專利名稱：：稠合的吡咯化合物在治療關(guān)節(jié)軟骨或軟骨下骨組織退化中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及稠合吡咯化合物、尤其是ML3000、其鹽或衍生物的用途，其在哺乳動(dòng)物中作為治療和預(yù)防所述哺乳動(dòng)物炎癥關(guān)節(jié)中的軟骨和/或軟骨下骨組織破損和損耗的手段。這種對(duì)軟骨和/或軟骨下骨組織的損傷是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生在哺乳動(dòng)物身上時(shí)自然產(chǎn)生的發(fā)展后遺癥和結(jié)局。獲得這種意想不到的效果的能力被稱之為“軟骨保護(hù)作用”。
背景技術(shù)：
：非甾類抗炎藥(NSAIDs)如乙酰水楊酸鹽(ASA)、雙氯芬酸、吲哚美辛、布洛芬和萘普生在臨床中被廣泛應(yīng)用。從藥理學(xué)觀點(diǎn)出發(fā)，它們扮演環(huán)加氧酶(COX)抑制劑的角色。藥理學(xué)作用相近的吡咯里嗪(pyrrolizine)類化合物已經(jīng)從大量的出版物中獲知。例如，具有消炎活性的吡咯里嗪類化合物在Arch.Pharm.319，65-69(1986)；319，231-234(1986)；318，661-663(1985)；318，663-664(1985)；319，500-505(1986)；319，749-755(1986)；327，509-514(1994)；330，307-312(1997)以及J.Med.Chem.1987，30，820-823和1994，37，1894-1897中述及。其它吡咯里嗪類化合物可從US5,260,451(對(duì)應(yīng)于EP0397175)以及WO95/32970、WO95/32971和WO95/32972中獲知。這些化合物的結(jié)構(gòu)式如下并且都具有稠合的二芳基吡咯部分以及第三酸性殘基R3。這些化合物的特征在于親脂性高、生物利用度良好和半衰期適中，參見DrugsoftheFuture，1995，20(10)1007-1009。DE19845446.6和WO01/05792描述了其它結(jié)構(gòu)相似的吡咯里嗪類化合物。此外，根據(jù)US4,232,038，烷基亞磺?；郊柞；屯榛酋；郊柞；〈倪量├镟侯惢衔飺?jù)說具有抗炎、止痛、解熱特性。根據(jù)DE19624290.8和DE19624289.4，這種類型的某些化合物具有降脂作用。式(Ia)的ML3000([2，2-二甲基-6-(4-氯苯基)-7-苯基-2，3-二氫-1H-吡咯里嗪-5基]-乙酸)是一種非抗氧化劑平衡的、COX和5-脂加氧酶(5-LO)的雙重抑制劑(3)。該藥物是COX的非選擇性抑制劑，同時(shí)抑制COX-1和COX-2。這種藥物具有止痛、解熱和抗炎活性，且已證實(shí)其在許多動(dòng)物模型、包括角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足趾水腫模型和大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型中具有強(qiáng)效抗炎活性(4)。骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是最常見的肌肉骨骼病。它主要影響負(fù)重的動(dòng)關(guān)節(jié)性關(guān)節(jié)如胯和膝，也影響其它關(guān)節(jié)如指節(jié)間關(guān)節(jié)和脊柱。這種疾病的結(jié)構(gòu)性改變包括關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性浸蝕、骨贅的形成以及在疾病臨床階段中出現(xiàn)的不同程度的滑膜炎。與這些改變相關(guān)的還有軟骨下骨組織的顯著重構(gòu)，根據(jù)若干研究可知，該重構(gòu)是疾病早期階段的過度骨重吸收，隨之而來的是過度骨形成，導(dǎo)致骨硬化和軟骨下骨組織增厚加劇。導(dǎo)致在骨性關(guān)節(jié)炎(OA)中所見的結(jié)構(gòu)改變的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制是多重的和復(fù)雜的，且在很大程度上是未知的。它們不僅涉及軟骨，其中可觀察到許多形態(tài)學(xué)改變，而且涉及滑膜，那里是各種程度和嚴(yán)重性的炎癥反應(yīng)發(fā)生的場所(1)。據(jù)信，有許多途徑導(dǎo)致了軟骨基質(zhì)的分解代謝，包括可溶性因子例如白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和前列腺素的上調(diào)，而軟骨基質(zhì)的分解代謝可誘發(fā)骨關(guān)節(jié)軟骨的喪失。對(duì)軟骨細(xì)胞的直接損傷也刺激了基質(zhì)金屬蛋白酶如膠原酶、溶基質(zhì)素和明膠酶的活性(MMP)，并刺激各種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生(2)。必須考慮的是代謝過程在任何給定的關(guān)節(jié)中均持續(xù)發(fā)生，其對(duì)于繼關(guān)節(jié)承受損傷如跌打損傷后的修復(fù)和正?；潜仨毜?。因此，一種化合物要成為可接受的軟骨保護(hù)劑，首先必須能夠維持這種軟骨細(xì)胞代謝的活性，即不能抑制或干擾細(xì)胞復(fù)制和基質(zhì)成分的生物合成，這是治愈過程的一部分。在這方面，熟練的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到許多NASID對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的主成分的生物合成顯示明顯的抑制作用。同時(shí)，可接受的軟骨保護(hù)劑必須能夠抵抗介質(zhì)對(duì)軟骨的降解作用，所述介質(zhì)如各種細(xì)胞因子、前列腺素和蛋白酶。相應(yīng)的，本領(lǐng)域內(nèi)已認(rèn)同潛在的軟骨保護(hù)藥物應(yīng)該從其對(duì)合成代謝途徑的積極作用以及其抑制分解代謝過程的能力兩方面進(jìn)行評(píng)估。通常檢測的分解代謝包括、尤其是溶基質(zhì)素的釋放和抑制、對(duì)前列腺素和白三烯生物合成的影響以及藥物抑制IL-1介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨降解的能力。大量的具有針對(duì)抑制COX酶活性的藥物如非甾體抗炎劑，已經(jīng)使用多年。盡管它們可有效地減輕骨性關(guān)節(jié)炎的癥狀如疼痛，但是它們在減輕實(shí)驗(yàn)性O(shè)A的體內(nèi)進(jìn)程方面的作用有限(8，9)。雖然用同時(shí)具有環(huán)加氧酶-1(COX-1)和COX-2抑制作用的兩種NASID替尼達(dá)普和卡布洛芬進(jìn)行治療顯示出抗OA的作用(8，9)，但其它NASID如雙氯芬酸或ASA是無效的(10)或甚至被證實(shí)加速了OA實(shí)驗(yàn)性狗模型中的軟骨損傷(11)。同樣，在人體中，對(duì)膝OA患者的近期研究已證實(shí)基于X射線標(biāo)準(zhǔn)，用另一種非甾體抗炎劑苯噻丙酸進(jìn)行治療，5年內(nèi)不能延緩軟骨損傷的進(jìn)展，用吲哚美辛甚至加速其進(jìn)程(15)。令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)某些稠合的吡咯化合物如ML3000，可顯著減少實(shí)驗(yàn)性狗OA的損傷的發(fā)生。這些化合物的保護(hù)作用在減少軟骨損傷的發(fā)展方面尤其顯著。這種現(xiàn)象不僅與PGE2和LTB4生成的明顯抑制相關(guān)，而且與涉及軟骨退化的兩種主要分解代謝因子即IL-1β和膠原酶-1的原位減少相關(guān)。發(fā)明概述因此，本發(fā)明涉及通式(I)代表的稠合吡咯化合物及其光學(xué)異構(gòu)體、生理可接受的鹽和衍生物用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損傷的用途其中X代表CR8R9、S、O、NR12或C(O)；A代表CR10R11或X與帶有殘基R6和R7的原子之間的鍵；基團(tuán)R1、R2、R3的其一代表任選被一個(gè)或多于一個(gè)取代基取代的芳基，取代基獨(dú)立地選自鹵素、烷基、鹵代烷基、烷氧基、芳氧基、鹵代烷氧基、烷硫基、羥基、硝基、烷基亞磺酰基、烷基磺?；被酋；?、N-烷基氨磺?；，N-二烷基氨磺?；⑼榛酋０被屯榛酋?N-烷基氨基；或代表芳香族或非芳香族的、單或二環(huán)的、任選苯并稠合的雜環(huán)基，其具有1、2或3個(gè)獨(dú)立地選自N、O和S的雜原子且任選被一個(gè)或多于一個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自鹵素、烷基、鹵代烷基、烷氧基、芳氧基、鹵代烷氧基、烷硫基、羥基、硝基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；被酋；-烷基氨磺?；?、N，N-二烷基氨磺酰基、烷基磺酰氨基和烷基磺酰-N-烷基氨基；基團(tuán)R1、R2、R3的其二代表任選被一個(gè)或多于一個(gè)取代基取代的烷基，取代基獨(dú)立地選自鹵素、環(huán)烷基、烷氧基、三氟甲氧基、羥基和三氟甲基；任選被一個(gè)或多于一個(gè)取代基取代的環(huán)烷基，取代基獨(dú)立地選自鹵素、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、烷氧基、鹵代烷氧基和羥基；任選被一個(gè)或多于一個(gè)取代基取代的芳基，取代基獨(dú)立地選自鹵素、烷基、鹵代烷基、烷氧基、芳氧基、鹵代烷氧基、烷硫基、羥基、硝基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、氨磺酰基、N-烷基氨磺?；，N-二烷基氨磺酰基、烷基磺酰氨基和烷基磺酰-N-烷基氨基；或芳香族或非芳香族的、單或雙環(huán)的、任選苯并稠合的雜環(huán)基，其具有1、2或3個(gè)獨(dú)立地選自N、O和S的雜原子且任選被一個(gè)或多于一個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自鹵素、烷基、鹵代烷基、烷氧基、芳氧基、鹵代烷氧基、烷硫基、羥基、硝基、烷基亞磺酰基、烷基磺?；被酋；琋-烷基氨磺?；?、N，N-二烷基氨磺?；?、烷基磺酰氨基和烷基磺酰-N-烷基氨基；基團(tuán)R1、R2、R3的其三代表H、烷基、鹵代烷基、羥基烷基、-CHO、-COOH、鹵素、氰基、烷基磺?；?、氨磺酰基或B-Y，其中B代表任選被羥基或烷氧基取代的亞烷基或亞烯基；Y代表-COOH、SO3H、OPO(OH)2、OP(OH)2、-CHO或四唑基；或基團(tuán)R1、R2、R3的其二和其三與和它們相連的原子一起代表飽和或不飽和的環(huán)烷基；R4至R11可以相同或不同，其代表氫、烷基、羥基烷基、烷氧基烷基、羥基、COOH或酰氧基，其中相鄰基團(tuán)也可以代表價(jià)鍵或偕二基團(tuán)，和與它們相連的碳原子一起也可以代表羰基或環(huán)烷基；R12代表氫、烷基或苯基。術(shù)語“烷基、烷氧基等”包括直鏈或支鏈烷基如CH3、C2H5、正丙基、CH(CH3)2、正丁基、CH(CH3)-C2H5、異丁基、C(CH3)3、正戊基或正己基，尤其是CH3、C2H5或CH(CH3)2，除非另外指明，優(yōu)選具有1至8個(gè)碳原子、特別是1至6個(gè)碳原子且更優(yōu)選1至4個(gè)碳原子；作為基團(tuán)R1至R12的取代基，“烷基、烷氧基等”優(yōu)選含有1至4個(gè)碳原子。取代的“烷基、烷氧基等”尤其包括鹵代烷基，即部分或全部被氟、氯、溴和/或碘取代的烷基，例如CH2F、CHF2、CF3、CH2CI、2-氟乙基、2-氯乙基或2，2，2-三氟乙基；作為基團(tuán)R1至R12的取代基，鹵代烷基優(yōu)選表示CHF2，特別是CF3；鹵代烷氧基，即部分或全部被氟、氯、溴和/或碘取代的烷氧基，例如對(duì)應(yīng)于前述鹵代烷基殘基的鹵代烷氧基殘基；作為基團(tuán)R1至R12的取代基，鹵代烷氧基優(yōu)選表示OCHF2，特別是OCF3；烷氧基烷基，即被烷氧基取代的烷基，例如-CH2-OCH3或2-甲氧基乙基；羥基烷基，即被羥基優(yōu)選單取代的烷基，例如羥甲基或2-羥乙基；三氟甲基烷基，即被三氟甲基優(yōu)選單取代的烷基，例如羥基烷基中所述的、被三氟甲基而不是被羥基取代的殘基；三氟甲氧基烷基，即被三氟甲氧基優(yōu)選單取代的烷基，例如羥基烷基中所述的、被三氟甲氧基而不是被羥基取代的殘基；環(huán)烷基烷基，即被環(huán)烷基優(yōu)選單取代的烷基，例如羥基烷基中所述的、被環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基取代而不是被羥基取代的殘基。術(shù)語“環(huán)烷基”包括單環(huán)或雙環(huán)烷基，如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等，除非另外指明，優(yōu)選具有3至9個(gè)碳原子、特別是3至7個(gè)碳原子且更優(yōu)選5或6個(gè)碳原子。術(shù)語“亞烷基”包括直鏈或支鏈亞烷基，如亞甲基和亞乙基，除非另外指明，優(yōu)選具有1至8個(gè)碳原子、特別是1至6個(gè)碳原子且更優(yōu)選1至4個(gè)碳原子。如果亞烷基被羥基或烷氧基取代，優(yōu)選單取代。術(shù)語“亞烯基”包括直鏈或支鏈、單或多不飽和亞烷基，如亞乙烯基，除非另外指明，優(yōu)選具有2至8個(gè)碳原子、特別是2至6個(gè)碳原子且更優(yōu)選2至4個(gè)碳原子。如果亞烯基被羥基或烷氧基取代，優(yōu)選單取代。酰氧基指的是-OCOR，其中R代表烷基或芳基。優(yōu)選的實(shí)例有乙酰氧基和苯甲酰氧基。-COO烷基指的是烷氧基羰基，如CO-OCH3、CO-OC2H5、CO-OCH2-C2H5、CO-OCH(CH3)2、正丁氧羰基、CO-OCH(CH3)-C2H5、CO-OCH2-CH(CH3)2、CO-OC(CH3)3，尤其是CO-OCH3、CO-OC2H5、CO-OCH(CH3)2或CO-OCH2-CH(CH3)2。-COO烷基苯基指的是烷基部分被苯取代的烷氧基羰基，如苯氧基羰基。烷硫基指的是-S-烷基，也被稱作烷基硫基或烷基巰基，如SCH3、SC2H5、SCH2-C2H5、SCH(CH3)2、正丁基硫基、1-甲基丙基硫基、2-甲基丙基硫基、SC(CH3)3。優(yōu)選甲硫基。烷基亞磺?；傅氖?S(O)-烷基，也被稱作烷基氧化硫(sulfoxo)，如SO-CH3、SO-C2H5、正丙基亞磺酰基、1-甲基乙基亞磺?；⒄』鶃喕酋；?、1-甲基丙基亞磺酰基、2-甲基丙基亞磺酰基、1，1-二甲基乙基亞磺酰基。優(yōu)選甲基亞磺?；?。烷基磺?；傅氖?S(O)2-烷基，也被稱為烷基砜，如SO2-CH3、SO2-C2H5、正丙基磺?；?、SO2-CH(CH3)2、正丁基磺?；?、1-甲基丙基磺?；?-甲基丙基磺?；O2-C(CH3)3。優(yōu)選甲基磺?