專利名稱：用于組織修復(fù)的方法和器件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療病變或受損組織，特別是治療與原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的關(guān)節(jié)軟骨變性的方法和器件，和治療通過由于運(yùn)動損傷或創(chuàng)傷導(dǎo)致的其他關(guān)節(jié)軟骨損傷的方法和器件。本發(fā)明還可應(yīng)用于組織增大(例如，用于美容目的)。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨被覆骨關(guān)節(jié)(例如膝關(guān)節(jié))的骨骼，在這里，它可以保證低摩擦力的穩(wěn)定運(yùn)動，并且提供對壓縮的耐受性和負(fù)荷分布。關(guān)節(jié)軟骨表現(xiàn)為透明軟骨的簡單的、無血管的基質(zhì)，但是，實(shí)際上它由根據(jù)基質(zhì)形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)組構(gòu)成四個(gè)區(qū)域(即表層區(qū)、過渡區(qū)、中間區(qū)和鈣化區(qū))的、由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形成的相對復(fù)雜的形式組成。反過來，上述每一個(gè)區(qū)又包括三個(gè)獨(dú)立的區(qū)(即細(xì)胞周區(qū)、區(qū)域區(qū)、和區(qū)域間區(qū))。軟骨細(xì)胞占人類關(guān)節(jié)軟骨體積的比例低于5％，因此，為了保持組織完整性(即大小和機(jī)械特性)，更換降解的ECM分子是必要的。ECM包括多種成分，這些成分包括膠原(主要是II型膠原)、糖蛋白、蛋白聚糖和組織液，它最多可占關(guān)節(jié)軟骨組織重量的大約80％。所述膠原成分供給了ECM纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)，而所述糖蛋白被認(rèn)為有助于該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。蛋白聚糖包括大的聚集的單體(即聚集蛋白聚糖)，由它填充纖維間的空間，并且因?yàn)樗哂械奈芰Γ徽J(rèn)為造成了關(guān)節(jié)軟骨彈性和負(fù)荷分布特性的大部分。最后，包括營養(yǎng)源和氧氣的所述組織液，提供了具有抗壓縮以及在變形之后恢復(fù)其規(guī)則形狀的能力的關(guān)節(jié)軟骨(有關(guān)綜述參見Temenoff和Mikos，2000)。
由關(guān)節(jié)軟骨變性或損傷導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疼痛，是困擾所有年齡段的人群的疾病。其主要成因是原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎和創(chuàng)傷導(dǎo)致的軟骨損失(Buckwalter和Mankin，1998)。最近，業(yè)已估算出僅在美國就以多達(dá)4300萬人患有某種形式的關(guān)節(jié)炎(參見以下網(wǎng)站的“關(guān)節(jié)炎小冊子”http//orthoinfo.aaos.org/)，同時(shí)由運(yùn)動損傷導(dǎo)致的軟骨損傷也很常見。
不幸的是，并且部分由于它的復(fù)雜結(jié)構(gòu)(Temenoff和Mikos，szpra)，關(guān)節(jié)軟骨具有極低的自我修復(fù)能力，因此，關(guān)節(jié)軟骨變性和損傷會持續(xù)多年時(shí)間，并且通常會導(dǎo)致進(jìn)一步的變性(即繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎)。
關(guān)節(jié)軟骨變性的治療方案可以根據(jù)四條原則分類，即置換、緩解、切除和重建。關(guān)節(jié)軟骨的置換包括使用假體或同種異體移植物。癥狀緩解可以通過截骨手術(shù)實(shí)現(xiàn)，這種手術(shù)切除了有缺陷的關(guān)節(jié)中骨骼之一的一部分，以便減輕負(fù)荷和張力。切除表示通過手術(shù)取出變性的關(guān)節(jié)軟骨，并且隨后連接健康的周圍關(guān)節(jié)軟骨組織。所述切除手術(shù)可能包括或不包括使用插入關(guān)節(jié)成形術(shù)，最后，重建表示治愈或再生所述關(guān)節(jié)表面，包括關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨。重建可能包括試圖增強(qiáng)自我修復(fù)(例如，通過使用諸如生長因子的藥用制劑，或軟骨下鉆孔，摩擦或微型骨折，以便從骨髓中“募集”多能干細(xì)胞)，或者通過移植具有再生關(guān)節(jié)軟骨能力的骨細(xì)胞或其他細(xì)胞再生新的關(guān)節(jié)表面。
