專利名稱：細(xì)胞毒性cd44抗體免疫偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于細(xì)胞毒性化合物與抗體的新的偶聯(lián)物。包含此種化合物的藥物組合物，及其在腫瘤療法上的用途。
有許多研究企圖將此種藥物與抗腫瘤相關(guān)抗原的抗體偶聯(lián)，以求用針對(duì)目標(biāo)的方式輸送至腫瘤，來提升藥物的局部濃度，增進(jìn)抗腫瘤藥物的效能。有許多這類方法已臻至有限的成功，并且在文獻(xiàn)中也已經(jīng)對(duì)數(shù)種原因進(jìn)行討論來解釋失敗的結(jié)果。為了使諸如14-羥基柔紅霉素(doxorubicin)或甲氨喋呤(methotrexate)的抗癌藥物以化學(xué)計(jì)量的方式作用，因此較高的細(xì)胞內(nèi)濃度對(duì)于呈現(xiàn)所需細(xì)胞毒性而言是必需的。這些濃度被認(rèn)為以許多抗體-藥物偶聯(lián)物很難達(dá)成，因?yàn)?a)有許多普通的抗癌藥物的效力不足，(b)抗原目標(biāo)物在細(xì)胞表面的濃度太低，(c)抗原-抗體復(fù)合物未有效內(nèi)化進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞，和(d)來自目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)部偶聯(lián)物的游離藥物不能有效釋出(Chari等人，1992年)。
先前提到的兩種缺點(diǎn)，亦即(a)與(b)已由Chari及其共事者說明過(Chari等人，1992年；Liu等人，1996年；美國專利案第5,208,020號(hào))。他們制備的抗體偶聯(lián)物中的抗體是經(jīng)由一種二硫鍵與美登木素生物堿(maytansinoid)連接。美登素屬于安沙(Ansa)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其得自奴卡氏菌(Nocardiasp.)。由細(xì)菌發(fā)酵所生產(chǎn)的美登素安沙分裂素(ansamitocin)P-3，被用做制造美登木素生物堿DM1的前體分子。美登素及其衍生物的作用為抗有絲分裂劑(微管蛋白聚合的抑制劑)，類似于長春新堿，但具有顯著高于長春新堿或其他已建立的化療劑的效力(DM1在體外以～10-10M濃度即對(duì)細(xì)胞具有毒性)。相對(duì)于游離的美登木素生物堿的高細(xì)胞毒性，該抗體偶聯(lián)物具有的毒性在抗原陰性細(xì)胞上要低于抗原陽性細(xì)胞數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)。二硫鍵連接具有的優(yōu)點(diǎn)是這些鍵可以很容易被細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽在目標(biāo)細(xì)胞中切斷，釋出具高毒性的游離藥物。這一方法已被應(yīng)用到對(duì)抗腫瘤相關(guān)抗原的抗體上，例如C242-DM1偶聯(lián)物(Liu等人，1996年；Lambert等人，1998年)，和HuN901-DM1(Chari等人，2000年)。然而，這些偶聯(lián)物的應(yīng)用卻受到限制，因?yàn)?，相?duì)應(yīng)的目標(biāo)抗原的表達(dá)有限。例如，被N901(CD56，N-CAM)識(shí)別的抗原主要是由神經(jīng)內(nèi)分泌來源的腫瘤所表達(dá)，而C242抗原(CanAg)的表達(dá)則大多受限于來源于腸胃道(GI)的腫瘤。
然而，吾人仍需藉由發(fā)現(xiàn)具有較佳抗原表達(dá)形式的適當(dāng)?shù)哪[瘤相關(guān)抗體、在目標(biāo)組織中高且具特異性的細(xì)胞表面抗原濃度、和有效的內(nèi)化過程使與抗原復(fù)合的抗體偶聯(lián)物被輸送到細(xì)胞內(nèi)部，來改進(jìn)此方法。
CD44是一種蛋白質(zhì)，其以數(shù)種相異的同種型表達(dá)在許多種細(xì)胞類型的表面。最小的同種型，亦即標(biāo)準(zhǔn)的CD44(CD44s)，是由各種不同的細(xì)胞表達(dá)，而被認(rèn)為是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外培養(yǎng)基成份粘附，并且可以在淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化中輔助刺激。相對(duì)的，在細(xì)胞外區(qū)域含v6結(jié)構(gòu)域的CD44剪接變體(CD44v6)的表達(dá)則被限制在上皮細(xì)胞的亞系中。CD44v6的生理角色尚未完全被了解。
CD44v6以及其他變體的外顯子(CD44v3，CD44v5，CD44v7/v8，CD44v10)等經(jīng)顯示為一種腫瘤相關(guān)抗原，在人類腫瘤和正常組織中有可利用的表達(dá)形式(Heider等人，1995年；Heider等人，1996年；Dall等人，1996年；Beham-Schmid等人，1998年；Tempfer等人，1998年；Wagner等人，1998年)，且被用于以抗體為基礎(chǔ)的診斷和治療方法中，尤其是腫瘤的放射免疫療法(RIT)上(stromer等人，2000年，WO95/33771，WO97/21104)。
然而，有效地用抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物殺死腫瘤細(xì)胞的先決條件是目標(biāo)抗原充分內(nèi)化。只有極少關(guān)于CD44進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的數(shù)據(jù)可獲得。Bazil和Horejsi報(bào)告過在以PMA刺激時(shí)，白細(xì)胞上CD44的下調(diào)乃是因?yàn)榭乖拿撀涠莾?nèi)化所致(Bazil和Horejsi，1992年)。CD44的脫落亦被數(shù)項(xiàng)報(bào)導(dǎo)支持，該報(bào)導(dǎo)是關(guān)于腫瘤患者和正常個(gè)體的血清中的可溶性CD44(Sliutz等人，1995年；Guo等人，1994年，Martin等人，1997年)。在最近Aguiar等人的論文中，CD44在培養(yǎng)基完整的軟骨細(xì)胞上內(nèi)化的量大約為4小時(shí)內(nèi)6％(Aguiar等人，1999年)。相似的腫瘤細(xì)胞上CD44v6低量內(nèi)化的結(jié)果在以BIA實(shí)行的實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)。把這些數(shù)據(jù)匯集，它們提出CD44受體較可能脫落而非內(nèi)化，因此CD44特異性抗體并不被認(rèn)為是美登木素生物堿偶聯(lián)物的方法的適當(dāng)候選者。這點(diǎn)業(yè)已由體外細(xì)胞增殖檢驗(yàn)結(jié)果支持，其中AbCD44v6-DMI顯示與缺乏該抗原的細(xì)胞相比較，其對(duì)抗原呈遞細(xì)胞僅有些微提高的細(xì)胞毒性。
目前已出人意料地發(fā)現(xiàn)CD44特異性抗體藉由在細(xì)胞內(nèi)可被切斷的連接體連接至其高度細(xì)胞毒性的藥物，在體內(nèi)是非常有效的腫瘤療法。
本發(fā)明提供包含CD44特異性抗體分子，而該分子經(jīng)由在細(xì)胞內(nèi)條件下可切斷的連接體連接至具高度細(xì)胞毒性的藥物的新的化合物。
尤其，本發(fā)明提供一種式A(LB)n(式(I))的化合物，其中A是對(duì)CD44具特異性的抗體分子；L是連接體分子部分；B是對(duì)細(xì)胞具有毒性的化合物；且n是n＝1至10的十進(jìn)位數(shù)字。
所述抗體分子A對(duì)于CD44具有高度的結(jié)合特異性，優(yōu)選對(duì)變體CD44有結(jié)合特異性。
“抗體分子”一詞涵蓋由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的完整免疫球蛋白，例如存在于血清者、以及由雜交瘤細(xì)胞系分泌的單克隆抗體、由重組表達(dá)在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的多肽，其具有免疫球蛋白或單克隆抗體的結(jié)合特異性、以及經(jīng)由進(jìn)一步加工而得自所述免疫球蛋白、單克隆抗體或多肽，而能保留其結(jié)合特異性者。尤其，“抗體分子”一詞包括包含兩條重鏈和兩條輕鏈的完整的免疫球蛋白，此種免疫球蛋白的片段如Fab，F(xiàn)ab′或F(ab)2片段(Kreitman等人，1993年)，重組方式生產(chǎn)的多肽，嵌合的、人類化的或完全的人類抗體(Breitling和Duebel，1999年；Shin等人，1989年；Gussow和Seemann，1991年；Winter等人，1994年，EP0 239 400，EP0 519 596；WO90/07861 EP0 368684；EP0 438 310；WO92/07075，WO92/22653，EP0 680 040，EP0 451 216)單鏈抗體(scFv，Johnson和Bird，1991年)及類似者。目前抗體亦可不必對(duì)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物進(jìn)行免疫接種即生產(chǎn)，例如藉由噬菌體展示法(Aujame等人，1997年；US5,885,793；US5,969,108；US6,300,064；US6,248,516；US6,291,158)。完全的人抗體可使用攜帶功能性人Ig基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來制備(EP0,438,474；EP0,463,151；EP0,546,073)。從先前提到的文獻(xiàn)參考中，專家可從其知道如何生產(chǎn)這些型式的抗體分子，采用典型的方法像自動(dòng)的肽和核酸合成、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物免疫接種，雜交瘤技術(shù)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，載體和表達(dá)技術(shù)、宿主細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白質(zhì)純化方法。以下“抗體”和“抗體分子”可互換使用。