；?。氨磺?；傅氖?S(O)2NH2，也被稱為氨基磺?；蛘呋撬狨０?。N-烷基氨磺酰基指的是單取代的氨磺?；?S(O)2NH-烷基，例如-S(O)2NH-CH3。N，N-二烷基氨磺酰基指的是二取代的氨磺?；?S(O)2N-(烷基)2，其中N上連接的烷基殘基可以相同或不同，例如-S(O)2N(CH3)2。烷基磺酰氨基指的是-NHS(O)2-烷基，如NHSO2-CH3、NHSO2-C2H5、正丙基磺酰氨基、NHSO2-CH(CH3)2、正丁基磺酰氨基、1-甲基丙基磺酰氨基、2-甲基丙基磺酰氨基、NHSO2-C(CH3)3。優(yōu)選甲基磺酰氨基。烷基磺酰-N-烷基胺基指的是-N(烷基)S(O)2-烷基，其中N和S上連接的烷基殘基可以相同或不同，例如N(CH3)SO2-CH3。羰基、CHO、-COOH、-SO3H分別指的是＞C＝O、甲酰基、羧基、羧基羰基和磺基(sulfo)。“芳基”優(yōu)選是萘基、尤其是苯基。術(shù)語“鹵素”包括氟、氯、溴或碘原子。通常優(yōu)選氟和氯，有些情況下也優(yōu)選溴?！半s環(huán)殘基”尤其包括5-或6-元雜環(huán)殘基，其可以是芳香族的或非芳香族的、單環(huán)或雙環(huán)的，和/或苯并稠合的。雜環(huán)基的實(shí)例有含氮雜環(huán)殘基，如吡咯基、咪唑基、吡唑基、噠嗪基、吡嗪基、吲哚基、喹啉基，特別是吡啶基、嘧啶基和異喹啉基。芳香族殘基也包括那些含有氧或硫原子的雜環(huán)殘基，如噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基和特別地苯并呋喃基。也包括那些含有2個(gè)或2個(gè)以上不同雜原子的雜環(huán)殘基，如噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、異噁唑基和噁唑基。噻吩基、吡啶基和噻唑基是優(yōu)選的芳香族雜環(huán)殘基。非芳香族殘基包括含氮雜環(huán)殘基，如吡咯烷基、哌啶基和哌嗪基。還包括含有2個(gè)或2個(gè)以上不同雜原子的雜環(huán)殘基，例如嗎啉基。取代的殘基，尤其是烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基，優(yōu)選為單取代、二取代或三取代的殘基。-位稠合物(annelland)可以是六元或特別是五元的雜環(huán)基或特別地脂環(huán)基，如果是脂環(huán)基，那么可以是不飽和的或特別是飽和的，和/或取代或未取代的。式(I)的[α]-稠合的吡咯化合物尤其包括這樣一些化合物，其中X代表CR8R9且A代表X與帶有R6和R7殘基的原子之間的價(jià)鍵(吡咯里嗪類)；X代表CR8R9且A代表CR10R11(中氮茚類)；X代表NR12且A代表X與帶有R6和R7殘基的原子之間的價(jià)鍵(吡咯并[1，2-a]咪唑類)；X代表S且A代表X與帶有R6和R7殘基的原子之間的價(jià)鍵(吡咯并[2，1-b]噻唑類)；X代表S且A代表CR10R11(吡咯并[2，1-b]1，3-噻嗪類)；X代表O且A代表CR10R11(吡咯并[2，1-b]1，3-噁嗪類)；X代表O且A代表X與帶有R6和R7殘基的原子之間的價(jià)鍵(吡咯并[2，1-b]噁唑類)，具有上述含義的未提及的基團(tuán)。如果[α]-位稠合物是五元不飽和殘基，特別的R4和R6代表一個(gè)價(jià)鍵，如例如在吡咯里嗪、吡咯并[2，1-b]咪唑和吡咯并[2，1-b]噻唑中的一個(gè)價(jià)鍵。如果[a]-位稠合物是六元不飽和殘基，特別地R4和R6代表一個(gè)價(jià)鍵，如在吡咯并[2，1-b]1，3-噻嗪、吡咯并[2，1-b]1，3-噁嗪或5，6-二氫中氮茚中的一個(gè)價(jià)鍵，并且任選地R8和R10也代表一個(gè)價(jià)鍵，如例如在中氮茚中的價(jià)鍵。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，如果沒有連接到特定的[a]-稠合位置，R4至R7可以相同或不同且代表氫或烷基。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案，基團(tuán)R4、R5、R6和R7中的至少一個(gè)代表羥基烷基，尤其是羥基甲基，且R4、R5、R6和R7中余下的殘基獨(dú)立地代表H或烷基。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，R4優(yōu)選是羥基烷基，尤其是羥基甲基，且R5是H或烷基，且R6、R7獨(dú)立地為H或烷基。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案，基團(tuán)R8和R9中的一個(gè)代表H、烷基、羥基烷基或烷氧基烷基，且另一個(gè)代表羥基、烷氧基、羧基或酰氧基，或R8和R9與和它們相連的C原子一起代表羰基。6，7-二氫-5H-吡咯里嗪類化合物特別有用，如式(I)化合物，其中X代表CR8R9、A代表X與帶有R6和R7殘基的原子之間的價(jià)鍵，且R4、R5、R6、R7、R8、R9可以相同或不同、具有上述含義且優(yōu)選代表氫或烷基。特別優(yōu)選6，7-二氫-5H-吡咯里嗪類化合物，其中R4至R9是氫，或R4至R9中至少一個(gè)或兩個(gè)殘基、例如R6和/或R7代表烷基、尤其是甲基。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)重要方面，式(I)化合物特別有用，其中基團(tuán)R1、R2、R3的其一和其二、優(yōu)選R1和R2獨(dú)立地代表一個(gè)富Il-電子體系，該體系選自芳基和芳香族雜環(huán)殘基、優(yōu)選苯基，任選被一個(gè)或多于一個(gè)取代基取代，這些取代基尤其獨(dú)立地選自鹵素、烷基和鹵代烷基，尤其是CF3，R1優(yōu)選為未取代的苯基且R2優(yōu)選為4-取代的苯基。根據(jù)本發(fā)明的另一重要方面，式(I)化合物特別有用，其中基團(tuán)R1、R2、R3的其三基團(tuán)、優(yōu)選R3代表酸性殘基如COOH或B-Y，其中Y為COOH且B優(yōu)選代表亞烷基，或代表酸性殘基的前體如B-Y，其中Y為四唑基。式(la)代表的[6-(4-氯苯基)-2，2-二甲基-7-苯基-2，3-二氫-1H-吡咯里嗪-5-基]-乙酸(ML3000)其生理可接受的鹽和衍生物，例如生理可水解的酯，其用途是特別優(yōu)選的。生理可接受的鹽包括酸或堿加成鹽。酸加成鹽為例如式(I)化合物與無機(jī)酸如鹽酸、硫酸、硝酸或磷酸形成的鹽，或與有機(jī)酸、尤其是羧酸形成的鹽，例如乙酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、扁桃酸、抗壞血酸、馬來酸、延胡索酸、葡糖酸或磺酸，例如甲磺酸、苯基磺酸和甲苯磺酸等。堿加成鹽為例如式(I)化合物與無機(jī)堿如氫氧化鈉或氫氧化鉀形成的鹽，或與有機(jī)堿如單，雙或三乙醇胺等形成的鹽。生理可接受的衍生物尤其包括式(I)化合物的前藥，它們在體內(nèi)被再轉(zhuǎn)化為式(I)化合物或其活性形式(代謝物)。例如式(I)化合物的可水解的酯，其中基團(tuán)R1、R2、R3的其三基團(tuán)代表酸性殘基，例如其烷基(包含功能性COO烷基的R1、R2、R3的其三基團(tuán))、芳烷基(包含功能性COO烷芳基如COO烷基苯基的R1、R2、R3的其三基團(tuán))、新戊酰氧基甲基、乙酰氧基甲基、2-苯并[c]呋喃酮基、2，3-二氫化茚基和甲氧基甲基酯等。根據(jù)特殊方面，本申請(qǐng)涉及選自式(I)化合物的軟骨保護(hù)劑的用途。這里所用的術(shù)語“軟骨保護(hù)劑”可理解為涉及那些主要作用位點(diǎn)是軟骨的化合物。還應(yīng)該理解的是這類軟骨保護(hù)劑還可具有與滑膜有關(guān)的抗炎作用，還可以對(duì)軟骨下骨組織和其它結(jié)締組織如滑膜成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞生物合成產(chǎn)生積極的影響，且可以調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的遷移以阻止炎性進(jìn)程。本發(fā)明提供了治療方法、可用于其中的藥物組合物以及其適宜的包裝，它們可用于那些在一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)上患有或?qū)砜赡芑加嘘P(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織損傷、破壞或損耗的哺乳動(dòng)物。使用式(I)化合物較其它NSAID、特別是那些常用的NSAID具有更突出的優(yōu)勢，后者實(shí)際上可加劇骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程，特別是當(dāng)長期使用時(shí)。令人驚訝的是，式(I)化合物在哺乳動(dòng)物相關(guān)關(guān)節(jié)中可用于治療或預(yù)防這種關(guān)節(jié)軟骨損傷，同時(shí)對(duì)炎癥進(jìn)程沒有不利的影響。式(I)化合物所具有的扭轉(zhuǎn)最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織損壞和損耗的疾病進(jìn)程的能力，對(duì)于安全且有效地治療哺乳動(dòng)物、特別是那些正處于關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織退化或損壞的早期階段的哺乳動(dòng)物具有深遠(yuǎn)的意義。這里所使用的術(shù)語“哺乳動(dòng)物”指的是任何哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類、貓、狗或馬，其中存在大量不同的品種。根據(jù)本發(fā)明，在需要這種治療的哺乳動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)治療或預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織損壞和損耗，包括向所述哺乳動(dòng)物施用對(duì)治療或預(yù)防所述關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織損壞和損耗而言治療有效量的一種或一種以上式(I)化合物。所述治療或預(yù)防特別包括改善、削弱、積極地治療、逆轉(zhuǎn)或預(yù)防任何關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損壞，例如損傷、損壞或損耗，特別是隨所述變性或破壞的早期階段而來的變性或破壞。在這里，提及施用本發(fā)明的軟骨保護(hù)化合物所使用的表述“治療或預(yù)防”應(yīng)該指的是所述施用的治療性目標(biāo)以及所述施用實(shí)際所取得的治療結(jié)果。如上所討論，由施用所述化合物所完成的治療的范圍包括疾病過程的改善至顯著削弱，且超出疾病的有效治療范疇，還包括疾病過程的逆轉(zhuǎn)。更高程度的療效可產(chǎn)生對(duì)所述關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織變性的早期階段之后的關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的任何損傷、損壞或損耗的預(yù)防作用。表述“關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織退化的早期階段”指的是關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的初始病理改變的最開始階段，其確定并成為疾病發(fā)展的結(jié)果。軟骨是纖維結(jié)締組織，以多種形式存在，例如玻璃樣軟骨、彈性軟骨和纖維軟骨。它是包含水、膠原和蛋白聚糖的結(jié)締組織，所述組分可共同形成獨(dú)特的被纖維強(qiáng)化的水凝膠，其堅(jiān)硬而又有彈性，且具有顯著的吸收震動(dòng)能力。關(guān)節(jié)軟骨是可見于哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)中的軟骨。它包含活細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)，所述活細(xì)胞生成間質(zhì)物質(zhì)且被間質(zhì)物質(zhì)包繞，間質(zhì)物質(zhì)通常被稱為細(xì)胞外基質(zhì)。產(chǎn)生軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的軟骨細(xì)胞具有高度活性，該基質(zhì)的完整性由分解代謝的細(xì)胞因子IL-1α、β和TNFα與合成代謝的細(xì)胞因子IGF和TGFβ的作用之間的平衡維持。IL-1α、β和TNFα通過誘導(dǎo)特定的基質(zhì)降解金屬蛋白酶的生成而發(fā)揮作用，而IGF和TGFβ作為生長因子誘導(dǎo)軟骨、膠原和蛋白聚糖的大分子構(gòu)建塊的生成。其它細(xì)胞因子和它們的抑制劑，以及金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)，也影響這種平衡，該平衡被稱為基質(zhì)自穩(wěn)態(tài)。這里使用的術(shù)語“金屬蛋白酶”指的是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，特指該酶家族中通常在關(guān)節(jié)軟骨退化時(shí)表現(xiàn)為濃度增高的酶，即溶基質(zhì)素、膠原酶和明膠酶。膠原酶通常在天然膠原的降解方面起作用；溶基質(zhì)素通常在蛋白聚糖的降解中起作用；明膠酶通常在變性膠原的降解中起作用。一種具有MMP特性的酶，即聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase)也包含在該術(shù)語中，因?yàn)樗陉P(guān)節(jié)變性早期出現(xiàn)的軟骨蛋白聚糖聚合物的蛋白水解中起作用。三種在變性的早期階段存在于關(guān)節(jié)軟骨中的膠原酶是膠原酶-1(MMP-1)、膠原酶-2(MMP-8)和膠原酶-3(MMP-13)。三種溶基質(zhì)素是溶基質(zhì)素-1(MMP-3)、溶基質(zhì)素-2(MMP-10)和溶基質(zhì)素-3(MMP-11)，其中只有溶基質(zhì)素-1在關(guān)節(jié)軟骨變性的早期階段出現(xiàn)。由于骨性關(guān)節(jié)炎被定義為動(dòng)(可活動(dòng)，滑液內(nèi)襯)關(guān)節(jié)性關(guān)節(jié)的功能障礙，因此斷定在這種關(guān)節(jié)中通常可見至少兩個(gè)可移動(dòng)的骨表面，但實(shí)際上它們?yōu)榛に@，滑膜分泌滑液，滑液是一種充盈于關(guān)節(jié)腔的透明的堿性粘液，而插入于兩個(gè)關(guān)節(jié)骨表面之間的關(guān)節(jié)軟骨通常取代滑膜的位置。