛋白酶該酶與亮氨酸(絲心蛋白的0.5％)和甘氨酸(絲心蛋白的44％)的化學(xué)鍵特異反應(yīng)。處理?xiàng)l件和酶-底物濃度比可進(jìn)行改變，從而得到粘度水平不同的獲得的絲心蛋白溶膠或溶液。在這種情況下，電泳分析測(cè)定產(chǎn)物包含的肽的分子量在20Kd-2Kd。
胰凝乳蛋白酶用該酶處理導(dǎo)致二硫鍵水解，所述二硫鍵連接Cp(重鏈)部分(主要由甘氨酸-丙氨酸-絲氨酸組成)和包含純絲心蛋白物質(zhì)中存在的其他氨基酸的Cs部分(輕鏈；短肽鏈的混合物)。在40℃向絲心蛋白水溶液中加入緩沖的酶溶液。水解程度由反應(yīng)時(shí)間控制。不同的處理時(shí)間能啟動(dòng)不同量的水解。反應(yīng)完畢后，得到的水介質(zhì)包含溶液形式的Cs或輕鏈部分和Cp或重鏈部分的凝膠沉淀。
實(shí)施例4通過向絲心蛋白溶液中加入酸或醇形成混懸液。
通過向絲心蛋白溶液中加入檸檬酸或甘油誘導(dǎo)凝膠化。
將檸檬酸逐滴加到10ml絲心蛋白溶液中，直到pH達(dá)到3.7(等電點(diǎn)為3.8)。約6小時(shí)后發(fā)生凝膠化，產(chǎn)生白色不透明的多孔凝膠，其含有約95重量％水分。圖2所示的是所形成物質(zhì)的環(huán)境掃描電鏡顯微照片。
當(dāng)將3ml甘油加到7ml絲心蛋白溶液中，在約20小時(shí)發(fā)生凝膠化，產(chǎn)生白色(半)透明凝膠，其含有約90重量％水分。圖3所示的是所形成物質(zhì)的環(huán)境掃描電鏡顯微照片。
實(shí)施例5體外制備可注射的絲心蛋白凝膠/羥基磷灰石/聚交酯組合物支架制備聚合物包被的羥基磷灰石顆粒的核/殼顆粒粉末。用分子量約為6,000的聚交酯(PLA)作為可生物降解聚合物的殼。將2克硅烷處理的羥基磷灰石加到含有6克聚交酯的50ml丁醇中。將溶液加加熱到70℃2小時(shí)，冷卻到室溫，并與50ml 2％重量/體積的聚乙二醇水溶液混合。為了維持包被過程的相對(duì)均一性，包被顆粒的裝配速率需要足夠慢。攪拌核/殼混合物，傾倒入Petrie玻璃皿中，在50℃干燥，并輕輕研磨成粉末。得到的物質(zhì)是一種相當(dāng)廣泛大小分布的聚合物包被的球形聚合體。
將2克核/殼粉末與10ml絲心蛋白凝膠混合。粉末很容易地分散在凝膠中形成糊。包含核/殼顆粒的糊在2天內(nèi)干燥，即冷凍干燥和同樣在室溫下緩慢干燥。圖4-7是得到的支架的光學(xué)顯微照片。在室溫下緩慢干燥，形成具有明顯結(jié)構(gòu)完整性的充滿顆粒的絲心蛋白物質(zhì)。該冷凍干燥的樣品表現(xiàn)出期望的形態(tài)結(jié)構(gòu)，即絲心蛋白包被的廣泛分布。
實(shí)施例6絲心蛋白混懸液的體外實(shí)驗(yàn)人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞(MG63)在絲心蛋白凝膠中培養(yǎng)72小時(shí)，該凝膠是通過向絲心蛋白水溶液中加入甘油和通過在4℃處理絲心蛋白水溶液而制備的。為了測(cè)定細(xì)胞增殖和活性，對(duì)在待測(cè)物質(zhì)上生長的MG63和在空聚苯乙烯孔中生長作為對(duì)照的MG63的生化和免疫酶學(xué)參數(shù)。
當(dāng)與對(duì)照比較時(shí)，通過熱處理制備的純絲心蛋白凝膠上的細(xì)胞增殖顯著降低，但同時(shí)，凝膠有利于成骨細(xì)胞活性和分化，如分別通過增強(qiáng)的ALP(堿性磷酸酶)活性(16.71+/-1.80相對(duì)于對(duì)照10.10+/-1.61)和TGFβ-1(轉(zhuǎn)化生長因子β1)水平(487+/-29相對(duì)于對(duì)照432+/-42)來證明。當(dāng)與對(duì)照比較時(shí)，在通過加入甘油制備的凝膠中的細(xì)胞增殖顯示很少的差異。
沒有凝膠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，如通過LDH(乳酸脫氫酶)水平(純絲心蛋白凝膠14.67+/-2.04；具有甘油的凝膠18.03+/-0.23；對(duì)照14.63+/-2.19)。