“對(duì)CD44具特異性”意指抗體分子對(duì)CD44上存在的表位具有專一的結(jié)合親和力。在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體分子對(duì)于由人類CD44基因的外顯子v6變體編碼的氨基酸序列具有結(jié)合特異性。外顯子v6變體以及其他外顯子變體的序列是本領(lǐng)域中已知者(Screaton等人，1992年；Tolg等人，1993年；Hofmann等人，1991年)。本發(fā)明的較佳的抗體分子會(huì)與具有或包含隨附的序列一覽表中的氨基酸序列SEQ ID NO1，或該序列的等位基因變體的肽或多肽專一地結(jié)合。優(yōu)選，所述抗體分子對(duì)所述序列內(nèi)的表位有結(jié)合特異性。優(yōu)選，該抗體分子特異地結(jié)合至具有氨基酸序列SEQ IDNO2的肽，甚至更好的是結(jié)合至具有氨基酸序列SEQ ID NO3的肽。此種抗體可用本領(lǐng)域已知的方法很容易地生產(chǎn)(WO95/33771，WO97/21104)，例如用化學(xué)合成的具有先前提過的序列的肽，例如與牛抗原結(jié)合的，對(duì)實(shí)施室動(dòng)物進(jìn)行免疫接種，或者用重組生產(chǎn)的包含所述序列的融合蛋白進(jìn)行免疫，并根據(jù)本發(fā)明已知的方法進(jìn)行生產(chǎn)(Harlow，1988年；Catty，1988年；Koopman等，1993；Heider等，1993)。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的抗體分子是命名為VFF-18的小鼠單克隆抗體，其是以1994年六月七日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM-Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Deutschland/德國)的雜交瘤細(xì)胞系(保藏號(hào)為DSM ACC2174)生產(chǎn)的。也優(yōu)選該單克隆抗體VFF-18的Fab，F(xiàn)ab′或F(ab)2片段。在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體分子是人類化的重組抗體，其中VFF-18的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR′s)已被移植到人類免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的相應(yīng)基因之中。
單克隆抗體的“互補(bǔ)決定區(qū)”理解為與特異性抗原結(jié)合有關(guān)的那些氨基酸序列，如Kabat et al.，1991，和Chothia and Lesk，1987所述。
在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，是將適當(dāng)?shù)拇朔NCDR移植抗體的框架殘基轉(zhuǎn)變成小鼠的殘基以增進(jìn)結(jié)合親和力。從和本領(lǐng)域有關(guān)的方法之中，專家會(huì)知道怎樣得到VFF-18的CDR′s，從先前提到的具保藏編號(hào)DSM ACC2174的雜交瘤開始，選擇并獲取適當(dāng)?shù)娜祟惷庖咔虻鞍谆?，將CDR′s移植到該基因，修飾經(jīng)挑選的框架殘基，使CDR移植抗體在適當(dāng)?shù)目s主細(xì)胞中表達(dá)，例如在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中，并測試所得到重組抗體的結(jié)合親和力和特異性(請(qǐng)參考例如以上的參考文獻(xiàn))。在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體分子是具有抗體VFF-18的CDR的重組抗體。優(yōu)選，此種重組抗體是人類化的抗體，并且是包含兩個(gè)完整輕鏈和兩個(gè)完整重鏈的完整免疫球蛋白。在本發(fā)明的另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體分子是與VFF-18抗體具有相同獨(dú)特型的重組抗體。在本發(fā)明的另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體分子是結(jié)合至與抗體VFF-18同樣的表位的重組抗體。
在一項(xiàng)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體分子A是包含具氨基酸序列SEQ ID NO4的輕鏈，和具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重鏈。這種抗體稱為BIWA 4，其為以上提過的抗體VFF-18的人類化版本，在完全人類框架中具有小鼠的單克隆抗體VFF-18的互補(bǔ)決定區(qū)，和人類的恒定區(qū)。因此，其在人體為免疫原性非常低的抗體，這是一項(xiàng)有利的特性。然而，因?yàn)槠洳痪哂行∈蟮氖箍乖Y(jié)合達(dá)到最佳的框架殘基，因此其具有比親代抗體VFF-18的顯著較低的抗原結(jié)合親和力，因此不被認(rèn)為是醫(yī)療藥物的好的候選者。未預(yù)料到的是，吾人發(fā)現(xiàn)BIWA4，盡管其結(jié)合親和力很低，但卻具有非常好的生物分布且在體內(nèi)有非常好的腫瘤攝取結(jié)果，使其較諸VFF-18的其他具有較高結(jié)合親和力的人類化版本更優(yōu)越(Veral et al.，2002)。在一項(xiàng)更佳的具體實(shí)例中，抗體分子A是包含具有氨基酸序列SEQ ID NO8的輕鏈，和氨基酸序列SEQ ID NO6的重鏈的抗體。這種抗體比BIWA4具有較高的結(jié)合親和力，被稱做BIWA8。
這些抗體可以如下方式生產(chǎn)。編碼重鏈和輕鏈的核酸分子可藉由標(biāo)準(zhǔn)方法用化學(xué)和酶的方式合成。首先，適當(dāng)?shù)墓押塑账峥捎帽绢I(lǐng)域已知的方法合成(例如，Gait，M.J.，1984年)，該方法可用于生產(chǎn)人工合成的基因。用以從寡核苷酸產(chǎn)生合成基因的方法已見知于本領(lǐng)域中(例如，Stemmer等人，1995年；Ye等人，1992年；Hayden和Mandecki，1998年；Frank等人，1987)。優(yōu)選，編碼BIWA 4的輕鏈和重鏈的核酸分子分別具有SEQ ID NO5和SEQID NO7的核苷酸序列。這些序列包括編碼被宿主細(xì)胞切割的前導(dǎo)肽的序列(SEQ ID NO5前60個(gè)核苷酸；SEQ ID NO7前57個(gè)核苷酸)。在進(jìn)一步的具體實(shí)例中，編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體分子的重鏈與輕鏈的核酸分子分別具有SEQ ID NO9和SEQ ID NO7的核苷酸序列。然后這些編碼抗體重鏈和輕鏈的核酸分子可經(jīng)克隆到一個(gè)表達(dá)載體上(可使兩種鏈均在一個(gè)載體上，或每個(gè)鏈克隆到分開的載體分子上)，然后將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。適用于在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)免疫球蛋白的表達(dá)載體和將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的。通常，所述免疫球蛋白基因與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子功能性連接，所述啟動(dòng)子如人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，倉鼠遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子(WO97/15664)，或猴病毒SV40啟動(dòng)子，它們位于Ig基因的上游。為終止轉(zhuǎn)錄，需要使用適當(dāng)?shù)慕K止/多腺苷酸位點(diǎn)，如牛生長激素或SV40的那些。另外，增強(qiáng)子序列也應(yīng)包括在其中，如CMV或SV40增強(qiáng)子。通常，所述病毒載體還包括選擇標(biāo)記基因，如二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，谷氨酰胺合成酶基因，腺苷脫氨酶基因，腺苷酸脫氨酶基因，或新霉素抗性基因，博萊霉素抗性基因，或嘌呤霉素抗性基因。各種表達(dá)載體可從商業(yè)渠道購買，如Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen，Carlsbad，CA；Promega，Madison，WI或BD Biosciences Clontech，PaloAlto，CA。例如，表達(dá)載體pAD-CMV1(NCBI基因庫登錄號(hào)碼A32111)或pAD-CMV19(NCBI基因庫登錄號(hào)碼A32110)可用于表達(dá)。該宿主細(xì)胞優(yōu)選哺乳動(dòng)物的宿主細(xì)胞，例如COS，CHO或BHK細(xì)胞，更好是中國倉鼠的卵巢(CHO)細(xì)胞，例如CHO-DUKX(Urlaub和Chasin，《PNAS》(美國國家科學(xué)院志)，第77期(7)4216-20頁(1980年))，CHO-DG44(Urlaub等人，《細(xì)胞》，第33期405-412頁(1983年)，或CHO-K1(ATCC CCL-61)細(xì)胞。然后將該宿主細(xì)胞于抗體生產(chǎn)的條件下，培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒖贵w從培養(yǎng)物中分離出來。用于在宿主細(xì)胞中從重組DNA生產(chǎn)抗體的方法和對(duì)應(yīng)的表達(dá)載體為本領(lǐng)域中已詳知者(請(qǐng)參考，例如WO94/11523，WO97/9351，EP0481 790，EP0 669 986)。
為了將抗體分子A連接到對(duì)細(xì)胞有毒性的化合物B上，所以使用一種連接的分子部分L。在最簡單的情形中，該連接用的分子部分L是化學(xué)鍵，優(yōu)選在細(xì)胞內(nèi)的條件下能被切斷的共價(jià)鍵。在本發(fā)明的一項(xiàng)具體實(shí)例中，該鏈介于抗體分子的硫原子(例如位在半胱氨酸的側(cè)鏈者)和另一個(gè)在毒性化合物中的硫原子之間。在另一項(xiàng)具體實(shí)例中，該連接用分子部分L由1個(gè)或更多原子或化學(xué)基團(tuán)組成。適當(dāng)?shù)倪B接基團(tuán)已詳知于本領(lǐng)域，且包括二硫化物基團(tuán)、硫醚基團(tuán)、易被酸破壞的基團(tuán)、易受光破壞的基團(tuán)、易受肽酶破壞的基團(tuán)和易被酯酶破壞的基團(tuán)。較佳者為二硫化物基團(tuán)和硫醚基團(tuán)。