骨性關(guān)節(jié)炎的最早的總的病理發(fā)現(xiàn)是關(guān)節(jié)表面習(xí)慣性負(fù)載區(qū)域的關(guān)節(jié)軟骨的軟化，對(duì)哺乳動(dòng)物的膝關(guān)節(jié)而言、特別是在涉及膝關(guān)節(jié)十字韌帶橫切的骨性關(guān)節(jié)炎模型中，所述區(qū)域由股骨髁和脛骨坪組成。隨著骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，軟骨表面的整合性喪失且關(guān)節(jié)軟骨變薄，出現(xiàn)垂直裂縫，裂縫延伸至軟骨深處，稱為纖維化過程。關(guān)節(jié)活動(dòng)可導(dǎo)致纖維化的軟骨脫落碎片，暴露出下面的骨組織(軟骨下)，而后經(jīng)歷硬化過程。軟骨下囊腫也會(huì)發(fā)展，被滑液充盈。在關(guān)節(jié)邊緣可形成骨贅(骨刺)。軟骨下骨組織的變化也在軟骨退化和破壞的病理改變中發(fā)揮作用。對(duì)已經(jīng)歷前部十字韌帶橫切的哺乳動(dòng)物、特別是狗的關(guān)節(jié)的研究顯示軟骨下硬化和骨質(zhì)減少，即軟骨下小梁的骨質(zhì)丟失。隨這些變化而來的是軟骨下板的增厚。軟骨下骨組織的丟失增加了覆蓋其上的關(guān)節(jié)軟骨的機(jī)械勞損，導(dǎo)致其變性。隨之而來的軟骨下板的增厚對(duì)骨內(nèi)部的修復(fù)機(jī)制有負(fù)性影響，從而促進(jìn)了軟骨毀壞的進(jìn)展。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的毀壞伴隨著軟骨細(xì)胞的有絲分裂，隨后形成簇。軟骨的葡糖胺聚糖成分減少且片狀蛋白聚糖減少。在許多區(qū)域，以增厚致密的平行膠原束的細(xì)胞外基質(zhì)為特征的纖維軟骨取代了透明軟骨。然而，應(yīng)注意的是這些和以上描述的關(guān)節(jié)軟骨的病理變化是骨性關(guān)節(jié)炎的晚期特征，而增厚，即關(guān)節(jié)軟骨的增厚首先發(fā)生，如十字韌帶缺損哺乳動(dòng)物、特別是狗的膝關(guān)節(jié)模型所示。軟骨增厚起因于關(guān)節(jié)軟骨中的水含量增多、蛋白聚糖合成增加和蛋白聚糖的含量和濃度的增加。這種關(guān)節(jié)軟骨肥大修復(fù)的階段可持續(xù)一段時(shí)間，但所形成的修復(fù)的軟骨組織缺乏正常透明軟骨所具有的對(duì)機(jī)械應(yīng)激的彈性和阻力。最終，蛋白聚糖的生成減退且軟骨細(xì)胞不再能夠保持其細(xì)胞外基質(zhì)。該最后階段導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的全厚度喪失。導(dǎo)致軟骨損傷和損耗的早期病理變化涉及通過增加基質(zhì)大分子的合成而進(jìn)行的修復(fù)。但修復(fù)后軟骨的組成是有缺陷的，是因?yàn)槠咸前肪厶墙M分的組成和分布發(fā)生改變，且其與透明質(zhì)酸組分聚集的能力發(fā)生變化。在這些病理改變期間釋放的顆粒也會(huì)導(dǎo)致滑膜的炎性變化。然而，盡管存在這種病理學(xué)的變化，軟骨損傷和丟失的初始階段仍可以是無癥狀的，相對(duì)而言幾乎沒有疼痛。因此，適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)是鑒別那些細(xì)胞外基質(zhì)組分和細(xì)胞因子，通過確定其可測量的變化，而在病灶軟骨損耗可通過放射線識(shí)別前診斷出哺乳動(dòng)物受試者處于軟骨損傷和損耗的早期階段。達(dá)到此目標(biāo)可在明顯的軟骨變性發(fā)生前對(duì)受試哺乳動(dòng)物進(jìn)行診斷性分類，以便進(jìn)行早期藥理學(xué)干預(yù)。所述關(guān)節(jié)軟骨的病理改變包括關(guān)節(jié)軟骨的組成、形式和密度相比所述疾病過程發(fā)生前發(fā)生的改變，其可導(dǎo)致所述關(guān)節(jié)軟骨的有益特性的退化，包括強(qiáng)度、回彈性、彈性、構(gòu)造完整性和穩(wěn)定性、存活力以及成功抵抗不同類型機(jī)械應(yīng)激的能力，特別是吸收機(jī)械振蕩的能力。這些組成上的病理變化特別包括存在于關(guān)節(jié)軟骨中的葡糖胺聚糖和膠原纖維的類型和數(shù)量上的變化。軟骨下骨組織的病理改變包括其硬化、密度逐漸增加且回彈性和彈性逐漸降低，以及成功抵抗不同類型的機(jī)械應(yīng)激的能力、特別是吸收機(jī)械振蕩的能力減弱。這些病理變化特別包括小梁微細(xì)裂縫的不適當(dāng)修復(fù)，伴小梁增厚，以及成骨細(xì)胞代謝物生成和分化型表型的病理變化?；ぱ?，即滑膜、滑液膜的炎癥，可促成軟骨損傷和損耗的病理學(xué)。滑液炎癥的特征在于滑液被單核細(xì)胞廣泛浸潤、滑液膜細(xì)胞增生以及淋巴樣聚集。滑膜炎在類風(fēng)濕性和其它炎性關(guān)節(jié)病變的軟骨損傷中起明顯作用?；貉装Y在早期OA中的作用所知很少，然而滑膜炎存在于骨性關(guān)節(jié)炎的臨床階段。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，式(I)化合物的用途涉及治療或預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損壞，其中所述退化或損壞與骨性關(guān)節(jié)炎有關(guān)。具體而言，所述用途涉及治療或預(yù)防與之相關(guān)的病理改變。因此，本發(fā)明也涉及骨性關(guān)節(jié)炎的治療，其中所述治療伴隨著對(duì)關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的治療上有用的影響。治療或預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織退化或損壞還可以包含施用除一種或多于一種式(I)化合物外的一種或多種基本上選自聚硫酸葡糖胺聚糖(PSGAG)、葡糖胺、硫酸軟骨素(CS)、透明質(zhì)酸(HA)、聚硫酸戊聚糖(PPS)、強(qiáng)力霉素和二甲胺四環(huán)素的成分。此外，本發(fā)明的式(I)化合物也可以與其它治療活性劑結(jié)合，所述其它活性劑對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，且通常由施用本發(fā)明的治療劑的情形所確定。例如，當(dāng)關(guān)節(jié)同時(shí)被微生物如細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、病毒等嚴(yán)重感染時(shí)，最好是將本發(fā)明的活性劑與一種或多種抗生素、抗真菌藥、抗原蟲藥、抗病毒藥或類似治療劑聯(lián)合施用。本發(fā)明的活性劑也可以與NSAID以及其它炎癥介質(zhì)的抑制劑聯(lián)合施用。其它類型的這種抑制劑及其實(shí)例包括例如H1-受體拮抗劑；激肽B1-和B2-受體拮抗劑；前列腺素抑制劑如PGD-、PGF-PGI2-和PGE-受體拮抗劑；血栓素A2(TXA2)抑制劑；PAF-受體拮抗劑；aurothio基團(tuán)中的金與各種親水基團(tuán)；免疫抑制劑例如環(huán)孢霉素、巰唑嘌呤和氨甲喋呤；抗炎糖皮質(zhì)激素例如地塞米松；廣譜抗寄生蟲抗生素，例如阿維菌素(avermectin)和米爾倍霉素；青霉胺；羥氯喹；抗通風(fēng)藥例如秋水仙堿，黃嘌呤氧化酶抑制劑例如別嘌醇以及促尿酸制劑例如丙磺舒，苯磺唑酮和苯溴馬隆。因?yàn)殛P(guān)節(jié)軟骨變性的早期階段常見于老年哺乳動(dòng)物，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為，也可將式(I)化合物與其它用于治療老年哺乳動(dòng)物常見的疾病狀態(tài)、綜合征和癥狀的活性劑聯(lián)合施用。這種治療劑和它們被用于治療的病癥包括，例如對(duì)抗記憶丟失和損傷的認(rèn)知治療劑，以及抗運(yùn)動(dòng)障礙/抗帕金森活性劑，例如司立吉林。另一大類這種治療劑包括抗高血壓藥物和其它用于對(duì)抗高血壓、心肌局部缺血包括心絞痛、充血性心力衰竭和心肌梗塞的心血管藥物，例如利尿劑；血管擴(kuò)張劑如肼苯噠嗪；β-腎上腺素能受體拮抗劑如普萘洛爾；血管緊張素II轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACE抑制劑)如用于治療患二尖瓣關(guān)閉不全的老年哺乳動(dòng)物的依那普利，且依那普利單獨(dú)或與中性內(nèi)肽酶抑制劑聯(lián)用；血管緊張素II受體拮抗劑如氯沙坦(losartan)；腎素抑制劑；鈣通道阻斷劑如硝苯地平；交感神經(jīng)阻滯劑如甲基多巴；α2腎上腺素能激動(dòng)劑如可樂定；α-腎上腺素能受體拮抗劑如哌唑嗪，以及HMG-CoA-還原酶抑制劑(抗高膽固醇血癥藥)如洛伐他汀或阿伐他汀。其它類型的這種治療劑包括用于治療各種癌癥的抗腫瘤藥，特別是抗有絲分裂藥，包括長春花屬生物堿如長春堿和長春新堿；用于治療腎衰的治療劑；用于治療哺乳動(dòng)物超重問題的減肥藥；用于治療常滋擾哺乳動(dòng)物的體內(nèi)和體外寄生蟲的抗寄生蟲藥；以及用于治療哺乳動(dòng)物不同類型瘙癢的止癢藥。其它可與本發(fā)明的抗炎劑聯(lián)合使用的藥物包括生長激素促分泌素；強(qiáng)力止痛藥；局部和全身麻醉藥；以及H2受體拮抗劑和其它胃保護(hù)劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到一些上述治療劑的組合最常用于治療哺乳動(dòng)物的各種急性病癥，例如與退行性關(guān)節(jié)疾病同時(shí)發(fā)生的細(xì)菌感染。然而，這些技術(shù)人員對(duì)治療哺乳動(dòng)物的慢性病癥方面也具有即使不是更大的也是同樣的興趣。根據(jù)用于此目的給藥方案，式(I)化合物預(yù)計(jì)將與其它用于治療慢性病癥如高脂血癥的、按常規(guī)預(yù)定基礎(chǔ)使用的藥物聯(lián)合施用。也可以設(shè)想聯(lián)合施用可具有多種不同的形式且仍在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，式(I)化合物可能僅僅與一種或多種其它形成預(yù)計(jì)組合的治療劑一起配制成方便的劑型如口服片劑，包含所有形成組合的藥物。不同藥物的不同半衰期可由本領(lǐng)域技術(shù)人員在制備制劑時(shí)進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過生產(chǎn)具有不同釋放時(shí)間的所述藥物的控釋形式，從而獲得相對(duì)均勻的給藥過程。以所述劑型使用的藥用飼料也可按照制劑領(lǐng)域熟知的原理制得，其中聯(lián)合使用的藥物可僅以混合物的形式共同存在于飼料組合物中。本發(fā)明還涉及聯(lián)合施用，其中藥物聯(lián)合是通過同時(shí)施用組合指定藥物完成的。這種聯(lián)合施用甚至可通過不同的劑型和施用途徑進(jìn)行。本發(fā)明還涉及根據(jù)不同的但卻有規(guī)律的連續(xù)給藥計(jì)劃的這種組合的用途，其中即使構(gòu)成組合的單個(gè)藥物不是被同時(shí)施用于所述哺乳動(dòng)物，但相關(guān)藥物的血漿水平在被治療哺乳動(dòng)物中被維持在所需水平。所有這些組合都在本領(lǐng)域的修改和調(diào)整的技術(shù)范圍內(nèi)。當(dāng)式(I)化合物被用作本發(fā)明的方法和組合物中的活性成分時(shí)，可將它們加入標(biāo)準(zhǔn)藥物劑型中。這樣，本發(fā)明也涉及藥物組合物，其包含可藥用載體和對(duì)于治療或預(yù)防所述關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損壞而言治療有效量的以上定義的式(I)化合物。例如，當(dāng)它們以全身或局部、口服或胃腸外制劑施用時(shí)是有用的，為此可與常用的藥用賦形劑、稀釋劑和佐劑聯(lián)用，例如有機(jī)和無機(jī)的惰性載體材料如水、明膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石、植物油、樹膠，聚亞烷基二醇等。這些藥物制劑可以固體形式使用，例如以片劑、膠囊和特別地與適合于哺乳動(dòng)物的美味食物成分聯(lián)合或混合使用；或它們可以液體形式施用，例如以溶液和酏劑形式施用?？杉尤氲乃幱觅x形劑和佐劑包括防腐劑、抗氧化劑、抗微生物劑和其它穩(wěn)定劑；潤濕、乳化和助懸劑，以及防結(jié)塊化合物；芳香和著色添加劑；以及增強(qiáng)抗壓性或使活性成分延遲、緩釋或控制釋放的組分；以及用于改變藥物制劑的滲透壓或作為緩沖劑的各種鹽。已成功使用的具體劑型包括靜脈內(nèi)注射用的5％ML3000的混合膠粒溶液、3％的調(diào)味糊劑(palatablepaste)和口服片劑?？蓪⑷缟隙x的治療有效量的式(I)化合物通過全身方式施用于所述哺乳動(dòng)物，其中所述全身施用包括(1)將含有所述化合物的藥物組合物以適當(dāng)?shù)囊后w形式如水溶液、乳劑或混懸劑注射或輸注至適當(dāng)?shù)臋C(jī)體組織或體腔中，所述液體形式用于動(dòng)脈內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)皮(包括皮下)或經(jīng)脊柱內(nèi)、特別是鞘內(nèi)且更常見用于肌內(nèi)或靜脈內(nèi)施用，或作為施用儲(chǔ)庫使用；(2)將含有所述化合物的藥物組合物以適當(dāng)?shù)墓腆w形式滴注至適當(dāng)?shù)臋C(jī)體組織或體腔中，所述固體形式例如包含生物可相容和生物可侵蝕物質(zhì)組成的基質(zhì)，其中具有軟骨保護(hù)作用的式(I)化合物的固體顆粒分散其間，或者具有軟骨保護(hù)作用的式(I)化合物的液態(tài)小球或分離體可能包埋于其中，用作用于延遲、持續(xù)和/或控制釋放的固體植入組合物；或(3)攝入或施用含有所述化合物的藥物組合物，其具有適當(dāng)?shù)墓虘B(tài)或液態(tài)形式，用于其經(jīng)皮釋放，例如經(jīng)皮帖劑或表皮下(皮下)植入劑，或用于其口服釋放。這里述及的大量劑型都可以配制，以便提供活性成分由所述劑型中的控釋、緩釋和/或延遲釋放。根據(jù)本發(fā)明，有用的ML3000的控釋劑型是一種在單次口服劑量為5mg/kg后可保持ML3000的血漿水平在一天中的大部分時(shí)間內(nèi)大于100ng/mL的劑型。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的ML3000的口服控釋劑型是這樣的劑型，當(dāng)所述控釋劑型和即釋劑型以相同劑量施用時(shí)，其將ML3000的血漿濃度保持在超過100ng/mL水平的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于ML3000的即釋劑型可保持相當(dāng)?shù)难獫{水平的時(shí)間。含有2.5和5mg/kg劑量的ML3000的即釋劑型可將血漿ML3000濃度保持在100ng/mL和200ng/mL以上分別達(dá)8小時(shí)。