實(shí)施例7絲心蛋白混懸液的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將檸檬酸衍生的絲心蛋白凝膠移植到兔股髁鉆孔得到的空腔(直徑6mm，深度10mm)中。無移植物的空腔作為對(duì)照。在移植1月后將兔殺死，并將移植部位的組織學(xué)結(jié)果與那些無移植物的部位進(jìn)行比較。
移植1月后，在一個(gè)由絲心蛋白凝膠填充的腔中的洞中完全被新形成的骨填充(圖8A)。觀察到帶有一些殘余絲心蛋白4的幾乎完全的骨骼愈合。沒有加入絲心蛋白的空腔則未表現(xiàn)出骨骼的再生(見圖8B)。觀察到原來的骨骼5和空的缺陷6。在4個(gè)填充了絲心蛋白凝膠的空腔中，空腔幾乎被新形成的骨7填滿，仍存在一小部分殘余的空腔8(圖9A)。在圖9A，空腔寬度為1.08毫米，長度為1.7毫米。圖10所示的是原來骨骼5與新生骨骼7之間的界面。新生骨骼形成良好組織的徑列條，其從原來骨徑列條處增殖，而不在新生骨骼和原來骨骼之間產(chǎn)生任何縫隙。觀察到作為經(jīng)歷礦化作用9的結(jié)締組織而產(chǎn)生的殘余空腔8。觀察到輕微的炎癥，沒有產(chǎn)生任何肉芽腫和明顯的不利免疫反應(yīng)。僅有最初的絲心蛋白凝膠的片段仍然是可見的，證實(shí)凝膠以與增殖再生一致的速率進(jìn)行降解，因此提供證據(jù)絲心蛋白混懸液可以用于所建議的應(yīng)用。
已經(jīng)公開了新的絲心蛋白混懸液和組合物。這種絲心蛋白混懸液可用純化的絲心蛋白溶液利用加熱，蛋白酶，酸，醇或可生物兼容的聚合物制備。絲心蛋白混懸液可以是包含體，凝膠，乳膏或糊形式。絲心蛋白混懸液，組合物及溶液具有專門用于骨骼和組織構(gòu)建，修復(fù)和再生的應(yīng)用。由于絲心蛋白溶液，混懸液和組合物可被注射，因此可降低對(duì)許多導(dǎo)入性外科手術(shù)，特別是整形外科的需求，從而減小感染的潛在危險(xiǎn)，縮短所需的恢復(fù)時(shí)間，降低醫(yī)療過程的全部花費(fèi)。
盡管參考優(yōu)選的實(shí)施方案已經(jīng)描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域中的熟練工作人員應(yīng)理解，在未脫離本發(fā)明的精神的條件下，可進(jìn)行各種改變，和對(duì)于其元素可可替代等價(jià)物。另外，在脫離其基本范圍的條件下，可進(jìn)行許多修改以使特定情形或物質(zhì)適合本發(fā)明的教導(dǎo)。因此，本發(fā)明并不限定于作為實(shí)施本發(fā)明的最佳方式所公開的特定實(shí)施方案，但本發(fā)明將包括所有落在后附的權(quán)利要求范圍內(nèi)的實(shí)施方案。
權(quán)利要求
1.一種包含絲心蛋白混懸液和任選形成多孔的顆粒物質(zhì)的組合物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述絲心蛋白混懸液為包含體，凝膠，乳膏或糊的形式。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述絲心蛋白包含家蠶絲心蛋白。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述絲心蛋白包含蛋白酶降解的絲心蛋白。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述形成孔的顆粒物質(zhì)包括羥基磷灰石，磷酸三鈣，陶瓷，珊瑚，脫乙酰殼多糖，或包含一種或多種上述物質(zhì)的組和。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述形成孔的顆粒物質(zhì)包含一種核/殼顆粒，所述核/殼顆粒包含任選的鈣化合物，任選磷酸源，和任選的反應(yīng)層。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述殼包含可生物降解的聚合物。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中所述核包含羥基磷灰石，基于磷酸鈣的礦物質(zhì)，可再吸收的玻璃填料，或包含一種或多種前述物質(zhì)的組合，其中所述殼包含聚乳酸，聚乙醇酸，聚己酸內(nèi)酯，聚碳酸三甲酯，聚二丙烯酸乙二醇酯類，聚酐類，聚原酸酯類，聚膦嗪類，聚縮醛類，聚酯類，聚脲類，聚碳酸酯類，聚氨基甲酸乙酯類，聚α-羥酸類，聚酰胺類，聚氨基酸類或包含一種或多種前述可生物降解聚合物的組合。