本發(fā)明的抗體分子與毒性化合物的偶聯(lián)物可利用目前已知或較晚研發(fā)出來的技術(shù)來形成。該毒性化合物可經(jīng)修飾以產(chǎn)生游離的氨基，然后經(jīng)由一個(gè)易受酸破壞的連接物或者易受光破壞的連接物而連接到抗體分子上。該毒性化合物可與肽縮合并緊接著連接至一種抗體分子以產(chǎn)生易被肽酶破壞的連接物。該毒性化物可經(jīng)處理以產(chǎn)生一級(jí)羥基，該羥基可經(jīng)琥珀酰基化并連接至抗體分子而產(chǎn)生能被細(xì)胞內(nèi)的酯酶切斷以釋出游離藥物的偶聯(lián)物。最好是將該毒性化合物處理使其產(chǎn)生游離或經(jīng)保護(hù)的硫醇基團(tuán)，然后將一個(gè)或更多含有二硫化物或硫醇的毒性化合物以共價(jià)方式經(jīng)由二硫鍵連接至抗體分子。
例如，抗體分子可藉由已知的方法用交連劑如N-琥珀酰亞氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，4-琥珀酰亞氨基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT)，N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)-丁酸酯(SDPB)，N-琥珀酰亞氨基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亞氨基-5-(2-吡啶基二硫代)戊酸鹽、2-氫硫醇亞胺?；蛞阴；晁狒麃磉M(jìn)行修飾，請(qǐng)參考，Carlsson等人，1978年；Blattler等人，1985年；Lambert等人，1983年；Klotz等人，1962年；Liu等人，1979年；Blakey和Thorpe，1988年；Worrell等人，1986年。在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，連接物分子部分是衍生自SPP的4-硫代戊酸鹽或5-硫代戊酸鹽。然后將由此得到的含有游離或經(jīng)保護(hù)的硫醇基團(tuán)的抗體分子與含有二硫化物或硫醇的毒性化合物反應(yīng)以產(chǎn)生偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物可藉由HPLC或凝膠過濾法予以純化。
“有毒的”是指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的化合物。用于偶合的有毒化合物可具細(xì)胞靜止或是細(xì)胞毒性的作用，且導(dǎo)致細(xì)胞周期停止或細(xì)胞死亡。這些化合物可在細(xì)胞周期不同的階段起作用，例如藉由干擾核酸合成，使核酸失活，或藉由和微管蛋白結(jié)合。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)細(xì)胞有毒的化合物B是美登木素生物堿，亦即一種美登素(CAS35846538)的衍生物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，其是美登木素生物堿的C-3酯。適于和抗體偶聯(lián)而用于癌癥療法的美登木素生物堿，包括制備該美登木素生物堿及其與抗體分子的連接，已由Chari和其同僚說明過(Chari等人，1992年；Liu等人，1996年；美國專利案第5,208,020號(hào))。這些美登木素生物堿可用于本發(fā)明。在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該毒性化合物是N2′-去乙?；?N2′-(3-巰基-1-氧代丙基)-美登素(CAS編號(hào)139504-50-0)，亦稱為DM1。優(yōu)選，該美登木素生物堿是一種美登素醇(maytansinol)衍生物，經(jīng)由二硫鍵與抗體分子連接在美登素醇的C-3位置上，在一項(xiàng)尤佳的具體實(shí)例中，該抗體/美登木素生物堿偶聯(lián)物可制備自下式的美登木素生物堿式(II) 其中R1代表H或SR4，其中的R4代表甲基、乙基、直鏈烷基、分支的烷基、環(huán)烷基、簡單的或經(jīng)取代的芳基或雜環(huán)基；R2代表Cl或H；R3代表H或CH3；且m代表1，2或3。
優(yōu)選，R1是H，CH3或SCH3，R2是Cl，R3是CH3，且m＝2。
R1＝H，R2＝Cl，R3＝CH3且m＝2的化合物在文獻(xiàn)中稱為DM1。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物具有下式式(III)
其中A是特異于CD44的抗體分子，其優(yōu)選特異于外顯子v6變體，優(yōu)選特異于SEQ ID NO3氨基酸序列；(L′)是視需要而定的連接體分子部分p是十進(jìn)位數(shù)字，p＝1至10。
優(yōu)選，p為3至4，更好是大約3.5。
用于制備此種美登木素生物堿的方法在本領(lǐng)域中已知(尤其請(qǐng)參考美國專利案第5,208,020號(hào)，實(shí)施例1)。方便地制備方法是，第一步，由屬于諾卡氏菌屬或束絲放線菌屬的微生物，例如ATCC31565，ATCC31281(US4,356,265；US4,450,234；WO01/77360)，通過細(xì)菌發(fā)酵制備美登木素生物堿C-3酯安絲菌素P3。安絲菌素P3可從培養(yǎng)物中用有機(jī)溶劑如乙基乙酸酯或甲苯來提取，用例如二氧化硅凝膠通過吸附層析進(jìn)行進(jìn)一步純化。然后用LiAlH4(US4,360,462)或者用近來報(bào)道的LiAl(OMe)3H或其他LiAl或NaAl雜合體(WO02/16368)對(duì)其還原形成美登素醇。所述美登素醇可例如，應(yīng)用二環(huán)己基碳二亞胺(DDC)(dicyclohexylcarbodiimide)和催化量的氯化鋅(US4,137,230；US4,260,609)，在C-3位置用N-甲基-L-丙氨酸或N-甲基-L-半胱氨酸衍生物酯化以產(chǎn)生包含二硫化物的美登木素生物堿(US5,208,020；US5,416k,064；US6,333,410)。在有序那實(shí)施方案中，所述美登素醇用下式的N-甲基-N-(3-甲基二硫代丙酰基)-L-丙氨酸 以產(chǎn)生式(II)的美登木素生物堿，其中，R1＝SR4，R4＝CH3，R2＝Cl，R3＝CH3，且m＝2。
所述游離的硫醇基可通過用二硫蘇糖醇(DTT)對(duì)二硫鍵的裂解來釋放，以產(chǎn)生例如DM1。
當(dāng)細(xì)胞內(nèi)切割發(fā)生時(shí)，游離的毒性化合物就被從偶聯(lián)物A(LB)n釋出。從化合物A(LB)n釋出的游離藥物可具有式B-X，其中X是一個(gè)原子或化學(xué)基團(tuán)，視該切割反應(yīng)的本質(zhì)而定。優(yōu)選X是一個(gè)氫原子，例如當(dāng)連接體分子(linker moiety)部分僅是介于兩個(gè)硫原子中間的共價(jià)鍵時(shí)，或X為羥基。該切割部位亦可在連接體分子部分之中，若該連接體分子部分是一個(gè)化學(xué)基團(tuán)，當(dāng)切割時(shí)能產(chǎn)生式B-L＂-X的游離藥物，其中X是一個(gè)原子或一個(gè)化學(xué)基團(tuán)，視該切割反應(yīng)的本質(zhì)而定，優(yōu)選X是氫原子或羥基。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，式(I)的化合物的毒性要比毒性化合物B、B-X或當(dāng)細(xì)胞內(nèi)切割作用發(fā)生時(shí)所釋出的B-L＂-X的毒性小。體外檢測細(xì)胞毒性的方法在本領(lǐng)域中已知(Goldmacher等人，1985年；Goldmacher等人，1986年；亦請(qǐng)參考美國專利案第5,208,020號(hào)，實(shí)施例2)。優(yōu)選，該化合物(I)的毒性比切割作用時(shí)釋出的游離藥物的毒性要小10倍或更多，更好是100倍或更多，或甚至1000倍或更多。
優(yōu)選抗體分子/美登木素生物堿偶聯(lián)物是經(jīng)由二硫鍵所連接者，如以上所討論，其能運(yùn)送美登木素生物堿分子。此種細(xì)胞結(jié)合偶聯(lián)物是藉由已知的方法制備，如用琥珀酰亞氨基吡啶基-二硫代丙酸鹽(SPDP)或戊酸鹽(SPP)修飾單克隆抗體(Carlsson等人，1978年)。然后將所得到的硫代吡啶基藉由含硫醇的美登木素生物堿處理予以置換，產(chǎn)生以二硫化物連接的偶聯(lián)物?；蛘撸诜蓟虼赖悄舅厣飰A的情形中，該抗體偶聯(lián)物的形成是藉由將先前導(dǎo)入抗體分子的氫硫基直接置換美登木素生物堿的芳基硫醇來實(shí)現(xiàn)的。包含1至10種以二硫鍵連接的美登木素生物堿藥物的偶聯(lián)物很容易由所述方法之一來制備。在本發(fā)明書的上下文中，吾人需了解式A(LB)n中的十進(jìn)位數(shù)字n是一個(gè)平均數(shù)，因?yàn)椴⒎撬薪o定制備物的偶聯(lián)物分子都具有完全相同的整數(shù)個(gè)LB殘基與抗體分子連接。
更具體地，將濃度為1毫克/毫升(存在于0.1M磷酸鉀緩沖液，pH7.0，其中包含1mM EDTA)的以二硫代吡啶基修飾的抗體溶液用含有硫醇的美登木素生物堿處理(1.25摩爾當(dāng)量/二硫代吡啶基)。吡啶-2-硫酮從經(jīng)修釋的抗體釋出是以光譜分析術(shù)在343納米波長下進(jìn)行檢測，并且在大約30分鐘內(nèi)完成。將抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物純化，并藉由凝膠過濾法通過SephadexG-25柱除去未反應(yīng)的藥物和其他低分子量的物質(zhì)。每一抗體分子上所結(jié)合的美登木素生物堿的數(shù)目是藉由測量波長252納米和280納米下吸光值的比率來決定。以此方法可得到平均有1-10個(gè)美登木素生物堿分子/每個(gè)抗體分子經(jīng)由二硫鍵連接。
還有一方面，本發(fā)明是關(guān)于對(duì)CD44v6有特異性的抗體分子與美登木素生物堿的偶聯(lián)物。在本說明書中，“CD44v6專一的”應(yīng)意指該抗體對(duì)于存在于一種肽中的表位有特異的結(jié)合親和力，而該肽具有由CD44的外顯子v6變體所編碼的氨基酸序列，該CD44則優(yōu)選人類的CD44。本發(fā)明優(yōu)選的抗體分子能特異地結(jié)合具有或包含附帶的序列表中SEQ ID NO1的氨基酸序列的肽或多肽，或所述序列的等位基因變體。優(yōu)選，所述抗體分子對(duì)所述序列中的表位具有結(jié)合特異性。更優(yōu)選，所述抗體分子特異性結(jié)合具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，更優(yōu)選具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的肽。