優(yōu)選的全身施用的口服劑型是固體劑型，例如可口的口服組合物，如速溶的美味薄片(wafer)、片劑、膠囊、囊片等；和液體劑型，例如溶液劑、混懸劑、乳劑等。適合哺乳動(dòng)物口服施用的特定類型的藥物組合物可以使用且包括但不限于這樣一些形式，如施用于所治療哺乳動(dòng)物的舌后部的口服糊劑、通過摻入哺乳動(dòng)物食物中被施用的顆粒形式，和其中活性成分與美味的咀嚼物一起被消耗的可咀嚼形式，或在所治療哺乳動(dòng)物咀嚼過程中通過濾去不被消耗的成分而施用活性成分的可咀嚼形式。所定義的治療有效量的式(I)化合物也可局部施用于所述哺乳動(dòng)物，其中所述局部施用包括(1)將含有所述式(I)化合物的藥物組合物注射或輸注至關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織退化或損傷的局部位置，所述組合物為有利于其傳輸?shù)囊后w形式，包括可提供所述化合物至所述局部位點(diǎn)的延遲釋放、控釋和/或緩釋的組分；或用作用于其釋放的儲(chǔ)庫，其中所述組合物提供所述化合物的貯存以及其后的延遲釋放、緩釋和/或控釋；或(2)向所述局部位置滴注藥物組合物，所述組合物含有所述化合物，其為適宜的固體形式，用作用于其釋放的固體植入劑，所述組合物任選提供所述化合物的延遲釋放、緩釋和/或控制釋放。局部施用集中于適宜的關(guān)節(jié)組織，可將具有軟骨保護(hù)作用的式(I)化合物注射、注入、植入、存放、插入或滴注其中。這種施用還包括但不限于關(guān)節(jié)內(nèi)、軟骨內(nèi)、肋內(nèi)、韌帶內(nèi)、髓內(nèi)、肌肉內(nèi)、骨骼內(nèi)、盆骨內(nèi)、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)、滑液內(nèi)、跗骨內(nèi)、鞘內(nèi)或靜脈內(nèi)施用。含有具有軟骨保護(hù)作用的式(I)化合物的藥物組合物具有可將液體注射進(jìn)入或非常接近于關(guān)節(jié)位置的優(yōu)勢。通過直接將式(I)化合物注射至關(guān)節(jié)內(nèi)，可以使所述化合物在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的濃度。這樣，不僅顯著增強(qiáng)了所述化合物進(jìn)入關(guān)節(jié)組織的能力以及因此增強(qiáng)了式(I)化合物的治療活性，而且同時(shí)使否則可能發(fā)生的不利副反應(yīng)的發(fā)生率降至最小。其結(jié)果就是式(I)化合物的高局部濃度，伴以與之相應(yīng)的全身性的低濃度殘留。注射劑可以由含有具有軟骨保護(hù)作用的式(I)化合物的藥物組合物制成，其中藥物組合物為延遲釋放、控釋或緩釋的形式。這些公認(rèn)的組合物的制劑可以是固體、半固體、凝膠或其它液體/固體聯(lián)合的形式，其中使用易侵蝕的基質(zhì)或包衣系列以使式(I)化合物以預(yù)定的速率或者如果需要以可變的速率連續(xù)釋放。術(shù)語“延長釋放”(extended-release)和“長效”以及其它術(shù)語用來描述這些制劑。所有這些制劑均采用生物可侵蝕的聚合物(例如各種纖維質(zhì)聚合物)和天然材料，(例如玉米淀粉和硬脂酸鎂)的各種組合，以使基質(zhì)中所含的式(I)化合物能夠緩慢和/或均一的配放。這些藥物組合物如果是適當(dāng)?shù)囊簯B(tài)或可混懸的形式，則可以被注射至關(guān)節(jié)位置，如果本質(zhì)上更接近固體則可以采用其它方式施用。式(I)化合物用以治療或預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損壞的治療有效量，是以一定的量施用于所治療的哺乳動(dòng)物，所述量以每天所述哺乳動(dòng)物每千克體重給予的毫克量表示的，即“mg/kg/day”。這里使用的表述“每天”不應(yīng)被解釋為必須要求任何特定的劑型都基于每天施用于所治療的哺乳動(dòng)物?！懊刻臁钡谋磉_(dá)方式僅僅指示一種最小的方便而任意的時(shí)間段，其被當(dāng)作總計(jì)量單位的一部分，以衡量所施用的具有軟骨保護(hù)作用的化合物的劑量。劑量，即用以治療或預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損壞的式(I)化合物的治療有效量，通常約0.1mg/kg/天至約20.0mg/kg/天、優(yōu)選約0.1mg/kg/天至約12.0mg/kg/天、更優(yōu)選約0.5mg/kg/天至約10.0mg/kg/天且最優(yōu)選約0.5mg/kg/天至約8.0mg/kg/天。ML3000的通常劑型和用量包括以2.5至5.0mg/kg體重的劑量口服施用。對(duì)技術(shù)人員而言必要的是不僅要確定優(yōu)選的施用途徑和相應(yīng)的劑型和用量，而且必須確定給藥方案，即給藥頻率。通常情況下，最可能的是在每日一次(s.i.d.)給藥和每日兩次(b.i.d.)給藥之間選擇，前者可提供更迅速而深遠(yuǎn)(profound)的治療，而后者可提供的治療雖缺少深度但更加持久。但是，這種概括并沒有將重要變量考慮進(jìn)去，如相關(guān)的關(guān)節(jié)軟骨或軟骨下骨組織的退化或損壞的特定類型、相關(guān)的特定治療劑及其藥代動(dòng)力學(xué)，以及相關(guān)的特定患者(哺乳動(dòng)物)。對(duì)于已批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品，這些信息的大部分已經(jīng)由為獲得批準(zhǔn)而進(jìn)行的臨床研究的結(jié)果提供。在另一些情況下，這種信息也可以以直接的方式、按照技術(shù)人員根據(jù)其知識(shí)和技能提取的本說明書中所包含的教導(dǎo)和指導(dǎo)而獲得。也可以將獲得的結(jié)果與在同樣實(shí)驗(yàn)中相應(yīng)的已批準(zhǔn)產(chǎn)品的評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。同樣可以認(rèn)為，本發(fā)明還將提供用于在需要所述治療的哺乳動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)治療或預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下組織的退化或損壞的適用于商業(yè)的包裝，其包括適宜的外部紙板盒和其中所放置的可移動(dòng)的內(nèi)部容器；在所述容器中含有以上所述的適宜劑型的式(I)化合物；以及與所述硬紙板或容器有關(guān)的印刷的使用說明和信息資料，其可貼于所述紙板盒或所述紙板盒中包含的所述容器上，或作為所述紙板盒或容器的固有部分被展示，所述使用說明和信息資料用文字告知讀者所述活性成分在一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下組織退化或損壞的情況下施用于哺乳動(dòng)物時(shí)，可改善、減輕、積極治療、扭轉(zhuǎn)或預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨或軟骨下骨組織的任何損傷、損害或損耗。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的包含如上所述的紙板盒和容器的包裝可以符合所有與治療哺乳動(dòng)物的藥物的銷售和使用有關(guān)的規(guī)范性要求，包括特別是所述使用說明和信息資料?？梢哉J(rèn)為，本發(fā)明還將提供一種上述類型的包裝，其包括如上所述的適宜的容器；所述容器中裝有口服劑型的式(1)化合物；還有與所述容器相關(guān)的如上所述的印刷的使用說明和信息資料。本發(fā)明的方法還可以被定義為包括兩個(gè)基本步驟(I)確定受試哺乳動(dòng)物的狀態(tài)，即所述哺乳動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)在當(dāng)前還是預(yù)期處于關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損壞的狀態(tài)，從而確定所述哺乳動(dòng)物需要所述治療；隨即(II)通過向所述哺乳動(dòng)物施用對(duì)于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損壞而言治療有效量的具有軟骨保護(hù)作用的式(I)化合物。以上已詳細(xì)討論了步驟(II)的各個(gè)方面。因此，現(xiàn)在詳細(xì)討論步驟(I)的各個(gè)方面。就診斷而言，根據(jù)本發(fā)明可方便地確定候選治療的哺乳動(dòng)物的狀態(tài)，即所述哺乳動(dòng)物是否當(dāng)前或預(yù)期處于一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損壞狀態(tài)下。這里使用的“當(dāng)前或預(yù)期的”指的是根據(jù)下述的作決定的方法，可以鑒別受試哺乳動(dòng)物是當(dāng)前需要這種治療，或在不久的將來很可能或期望需要這種治療。對(duì)治療的預(yù)期需要可通過那些肯定因素的測定結(jié)果決定，根據(jù)技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)，所述結(jié)果可直接導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織退化或損壞的情形。例如，技術(shù)人員可由哺乳動(dòng)物臨床檢測結(jié)果確定其具有初始髖關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)異常，并可用射線成像證據(jù)確定這一結(jié)論，從所述證據(jù)中可依據(jù)已建立的度量方法確定該哺乳動(dòng)物在不久的將來將發(fā)生髖關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)異常。具體而言，所述哺乳動(dòng)物的狀態(tài)，即是否當(dāng)前或預(yù)期處于所述退化或損壞狀態(tài)且特別是所述早期階段，并是否需要這種治療，是根據(jù)以下情況確定的(A)來自受試哺乳動(dòng)物的臨床關(guān)節(jié)內(nèi)窺鏡檢查和關(guān)節(jié)評(píng)價(jià)的陽性結(jié)果(positiveresult)。已經(jīng)討論了初始或事實(shí)髖關(guān)節(jié)異常結(jié)構(gòu)的診斷。其它臨床癥候和跡象包括那些對(duì)受試哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)直接檢查所獲得的結(jié)果；(B)對(duì)受試哺乳動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)進(jìn)行的任何有創(chuàng)性外科操作的效果，所述外科操作僅可在本身具有充足的理由的情況下決定需要所述治療方式。從事實(shí)而言，對(duì)哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)實(shí)施的有創(chuàng)性外科手術(shù)不可避免地降低了所述關(guān)節(jié)與手術(shù)前一樣有效的承載常規(guī)負(fù)荷的能力。以一個(gè)熟練技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)出發(fā)，在關(guān)節(jié)上增加的機(jī)械壓力將直接導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織退化的早期階段。這種關(guān)節(jié)手術(shù)還將導(dǎo)致血液和其它含有細(xì)胞因子和其它因子的流體的滲出，這些因子是炎癥的誘發(fā)劑，從而使得這些物質(zhì)可轉(zhuǎn)移并吸收進(jìn)關(guān)節(jié)的固態(tài)組織中，包括軟骨和/或軟骨下骨組織。技術(shù)人員可以判斷這也將直接導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織退化的早期階段；(C)來自于采用包括放射成像和磁共振成像技術(shù)(MRI)在內(nèi)的無創(chuàng)性操作對(duì)所述哺乳動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)進(jìn)行檢查的陽性結(jié)果。后一種技術(shù)比前者更適合于對(duì)軟組織進(jìn)行測定。MRI是一種多平面人體成像技術(shù)，可以顯示增強(qiáng)的軟組織對(duì)比分辨率。由于MRI可以使軟組織的改變形象化，因此它適合于對(duì)關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨組織退化的早期改變的病理學(xué)進(jìn)行成像；(D)來自于對(duì)受試哺乳動(dòng)物的體液或關(guān)節(jié)組織進(jìn)行的任何生化實(shí)驗(yàn)的陽性結(jié)果，所述結(jié)果涉及一種或多種以下物質(zhì)增加的白介素-1β(IL-1β)；增加的腫瘤壞死因子α(TNFα)；增加的IL-1β相對(duì)IL-1受體拮抗蛋白(IL-1Rα)的比例；增加的p55TNF受體(p55TNF-R)的表達(dá)；增加的白介素-6(IL-6)；增加的白血病抑制因子(LIF)；未改變或減少的胰島素樣生長因子-1(IGF-1)；減少的轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)；未改變或減少的血小板衍生生長因子(PDGF)；未改變或減少的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)；增加的硫酸角質(zhì)素；增加的溶基質(zhì)素；增加的溶基質(zhì)素相對(duì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)的比例；增加的骨鈣蛋白；增加的堿性磷酸酶；增加的對(duì)激素攻擊有響應(yīng)的cAMP；增加的尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA)；增加的軟骨寡聚基質(zhì)蛋白；以及增加的膠原酶。以IL-1α和IL-1β存在的IL-1是一種分解代謝細(xì)胞因子，其可調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨損傷和損失。其通過以下方式發(fā)揮作用抑制關(guān)節(jié)軟骨中可見的II型膠原質(zhì)的合成、同時(shí)促進(jìn)作為成纖維細(xì)胞特征的I型膠原的合成；誘導(dǎo)與基質(zhì)退化有關(guān)的酶的產(chǎn)生；抑制軟骨細(xì)胞合成新蛋白聚糖的能力。為了引起分解代謝酶的產(chǎn)生而被占據(jù)的IL-1受體，其數(shù)量在退化早期的關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細(xì)胞表面僅是所需正常值的四分之一(1％對(duì)4％)。