為了開發(fā)合適的“重建”治療，或者更確切地講，包括再生新關(guān)節(jié)表面的治療(有時(shí)稱之為“生物學(xué)表面再生”)，近年來業(yè)已進(jìn)行了大量研究。所述治療與截骨術(shù)或假體置換相比，對患者的創(chuàng)傷較小，并且與使用同種異體移植物相比也具有優(yōu)點(diǎn)。所述同種異體移植物可能不具有免疫耐受能力，并且可能含有外源病原體，或者多種同種異體移植物不可避免地會在所述患者的其他部位導(dǎo)致?lián)p傷。業(yè)已提出的一種“生物學(xué)表面再生”治療，包括從患者的關(guān)節(jié)軟骨生物活組織檢查物中收獲軟骨細(xì)胞(Freed等，1999)。在培養(yǎng)物中擴(kuò)增所述細(xì)胞，并且通過在骨膜瓣下注射，回輸?shù)剿龌颊唧w內(nèi)。對所述骨膜瓣進(jìn)行縫合，以便將擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞保留在需要修復(fù)的部位。盡管在過去十年中，業(yè)已證實(shí)這種治療方法在人類實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好前景(Temenoff和Mikos，同上)，由于需要骨膜瓣，增加了對該技術(shù)的額外限制，并且將所述骨膜瓣縫合在注射軟骨上方的動作，可能導(dǎo)致對相鄰組織的損傷。另外，沒有證據(jù)表明所述擴(kuò)增的細(xì)胞保持了軟骨細(xì)胞的表型和功能特征。實(shí)際上，它們可能分化成成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，這種細(xì)胞能產(chǎn)生有機(jī)械缺陷的組織。
使用上述自體細(xì)胞系統(tǒng)和骨膜瓣的一種潛在的替代方案是使用預(yù)先成型的多孔支架，該支架接近所述病變或受損組織的所需形狀和形式，并且業(yè)已接種過軟骨細(xì)胞，并且培養(yǎng)了至少2-3周時(shí)間。然后將所形成的所述組織等同物移植到需要部位(Thomson等，1995)。用基于膠原的支架進(jìn)行的最新研究一直充滿著希望。不過，在本領(lǐng)域中進(jìn)行的大多數(shù)現(xiàn)有研究是為了鑒定適合支架的合成聚合物材料，因?yàn)檫@種材料可以大量生產(chǎn)，并且可以克服有關(guān)不能從供體膠原中完全清除病原體的可能性的問題(Temenoff和Mikos，同上)，研究過的合成聚合物材料的具體例子是FIDA-批準(zhǔn)的聚合物纖維、聚乙交酯(PGA)、聚丙交酯(PLA)和聚(丙交酯-共乙交酯共聚物)(PLGA)?？梢钥棾杉啿嫉乃鼍酆衔锢w維是生物可以降解的，因此，與不可降解的聚合物相比，它所具有的優(yōu)點(diǎn)是，它們的逐漸降解穩(wěn)定地產(chǎn)生了供組織生長使用的空間，并且，其次，它們還消除了在重建關(guān)節(jié)軟骨之后通過手術(shù)取出所述支架的必要性。
不過，支架的使用具有必須通過手術(shù)植入的顯著缺陷。因此，其他研究小組致力于開發(fā)可以隨軟骨一起注射的聚合物，并且，這些聚合物隨后在原位進(jìn)行交聯(lián)，形成支架基質(zhì)。例如，可以混合并且注射血纖蛋白原和凝血酶，其中，形成了一種可降解的血纖蛋白網(wǎng)(Sims等，1998)，并且業(yè)已研究了藻酸鹽，因?yàn)樗赡芘c鈣發(fā)生交聯(lián)(Rodriguez和Vacanti，1998)。不過，業(yè)已發(fā)現(xiàn)藻酸鹽是免疫原性的(Kulseng等，1999)，并且能引起比合成聚合物材料更強(qiáng)的炎性反應(yīng)(Cao等，1998)。因此，業(yè)已用可注射的合成聚合物凝膠材料進(jìn)行了研究，所述材料包括環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷共聚物PEO-共-PPO(Cao等，同上)，以及聚環(huán)氧乙烷和α-羥酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物(Hubbell，1998)。
本發(fā)明涉及組織再生的替代方法，特別是關(guān)節(jié)軟骨再生，其中，將軟骨細(xì)胞和/或其他合適的祖細(xì)胞與可生物再吸收的珠或顆粒結(jié)合或混合，以便給予受試者的需要組織再生的部位。據(jù)信，所述方法使它本身具有上文所討論的生物可降解的聚合物支架的諸多優(yōu)點(diǎn)，包括在需要時(shí)通過注射使用的能力。另外，盡管不希望受理論的約束，人們認(rèn)為使用珠或顆粒，可以提供機(jī)械和空間填充優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)通過對壓縮的物理支撐和抗性而促進(jìn)組織再生。