優(yōu)選，所述偶聯(lián)物中的抗體分子是單克隆抗體VFF-18(DSM ACC2174)或具有VFF-18的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的重組抗體。更優(yōu)選該抗體包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4，或者亦可選擇SEQ ID NO8的輕鏈，和具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重鏈。
該美登木素生物堿優(yōu)選以二硫化物分子部分連接至抗體，且該美登木素生物堿具有下式式(IV) 其中，與抗體的連接是經(jīng)由如式IV所示的硫原子到存在于抗體分子的第二個(gè)硫原子上。為了產(chǎn)生此種能用于鍵結(jié)的硫原子，可藉由導(dǎo)入如以上所列的適當(dāng)連接體修飾該抗體分子。優(yōu)選，所述美登木素生物堿通過S-CH2CH2-CO-，-S-CH2CH2CH2CH2-CO-或-S-CH(CH3)CH2CH2-CO-基團(tuán)連接抗體分子。在所述連接體基團(tuán)中的所述硫原子與美登木素生物堿形成二硫鍵，而羰基官能團(tuán)被鍵合到抗體分子中氨基酸殘基側(cè)鏈上存在的氨基官能團(tuán)上。
通過上述方式，一個(gè)或多個(gè)美登木素生物堿殘基連接到抗體分子上。
最優(yōu)選的是CD44v6特異性的抗體分子和美登木素生物堿的偶聯(lián)物，其中所述的抗體包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4的輕鏈和具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重鏈，且其中所述的美登木素生物堿具有下式式(IV) 并且其通過二硫鍵與抗體連接。優(yōu)選，所述連接基團(tuán)是-S-CH2CH2CH2CH2-CO-或-S-CH(CH3)CH2CH2-CO-，并且每個(gè)抗體分子結(jié)合美登木素生物堿殘基的數(shù)目是3到4個(gè)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明是關(guān)于生產(chǎn)式(I)化合物的方法，其包括以下步驟(a)將游離的或經(jīng)保護(hù)的硫醇基導(dǎo)入對(duì)CD44具特異性的抗體分子；(b)使步驟(a)的抗體分子與對(duì)細(xì)胞有毒的化合物反應(yīng)，該化合物具有一個(gè)或更多二硫化物或硫醇基團(tuán)；且(c)回收所產(chǎn)生的偶聯(lián)物。
優(yōu)選，該抗體分子對(duì)CD44v6具特異性，更好是對(duì)SEQ ID NO3的氨基酸序列具特異性，且該對(duì)細(xì)胞有毒的化合物是美登木素生物堿，更優(yōu)選為式(II)的美登木素生物堿，最好是具有R1＝H，R2＝Cl，R3＝CH3和m＝2的美登木素生物堿。在更佳的具體實(shí)例中，該抗體包含具有氨基酸序列SEQ IDNO4或SEQ ID NO8的輕鏈，和具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重鏈。
在所述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，(2-吡啶基)-3-二硫代丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯)，(2-吡啶基)-4-二硫代戊酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(N-琥珀酰亞氨基-4-(2-吡啶基二硫代)-戊酸酯)或(2-吡啶基)-5-二硫代戊酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(N-琥珀酰亞氨基-5-(2-吡啶基二硫代)-戊酸酯)可用于將游離的或經(jīng)保護(hù)的硫醇基引入到抗體分子中。本發(fā)明還涉及由所述方法獲得的化合物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明是關(guān)于一種包含式(I)化合物的藥物組合物，優(yōu)選與一種醫(yī)藥上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑在一起的組合物。
適當(dāng)?shù)尼t(yī)藥上可接受的載體、稀釋劑和賦形劑是已知的，且可由熟習(xí)本領(lǐng)域者測定以做為臨床情況的保證。適當(dāng)?shù)妮d體、稀釋劑和/或賦形劑的實(shí)例包括(1)杜貝克氏(Dulbecco′s)磷酸鹽緩沖的鹽溶液，pH大約為7.4，其含有大約1毫克/毫升至25毫克/毫升人類血清白蛋白，(2)0.9％鹽溶液(0.9％w/v NaCl)和(3)5％(w/v)右旋糖。
更優(yōu)選，存在于藥物組合物中的抗體分子是單克隆抗體VFF-18，或具有抗體VFF-18的CDR′s(優(yōu)選在人類框架中)的重組抗體。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括具有氨基酸序列SEQ ID NO4或SEQ ID NO8的輕鏈，和具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重鏈。優(yōu)選該毒性化合物是式(II)的美登木素生物堿。
本發(fā)明的所述化合物可用于各種臨床或非臨床的應(yīng)用中，其中毒性化合物靶向細(xì)胞表面表達(dá)CD44，優(yōu)選表達(dá)CD44v6的細(xì)胞。
該偶聯(lián)物可例如臨床上在癌癥治療中自體移植之前，于體外使用以將腫瘤細(xì)胞從骨髓移除。治療可如以下方式實(shí)行。從患者或其他個(gè)體收獲骨髓，然后培養(yǎng)在含有添加了根據(jù)本發(fā)明的式(I)化合物的包含血清的培養(yǎng)基中，該化合物濃度范圍是從大約10微摩爾濃度至1pM摩爾濃度，經(jīng)大約30分鐘至大約48小時(shí)，于大約37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。確切的培養(yǎng)的濃度與時(shí)間的條件(即等于劑量)可以很容易地由熟悉本領(lǐng)域者測定出來。培養(yǎng)之后，用含有血清的培養(yǎng)基沖洗骨髓細(xì)胞，并以根據(jù)已知方法的i.v.灌輸送回病人體內(nèi)。在患者于骨髓收獲和再灌輸經(jīng)處理細(xì)胞之間接受了其他治療，如消融性的(ablative)化學(xué)療法過程或全身輻射治療的情況下，該處理過的細(xì)胞則利用標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)設(shè)備在液態(tài)氮中冷凍保存。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明是關(guān)于一種治療癌癥的方法，其包括如以上說明對(duì)患者施用一種藥物組合物。尤其，本發(fā)明的這方面是關(guān)于一種治療需要的患者體內(nèi)癌癥的方法，其包括對(duì)患者施用治療有效量的如以上說明的化合物，或如以上說明的藥物組合物。優(yōu)選該癌癥為頭部和頸部的鱗狀細(xì)胞癌(SCC)，食管SCC，肺SCC，皮膚SCC，乳腺腺癌(AC)，肺AC，子宮頸(cervix)SCC，胰腺AC，結(jié)腸AC或胃AC。
為了癌癥的臨床治療，根據(jù)本發(fā)明的式(I)化合物可用作檢測不育(sterility)和內(nèi)毒素水平的溶液。偶聯(lián)物施用的適當(dāng)方法如下。偶聯(lián)物可每周施給達(dá)一至六周，以i.v.大丸劑(bolus)方式，或以連續(xù)輸注的方式輸注五天。大丸劑可溶于50至100毫升生理鹽水施予，該鹽溶液中已添加了5至10毫升人類的血清白蛋白。連續(xù)輸注則可在每24小時(shí)期間以250至500毫升的生理鹽水形式施予，而該鹽溶液已添加了25至50毫升的人血清白蛋白。每次的施用劑量為10毫克至400毫克/每平方米身體表面積。施用于患者的劑量必須夠高才能有效，但必須低于毒性限制劑量(dose limiting toxicity)(DLT)。一般而言，低于DLT的充分良好的被耐受劑量被認(rèn)為是最大可耐受劑量(MTD)。專家會(huì)知道如何測定MTD(Lambert等人，1998年)。用于每周施用，MTD可被期望在100至200毫克/平方米的范圍?；蛘?，施用的間隔可以更長，例如，二周至四周，優(yōu)選三周。在此情形之中，MTD可被期望在200至300毫克/平方米的范圍?；蛘?，可采5次每日施用劑量，接著數(shù)周停止施用，而后可重復(fù)予以治療。在此情形之中，每次施用的MTD被期望在低于100毫克/平方米。例如，偶聯(lián)物可用單一i.v.輸注的方式，以3毫克/分鐘，每21日施用之。該施用達(dá)7個(gè)治療循環(huán)?？梢岳斫猓绻R床需要上述使用的劑量可以超出所給定的范圍。例如，如果發(fā)現(xiàn)MTD比所提示的高，可以以高于400mg/m2的劑量單次給藥，或每周可以以高于200mg/m2的劑量給藥。
劑量、施用途徑、施用計(jì)劃表、重復(fù)性與治療療程一般而言視疾病的本質(zhì)(腫瘤的類型、等級(jí)和階段等)和患者(體質(zhì)、年齡、性別等)的情況，由負(fù)責(zé)該治療的醫(yī)學(xué)專家確定。除了固體腫瘤的治療，根據(jù)本發(fā)明的醫(yī)療應(yīng)用尤其有利于做為手術(shù)介入的佐劑，以治療最少的殘余疾病。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明是關(guān)于式(I)化合物用于制備治療癌癥的藥物組合物的應(yīng)用。更好的是，存在于藥物組合物中的抗體分子是單克隆抗體VFF-18，或具有抗體VFF-18的CDR′s的重組抗體，優(yōu)選處在人類的框架中。最好的是一種包含具有SEQ ID NO4或SEQ ID NO8的輕鏈，與SEQID NO6的重鏈的抗體分子。優(yōu)選該毒性化合物具有式(II)的化學(xué)式。優(yōu)選該癌癥為頭部和頸部的鱗狀細(xì)胞癌(SCC)，食管SCC，肺SCC，皮膚SCC，乳腺腺癌(AD)，肺AC，子宮頸SCC，胰腺AC，結(jié)腸AC或胃AC。
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實(shí)施例1.材料與方法1.1.體外的細(xì)胞增殖試驗(yàn)為了測定存活的細(xì)胞，吾人使用細(xì)胞效價(jià)96AQueous(Cell Titer 96AQueous)非放射性細(xì)胞增殖檢測(Promega公司出品)。將每孔5000個(gè)細(xì)胞接種到含90微升沒有酚紅的培養(yǎng)基的96孔板中。使細(xì)胞放置1至3小時(shí)，然后添加免疫偶聯(lián)物在10微升PBS中的連續(xù)稀釋液。用不含免疫偶聯(lián)物的細(xì)胞做為陰性對(duì)照組。將細(xì)胞培養(yǎng)在37℃，潮濕的5％CO2氛圍中培養(yǎng)4天，然后根據(jù)制造商的建議添加20微升的MTS/PMS。在37℃培養(yǎng)另外1-4小時(shí)以后，利用ELISA平板讀數(shù)機(jī)記錄在490納米波長下的吸光值。對(duì)每一個(gè)細(xì)胞株而言，分析三個(gè)重復(fù)樣品。利用GraphPad Prism(第3.0版本)軟件計(jì)算存活的細(xì)胞組分的百分率和IC50值。