IL-1及其調(diào)節(jié)劑IL-1Rα由相同的滑液巨噬細(xì)胞以自分泌和旁分泌的形式產(chǎn)生，IL-1Rα的產(chǎn)生在粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的存在下可以增加。但是，IL-1和IL-1Rα的效能存在顯著的不同，如在軟骨細(xì)胞和軟骨植入體上測定到的，消除IL-1的作用需要大約130倍的IL-1Rα。IL-1和IL-1Rα之間的任何不平衡都會(huì)進(jìn)一步加劇關(guān)節(jié)軟骨的惡化。因此，適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)還可以是測量處于早期關(guān)節(jié)軟骨退化的哺乳動(dòng)物中的IL-1和IL-1Rα水平及它們之間的比例，并且測量沒有如此受病患折磨的哺乳動(dòng)物中的相同的數(shù)值，以便確定可測量的改變，根據(jù)所述改變，可在病灶軟骨喪失可通過放射成像的方式確定前概括出受試哺乳動(dòng)物處于軟骨損傷或損耗的早期。這些結(jié)論可提供在顯著的軟骨退化發(fā)生前預(yù)計(jì)接受早期藥物干預(yù)的受試哺乳動(dòng)物的診斷分類。此外，可以測定處于關(guān)節(jié)軟骨退化早期階段的關(guān)節(jié)滑液和滑液組織中存在的IL-1α和分泌IL-1β的巨噬細(xì)胞的比例，其顯著大于從正常關(guān)節(jié)、即非關(guān)節(jié)軟骨退化早期階段的關(guān)節(jié)的滑液和滑液組織中分離到的相同細(xì)胞的比例。這些結(jié)論再次提供了在顯著的軟骨退化發(fā)生前預(yù)計(jì)接受早期藥物干預(yù)的受試哺乳動(dòng)物的診斷分類。另外，由于引發(fā)并維持炎癥過程的細(xì)胞因子能夠通過鈣化帶上的細(xì)小裂縫到達(dá)軟骨下層，所以在關(guān)節(jié)軟骨總體改變明顯之前軟骨下骨組織就發(fā)生改變。所涉及的軟骨細(xì)胞的新陳代謝受到不利的影響，另外在關(guān)節(jié)軟骨的中間地帶的軟骨細(xì)胞可產(chǎn)生許多細(xì)胞因子，包括那些引發(fā)和維持炎癥過程的細(xì)胞因子。這些軟骨細(xì)胞以自分泌形式發(fā)揮作用，從而促進(jìn)其自身細(xì)胞外基質(zhì)的破壞。關(guān)節(jié)軟骨的水含量增加通過增加炎性細(xì)胞因子在基質(zhì)內(nèi)的擴(kuò)散，也促進(jìn)了這一進(jìn)程。因此適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)是測量關(guān)節(jié)軟骨退化過程中由哺乳動(dòng)物的軟骨細(xì)胞、滑液細(xì)胞和/或軟骨下骨細(xì)胞、特別是齒突所產(chǎn)生各種炎癥性細(xì)胞因子的水平，并且測量沒有如此受病患折磨的哺乳動(dòng)物中的相同的數(shù)值，以便確定可測量的改變，根據(jù)所述改變，可在病灶軟骨喪失可通過放射成像的方式確定前概括出受試哺乳動(dòng)物處于軟骨損傷和損耗的早期。這些結(jié)論可提供在顯著的軟骨退化發(fā)生前預(yù)計(jì)接受早期藥物干預(yù)的受試哺乳動(dòng)物的診斷分類。腫瘤壞死因子α(TNFα)在軟骨退化方面僅僅是IL-1的強(qiáng)度的十分之一，但是在哺乳動(dòng)物膝關(guān)節(jié)中、特別是在十字韌帶橫切關(guān)節(jié)中與相對(duì)的未手術(shù)的膝關(guān)節(jié)相比，其滑液內(nèi)的濃度顯著增加。從這種膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨中分離的軟骨細(xì)胞上的p55TNF受體(TNF-R)的表達(dá)也增強(qiáng)。相應(yīng)地，因?yàn)門NFα在軟骨損傷和損耗的早期階段發(fā)生的病理改變中發(fā)揮作用，出于同樣的原因，適合的目標(biāo)是測量處于關(guān)節(jié)軟骨退化的早期階段的哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)中的TNFα和TNF-R水平，并且測量沒有如此受病患折磨的哺乳動(dòng)物中的相同的數(shù)值，以便確定可測量的改變，根據(jù)所述改變，可在病灶軟骨喪失可通過放射成像的方式確定前概括出受試哺乳動(dòng)物處于軟骨損傷和損耗的早期。這些結(jié)論可提供在顯著的軟骨退化發(fā)生前預(yù)計(jì)接受早期藥物干預(yù)的受試哺乳動(dòng)物的診斷分類。白介素-6(IL-6)是一種多功能細(xì)胞因子，但發(fā)揮炎性作用，且發(fā)現(xiàn)同對(duì)照的正常四肢相比，其在受損四肢的關(guān)節(jié)和滑液中的水平升高。IL-6也使得軟骨細(xì)胞上TNF-R的表達(dá)增強(qiáng)和由軟骨細(xì)胞生成的蛋白聚糖增加，以及誘導(dǎo)葡萄糖胺聚糖的釋放。與對(duì)照組相對(duì)比，對(duì)處于關(guān)節(jié)軟骨損傷和損耗的早期階段的哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)的軟骨細(xì)胞、滑液和關(guān)節(jié)中的IL-6水平的測定結(jié)果可用作鑒別哺乳動(dòng)物的診斷工具，所述哺乳動(dòng)物在任何病灶軟骨喪失通過放射成像檢查被證實(shí)前預(yù)計(jì)接受藥物治療。白血病抑制因子(LIF)由單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及其它與炎癥情況相關(guān)的細(xì)胞類型產(chǎn)生?；ぜ?xì)胞和軟骨細(xì)胞在IL-1β和TNFα存在下合成并分泌LIF。所以，測得LIF水平的對(duì)比增加可以在診斷上被用于挑選適宜關(guān)節(jié)軟骨損傷和損耗早期階段的藥物治療的受試哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨的退化、損傷和損耗是兩種細(xì)胞因子的不平衡造成的，這兩種細(xì)胞因子分別是促進(jìn)上述分解代謝過程的細(xì)胞因子和維持軟骨中的軟骨細(xì)胞合成和增生響應(yīng)的細(xì)胞因子。胰島素樣生長因子(IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)以及成纖維細(xì)胞生長因子例如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)就軟骨細(xì)胞而言都是促有絲分裂的并且可刺激關(guān)節(jié)軟骨中的基質(zhì)合成。胰島素樣生長因子(IGF)以I型和II型存在，且IGF-I是軟骨合成的強(qiáng)效調(diào)節(jié)劑。此外，它甚至在IL-1β和TNFα存在下減少蛋白聚糖的降解并促進(jìn)其合成。IGF-I的血清水平是由高親和性結(jié)合蛋白(IGF-BPs)維持的，并且IGF-I在骨和軟骨的代謝中都很重要。與對(duì)照組相比，IGF-I的水平可以成為對(duì)受試哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨退化的早期藥物治療的診斷評(píng)價(jià)。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)軟骨和骨組織的代謝回轉(zhuǎn)而言均是有力的促細(xì)胞分裂劑。此外，它可刺激基質(zhì)的合成且具有抗炎活性。它還可通過刺激蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生和阻止膠原酶和金屬蛋白酶的釋放而抑制基質(zhì)的退化。此外，它可通過刺激由哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)中的各種細(xì)胞產(chǎn)生的膠原、纖維結(jié)合素、纖溶酶原激活物抑制劑和金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)來提高軟骨修復(fù)能力。在處于關(guān)節(jié)軟骨損傷和損耗早期階段的哺乳動(dòng)物的關(guān)節(jié)中，滑液的TGFβ水平較低。因此，與對(duì)照組相比，TGFβ的水平可以成為對(duì)受試哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨退化的早期藥物治療的診斷評(píng)價(jià)。隨著退化的進(jìn)行，即哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)中關(guān)節(jié)軟骨的分解代謝，產(chǎn)生了大量的代謝產(chǎn)物，它們可用作軟骨退化發(fā)生和發(fā)展的標(biāo)記物。例如，由IL-1α和IL-1β或TNFα引起的軟骨退化釋放葡萄糖胺聚糖(GAGS)，這可以在被測哺乳動(dòng)物的滑液中測量出來。此外，GAG的水平在治療后會(huì)改變，所以使用滑液GAG水平作為關(guān)節(jié)軟骨轉(zhuǎn)化(turnover)的標(biāo)記物，GAG水平可以用來監(jiān)控藥物干預(yù)的過程。因?yàn)殛P(guān)節(jié)軟骨的退化涉及膠原和其它軟骨組分，所以幾種膠原產(chǎn)物可作為哺乳動(dòng)物軟骨退化、特別是齒突關(guān)節(jié)軟骨損傷和損耗的標(biāo)記物。II型特定膠原分解產(chǎn)物，例如20至30氨基酸新表位，可在滑液、血漿、血清或尿液等體液中被測定出來。在這些體液中新表位的存在被用作OA發(fā)病和進(jìn)展的指示劑。硫酸角質(zhì)素是特殊的GAG，其具有表位5D4，其在滑液中的水平可用作早期關(guān)節(jié)軟骨損傷和損耗的標(biāo)記。相反，另一種表現(xiàn)為許多表位的特殊的GAG硫酸軟骨素的水平與處于軟骨損傷和損耗早期階段的哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨的合成代謝有關(guān)?；褐械倪@些表位的水平，尤其是3B3、7D4和846，可以通過特定的可識(shí)別它們的單克隆抗體測定。3B3表位在細(xì)胞外基質(zhì)的修復(fù)和重構(gòu)期間于軟骨的硫酸軟骨素鏈上被表達(dá)，因此它在滑液中的水平與上述5D4的水平呈負(fù)相關(guān)。在關(guān)節(jié)軟骨的表層或中上層中的新合成的PGs上的3B3的表達(dá)意味著3B3與處于軟骨退化早期階段的哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨中的早期改變相關(guān)。相應(yīng)的，測定待測哺乳動(dòng)物滑液中的3B3水平并將這些水平與對(duì)照數(shù)值相比，可以形成適宜早期藥物治療的受試哺乳動(dòng)物的診斷特征。另一個(gè)軟骨合成代謝活性的標(biāo)記物是II型原膠原前肽(PIIP)。該物質(zhì)是關(guān)節(jié)軟骨中的主要膠原，且由軟骨細(xì)胞以原膠原的形式產(chǎn)生。在膠原原纖維形成的過程中，不產(chǎn)生膠原的氨基前肽和羧基前肽被裂開并釋放進(jìn)體液中，在體液中對(duì)它們進(jìn)行測量能夠反映關(guān)節(jié)軟骨中合成代謝的活性。羧基-PIIP的水平將升高，且它在滑液中的水平與軟骨改變的放射成像證據(jù)相關(guān)。相應(yīng)的，測量滑液中羧基-PIIP的水平并與對(duì)照進(jìn)行比較，可以鑒別適宜早期藥物治療的受試哺乳動(dòng)物。處于早期關(guān)節(jié)軟骨退化的哺乳動(dòng)物的關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)液中的溶基質(zhì)素/TIMP的比例失衡也可用于鑒別這種哺乳動(dòng)物。損傷引起的關(guān)節(jié)負(fù)荷的改變可以引起過量的溶基質(zhì)素的產(chǎn)生，其是一種在IL-1的影響下由軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的酶。溶基質(zhì)素在原纖維組成的軟骨中的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在遠(yuǎn)離相關(guān)損傷的軟骨中的濃度。溶基質(zhì)素水平僅可在短時(shí)間內(nèi)升高，但當(dāng)對(duì)關(guān)節(jié)的損傷超出關(guān)節(jié)軟骨的潮間帶(tidemarkzone)且到達(dá)軟骨下骨組織時(shí)，通常軟骨下骨組織硬化之后繼發(fā)關(guān)節(jié)軟骨退化的可能性很大。另外，在用于檢測早期關(guān)節(jié)軟骨退化的十字韌帶缺損的哺乳動(dòng)物模型中，涉及溶基質(zhì)素、IL-1α、IL-1β和三種致癌基因蛋白c-MYC、c-FOS和c-JUN的合成的細(xì)胞數(shù)量增多。在滑膜中發(fā)現(xiàn)，這些主要是表面滑膜內(nèi)層細(xì)胞，而在軟骨中，所述細(xì)胞為表層和中層的軟骨細(xì)胞，以及脛骨坪的原纖維組成區(qū)域中的細(xì)胞。此外，溶基質(zhì)素和IL-1可擴(kuò)散進(jìn)脛骨坪的軟骨基質(zhì)中。溶基質(zhì)素可降解包括蛋白聚糖和IX型膠原在內(nèi)的結(jié)締組織的組分，其在關(guān)節(jié)軟骨退化早期的哺乳動(dòng)物的滑膜中被大量合成，且是軟骨損壞所涉及的主要的蛋白水解酶。溶基質(zhì)素mRNA的水平增加可在這種哺乳動(dòng)物的滑膜中檢測到，膠原酶mRNA的水平增加同樣可以檢測。IL-1的兩種亞型特別是IL-1β水平的增加可通過加強(qiáng)滑膜成纖維細(xì)胞對(duì)溶基質(zhì)素和膠原酶的基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用而刺激溶基質(zhì)素合成的增加。同時(shí)，IL-1不誘導(dǎo)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)的mRNA，并且當(dāng)滑膜中的金屬蛋白酶水平顯著增加時(shí)該抑制劑的水平仍保持不變。金屬蛋白酶由軟骨細(xì)胞以酶原的形式分泌，其在細(xì)胞外基質(zhì)大分子可發(fā)生降解之前必須被激活?；罨婕懊讣?jí)聯(lián)反應(yīng)，其中絲氨酸蛋白酶包括纖溶酶原激活物/纖溶酶原體系，發(fā)揮關(guān)鍵作用。哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)中關(guān)節(jié)軟骨的完整性取決于來自其所覆蓋的骨床的充分的支持，即下面的軟骨下骨組織的結(jié)構(gòu)特性。骨床的改變先于關(guān)節(jié)軟骨的退化改變。這些改變包括軟骨下骨組織的硬化增加，伴隨吸收震蕩能力的喪失。這些軟骨下骨組織改變是由小梁微小裂縫的不適當(dāng)修復(fù)引起的，所述微小裂縫又是由關(guān)節(jié)過量負(fù)載導(dǎo)致。