發(fā)明公開因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療受試者中的病變或受損組織的方法，該方法包括給所述受試者的發(fā)生所述病變或受損組織的部位，施用正常情況下存在于相當(dāng)于所述病變或受損組織的健康組織中的類型的細(xì)胞，和/或其合適的祖細(xì)胞，所述細(xì)胞與可生物再吸收的珠或顆粒聯(lián)合，并且選擇地與凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合。
所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞可以通過簡單地混合與所述珠或顆粒聯(lián)合，因此，可能不必與所述珠或顆粒結(jié)合?？梢酝ㄟ^在合適的容器中進(jìn)行低剪切力攪拌，將所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞與所述珠或顆粒混合。所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)，可以同時(shí)與所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞和珠或顆?；旌?，或者依次混合。不過，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞優(yōu)選通過結(jié)合與所述珠或顆粒聯(lián)合。這一目的可以通過在存在所述珠或顆粒的情況下擴(kuò)增所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。
因此，在第二方面，本發(fā)明提供了一種用于治療受試者中的病變或受損組織的方法，該方法包括以下步驟(i)獲得正常情況下存在于相當(dāng)于所述病變或受損組織的健康組織中的類型的細(xì)胞和/或其合適的祖細(xì)胞，(ii)在存在可生物再吸收的珠或顆粒條件下擴(kuò)增所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，以便所述擴(kuò)增的細(xì)胞和/或祖細(xì)胞結(jié)合在所述珠或顆粒上，和(iii)在存在所述病變或受損組織的部位給所述受試者施用在它上面結(jié)合了所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的珠或顆粒，任選處于凝膠和/或成凝膠物質(zhì)中。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在上面步驟(i)和(ii)之間，可以進(jìn)行額外的擴(kuò)增步驟。所述額外的擴(kuò)增步驟可能包括在例如，單層中生長所述細(xì)胞。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解的是，根本沒有必要在存在所述珠或顆粒的條件下擴(kuò)增所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞。相反，可以擴(kuò)增所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，并且隨后結(jié)合在所述珠或顆粒上。
因此，在第三方面，本發(fā)明提供了用于治療受試者的病變或受損組織的方法，該方法包括以下步驟(i)獲得正常情況下存在于相當(dāng)于所述病變或受損組織的健康組織中的類型的細(xì)胞和/或其合適的祖細(xì)胞，(ii)擴(kuò)增所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，(iii)將所述擴(kuò)增的細(xì)胞和/或祖細(xì)胞與生物再生珠或顆粒連接，和(iv)在存在所述病變或受損組織的部位給所述受試者施用在它上面結(jié)合了所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的珠或顆粒，任選處于凝膠和/或成凝膠物質(zhì)中。
所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是經(jīng)過選擇的，以便它們是適合再生所述特定病變或受損組織類型(例如，要治療的組織類型的成熟分化細(xì)胞)的類型。因此，舉例來說，為了治療病變或受損的皮膚，用于本發(fā)明方法中的細(xì)胞可以是成纖維細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。當(dāng)要再生的組織是骨時(shí)，所述細(xì)胞可以是成骨細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞，同時(shí)為了治療脂肪組織，所述細(xì)胞可以是脂肪細(xì)胞和其祖細(xì)胞。