1.2.制備BIWI 1把對(duì)于SEQ ID NO1中的表位有結(jié)合特異性的人類化重組抗體BIWA 4連接至如以上說明的美登木素生物堿MD1。該偶聯(lián)物稱為BIWI 1。
產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。將編碼BIWA 4的輕鏈與重鏈的基因，即SEQID NO5和SEQ ID NO7連接到表達(dá)載體pAD-CMV 1(WO 92/01055；NCBIGenBank查詢編號(hào)A32111)或pAD-CMV19(NCBI GenBank查詢編號(hào)A32110)。對(duì)于第二種抗體BIWA 8而言，輕鏈?zhǔn)怯删哂蠸EQ ID NO9的基因編碼，而重鏈則與BIWA 4中的相同。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株是藉由如下的電穿孔法產(chǎn)生的。吾人使用CHO DUX/57ss(中國倉鼠卵巢細(xì)胞的dhfr陰性突變株，經(jīng)改造能適應(yīng)無血清的上清液培養(yǎng))。在胰蛋白酶處理和用RPMI-10(90％RPMI 1640，10％熱失活的胎牛血清)使胰蛋白酶失活之后，將細(xì)胞用RPMI-0(不含血清的RPMI 1640)沖洗一次，并將1×107個(gè)細(xì)胞重新懸浮在0.8毫升RPMI-0之中。在添加線性化的DNA(每一質(zhì)粒20微克；使編碼輕鏈和重鏈的載體共同感染)之后，利用Hoefer氏電穿孔法在以下條件下進(jìn)行電穿孔1080μF，320V，1000毫秒，一個(gè)脈沖。細(xì)胞容許留置5分鐘，然后稀釋成12500細(xì)胞/毫升和2500細(xì)胞/毫升于α-MEM 10d中(90％MEM-α，不含核苷且不含去氧核苷(GIBCO BRL出品)，10％熱失活的經(jīng)透析的胎牛血清)。將細(xì)胞接種到96孔微量滴定板中(200微升/每孔，分別相當(dāng)于2500和500個(gè)細(xì)胞/每孔)。十天之后出現(xiàn)克隆。只對(duì)500個(gè)細(xì)胞/每孔的板作后續(xù)處理(3-6個(gè)克隆/每孔)。14至15天以后，將得自每孔的上清液以κ/γELISA試驗(yàn)將53個(gè)克隆接種于含α-MEM 10d的12孔板中。3至6天以后(視細(xì)胞匯合情況而定)，將上清液再次以κ/γELISA檢測(連續(xù)稀釋)，并且利用人類的IgG1標(biāo)準(zhǔn)物予以定量。將細(xì)胞冰凍并貯存在液態(tài)氮中。53個(gè)克隆的IgG含量范圍是自12-417ng/ml。挑選10個(gè)具有最高表達(dá)水平的克隆，并予次克隆如下將每個(gè)克隆的細(xì)胞接種到96孔的微量滴定板中，密度為1和5個(gè)細(xì)胞/每孔在100微升/每孔α-MEM 10d中(每個(gè)克隆和每種密度使用一個(gè)板)。8天后，將上清液以1∶2稀釋，并將此稀釋液100微升以κ/γELISA檢測，且利用BIWA 4制備物作為標(biāo)準(zhǔn)定量之。將每一克隆的5個(gè)次克隆轉(zhuǎn)移到12孔板中。IgG的量是自1.3-908ng/ml的范圍。用具有最高表達(dá)水平(384-908ng/ml)的14個(gè)克隆以氨甲喋呤擴(kuò)增如下起初將克隆培養(yǎng)在25cm2的含α-MEM 10d和20，50及100nM氨甲喋呤的培養(yǎng)瓶中。待克隆長滿后，將上清液以κ/γELISA測試。在緊接的擴(kuò)增循環(huán)中，使氨甲喋呤的濃度提高到2000nM，起初最高表達(dá)水平的范圍是從10.5-14.8微克/毫升(克隆A31/100，100nM氨甲喋呤)。進(jìn)一步用500nM的氨甲喋呤進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生19-20微克/毫升的表達(dá)(A31/500)。
抗體的純化。以如下方式從細(xì)胞培養(yǎng)上清液純化抗體。將含有抗體的組織培養(yǎng)上清液上樣至5毫升蛋白A Sepharose柱上，在4℃以80-90毫升/每小時(shí)的流速進(jìn)行。用50毫升結(jié)合緩沖液(0.1M磷酸鈉，pH7.5)沖洗之后，用洗脫緩沖液(0.1M甘氨酸-HCl，pH2.7)洗脫Ig的級(jí)分。對(duì)波長280納米的吸光值進(jìn)行監(jiān)測。
用SPP修飾BIWA 4以形成BIWA 4-SS-Py。用液態(tài)形式供應(yīng)BIWA 4，在含Tween 20的PBS制劑中的濃度為5毫克/毫升。在將DM1偶合到MAb之前，先把Tween 20除去。用25mM MES緩沖液(pH5.6，含50mM NaCl)(MES緩沖液)將MAb溶液(40毫升)稀釋15倍，然后上樣至Sepharose S管柱(12.5毫升)上，該柱已用MES緩沖液(流速100cm/小時(shí))平衡過。將該柱用10倍柱體積的MES緩沖液沖洗?？贵w則以含有400mM NaCl的MES緩沖液洗脫。將抗體溶液對(duì)450mM磷酸鉀緩沖液，pH6.5，含50mM NaCl和2mM EDTA(緩沖液A)進(jìn)行透析。用SPP((2-吡啶基)-5-二硫代戊酸N-羥基琥珀酰亞胺酯修飾BIWA 4抗體以導(dǎo)入二硫代吡啶基。將緩沖液A中的MAb(185毫克，8毫克/毫升)用EtOH中過量7倍摩爾的SPP(5％v/v MAb溶液)進(jìn)行修飾。使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行90分鐘。然后用凝膠過濾層析對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行處理，使之通過以緩沖液A平衡過的Sephadex G25F(2.6×31.5cm柱，167毫升)。將含MAb的級(jí)分匯集，藉由測量280nm的吸光值以及在343nm的吸光值變化來測定修飾的程度，該吸光值變化是由添加DTT所釋出的2-巰基吡啶所引起。釋出的2-巰基吡啶濃度乃利用的8080M-1cm-1的ε343nm來計(jì)算，而MAb的濃度則是在280nm吸光值經(jīng)校正得知2-巰基吡啶的貢獻(xiàn)后，利用224,000M-1cm-1的ε280nm來計(jì)算。(2-巰基吡啶的A280nm＝A343nm×5100/8080)。MAb的回收率為99.6％，每個(gè)MAb分子有5.5個(gè)可釋放的2-巰基吡啶基團(tuán)與之相連。
使BIWA 4-SS-Py與DM1連接。利用超過可釋放的2-巰基吡啶基團(tuán)1.7倍摩爾的DM1連接濃度為2.5毫克MAb/毫升的溶于緩沖液A的以上修飾過的MAb(184毫克)。將DM1添加到DMA(3％v/v的MAb溶液)中，并使反應(yīng)混合物在室溫下培養(yǎng)29小時(shí)。然后用凝膠過濾層析法在以PBS平衡過的Sephacryl S300 HR柱(5×50cm柱，980毫升，流速為10cm/小時(shí))上分離出偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物以單峰形式被洗脫出來，在帶有少量先前洗脫的蛋白質(zhì)的單體MAb的位置上。對(duì)各級(jí)分進(jìn)行檢驗(yàn)以得知與每個(gè)MAb分子連接的DM1分子的數(shù)目。(藉由測定波長252nm和280nm的吸光值測定所連接的DM1分子)。根據(jù)所得的結(jié)果，將代表63-77％柱體積的級(jí)分匯集起來。匯集溶液中的DM1/MAb比率經(jīng)發(fā)現(xiàn)為3.1，且根據(jù)起始MAb得知偶聯(lián)的BIWA 4的產(chǎn)率為75％。在非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE以評(píng)估偶聯(lián)物BIWI1，且發(fā)現(xiàn)其主要由單體(＞95％)和微量(＜5％)的二聚體偶聯(lián)物所組成。
對(duì)體外的BIWI1結(jié)合進(jìn)行分析。對(duì)BIWA 4抗體和BIWI1偶聯(lián)物與抗原陽性FaDu細(xì)胞的結(jié)合進(jìn)行測定。將細(xì)胞(1-2×10-5)在96孔板中，在冰上與不同濃度的抗體或偶聯(lián)物培養(yǎng)1小時(shí)。把試驗(yàn)物從所述板上洗下來，并予添加FITC標(biāo)記的抗人類IgG，然后在冰上繼續(xù)避光培養(yǎng)1小時(shí)。在沖洗之后，把細(xì)胞用1％多聚甲醛固定，并且在熒光活化細(xì)胞分類機(jī)(FACS)上進(jìn)行分析。BIWA 4抗體以1×10-9M的表觀KD結(jié)合，而BIWI1則以1.8×10-9M的表觀KD結(jié)合。因此，與DM1的偶聯(lián)只不過些微地改變了抗體的結(jié)合親和力。
1.3.在裸鼠身上進(jìn)行的效力研究BIWI1在體內(nèi)的抗腫瘤效力是在兩個(gè)施用抗原陽性的人類腫瘤的裸鼠異種移植模型上進(jìn)行的，其相異處在于腫瘤的來源，程度和CD44v6表達(dá)的同質(zhì)性(homo geneity)A431(ATCC#CRL 1555；外陰的類上皮細(xì)胞癌)，F(xiàn)aDu(ATCC#HTB 43；咽部的鱗狀細(xì)胞癌)。腫瘤細(xì)胞株A431和FaDu是得自ATCC，并且在含有10％胎牛血清和補(bǔ)充物的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
把小鼠任意編入以下的處理組中(處理/最初的平均腫瘤體積/腫瘤體積范圍/小鼠的數(shù)目)A431第1組對(duì)照組(PBS)/185±217mm3/19-424mm3/5只小鼠第2組BIWA4(21mg/kg/每日)/133±115mm3/42-302mm3/5只小鼠第3組BIWI1(2.1mg/kg/每日)/107±63mm3/42-205mm3/5只小鼠第4組BIWI1(7mg/kg/每日)/132±73mm3/42-205mm3/5只小鼠第5組BIWI1(21mg/kg/每日)/107±63mm3/42-205mm3/5只小鼠FaDu第1組對(duì)照組(PBS)/142±82mm3/134-268mm3/8只小鼠第2組BIWA4(21mg/kg/每日)/134±86mm3/42-268mm3/6只小鼠第3組BIWI1(2.1mg/kg/每日)/149±96mm3/50-268mm3/6只小鼠第4組BIWI1(7mg/kg/每日)/132±97mm3/42-268mm3/6只小鼠第5組BIWI1(21mg/kg/每日)/129±74mm3/50-231mm3/6只小鼠將1×106個(gè)腫瘤細(xì)胞皮下移植到6周大的雌性NMRI-nu/nu小鼠的右側(cè)。當(dāng)腫瘤達(dá)到107至185mm3的平均大小時(shí)，開始進(jìn)行治療。治療包括i.v.內(nèi)注射BIWI1，連續(xù)5天施予，從第1天開始。對(duì)以下3種不同的BIWI1劑量進(jìn)行平行的試驗(yàn)2.1mg/kg/每日BIWI1，相當(dāng)于30微克/kg/每日DM1；7mg/kg/每日BIWI1，相當(dāng)于100微克/kg/每日DM1；和21mg/kg/每日BIWI1，相當(dāng)于300微克/kg/每日DM1。對(duì)照組動(dòng)物則未予治療(PBS)或以未偶聯(lián)的抗體治療(對(duì)照抗體，21mg/kg/每日)。藉由測量腫瘤大小來監(jiān)測腫瘤的生長。將腫瘤應(yīng)答評(píng)定等級(jí)為完全應(yīng)答，即當(dāng)該腫瘤在開始治療后的任何時(shí)間完全消失。將腫瘤應(yīng)答評(píng)定等級(jí)為部分應(yīng)答，即當(dāng)治療后腫瘤積體減少，但隨后又開始再生長。對(duì)該治療的耐受性是在整個(gè)觀察期間藉由測量小鼠的體重來監(jiān)測。