軟骨下骨組織的小梁增厚是骨改變的一部分，所述改變導(dǎo)致了受累關(guān)節(jié)中骨礦物質(zhì)密度和/或體積增加，反過來這又是由骨細(xì)胞中缺失成骨細(xì)胞引起，導(dǎo)致軟骨下骨組織的類成骨細(xì)胞中變化的顯性特征。軟骨下骨組織密度的改變不僅是骨重構(gòu)過程失衡的證據(jù)，而且是最終病灶點(diǎn)軟骨損耗的關(guān)鍵因素。骨硬化也是由于該骨重建過程中的失調(diào)引起。另外，成骨細(xì)胞新陳代謝中出現(xiàn)與位點(diǎn)相關(guān)的差異，導(dǎo)致不同軟骨降解分子的產(chǎn)生。這些成骨細(xì)胞代謝物的變化繼而導(dǎo)致了軟骨細(xì)胞代謝的相應(yīng)變化，致使它們對(duì)上述類型的細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性更加敏感。成骨細(xì)胞反常和分化的表型的特征在于骨鈣蛋白、堿性磷酸酯酶、對(duì)激素激活響應(yīng)的cAMP、尿激酶代謝蛋白溶酶原激活劑(uPA)和胰島素樣生長因子1(IGF-1)的生產(chǎn)水平不同。另一個(gè)軟骨下骨活性涉及最終關(guān)節(jié)軟骨退化的證據(jù)是關(guān)節(jié)腔狹窄，其可以用骨閃爍掃描法測定。這些軟骨下骨組織活性的改變伴隨著特定骨細(xì)胞代謝物例如骨鈣蛋白的相應(yīng)改變。骨鈣蛋白是維生素K依賴型鈣結(jié)合骨蛋白，其是骨中最豐富的非膠原蛋白。骨鈣蛋白水平升高是各種疾病狀態(tài)、尤其包括關(guān)節(jié)軟骨退化的早期狀態(tài)中骨轉(zhuǎn)化的標(biāo)志。骨鈣蛋白的體液、特別是滑液水平與閃爍掃描法測定的軟骨下骨組織的改變直接相關(guān)。除了作為哺乳動(dòng)物早期關(guān)節(jié)軟骨退化指示物的軟骨下骨組織活性的標(biāo)記之外，還有軟骨和滑膜活性的代謝物也可用作指示這種早期關(guān)節(jié)軟骨退化的標(biāo)記。例如，檢測增加的軟骨低聚基質(zhì)蛋白的血清水平，作為軟骨轉(zhuǎn)化的標(biāo)記。類似地，檢測體液、特別是血清中的透明質(zhì)酸鹽的升高的水平，作為滑液炎癥的標(biāo)記。在這兩種情況下，這些代謝標(biāo)記物的增加的體液、特別是血清水平顯示早期關(guān)節(jié)軟骨退化。這里所使用的表述“體液”應(yīng)包括所有能得到的可用作臨床樣本的體液，這些體液中可以含有足夠濃度的待測化合物，使其達(dá)到所用實(shí)驗(yàn)儀器或分析方法的檢測限內(nèi)。因而，體液可包括全血、血清、血漿、尿、腦脊髓液、滑液以及空隙液和其它細(xì)胞外液。因此，前述測定通常是對(duì)來自受試哺乳動(dòng)物的樣本進(jìn)行的體外測定。附圖簡介圖1股骨髁關(guān)節(jié)和脛骨坪的軟骨變化的宏觀等級(jí)列表；圖2滑液組織學(xué)等級(jí)列表；圖3骨性關(guān)節(jié)炎狗中的軟骨細(xì)胞膠原酶-1(MMP-1)評(píng)分列表和滑膜細(xì)胞IL-1β的評(píng)分列表；圖4骨想關(guān)節(jié)炎狗的股骨髁關(guān)節(jié)和脛骨坪的軟骨的組織學(xué)分級(jí)；圖5骨性關(guān)節(jié)炎狗的滑液中PGE2水平和培養(yǎng)的滑液外植體中的LTB4水平；圖6狗初級(jí)成骨細(xì)胞釋放骨鈣蛋白；圖7狗初級(jí)成骨細(xì)胞中堿性磷酸酯酶的活性；圖8狗初級(jí)成骨細(xì)胞生成IGF-1；圖9狗初級(jí)成骨細(xì)胞的uPA活性；圖10狗初級(jí)成骨細(xì)胞生成PGE2。優(yōu)選實(shí)施方案描述為進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明的方法和成分，在下面的段落中列舉了一些可在實(shí)施所述方法中使用的典型步驟的具體的描述性實(shí)例。然而，所述實(shí)例僅供說明，不應(yīng)當(dāng)被當(dāng)作是以任何方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，為此本發(fā)明的權(quán)利要求附加在說明書之后。實(shí)施例1研究了ML3000對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨性關(guān)節(jié)炎(OA)狗模型中損傷發(fā)展的治療效果。具體而言，測定了ML3000對(duì)軟骨中膠原酶-1(MMP-1)和滑膜內(nèi)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的合成的作用，以及其對(duì)初級(jí)成骨細(xì)胞中存在或由其產(chǎn)生的堿性磷酸酯酶活性、IGF-1的生成、骨鈣蛋白的釋放、PEG2和uPA的活性的作用。實(shí)驗(yàn)組取每只重20至25kg的21只成年雜種狗(2-3歲)用于該項(xiàng)研究。如前所述(5，6)對(duì)所有狗進(jìn)行外科手術(shù)，通過刺傷的傷口，切除右膝的前十字韌帶(ACL)。手術(shù)前，用戊巴比妥鈉(25mg/kg)靜脈注射對(duì)狗進(jìn)行麻醉并插管。手術(shù)后，將狗放養(yǎng)于家庭農(nóng)場，讓其在大圍欄中自由活動(dòng)。將狗隨機(jī)分為3個(gè)治療組。組1(n＝7只狗)由接受安慰劑(甲基纖維素膠囊)的狗組成(OA狗)；組2和3(每組n＝7只狗)于手術(shù)后次日開始每日兩次接受ML3000膠囊，持續(xù)8周，總劑量分別為2.5和5mg/kg。在整個(gè)研究期間，每周/7天施用藥物。所有狗在手術(shù)后8周處死。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的所有狗都完成了研究。用ML3000治療的各組中的狗沒有發(fā)現(xiàn)藥物毒性臨床癥狀，包括那些與胃腸道有關(guān)的癥狀。來自3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的所有狗的每天的活動(dòng)水平相似，并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，狗的體重沒有變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)值以平均值±SEM表示。用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P值小于0.05，則認(rèn)定為是顯著的。宏觀分級(jí)處死后立即將每只狗的右膝解剖，置于冰上并吸取滑液。由2個(gè)獨(dú)立的不知情的觀察者(DVJ、JCF)檢查每個(gè)膝關(guān)節(jié)總體形態(tài)的改變，這些改變包括是否有骨贅形成和軟骨損傷，如前所述(5，6)。骨贅形成的程度通過測量每個(gè)股骨髁骨刺的最大寬度(mm)來分級(jí)。在股骨髁關(guān)節(jié)中間和側(cè)面以及脛骨坪上的軟骨變化分別在解剖顯微鏡(Stereozoom；Bausch&Lomb，Rochester，NY)下分級(jí)。測量關(guān)節(jié)表面變化的面積，用mm2表示。侵蝕的深度分為如下0至4級(jí)0＝表面顯示正常，1＝微小原纖維形成或表面輕微淺黃色變色，2＝侵蝕擴(kuò)散到表層或中層，3＝侵蝕擴(kuò)散到深層和4＝侵蝕擴(kuò)散到軟骨下骨組織。骨贅。在安慰劑治療的OA狗中，93％的髁中存在骨贅，測量其寬度為4.50±0.66mm。在用2.5mg/kg/天和5mg/kg/天的ML3000治療的狗中，骨贅分別存在于93％和86％的髁中。與安慰劑治療的OA組相比，這兩個(gè)治療組的骨贅寬度測量結(jié)果或多或少地小于前者(分別為3.57±0.56和3.86±0.66)，而且其差異沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平。軟骨。在安慰劑治療的OA狗中，一般嚴(yán)重等級(jí)和尺寸的軟骨損傷出現(xiàn)在于髁關(guān)節(jié)和骨坪上，且骨坪的損傷更嚴(yán)重(圖1)。用ML3000治療的兩組的髁關(guān)節(jié)和骨坪上的損傷尺寸均有顯著降低。在2.5mg/kg/天的治療組中，股骨髁關(guān)節(jié)的損傷尺寸降低了39％(P＜0.05)，脛骨坪的損傷尺寸降低了45％(P＜0.01)。在接受5mg/kg/天的治療組中，股骨髁關(guān)節(jié)的損傷尺寸也減少了(61％，P＜0.04)，而對(duì)脛骨坪的影響大約與2.5mg/kg/天的治療組相同(54％，P＜0.01)。兩中ML3000濃度將脛骨坪的損傷等級(jí)顯著降低至大約相同的程度。盡管接受治療的狗的股骨髁關(guān)節(jié)的損傷顯示等級(jí)降低的趨勢，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性?；?。安慰劑治療的OA狗的滑膜是肥大的，顯示紅色和微黃色變色，并包括大量血管。在用ML3000治療的狗中，滑液較薄，包括較少的血管，且變色程度低于安慰劑治療的OA狗。組織學(xué)分級(jí)對(duì)文獻(xiàn)所述(7，8)，對(duì)每個(gè)股骨髁關(guān)節(jié)和脛骨坪受損區(qū)域的軟骨的徑向切面進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。分割樣本，固定于TissuFix#2(GillesChaput實(shí)驗(yàn)室，Montreal，Quebec，加拿大)，并嵌于石蠟中，用于組織學(xué)評(píng)價(jià)。用番紅菌素O對(duì)系列切片(5μm)進(jìn)行染色。由兩個(gè)獨(dú)立的觀察者(DJ，JF)使用Mankin等人(12)的組織學(xué)/組織化學(xué)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將OA損害的嚴(yán)重程度分成0至14個(gè)等級(jí)。這些等級(jí)評(píng)估OA損害的嚴(yán)重程度，是基于被番紅菌素O染色的喪失(0至4級(jí))、細(xì)胞的改變(0至3級(jí))、潮標(biāo)被血管浸潤(0至1級(jí))和結(jié)構(gòu)的改變(0至6級(jí)，其中0＝正常軟骨結(jié)構(gòu)，6＝軟骨侵蝕達(dá)到軟骨下骨組織)。該等級(jí)系統(tǒng)是基于每個(gè)軟骨截面中最嚴(yán)重的組織學(xué)改變。將來自膝關(guān)節(jié)腔中間和側(cè)面槽的代表性滑膜樣本也與下面的組織進(jìn)行分離。將樣本固定于TissuFix#2中，嵌入石蠟，切片(5um)并用蘇木精和曙紅染色。對(duì)來自每個(gè)腔的2個(gè)滑膜樣本進(jìn)行檢查，連續(xù)選擇整個(gè)樣本并逐一分級(jí)。記錄每個(gè)樣本的最高評(píng)分，計(jì)算平均值并作為整個(gè)膝關(guān)節(jié)的單位。由2個(gè)獨(dú)立觀察者(DVJ，JCF)按照0至10的分級(jí)(13)對(duì)滑膜炎的嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)，對(duì)于3個(gè)組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)增加等級(jí)滑膜內(nèi)襯細(xì)胞增生(0至2級(jí))、絨毛狀增生(0至3級(jí))和細(xì)胞被單核和多形核細(xì)胞浸潤的程度(0至5級(jí))。軟骨。得自安慰劑治療的OA狗的軟骨呈現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，包括原纖維化和分裂、細(xì)胞過多和克隆、番紅菌素O染色喪失。骨坪損害的組織學(xué)評(píng)分較髁關(guān)節(jié)損傷的組織學(xué)評(píng)分略微嚴(yán)重(圖4)。在ML3000治療的狗中，髁關(guān)節(jié)的損傷不如安慰劑治療的OA狗嚴(yán)重，在最高劑量(5mg/kg/天)藥物治療組中獲得了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。這個(gè)組織學(xué)評(píng)分的降低很大程度上歸因于結(jié)構(gòu)改變的嚴(yán)重程度和番紅菌素O染色的喪失降低。在脛骨坪上，兩個(gè)ML3000劑量(2.5和5mg/kg/天)下均獲得損傷嚴(yán)重程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低(分別P＜0.002和P＜0.02)。這是因?yàn)槌?xì)胞克隆減少之外的結(jié)構(gòu)改變的嚴(yán)重程度和番紅菌素O染色喪失的降低?；ぁ５米园参縿┲委煹腛A狗的滑液是粘稠的，具有大量的長茸毛并顯示滑膜內(nèi)襯細(xì)胞增生。在ML3000治療狗中，5mg/kg/天劑量組的絨毛狀增生顯著地減少?；褐蠵GE2的測量將處死動(dòng)物時(shí)取出的滑液離心(14000g，15分鐘，4℃)，上清液用于PGE2測定。用特定酶免疫測定法(EIA)(CaymanChemical，AnnArbor，MI)測定PGE2水平。得自安慰劑治療的OA狗的滑液含有高水平的PGE2(652.8±149.9pg/ml)。用2.5和5mg/kg/天的ML3000進(jìn)行治療使該水平顯著降低(圖5)。在滑液外植體培養(yǎng)基中LTB4的生成將所有狗的代表性滑膜樣本與其下面的組織無菌分離。將樣本在Dulbecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM；Gibco-BRLLifeTechnologies，Burlington，Ontario，加拿大)中多次沖洗，將150mg組織在5％CO2/95％的潮濕空氣中、在DMEM培養(yǎng)基中、在1ug/ml脂多糖(LPS；Sigma-AldrichCanada，Oakville，Ontario，加拿大)存在下，于37℃培養(yǎng)48小時(shí)(一式兩份)。如下法從培養(yǎng)的滑膜外植體中提取LTB4將膜在EIA緩沖液(1M磷酸鹽，pH7.4，含有1％BSA、4MNaCl、10mMEDTA和0.1％疊氮化鈉)中勻漿并離心(30000g，20分鐘，4℃)。收集上清液并用EIA(CaymanChemical)測定LTB4水平。得自用1ug/mlLPS治療的OA狗的培養(yǎng)的滑膜包含大量LTB4(2.48±0.69pg/mg組織)。兩個(gè)ML3000治療組均證實(shí)了LTB4水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低(圖5)。免疫組織化學(xué)如前述(7，14)對(duì)軟骨和滑膜樣本進(jìn)行處理用于免疫組織化學(xué)分析。簡而言之，將樣本固定于4％中性緩沖甲醛水中24小時(shí)，然后嵌入石蠟。將嵌入石蠟中樣本切片(5μm)置于SuperfrostPlus載玻片上(FisherScientific，Nepean，Ontario，加拿大)、用甲苯脫石蠟、用系列等級(jí)的乙醇脫水并在37℃下于磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS；Sigma-Aldrich加拿大)中用軟骨素酶ABC(0.25單位/ml)預(yù)培養(yǎng)60分鐘。