優(yōu)選將本發(fā)明的方法用于治療(例如修復(fù))關(guān)節(jié)軟骨變性或損傷。就此而言，關(guān)節(jié)軟骨組織再生可以在關(guān)節(jié)軟骨變性或損傷部位完成，并且逐漸降解所述可生物再吸收的珠或顆粒，以便在再生之后清除不需要的所述珠或顆粒。在本發(fā)明方法的這種應(yīng)用中，所使用的細(xì)胞是軟骨細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。另外，如上文所述，人們認(rèn)為在組織再生進(jìn)行的過程中，所述珠或顆粒提供了機(jī)械和空間填充優(yōu)點(diǎn)。就是說，它們可以通過提供對骨關(guān)節(jié)的物理支撐，提供對關(guān)節(jié)軟骨變性或損傷的承重緩沖，降低在關(guān)節(jié)運(yùn)動期間的摩擦和抗壓縮。另外，當(dāng)所述珠或顆粒在凝膠和/或成凝膠物質(zhì)中使用時(shí)，所述珠或顆粒似乎能阻止凝膠收縮，這種收縮有可能對組織缺陷的空間填充造成負(fù)面影響。
所述軟骨細(xì)胞和/或祖細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域公知的任何方法收獲，不過，最方便的是通過組織活組織檢查收獲。合適的軟骨祖細(xì)胞是未分化過的細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞。所述軟骨細(xì)胞和/或祖細(xì)胞優(yōu)選是從要治療的受試者獲得的。
在本發(fā)明第二和第三方面方法中的擴(kuò)增步驟，優(yōu)選通過本領(lǐng)域公知的任何方法擴(kuò)增細(xì)胞和/或祖細(xì)胞5-2000倍，更優(yōu)選擴(kuò)增10-100倍。例如，擴(kuò)增可以在合適的培養(yǎng)皿中通過細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行(如陪替氏培養(yǎng)皿，例如，使用或不使用瓊脂凝膠)，不過，更優(yōu)選的是在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，其中，對培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌和通氣。不過，所述擴(kuò)增可以包括一個(gè)以上階段。例如，軟骨細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞首先可以在合適的培養(yǎng)皿中生長成單層，其中，可以通過諸如纖連蛋白(Fn)和玻連蛋白(Vn)的血清粘附蛋白介導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)散，然后在生物反應(yīng)器中生長。如上文所述，擴(kuò)增或部分?jǐn)U增能夠或不能夠在存在可生物再吸收的珠或顆粒的條件下進(jìn)行。另外，當(dāng)在所述擴(kuò)增或部分?jǐn)U增期間存在珠或顆粒時(shí)，可以？出所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，并且“重新接種”到可生物再吸收的珠或顆粒上。在這種情況下，首次提到的珠或顆粒不必是可生物再吸收的珠或顆粒。當(dāng)所述擴(kuò)增包括在所述生物反應(yīng)器中培養(yǎng)時(shí)，常見的是將可生物再吸收的珠或顆粒添加到所述培養(yǎng)基中。不過，當(dāng)所述擴(kuò)增是在沒有珠或顆粒的條件下進(jìn)行時(shí)，正如通過以上說明可以看出的，隨后必須將擴(kuò)增的細(xì)胞和/或祖細(xì)胞結(jié)合到可生物再吸收的珠或顆粒上。
適合擴(kuò)增用于所述第二和第三方面的方法中的細(xì)胞(例如軟骨細(xì)胞)和/或祖細(xì)胞的簡單的生物反應(yīng)器是旋轉(zhuǎn)燒瓶(spinner flask)。另外，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的擴(kuò)增可以使用翻轉(zhuǎn)型(tumbler-type)生物反應(yīng)器進(jìn)行(例如SyntheconTMInc.STLVTMRotary CellCulture System)，該反應(yīng)器可以裝配或不裝配內(nèi)部漿葉，以便促進(jìn)所述細(xì)胞、培養(yǎng)基和可生物再吸收的珠或顆粒(如果存在的話)的運(yùn)動。