2.結(jié)果與討論2.1.BIWI1的體外細(xì)胞毒性BIWI 1的體外細(xì)胞毒性是利用抗原陽性細(xì)胞株A431和FaDu，以及抗原陰性細(xì)胞株A459進(jìn)行評(píng)估的。將細(xì)胞暴露于不同濃度的BIWI 14天，然后用MTS/PMS染色，并且在ELISA平板讀取機(jī)上進(jìn)行測定。然后利用GraphPad Prism軟件套裝計(jì)算細(xì)胞中存活的細(xì)胞比例。結(jié)果顯示于

圖1。BIWI1能有效殺死抗原陽性的A431細(xì)胞，其IC50約為7.6×10-8M；并且能有效殺死第二種抗原陽性的細(xì)胞株FaDu，其IC50約為2.4×10-8M?？乖幮缘募?xì)胞株A549則會(huì)受偶聯(lián)物作用影響，其IC50約為1.3×10-7M，在所試驗(yàn)的最高BIWI 1濃度下(5×10-7M)有50％的存活比例。這些結(jié)果顯示BIWI 1在體外對(duì)于抗原陽性細(xì)胞的細(xì)胞毒性僅比對(duì)抗原陰性細(xì)胞者略強(qiáng)。為了進(jìn)行比較，另一種DM1-抗體偶聯(lián)物對(duì)抗原陽性細(xì)胞的毒性比對(duì)抗原陰性細(xì)胞的毒性至少高1000倍(Chari et al.，1992)。
2.2.在A431異種移植裸鼠中的效力將包含5只小鼠的各組分別用2.1mg/kg/每日BIWI1，7mg/kg/每日BIWI1，21mg/kg/每日BIWI1和21mg/kg/每日對(duì)照抗體治療。開始治療時(shí)腫瘤的平均大小分別為185+/-217mm3(PBS)，133+/-115mm3(對(duì)照抗體)，107+/-63mm3(21mg/kg/每日BIWI1)，132+/-73mm3(7mg/kg/每日BIWI1)和107+/-63mm3(2.1mg/kg/每日BIWI1)。觀察期間，每一組的平均腫瘤體積顯示于圖2中。以對(duì)照抗體治療的腫瘤顯示與未經(jīng)治療的腫瘤有相似的生長情形，腫瘤體積的倍增時(shí)間大約為五日。以7mg/kg/每日BIWI1或21mg/kg/每日BIWI1治療的動(dòng)物中，所有腫瘤均完全應(yīng)答，并且在第17天左右消失。未有任何腫瘤再生被觀察到，直至觀察期末(第134天)。在3/5的情形中，以2.1mg/kg/每日治療的腫瘤完全有應(yīng)答，直到第134天都沒有腫瘤再生。余下的兩個(gè)腫瘤顯示部分應(yīng)答，但最終有再生現(xiàn)象。該結(jié)果顯示BIWI1會(huì)在A431異種移植裸鼠體內(nèi)誘發(fā)視劑量而定的抗腫瘤應(yīng)答，而其完全與長久持續(xù)應(yīng)答的使用劑量為2.1mg/kg/每日BIWI1至21mg/kg/每日BIWI1。未偶聯(lián)的對(duì)照抗體則顯示沒有抗腫瘤的效果。
請(qǐng)參考圖2。
2.3.在FaDu異種移植的裸鼠身上的效力包含在6只小鼠的各組分別用2.1mg/kg/每日BIWI1，7mg/kg/每日BIWI1，21mg/kg/每日BIWI1和21mg/kg/每日對(duì)照抗體治療。一開始治療時(shí)腫瘤的平均大小分別為142+/-82mm3(PBS)，134+/-86mm3(對(duì)照抗體)，129+/-74mm3(21mg/kg/每日BIWI1)，132+/-97mm3(7mg/kg/每日BIWI1)和149+/-96mm3(2.1mg/kg/每日BIWI1)。觀察期間，每組的腫瘤平均體積顯示于圖3。用對(duì)照組抗體和2.1mg/kg/每日BIWI1治療的腫瘤顯示與未經(jīng)治療的腫瘤相似的生長情形，腫瘤體積倍增時(shí)間大約為5天。在以21mg/kg/每日BIWI1治療的動(dòng)物中，所有的腫瘤均完全應(yīng)答且在第24天左右完全消失。直到觀察期末(第107天)未有任何腫瘤再生被發(fā)現(xiàn)。有1/6腫瘤以7mg/kg/每日BIWI1治療者完全應(yīng)答，而有3/6顯示其部分應(yīng)答。余下的兩個(gè)腫瘤顯示其與未經(jīng)治療的對(duì)照腫瘤有相似的生長情形。這些結(jié)果顯示BIWI1會(huì)在FaDu異種移植的裸鼠身上誘發(fā)出視劑量而定的抗腫瘤反應(yīng)，而其完全且長久持續(xù)應(yīng)答的使用劑量為7mg/kg/每日BIWI1至21mg/kg/每日BIWI1。未偶聯(lián)的對(duì)照抗體則顯示沒有抗腫瘤的效果。
請(qǐng)參考圖3。
2.4.在裸鼠體內(nèi)的耐受性以BIWI1治療的耐受性是藉由在2個(gè)模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的全部期間監(jiān)測小鼠的體重來判定。所觀察到每組的平均體重減少的最大值是5％。在以21mg/kg/每日BIWI1治療的FaDu異種移植小鼠身上(圖4)。重量減輕是從治療第3天左右開始，并持續(xù)到第10天，其后動(dòng)物重量再回復(fù)并且表現(xiàn)相似于對(duì)照組的動(dòng)物。在所有其他的劑量組群中，重量減輕的情形相似于賦形劑對(duì)照組(PBS)。在所有治療組中5％或少于此的平均重量減輕指出裸鼠體內(nèi)對(duì)于所給劑量的BIWI1治療有良好的耐受性。因?yàn)锽IWI1不會(huì)與小鼠的CD44v6有交叉反應(yīng)，所以只有獨(dú)立于抗原的效果，比如由游離的DM1所引起的毒性能在此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中被監(jiān)測到。
3.在MDA-MB 453中的體內(nèi)抗腫瘤效力
3.1材料與方法BIWI1的體內(nèi)抗腫瘤效力在裸小鼠異種移植模型中，應(yīng)用抗原陽性人腫瘤MDA-MB 453(ATCC#HTB-131；乳腺癌)檢測。所述細(xì)胞得自ATCC，在包含10％胎牛血清和添加劑的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將1×106個(gè)腫瘤細(xì)胞移植到6周齡的雌性NMR-nu/nu小鼠右側(cè)腹皮下。為進(jìn)行治療試驗(yàn)，通過使腫瘤碎片傳代來培養(yǎng)腫瘤。在腫瘤達(dá)到平均大小188mm3至245mm3時(shí)，開始治療。每周i.v.注射BIMI1，共4周。3個(gè)不同劑量的BIMI1平行測試6.25mg/Kg BIMI1相當(dāng)于100μg/Kg DM1，12.5mg/Kg BIMI1相當(dāng)于200μg/KgDM1和25mg/Kg BIMI1相當(dāng)于400μg/Kg DM1。用PBS處理動(dòng)物作為腫瘤生長對(duì)照。腫瘤的生長通過測定腫瘤的大小來監(jiān)測。處理開始后任何時(shí)間腫瘤完全消失時(shí)，腫瘤的應(yīng)答被定義為完全應(yīng)答。
3.2結(jié)果和討論6只小鼠的各組分別用6.25mg/Kg BIMI1，12.5mg/Kg BIMI1和25mg/KgBIMI1處理，一周一次，共4周。開始處理時(shí)的平均腫瘤大小分別是246+/-79mm3(PBS)，216+/-85mm3(6.25mg/Kg BIMI1)，188+/-79mm3(12.5mg/Kg BIMI1)和207+/-96mm3(25mg/Kg BIMI1)。觀察期間每組腫瘤的平均體積如圖5所示。起初對(duì)照腫瘤體積增加一倍的時(shí)間大約5天。用25mg/Kg BIMI1治療的動(dòng)物中，所有腫瘤完全應(yīng)答，在開始治療后的22天左右消失了。直到觀察期結(jié)束時(shí)(64天)仍然沒有觀察到腫瘤生長。用12.5mg/Kg BIMI1或6.25mg/Kg BIMI1治療的腫瘤，每一劑量組中5/6完全應(yīng)答，每組4只動(dòng)物直到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍然沒發(fā)現(xiàn)腫瘤。這些結(jié)果顯示，當(dāng)每周給藥BIMI1一次，給藥4周時(shí)，其可在MDA-MB 453異種移植裸鼠中誘導(dǎo)出極好的抗腫瘤應(yīng)答，即BIMI1從6.25mg/Kg至25mg/Kg時(shí)可產(chǎn)生完全且持續(xù)長時(shí)間的應(yīng)答。
附圖簡述圖1BIWI1的體外細(xì)胞毒性。其中使用抗原陽性的細(xì)胞株A431和FaDu以及抗原陰性的細(xì)胞株A549。
圖2BIWI1在經(jīng)A431腫瘤異種移植裸鼠身上的治療效果。每組的平均腫瘤體積與標(biāo)準(zhǔn)差均顯示在圖中，且治療組別亦經(jīng)指出。箭頭指出治療的開始(第1天)。
圖3BIWI1在經(jīng)FaDu腫瘤異種移植裸鼠身上的治療效果。每組的平均腫瘤體積與標(biāo)準(zhǔn)差均顯示在圖中，且治療組別亦經(jīng)指出。箭頭指出治療的開始(第1天)。
圖4BIWI1治療的耐受性。其中顯示在兩個(gè)研究的模型中所有治療組別的平均體重變化。第1天治療的開始。
圖5BIWI1在用MDA-MB453腫瘤異種移植裸鼠中的治療效力。每組的平均腫瘤體積與標(biāo)準(zhǔn)差均顯示在圖中，且治療組別亦經(jīng)指出。箭頭指示治療的天數(shù)。