在那之后，以PBS清洗樣本，然后以0.3％過氧化氫/PBS清洗30分鐘。切片進(jìn)一步用封閉溶液(DakoDiagnostics，Mississauga，Ontario，加拿大)和5％脫脂奶培養(yǎng)60分鐘，吸干，然后用抗膠原酶-1的初級(jí)單克隆抗體(100ug/ml，稀釋1∶500，OncogeneResearchProducts，Cambridge，MA)(軟骨)或抗人IL-1β的初級(jí)抗體(1μg/ml，稀釋1∶50；BiosourceInternational，Camarillo，CA)(滑膜)在潮濕的環(huán)境下、于室溫下覆蓋18小時(shí)。每個(gè)切片用PBS(pH7.4)清洗3次，并用抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物法(VectastainABC試劑盒；DAKODiagnostics加拿大)染色。此方法需要在生物素共扼的第二抗體存在下于室溫培養(yǎng)30分鐘，然后于30分鐘內(nèi)加入抗生物素蛋白-生物素過氧化酶復(fù)合物。所有培養(yǎng)均在潮濕環(huán)境下進(jìn)行，并用含過氧化氫的3，3′-二氨基對(duì)二氨基聯(lián)苯(DAKODiagnostics加拿大)顯色。切片用中性紅(軟骨)或蘇木精/曙紅(滑膜)復(fù)染。為決定染色特異性，按照相同的實(shí)驗(yàn)方法采取3個(gè)對(duì)照步驟1)使用有20倍摩爾過量的重組膠原酶-1或IL-1β的被吸收的免疫血清(1小時(shí)，37℃)；2)省略初級(jí)抗體；和3)用自體免疫前血清代替初級(jí)抗體。我們研究中使用的純化抗原為人重組膠原酶-1(OncogeneResearchProducts)或人重組IL-lβ(Genzyme，Cambridge，MA，USA)。由每個(gè)軟骨塊制成幾個(gè)切片，并對(duì)每個(gè)樣本的切片進(jìn)行處理用于免疫組織化學(xué)分析。每個(gè)切片在光學(xué)顯微鏡(LeitzOrthoplan；WildLeitz，St.Laurent，Quebec，加拿大)下觀察，并用柯達(dá)Ektachrome64ASA膠片(Kodak，Rochester，NY)照相。軟骨(圖3)。在用安慰劑治療的狗體內(nèi)，軟骨樣本表層的大量軟骨細(xì)胞對(duì)髁關(guān)節(jié)和骨坪的膠原酶-1染色呈陽性。在ML3000治療的OA狗中，髁關(guān)節(jié)和骨坪都在膠原酶-1軟骨細(xì)胞評(píng)分上呈現(xiàn)顯著的降低，這種影響在用最高劑量藥物治療的組稍微更加顯著?；?圖3)。檢查安慰劑治療的OA狗的滑膜樣本，顯示存在大量對(duì)IL-1β染色呈陽性的內(nèi)襯細(xì)胞。在用ML3000治療的狗中，對(duì)IL-1β染色呈陽性的細(xì)胞數(shù)量呈劑量依賴性且顯著降低。形態(tài)測量學(xué)分析軟骨。對(duì)軟骨中不同抗原的量化是使用公開方法進(jìn)行的(7，14)。通過測定軟骨上部區(qū)域(表面和中間層的上部)染色呈陽性的軟骨細(xì)胞的數(shù)量來評(píng)估抗原的存在。在這一區(qū)域，軟骨被分成3個(gè)微觀區(qū)域(X40；LeitzDiaplan)并進(jìn)行平均。對(duì)于每個(gè)關(guān)節(jié)炎樣本，要確保在評(píng)估前可檢測到完整的軟骨表面，用作形態(tài)測量學(xué)分析的確認(rèn)標(biāo)記。測定軟骨細(xì)胞的總數(shù)和對(duì)特定抗原染色呈陽性的軟骨細(xì)胞的數(shù)量。最終的結(jié)果用軟骨細(xì)胞對(duì)抗原染色呈陽性的百分比來表示，所述抗原(細(xì)胞評(píng)分)具有最大評(píng)分100％。對(duì)每個(gè)切片進(jìn)行雙盲評(píng)價(jià)，得到的變異系數(shù)＜5％。為達(dá)到統(tǒng)計(jì)分析的目的，從中間和側(cè)面股骨髁和脛骨坪中得到的數(shù)據(jù)被認(rèn)為是獨(dú)立的?；?。對(duì)于滑液膜分析，對(duì)每個(gè)部位，使用我們已經(jīng)公開的方法(8)測定不同樣本的細(xì)胞評(píng)分。在滑膜內(nèi)襯水平上，將每個(gè)樣本分成5個(gè)微觀區(qū)域(X40)。用上述對(duì)軟骨的描述方法評(píng)估每個(gè)區(qū)域內(nèi)對(duì)特定抗原染色呈陽性的細(xì)胞的百分比。對(duì)滑膜內(nèi)襯細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤分別進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)評(píng)分，每個(gè)區(qū)域的最大值為100％。成骨細(xì)胞分析如下所述將脛骨的近端除去，用冷的生理鹽水沖洗并在解剖前和整個(gè)解剖過程中置于冰上。提取中間的脛骨坪以制備外植體和初級(jí)骨細(xì)胞培養(yǎng)基；不包括邊緣皮質(zhì)骨組織。首先從脛骨坪上除去其上的軟骨，并從中間骨坪的中部切除插入的外植體。然后，從軟骨下骨片上切去有橫隔片的骨組織。所有操作均在放大顯微鏡下進(jìn)行，以確保完全除去軟骨和有橫隔片的骨組織。經(jīng)少許改進(jìn)，按照(16)所述的方法，使用樣本制備初級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)基。將骨樣品切成小片(2mm2)，然后將骨樣本在沒有血清的Ham′sF-12/Dulbecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM；Sigma)中、在1mg/mlI-型膠原酶(Sigma)存在下于37℃持續(xù)消化20、20和240分鐘。這一處理方法將附著和殘留的骨髓細(xì)胞從皮層骨片上除去。用相同的介質(zhì)清洗后，將被消化的骨片在含有20％胎牛血清(FBS；Wisent，St.Bruno，Quebec，加拿大)的BGJ介質(zhì)中培養(yǎng)。每2天更換這種培養(yǎng)基，直至在Petri培養(yǎng)皿中觀察到細(xì)胞為止，此時(shí)用含10％FBS的新鮮介質(zhì)替換培養(yǎng)介質(zhì)。細(xì)胞富集后，細(xì)胞以25,000細(xì)胞/cm2的比例傳代一次，并在分析前在24孔板(Falcon，LincolnPark，NJ)上生長5天。在這種培養(yǎng)條件下得到的細(xì)胞顯示成骨細(xì)胞樣表型，如(16)所示。在最后2天的培養(yǎng)中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件，于含有2％木炭去色(stripped)FBS的Ham′sF-12/DMEM中，在50nM1，25(OH)2D3(1，25-二羥基維生素D)存在或缺失的情況下使刺激最大化，可產(chǎn)生對(duì)堿性磷酸酯活性和骨鈣蛋白分泌的最大刺激，如(16)所示。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)收集培養(yǎng)基并在實(shí)驗(yàn)前于-80℃下冷凍。然后用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)pH7.4清洗2次，并使之在堿性磷酸酯酶緩沖液(100mM甘氨酸、1mMMgCl2、1mMZnCl2、1％TritonX-100，pH10.5)中增溶60分鐘，伴以4℃下攪拌。骨鈣蛋白的釋放骨鈣蛋白的釋放是在如(16)所述為成骨細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)的最后兩天而制備的條件Ham′sF-12/DMEM(1∶1)中測量，它含有2％木炭去色的FBS并存在50nM1，25(OH)2D3或媒介(0.1％乙醇)。使用特定的酶免疫分析法(BiomedicalTechnologies，Stoughton，MA)測定初生的骨鈣蛋白。這種分析方法的檢測限為0.5ng/ml，而且2％木炭去色的FBS中包含＜0.1ng/ml的骨鈣蛋白。結(jié)果見圖6。堿性磷酸酯酶的活性在用于釋放骨鈣蛋白的細(xì)胞上測量細(xì)胞堿性磷酸酶的活性，以37℃下將細(xì)胞溶于如上所述的堿性磷酸酯酶緩沖液之后30分鐘時(shí)p-硝基苯磷酸酯(終濃度12.5mM)水解釋放p-硝基苯酚的量表示。立即等分測定堿性磷酸酯酶的活性。用Smith，P.K.、Krohn，R.I.、Hermanson，G.T.、Mallia，A.K.、Gartner，F(xiàn).H.、Provenzano，M.D.等人，“用二辛可寧酸測定蛋白質(zhì)”，AnalBiochem，150，1985，76-85中描述的二辛可寧酸法測定蛋白質(zhì)。結(jié)果見圖7。對(duì)初級(jí)成骨細(xì)胞中uPA和IGF-1的評(píng)價(jià)為了評(píng)價(jià)uPA和IGF-1，在融合的成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的條件介質(zhì)中補(bǔ)入用于最后兩天培養(yǎng)的Ham′sF-12/DMEM，不含PBS但含有1％胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒混合物(ITS，Sigma)。首先，用特定的酶聯(lián)免疫吸附劑分析法(ELISA；AmericanDiagnostica，Greenwich，CT)測定uPA水平。然后，使用Leprince，P.、Rogister，B.、Moonen，G.A.，“用比色法同時(shí)測定培養(yǎng)細(xì)胞的無血清條件培養(yǎng)基中的代謝蛋白溶酶原激活劑及其抑制劑”，AnalBiochem，177，1989，341-346中所述的方法，通過水解特異性底物DL-Val-Leu-Arg-對(duì)硝基酰苯胺(anilide)(Sigma)測定uPA的活性，所述底物釋放的對(duì)硝基苯胺可于405nm測定。PAI-1水平通過ELISA、使用可得自AmericanDiagnostica(Greewich，CT)的材料測定。用高靈敏度的不與胰島素發(fā)生交叉反應(yīng)的ELISA(DiagnosticSystemsLaboratories.Webster，TX)測定IGF-1。用只含有1％ITS的介質(zhì)進(jìn)行內(nèi)控研究，得到的任何結(jié)果都應(yīng)在檢測限下。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)樣品的條件介質(zhì)，匯總3或4份上清液，凍干，然后于pH7.4的PBS緩沖液中重構(gòu)。然后按照Mohan，S.、Bautista，C.M.、Herring，S.J.、Linkhart，T.A.、Baylink，D.J.，“在骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基中測定胰島素樣生長因子-I和-II型的有效方法進(jìn)展”，Endocrinology，126，1990，2534-42中所述方法處理樣品。結(jié)果見圖8和9。對(duì)初級(jí)成骨細(xì)胞中PGE2的評(píng)價(jià)初級(jí)成骨細(xì)胞中的PGE2的測定基本上按照與上述滑液相同的方式測定。結(jié)果見圖10。從上述結(jié)果可以得出結(jié)論平衡的COX/5-LO雙重抑制劑ML3000可顯著減少初期實(shí)驗(yàn)性O(shè)A的發(fā)展，同時(shí)在體內(nèi)抑制PGE2和LTB4的生成。藥物的保護(hù)作用被認(rèn)為在很大程度上與對(duì)主要的骨關(guān)節(jié)炎病理生理學(xué)途徑、即IL-1β和膠原酶-1的過度合成的顯著的抑制作用有關(guān)。這些作用中的一些顯示與抑制LTB4的過度生成有關(guān)。參考文獻(xiàn)1.PelletierJP、Martel-PelletierJ、HowellDS.Etiopathogenesisofosteoarthritis.InKoopmanWJ，editor.Arthritis&AlliedConditions.ATextbookofRheumatology.第14版，BaltimoreLippincottWilliams&Wilkins；2000.2195-245頁。2.Martel-PelletierJ、DiBattistaJA、LajeunesseD、Biochemicalfactorsinjointarticulartissuedegradationinosteoarthritis.InReginsterJY、PelletierJP、Martel-PelletierJ、HenrotinY，editors.OsteoarthritisClinicalandexperimentalaspects.BerlinSpringer-Verlag；1999.156-87頁。3.LauferS、TriesS、AugustinJ、DannhardtG.Pharmacologicalprofileofanewpyrrolizinederivativeinhibitingtheenzymescyclo-oxygenaseand5-lipoxygenase.Arzneimittelforschung1994；44629-36。4.LauferS、TriesS、AugustinJ、ElsasserR、AlbrechtW、GuserleR等人，Acuteandchronicanti-inflammatorypropertiesof[2，2-dimethyl-6-(4-chlorophenyl)-7-phenyl-2，3-dihydro-1H-pyrrolizine-5-yl]-aceticacid，Arzneimittelforschung1995；4527-32。5.FernandesJC、Martel-PelletierJ、OtternessIG、Lopez-AnayaA、MineauF、TardifG等人，EffectsoftenidaponcanineexperimentalosteoarthritisI.Morphologicandmetalloproteaseanalysis.ArthritisRheum1995；381290-303.6.PelletierJP、MineauF，RaynauldJP、WoessnerJFJr、Gunja-SmithZ、Martel-PelletierJ.，Intraarticularinjectionswithmethylprednisoloneacetatereduceosteoarthriticlesionsinparallelwithchondrocytestromelysinsynthesisinexperimentalosteoarthritis，ArthritisRheum1994；37414-23。7.PelletierJP、Lascau-ComanV、JovanovicD、FernandesJC、ManningP、CurrieMG等人，Selectiveinhibitionofinduciblenitricoxidesynthaseinexperimentalosteoarthritisisassociatedwithreductionintissuelevelsofcatabolicfactors，JRheumatol1999；262002-14。