在使用軟骨細(xì)胞時(shí)，在旋轉(zhuǎn)燒瓶或翻轉(zhuǎn)型生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，可以確保維持細(xì)胞表型。不過，當(dāng)所述擴(kuò)增包括在基本上靜止的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，就可能必須采取避免軟骨細(xì)胞去分化的步驟。在這兩種情況下，所述培養(yǎng)基可能包括添加劑，如抗壞血酸或生長因子，它們能控制細(xì)胞生長和特征。
用于本發(fā)明方法中的可生物再吸收的珠或顆粒優(yōu)選具有一定的大小，以便可以方便地進(jìn)行注射。因此，所述可生物再吸收的珠或顆粒的直徑或尺寸優(yōu)選為大約20-2500微米，更優(yōu)選具有大約50-200微米的平均粒度。合適的可生物再吸收的珠可以具有規(guī)則的形狀(例如，球體，如微球體、卵形、片狀或桿狀形狀)，或規(guī)則形狀的混合物。另一方面，合適的可生物再吸收的顆粒通常包括多種不規(guī)則形狀的顆粒，這些形狀通常是通過壓碎或粉碎固體物質(zhì)產(chǎn)生的。
所述可生物再吸收的珠或顆?？梢杂扇魏慰梢运幱玫木酆衔锝M成，包括基于生物學(xué)的聚合物，如明膠和膠原(特別是I型和/或II型)，以及合成聚合物，如業(yè)已用于細(xì)胞支架的合成聚合物(即PGA，PLA和PLGA)，和基于生物學(xué)的聚合物和合成聚合物的混合物。另外，所述可生物再吸收的珠或顆?？梢杂善渌梢运幱玫姆蔷酆衔镂镔|(zhì)組成，包括骨顆粒(例如，壓碎的骨和脫礦化的骨的顆粒)。另外，所述可生物再吸收的珠或顆?？梢杂伤鼍酆衔锖头蔷酆衔镔|(zhì)的混合物組成。
所述可生物再吸收的珠或顆粒的大小和密度，優(yōu)選使得所述珠或顆粒能夠在旋轉(zhuǎn)燒瓶或翻轉(zhuǎn)型生物反應(yīng)器中充分運(yùn)動。這有助于細(xì)胞擴(kuò)增，并且，在使用軟骨細(xì)胞時(shí)，能保持軟骨細(xì)胞表型。
所述可生物再吸收的珠或顆?？梢栽诤线m材料中功能化或包被，以便增強(qiáng)細(xì)胞粘附(例如，與細(xì)胞表面抗原結(jié)合的抗體或其片段，或ECM蛋白，如I，II，VI，IX，XI型膠原等)和/或，當(dāng)使用軟骨細(xì)胞時(shí)，還可以用一種試劑包被，以便有助于保持表型(例如，II型膠原)。另外，所述珠或顆粒可以包括其他有益試劑，如生長因子(例如，TGFβ，EGF，F(xiàn)GF，IGF-1和OP-1等)，糖胺聚糖(GAGs)(例如，聚集蛋白聚糖，核心蛋白聚糖，雙糖鏈蛋白聚糖，纖調(diào)蛋白聚糖)和親水性化合物(例如聚賴氨酸，脫乙酰殼多糖，透明質(zhì)素)。
將優(yōu)選具有與它聯(lián)合的合適的細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的珠或顆粒包含在凝膠和/或成凝膠物質(zhì)中給受試者使用。不過，作為補(bǔ)充或替代方案，具有與它聯(lián)合的合適的細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的珠或顆?？梢耘c合適的可以藥用的載體(例如，生理鹽水、無菌組織培養(yǎng)基等)組合使用。
合適的凝膠和/或成凝膠物質(zhì)優(yōu)選是可生物再吸收性的，并且是能確保所述珠或顆粒基本上保留在施用部位上的類型的。因此，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括粘性材料(例如，血纖蛋白和/或膠原，或轉(zhuǎn)谷胺酰胺酶系統(tǒng))，以便將所述凝膠或形成的凝膠粘附在所述施用部位周圍。作為替代或補(bǔ)充方案，可以通過將含有所述珠或顆粒的凝膠和/或成凝膠物質(zhì)捕集在組織內(nèi)(例如真皮和/或脂肪組織)，或捕集在組織(例如骨膜瓣)或其他膜瓣(例如膠原膜)下面，將所述珠或顆粒基本上保留在施用部位。
合適的凝膠和成凝膠物質(zhì)可以包括基于生物學(xué)的聚合物(即天然聚合物或處理過的天然聚合物)，如膠原溶液或纖維狀懸浮液，透明質(zhì)素或脫乙酰殼多糖(水解殼多糖)，或合成聚合物，如聚環(huán)氧乙烷和α-羥酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物。所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)還可以包括其他有益試劑，如生長因子(包括上文提到過的生長因子)、糖胺聚糖(GAGs)和親水性化合物(例如上文所提到過的化合物)。
在所述第二和第三方面的方法中，與所述珠或顆粒結(jié)合的細(xì)胞和/或祖細(xì)胞在即將使用時(shí)可以是鋪滿的或亞鋪滿的。優(yōu)選將平均大約3-500個(gè)細(xì)胞和/或祖細(xì)胞與每一個(gè)可生物再吸收的珠或顆粒結(jié)合。不過，所述數(shù)字可以根據(jù)所述珠或顆粒的特征(例如組成和大小)改變。為了施用，優(yōu)選在每一立方厘米珠或顆粒上結(jié)合1×105-1×109個(gè)細(xì)胞和/或祖細(xì)胞。