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<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>42<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu1 5 10 15Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg20 25 30Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala35 40<210>2<211>14<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr1 5 10<210>3<211>11<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Trp Phe Gly Ash Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg1 5 10<210>4<211>213<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人源化的小鼠抗體<400>4Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Ile20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr35 40 45Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr115 120 125Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu145 150 155 160Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser165 170 175Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala180 185 190Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe195 200 205Asn Arg Gly Glu Cys210<210>5<211>702<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人源化的小鼠抗體<400>5atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctgctct ggctcccaga taccaccgga 60gaaattgttc tcacccagtc tccagcaacc ctgtctctgt ctccagggga gagggccacc 120ctgtcctgca gtgccagctc aagtataaat tacatatact ggtaccagca gaagccagga 180caggctccta gactcttgat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgcgcgc 240ttcagtggca gtgggtctgg aaccgacttc actctcacaa tcagcagcct ggagcctgaa 300gattttgccg tttattactg cctgcagtgg agtagtaacc cgctcacatt cggtggtggg 360accaaggtgg agattaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ga702<210>6<211>444<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述人源化的小鼠抗體<400>6Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Ile50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val100 105 110Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser115 120 125Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys130 135 140Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu145 150 155 160Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu165 170 175Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr180 185 190Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Ash His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val195 200 205Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro210 215 220Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe225 230 235 240Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val245 250 255Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe260 265 270Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro275 280 285Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr290 295 300Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala325 330 335Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg340 345 350Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly355 360 365Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro370 375 380Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser385 390 395 400Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln405 410 415Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His420 425 430Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440<210>7<211>1392<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人源化的小鼠抗體<400>7atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct aagactctcc 120tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatgacatgt cttgggttcg ccaggctccg 180gggaaggggc tggagtgggt ctcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcta 240gacagtataa agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cctgtacctg 300caaatgaaca gtctgagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaag acaggggttg 360gactactggg gtcgaggaac cttagtcacc gtctcctcag ctagcaccaa gggcccatcg 420gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1140ctgacctgcc tggtcaaagg cttcratccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380ccgggtaaat ga 1392<210>8<211>213<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人源化的小鼠抗體BIWA8輕鏈SEQ ID NO8<400>8Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Ile20 25 30Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ile Leu Ile Tyr35 40 45Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr115 120 125Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu145 150 155 160Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser165 170 175Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala180 185 190Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe195 200 205Asn Arg Gly Glu Cys210<210>9<211>702<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人源化的小鼠抗體BIWA8輕鏈SEQ ID NO9<400>9atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctgctct ggctcccaga taccaccgga 60gaaattgttc tcacccagtc tccagcaacc ctgtctctgt ctccagggga gagggccacc 120ctgtcctgca gtgccagctc aagtataaat tacatatact ggctccagca gaagccagga 180caggctccta gaatcttgat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgcgcgc 240ttcagtggca gtgggtctgg aaccgacttc actctcacaa tcagcagcct ggagcctgaa 300