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述絲心蛋白混懸液還包含生理活性劑。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述生理活性劑包含抗生素，骨形態(tài)發(fā)生蛋白，刺激組織生長的化合物，刺激骨再生的化合物，刺激傷口修復(fù)的化合物，細(xì)胞或，包含一種或多種前述試劑的組合。
11.一種形成絲心蛋白混懸液的方法，其包含用一種試劑處理絲心蛋白溶液以形成絲心蛋白混懸液，所述試劑包含熱，酸，醇，蛋白酶，可生物兼容的聚合物，或包含一種或多種前述試劑的組合。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述絲心蛋白混懸液是包含體，凝膠，乳膏或糊的形式。
13.權(quán)利要求11的方法，其中用熱處理包含加熱到約-20℃到約50℃的溫度。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述醇包含甘油，其中所述酸包含檸檬酸，抗壞血酸，乳酸或包含一種或多種前述酸的組合，其中所述可生物兼容的聚合物包含聚乙二醇，聚環(huán)氧乙烷，聚乙烯吡咯烷酮，或包含一種或多種前述可生物兼容聚合物的組合，其中所述蛋白酶包含來源于灰色鏈霉菌的蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，或包含一種或多種前述蛋白酶的組合。
15.權(quán)利要求11的方法，還包含向所述絲心蛋白混懸液中加入形成孔的顆粒物質(zhì)，生理活性劑，或包含一種或多種前述試劑和物質(zhì)的組合。
16.一種用絲心蛋白溶液和混懸液處理哺乳動(dòng)物的方法，其包含對(duì)組織構(gòu)建部位給藥有效量的絲心蛋白溶液或混懸液以刺激組織形成，其中所述絲心蛋白溶液或混懸液對(duì)所述絲心蛋白物質(zhì)任選包含形成孔的顆粒物質(zhì)，生理活性劑，或包含一種或多種前述試劑和物質(zhì)的組合。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述絲心蛋白混懸液是包含體，凝膠，乳膏或糊的形式。
18.一種用絲心蛋白溶液或混懸液處理細(xì)胞的方法，其包含用有效量的絲心蛋白溶液或混懸液接觸細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述絲心蛋白混懸液是包含體，凝膠，乳膏或糊的形式。
全文摘要
利用可單獨(dú)使用或作為與顆粒如核/殼顆粒的組合物的絲心蛋白溶液和混懸液制備生物活性物質(zhì)。將物質(zhì)設(shè)計(jì)成支持機(jī)體的骨和其它組織的構(gòu)建，修復(fù)，再生或增加。該溶液和混懸液可被裝有核/殼型顆粒，所述核/殼顆粒包含被具有磷酸鈣前體的外涂層的可生物降解聚合物包被的無機(jī)核顆粒。絲心蛋白溶液，混懸液，和組合物可被注射以填充空腔或代替缺少的組織。注射后，該物質(zhì)可產(chǎn)生能促進(jìn)組織再生、同時(shí)降解的支架。當(dāng)存在時(shí)，顆粒的降解可在支架內(nèi)產(chǎn)生額外的孔，并以可控制的方式釋放其它化合物以增強(qiáng)組織修復(fù)所需的生長和細(xì)胞活化。注射絲心蛋白溶液，混懸液和組合物的能力可降低用于替換或修復(fù)骨和其它組織的很多類型外科外科手術(shù)程序的需要。
文檔編號(hào)A61L24/00GK1575188SQ02821281
公開日2005年2月2日 申請(qǐng)日期2002年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月25日
發(fā)明者安東尼·T·迪貝內(nèi)代托, 克勞迪奧·米利亞雷西, 安東內(nèi)拉·莫塔, 塞繆爾·振碩·黃 申請(qǐng)人:康涅狄格大學(xué), 克勞迪奧·米利亞雷西, 安東內(nèi)拉·莫塔