可以在使用軟骨細(xì)胞時(shí)，在所述軟骨細(xì)胞業(yè)已開始分泌細(xì)胞外基質(zhì)之前或之后，給所述受試者施用與所述珠或顆粒結(jié)合的軟骨細(xì)胞。不過，后一種方案不太理想，因?yàn)樗黾?xì)胞基質(zhì)可能會導(dǎo)致聚集體的形成，這些聚集體不利于注射。
在本發(fā)明第三方面的方法中，首先擴(kuò)增所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，然后(即隨后)與可生物再吸收的珠或顆粒結(jié)合。這一目的可以在合適的培養(yǎng)皿(例如培替氏培養(yǎng)皿)或組織培養(yǎng)燒瓶中實(shí)現(xiàn)。同樣，可以在合適材料中對所述可生物再吸收的珠或顆粒進(jìn)行功能化或包被，以便增強(qiáng)細(xì)胞粘附，和/或用有助于維持軟骨細(xì)胞表型的試劑包被。所述珠或顆粒還可以包括其他有益試劑，如生長因子，糖胺聚糖(GAGs)和親水性化合物。
在本發(fā)明第三方面的方法中，可以在步驟(iii)之后馬上給所述患者使用具有結(jié)合的細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的珠或顆粒，或者在進(jìn)一步培養(yǎng)所述珠或顆粒上的細(xì)胞和/或祖細(xì)胞之后施用。
與所述珠或顆粒聯(lián)合的細(xì)胞和/或祖細(xì)胞和凝膠和/或成凝膠物質(zhì)的使用，優(yōu)選是通過注射或關(guān)節(jié)內(nèi)窺鏡輸送進(jìn)行的。
本發(fā)明的方法主要是用于人類的，特別是與治療關(guān)節(jié)軟骨組織變性或損傷相關(guān)(例如膝關(guān)節(jié)、指關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)或其他關(guān)節(jié))。不過，預(yù)計(jì)，該方法還可適用于獸醫(yī)用途(例如，用于治療賽馬的關(guān)節(jié)軟骨變性或損傷，以及用于治療寵物的關(guān)節(jié)軟骨變性或損傷)。
本發(fā)明還涉及可以手術(shù)植入受試者中以便治療病變或受損組織的組織樣器件的生產(chǎn)。
因此，在第四方面，本發(fā)明提供了一種用于治療受試者中的病變或受損組織的具有組織樣特征的器件，其中，所述器件包括正常情況下存在于相當(dāng)于所述病變或受損組織的健康組織中的類型的細(xì)胞和/或其合適的祖細(xì)胞，所述細(xì)胞與可生物再吸收的珠或顆粒聯(lián)合，并且任選與凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合。
所述器件可以通過將所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞與可生物再吸收的珠或顆粒聯(lián)合并且任選與凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)一段足以形成組織樣物質(zhì)的時(shí)間而制備。所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞可以結(jié)合或不結(jié)合可生物再吸收的珠或顆粒。所述可生物再吸收的珠可以在植入所述器件之前完全降解，不過，所述珠或顆粒在移植時(shí)優(yōu)選在所述器件內(nèi)基本上是完整的。
在第五方面，本發(fā)明提供了一種用于治療受試者中的病變或受損組織的方法，所述方法包括將根據(jù)所述第四方面的器件植入所述受試者的存在所述病變或受損組織的部位。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，可能與相同或不同類型珠聯(lián)合的不同類型細(xì)胞的組合，可用于實(shí)現(xiàn)病變或受損組織的修復(fù)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解的是，本發(fā)明可用于組織增大(例如，治療疤痕或面部皺紋)。
我們所使用的術(shù)語“結(jié)合”表示細(xì)胞和/或祖細(xì)胞可以粘附在可生物再吸收的珠或顆粒上的任何機(jī)制，以便結(jié)合在特定可生物再吸收的珠或顆粒上的基本上所有所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞保持與所述珠或顆粒的結(jié)合。所述機(jī)制包括通過抗體將軟骨細(xì)胞和/或祖細(xì)胞與所述珠結(jié)合(它可能是與所述珠的共價(jià)結(jié)合)，或通過ECM蛋白(例如I，II，VI，IX，XI型膠原等)或其片段結(jié)合，這種結(jié)合也可以是與所述珠的共價(jià)結(jié)合。