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1.一種式A(LB)n的化合物，其中A是對(duì)CD44具特異性的抗體分子；L是一種連接體分子部分；B是對(duì)細(xì)胞具有毒性的化合物；且n是十進(jìn)位數(shù)字，n＝1至10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該連接體分子部分具有能在細(xì)胞內(nèi)部被切斷的化學(xué)鍵。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其中該化學(xué)鍵是二硫鍵。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的化合物，其中該抗體分子對(duì)人類CD44的外顯子v6有特異性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的化合物，其中該抗體分子對(duì)氨基酸序列SEQID NO3中的表位有特異性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5的化合物，其中該抗體分子是VFF-18單克隆抗體(DSMACC2174)或具有VFF-18的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的重組抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6的化合物，其中該抗體分子包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4或氨基酸序列SEQ ID NO8的輕鏈，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重鏈。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7的化合物，其中該毒性化合物B是美登木素生物堿。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的化合物，其中所述美登木素生物堿具有下式(式(II)) 其中R1代表H或SR4，其中R4代表甲基、乙基、直鏈烷基、分支的烷基、環(huán)烷基、簡單的或經(jīng)取代的芳基或雜環(huán)基；R2代表Cl或H；R3代表H或CH3；且m代表1，2或3。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的化合物，其中R1是H或CH3，R2是Cl，R3是CH3且m＝2。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10的化合物，其式為(式(III)) 其中A是對(duì)CD44具有特異性的抗體分子，(L′)是一種視需要而用的連接體分子部分，p是十進(jìn)位數(shù)字，p＝1至10。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11的化合物，其中p是3至4。
13.一種對(duì)CD44v6具特異性的抗體分子與美登木素生物堿的偶聯(lián)物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的偶聯(lián)物，且其中所述抗體分子對(duì)氨基酸序列SEQ ID NO3中的表位是特異性的。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的偶聯(lián)物，其中所述抗體分子是VFF-18單克隆抗體(DSM ACC2174)或具有VFF-18的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的重組抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述抗體分子包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4或氨基酸序列SEQ ID NO8的輕鏈，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重鏈。
17.根據(jù)權(quán)利要求13或16任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述美登木素生物堿是以二硫化物分子部分連接至所述抗體分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求13至17任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述美登木素生物堿具有下式(式(IV))
19.對(duì)CD44v6具特異性的抗體分子和美登木素生物堿的偶聯(lián)物，其中所述抗體包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4的輕鏈，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重鏈，其中所述的美登木素生物堿具有下式(式(IV)) 并且該美登木素生物堿通過二硫鍵與所述抗體連接。
20.權(quán)利要求13至19任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述一個(gè)或多個(gè)美登木素生物堿殘基與抗體分子連接。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的偶聯(lián)物，其中3至4個(gè)美登木素生物堿殘基與抗體分子連接。
22.權(quán)利要求13至21任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述美登木素生物堿通過-S-CH2CH2-CO-，-S-CH2CH2CH2CH2-CO-，或-S-CH(CH3)CH2CH2-CO-基團(tuán)與抗體分子連接。
23.制備根據(jù)權(quán)利要求1至12的化合物A(LB)n，或根據(jù)權(quán)利要求13至22的偶聯(lián)物的方法，其包括以下步驟(a)把一個(gè)或更多個(gè)游離的或經(jīng)保護(hù)的硫醇基引入對(duì)CD44具特異性的抗體分子；(b)使步驟(a)的抗體分子與對(duì)細(xì)胞有毒的化合物反應(yīng)，所述化合物具有一個(gè)或更多個(gè)二硫化物或硫醇基團(tuán)；并且(c)回收所產(chǎn)生的偶聯(lián)物。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述抗體分子是對(duì)CD44v6特異性的。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗體分子是對(duì)SEQ ID NO3中的表位特異性的。
26.權(quán)利要求23至25任一項(xiàng)的方法，其中所述有毒的化合物是美登木素生物堿。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述美登木素生物堿具有下式(式(II)) 其中R1代表H或SR4，其中R4代表甲基、乙基、直鏈烷基、分支的烷基、環(huán)烷基、簡單的或經(jīng)取代的芳基或雜環(huán)基；R2代表Cl或H；R3代表H或CH3；且m代表1，2或3。
28.權(quán)利要求27的方法，其中R1是H或CH3，R2是Cl，R3是CH3且m＝2。
29.權(quán)利要求23至28任一項(xiàng)的方法，其中(2-吡啶基)-3-二硫代丙酸N-羥基琥珀酰亞氨酯，(2-吡啶基)-4-二硫代戊酸N-羥基琥珀酰亞氨酯，或(2-吡啶基)-5-二硫代戊酸N-羥基琥珀酰亞氨酯用于將游離的或經(jīng)保護(hù)的硫醇基引入到抗體分子。
30.根據(jù)權(quán)利要求23至29任一項(xiàng)的方法獲得的化合物。
31.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至12或30的化合物A(LB)n，或根據(jù)權(quán)利要求13至22的偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或附形劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求1至12或30的化合物A(LB)n，或根據(jù)權(quán)利要求13至22的偶聯(lián)物，在制備治療癌癥的藥物組合物中的用途。
33.權(quán)利要求32的用途，其中所述癌癥是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，食管鱗狀細(xì)胞癌，肺鱗狀細(xì)胞癌，皮膚鱗狀細(xì)胞癌，子宮頸(cervix)鱗狀細(xì)胞癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌，結(jié)腸腺癌或胃腺癌。
34.根據(jù)權(quán)利要求1至12或30的化合物A(LB)n，或根據(jù)權(quán)利要求13至22的偶聯(lián)物，或根據(jù)權(quán)利要求31的藥物組合物治療癌癥的用途。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的用途，其中所述癌癥是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，食管鱗狀細(xì)胞癌，肺鱗狀細(xì)胞癌，皮膚鱗狀細(xì)胞癌，子宮頸鱗狀細(xì)胞癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌，結(jié)腸腺癌或胃腺癌。
36.一種治療癌癥患者的方法，其包括給藥所述患者治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至12或30的化合物A(LB)n，或根據(jù)權(quán)利要求13至22的偶聯(lián)物，或根據(jù)權(quán)利要求31的藥物組合物。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述癌癥是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，食管鱗狀細(xì)胞癌，肺鱗狀細(xì)胞癌，皮膚鱗狀細(xì)胞癌，子宮頸鱗狀細(xì)胞癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌，結(jié)腸腺癌或胃腺癌。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于細(xì)胞毒性化合物與抗體的新偶聯(lián)物，包含該偶聯(lián)物的藥物組合物，及它們?cè)诎┌Y療法中的用途。具體而言，本發(fā)明是關(guān)于美登木素生物堿與CD44特異性抗體的偶聯(lián)物，所述美登木素生物堿優(yōu)選是N
文檔編號(hào)A61K31/5386GK1509187SQ02810163
公開日2004年6月30日 申請(qǐng)日期2002年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月18日
發(fā)明者岡瑟·阿道夫, 卡爾-海因茨·海德, 埃里克·帕特澤爾特, 馬利斯·斯普羅爾, 帕特澤爾特, 斯普羅爾, Ｒ虼摹ず５, 岡瑟 阿道夫 申請(qǐng)人:貝林格爾·英格海姆國際有限公司, 貝林格爾 英格海姆國際有限公司