8.FernandesJC、Martel-PelletierJ、JovanovicD、TardifG、DiBattistaJA、Lascau-ComanV等人，Theeffeetsoftenidaponcanineexperimentalosteoarthritis.IIStudyoftheexpressionofcollagenase-1andinterleukin-1betabyinsituhybridization，JRheumatol1998；25951-8。9.PelletierJP、LajeunesseD、JovanovicDV、Laseau-ComanV、JolicoeurFC、HilalG等人，Carprofensimultaneouslyreducesprogressionofmorphologicalchangesincartilageandsubchondralboneinexperimentaldogosteoarthritis，JRheumatol2000；272893-902。10.PelletierJP、Martel-PelletierJ.，Invivoprotectiveeffectsofprophylactictreatmentwithtiaprofenicacidorintraarticularcorticosteroidsonosteoarthriticlesionsintheexperimentaldogmodel，JRheumatolSuppl1991；27127-30。11.PalmoskiMJ、BrandtKD.，Invivoeffectofaspirinoncanineosteoarthriticcartilage，ArthritisRheum1983；26994-1001。12.MankinHJ、DorfmanH、LippielloL、ZarinsA.，Biochemicalandmetabolicabnormalitiesinarticularcartilagefromosteoarthritichumanhips.II.Correlationofmorphologywithbiochemicalandmetabolicdata.JBoneJointSurgAm1971；53523-37。13.PelletierJP、Martel-PelletierJ、Ghandur-MnaymnehL、HowellDS、WoessnerJFJr.，RoleofsynovialmembraneinflammationincartilagematrixbreakdowninthePond-Nukidogmodelofosteoarthritis，ArthritisRheum1985；28554-61。14.MoldovanF、PelletierJP、HamborJ、CloutierJM、Martel-PelletierJ.，Collagenase-3(matrixmetalloprotease13)ispreferentiallylocalizedinthedeeplayerofhumanarthriticcartilageinsituInvitromimickingeffectbytransforminggrowthfactorbeta，ArthritisRheum1997；401653-61。15.HuskissonEC、BerryH、GishenP、JubbRW、WhiteheadJ.，Effectsofantiinflammatorydrugsontheprogressionofosteoarthritisoftheknee，LINKStudyGroup.LongitudinalInvestigationofNonsteroidalAntiinflammatoryDrugsinKneeOsteoarthritis.JRheumatol1995；221941-6。16.Lajeunesse，D.、Busque，L.、Ménard，P.、Brunette，M.G.、Bonny，Y.、“DemonstrationofanOsteoblastDefectinTwoCasesofHumanMalignantOsteoporosisCorrectionofthePhenotypeafterBoneMarrowTransplant”；J.ClinInvest，98，1996，1835-1842。權(quán)利要求1.一種或多于一種式(I)化合物及其光學(xué)異構(gòu)體、生理學(xué)上可接受的鹽和衍生物用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損傷的用途，其中X代表CR8R9、S、O、NR12或C(O)；A代表CR10R11或X與帶有基團(tuán)R6和R7的原子之間的鍵；基團(tuán)R1、R2、R3的其一代表任選被一個(gè)或多于一個(gè)取代基取代的芳基，取代基獨(dú)立地選自鹵素、烷基、鹵代烷基、烷氧基、芳氧基、鹵代烷氧基、烷硫基、羥基、硝基、烷基亞磺酰基、烷基磺?；?、氨磺?；?、N-烷基氨磺?；?、N，N-二烷基氨磺酰基、烷基磺酰氨基和烷基磺酰-N-烷基氨基；或代表芳香族或非芳香族的、單環(huán)或二環(huán)的、任選苯并稠合的雜環(huán)基，其具有1、2或3個(gè)獨(dú)立地選自N、O和S的雜原子且任選被一個(gè)或多于一個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自鹵素、烷基、鹵代烷基、烷氧基、芳氧基、鹵代烷氧基、烷硫基、羥基、硝基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；被酋；-烷基氨磺?；?、N，N-二烷基氨磺?；?、烷基磺酰氨基和烷基磺酰-N-烷基氨基；基團(tuán)R1、R2、R3的其二代表任選被一個(gè)或多于一個(gè)取代基取代的烷基，取代基獨(dú)立地選自鹵素、環(huán)烷基、烷氧基、三氟甲氧基、羥基和三氟甲基；任選被一個(gè)或多于一個(gè)取代基取代的環(huán)烷基，取代基獨(dú)立地選自鹵素、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、烷氧基、鹵代烷氧基和羥基；任選被一個(gè)或多于一個(gè)取代基取代的芳基，取代基獨(dú)立地選自鹵素、烷基、鹵代烷基、烷氧基、芳氧基、鹵代烷氧基、烷硫基、羥基、硝基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、氨磺?；?、N-烷基氨磺?；?、N，N-二烷基氨磺酰基、烷基磺酰氨基和烷基磺酰-N-烷基氨基；或芳香族或非芳香族的、單環(huán)或雙環(huán)的、任選苯并稠合的雜環(huán)基，其具有1、2或3個(gè)獨(dú)立地選自N、O和S的雜原子且任選被一個(gè)或多于一個(gè)取代基取代，取代基獨(dú)立地選自鹵素、烷基、鹵代烷基、烷氧基、芳氧基、鹵代烷氧基、烷硫基、羥基、硝基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；?、氨磺?；?，N-烷基氨磺酰基、N，N-二烷基氨磺?；?、烷基磺酰氨基和烷基磺酰-N-烷基氨基；基團(tuán)R1、R2、R3的其三代表H、烷基、鹵代烷基、羥基烷基、-CHO、-COOH、鹵素、氰基、烷基磺?；被酋；駼-Y，其中B代表任選被羥基或烷氧基取代的亞烷基或亞烯基；Y代表-COOH、SO3H、OPO(OH)2、OP(OH)2、-CHO或四唑基；或基團(tuán)R1、R2、R3的其二和其三與和它們相連的原子一起代表飽和或不飽和環(huán)烷基；R4至R11可以相同或不同，其代表氫、烷基、羥基烷基、烷氧基烷基、羥基、COOH或酰氧基，其中相鄰基團(tuán)也可以代表價(jià)鍵或偕二基團(tuán)，和與它們相連的碳原子一起也可以代表羰基或環(huán)烷基；R12代表氫、烷基或苯基。2.權(quán)利要求1的用途，其中基團(tuán)R1、R2、R3的其一和其二獨(dú)立地表示任選被取代的芳基或芳香族雜環(huán)殘基。3.權(quán)利要求1的用途，其中基團(tuán)R1、R2、R3的其三表示COOH或B-Y，其中Y是COOH且B表示亞烷基。4.權(quán)利要求2的用途，其中基團(tuán)R1、R2、R3的其三表示COOH或B-Y，其中Y是COOH且B表示亞烷基。5.權(quán)利要求1的用途，其中所述式(I)化合物為式(Ia)[6-(4-氯苯基)-2，2-二甲基-7-苯基-2，3-二氫-1H-吡咯里嗪-5-基]-乙酸、其生理學(xué)上可接受的鹽或生理學(xué)上可水解的酯。6.權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的用途，其中關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損傷包括關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的損傷、損壞或損耗。7.權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的用途，用于所述退化或損傷的早期的治療。8.權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的用途，用于治療哺乳動(dòng)物，所述哺乳動(dòng)物目前或預(yù)期處于所述退化或損傷的狀況。9.權(quán)利要求8的用途，其中所述哺乳動(dòng)物目前或預(yù)期處于所述狀況的所述狀態(tài)由下列一個(gè)或多個(gè)因素決定(A)對(duì)所述哺乳動(dòng)物的關(guān)節(jié)進(jìn)行臨床檢查和評(píng)價(jià)、包括測量髖關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)異常進(jìn)展所得到的陽性結(jié)果；(B)所述哺乳動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)進(jìn)行有創(chuàng)外科手術(shù)的情況；(C)使用包括射線照像和磁共振成像(MRI)在內(nèi)的無創(chuàng)手段對(duì)所述哺乳動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)進(jìn)行檢查的陽性結(jié)果；和(D)對(duì)所述哺乳動(dòng)物的體液或關(guān)節(jié)組織進(jìn)行生物化學(xué)檢查的陽性結(jié)果，涉及下列一種或多種物質(zhì)(1)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)增加；(2)腫瘤壞死因子α(TNFα)增加；(3)IL-1β與IL-1受體拮抗蛋白(IL-1Rα)的比例增加；(4)p55TNF受體(p55TNF-R)的表達(dá)增加；(5)白細(xì)胞介素-6(IL-6)增加；白血病抑制因子(LIF)增加；(6)胰島素樣生長因子-1(IGF-1)不變或減少；(7)轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)減少；血小板衍生生長因子(PDGF)不變或減少；(8)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)不變或減少；(9)硫酸角質(zhì)素增加；(10)包括溶基質(zhì)素的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)增加；(11)包括溶基質(zhì)素的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)與金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)的比例增加；(12)骨鈣蛋白增加；(13)堿性磷酸酯酶增加；(14)對(duì)激素攻擊有響應(yīng)的cAMP增加；(15)尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)增加；(16)軟骨寡聚基質(zhì)蛋白增加；(17)II型特定膠原新表位的存在，和(18)膠原酶增加。10.權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的用途，其中所述治療或預(yù)防包括施用約1至10mg/kg/天的所述化合物。11.權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的用途，其中所述治療或預(yù)防包括施用除一種或多于一種式(I)化合物之外的一種或多種基本上選自下列物質(zhì)的成分聚硫酸葡糖胺聚糖(PSGAG)、葡糖胺、硫酸軟骨素(CS)、透明質(zhì)酸(HA)、聚硫酸戊聚糖(PPS)、強(qiáng)力霉素和二甲胺四環(huán)素。12.藥物組合物，其包含(A)一種或多于一種如權(quán)利要求1所定義的式(I)化合物；和(B)一種或多種基本上選自以下物質(zhì)的成分(1)聚硫酸葡糖胺聚糖(PSGAG)、葡糖胺、硫酸軟骨素(CS)、透明質(zhì)酸(HA)、聚硫酸戊聚糖(PPS)、強(qiáng)力霉素和二甲胺四環(huán)素。13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述式(I)化合物為式(Ia)的[6-(4-氯苯基)-2，2-二甲基-7-苯基-2，3-二氫-1H-吡咯里嗪-5-基]-乙酸、其生理上可接受的鹽或生理上可水解的酯。14.治療或預(yù)防需要這種治療的哺乳動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損傷的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用對(duì)于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損傷而言治療有效量的一種或多種權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)所定義的式(I)化合物。全文摘要本發(fā)明涉及治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物患病關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨和/或軟骨下骨組織的退化或損傷，其通過施用式(I)化合物而實(shí)現(xiàn)，式(I)中的所有變量具有說明書中給出的含義。優(yōu)選的式(I)化合物為式(II)化合物。這種治療可改善、減輕、積極治療、扭轉(zhuǎn)或預(yù)防繼所述早期階段的所述退化之后的關(guān)節(jié)軟骨或軟骨下骨組織的任何損傷、損害或損耗。文檔編號(hào)A61K31/5415GK1549711SQ02817080公開日2004年11月24日申請(qǐng)日期2002年8月29日優(yōu)先權(quán)日2001年8月30日發(fā)明者J－P·皮爾蒂爾,J·馬特爾－皮爾蒂爾,J-P皮爾蒂爾,囟皮爾蒂爾申請(qǐng)人:默克勒有限公司,阿森蒂亞藥物公司