我們所使用的術(shù)語“凝膠”表示能夠推遲上述可生物再吸收的珠或顆粒沉降的任何粘性或半固體溶液或懸浮液(形成對比的是，可生物再吸收的珠或顆粒很容易從生理鹽水中沉淀出來)。所述溶液或懸浮液優(yōu)選在37℃下和大氣壓力下，在少于30秒的時(shí)間內(nèi)不能流過#2Zahn杯(Gardco，Inc.)(放入#2 Zahn杯中的44ml溶液)。所述溶液或懸浮液更優(yōu)選不能在37℃下，在大氣壓力下，在2分鐘之后流過#4Zahn杯(Gardco，Inc.)，就是說，在在37℃下，在大氣壓力下在2分鐘之后流過的溶液不到原始體積的5％(放入#4 Zahn杯中的44ml溶液)。
在本說明書中所使用的術(shù)語“包括”(comprise、comprises和comprising)意在用于表示包括所說的步驟、成分或特征或一組步驟、成分或特征，包括或不包括其他步驟、成分或特征或一組步驟、成分或特征。
在本說明書中所包括的有關(guān)文獻(xiàn)、操作、材料、器件、或制品等的任何討論都僅僅是為了提供本發(fā)明的文本。不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為以上事物中的任一種或全部構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的部分或在本申請的每一個(gè)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日期之前，存在于澳大利亞或其他地方的與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的公知一般知識。
下面將通過以下非限定實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
附圖的簡要說明

圖1提供了軟骨細(xì)胞在明膠珠(A)和PLGA珠(B)上生長的顯微鏡圖象(實(shí)施例8和10)。
圖2表示用RT-PCR評估細(xì)胞表型的結(jié)果，其中，PCR產(chǎn)物是通過在2％瓊脂糖凝膠上電泳分析的(實(shí)施例20)。
圖3表示在I型膠原凝膠中使用和不使用珠(凝膠)培養(yǎng)軟骨細(xì)胞2周之后珠對凝膠收縮的影響(實(shí)施例28)。
圖4表示使用具有I型膠原凝膠的在脫礦化骨顆粒上培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞形成新的組織的例子(實(shí)施例31)。
實(shí)施例1軟骨細(xì)胞分離將新鮮軟骨組織收集在DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和鏈霉素的自體血清中。在稱重之后，將所述組織放入裝有3-4ml DMEM的無菌培替氏培養(yǎng)皿中，并且用鋒利的無菌手術(shù)刀解剖成1mm3的碎片。然后在37℃下，用溶解在PBS中的10％w/v胰蛋白酶消化1小時(shí)。每克組織使用大約2ml 10％w/v胰蛋白酶。通過離心(1000rpm，5分鐘)，收集殘余組織片，并且用PBS洗滌，然后用水洗滌(每克組織使用大約5-10ml)。然后每克組織使用2ml細(xì)菌膠原酶和透明質(zhì)酸酶的混合物在37℃下進(jìn)行第二個(gè)消化步驟過夜。所述消化混合物是通過以下方法制備的將2毫克透明質(zhì)酸酶(1520單位)和200μl膠原酶母液(取自3000單位/ml母液，在-70℃下保存在50mMtris，10mM CaCl2，pH 7.0的緩沖液中)添加到2ml DMEM中，并且過濾消毒。讓消化過的組織通過75μm的尼龍細(xì)胞粗濾器，洗滌所述細(xì)胞，并且通過離心收集。通過對小的已知等份樣品進(jìn)行臺盼蘭計(jì)數(shù)，評估細(xì)胞數(shù)量和存活力。
實(shí)施例2成纖維細(xì)胞分離在除毛、并且用70％乙醇洗滌之后，將新鮮皮膚收集到DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和鏈霉素的自體血清中。將所述組織放入裝有3-4ml DMEM的無菌培替氏培養(yǎng)皿中，并且用鋒利的無菌手術(shù)刀解剖成1mm3的碎片。讓所述組織片放在DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和鏈霉素的自體血清中培養(yǎng)。使成纖維細(xì)胞遷移到組織培養(yǎng)塑料上。在所述組織培養(yǎng)塑料上可以見到細(xì)胞之后，除去所述組織，并且對所述細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用小的已知等份樣品，通過臺盼蘭計(jì)數(shù)評估細(xì)胞數(shù)量和存活力。
實(shí)施例3成骨細(xì)胞分離將新鮮皮質(zhì)骨收集到DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和鏈霉素的自體血清中。將所述骨放入裝有3-4ml DMEM的無菌培替氏培養(yǎng)皿中。在DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和鏈霉素的自體血清中培養(yǎng)所述骨碎片，以便成骨細(xì)胞遷移到組織培養(yǎng)塑料上。在所述組織培養(yǎng)塑料上可以見到細(xì)胞之后，取出所述骨，并且對所述細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用小的已知等份樣品，通過臺盼蘭計(jì)數(shù)評估細(xì)胞數(shù)量和存活力。
實(shí)施例4干細(xì)胞分離從骨髓吸出液中收集成人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。用無菌PBS洗滌所述骨髓2次，然后重新懸浮在DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和鏈霉素的自體血清中。然后將骨髓細(xì)胞層積在Perco11層上(1.073g/ml密度)，并且在以250g的速度離心30分鐘之后收集細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)燒瓶中。用包括地塞米松、生長因子和細(xì)胞因子在內(nèi)的各種添加劑篩選并且繁殖特定細(xì)胞系。
實(shí)施例5單層細(xì)胞培養(yǎng)物在組織培養(yǎng)塑料上，在DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和鏈霉素的自體血清中，在37℃下，在5％二氧化碳?xì)夥罩信囵B(yǎng)按上述實(shí)施例1-4所披露的方法分離的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和其他類型細(xì)胞。每隔2天添加培養(yǎng)基或更換培養(yǎng)基。讓細(xì)胞生長至鋪滿，然后進(jìn)行胰蛋白酶處理，并且作為單層重新鋪平板到燒瓶中，或者轉(zhuǎn)移到珠/顆粒上。
實(shí)施例6在不可再吸收珠上培養(yǎng)細(xì)胞用50μl加熱到37℃的培養(yǎng)基(DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和鏈霉素的自體血清)預(yù)洗滌諸如Cytodex珠(PharmaciaBiotech)的珠或顆粒，以便提供250-500cm2的表面積，然后放入125ml的旋轉(zhuǎn)瓶內(nèi)。將1×105個(gè)細(xì)胞，即新分離的細(xì)胞、以前傳代的細(xì)胞或以前分離并且冷凍的細(xì)胞添加到所述珠或顆粒上。然后在37℃的孵育箱中(具有5％CO2)，以25rpm的速度攪拌所述旋轉(zhuǎn)瓶，每30分鐘間歇2分鐘，共攪拌3小時(shí)，然后每30分鐘間歇2分鐘，再攪拌3小時(shí)。然后首先以45rpm的速度連續(xù)攪拌15分鐘，再以50rpm的速度攪拌15分鐘，以55rpm的速度攪拌15分鐘，然后使用60rpm的最終速度。然后讓細(xì)胞在該速度下生長直到獲得90％的鋪滿度。根據(jù)原始接種物，通常需要5-8天時(shí)間。為了收集所述珠或顆粒上的細(xì)胞，以便釋放和進(jìn)一步接種或用于制備輸送到患者體內(nèi)或進(jìn)一步處理，用37℃的熱的PBS洗滌所述細(xì)胞和珠，并且通過離心收集。
實(shí)施例7制備明膠珠通過使用乳液方法合成明膠微顆粒。簡單地講，將明膠溶解在50mM乙酸中，達(dá)到20％(w/v)的濃度。將200ml橄欖油加熱到37℃。以300rpm的速度攪拌加熱的橄欖油。然后通過20號針頭將40ml保持在37℃的明膠溶液加樣到橄欖油上。將該溶液制備成含有10％w/w的天然膠原。攪拌該乳液90分鐘。通過在4℃下攪拌30分鐘使該乳液冷凍，以便使明膠顆粒硬化。將500ml溶解在PBS中的0.2％TritonX-100添加到所述乳液中，并且在室溫下攪拌10分鐘。然后將該混合物放入分離漏斗中，并且沉降1小時(shí)。收集底下部分的液體，并且在明膠微顆粒沉淀之后，小心掉去上部液體，并且用水漂洗所述顆粒2次。將500ml溶解在PBS中的0.1％的戊二醛添加到所述明膠微顆粒中，并且攪拌1小時(shí)，以便交聯(lián)。然后用水漂洗交聯(lián)過的明膠珠若干次，并且浸泡在乙醇中。倒掉乙醇，并且在真空條件下干燥所述明膠微顆粒。在接種細(xì)胞之前，用PBS對所述明膠珠進(jìn)行再水合過夜，然后用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基再水合。明膠微顆粒的平均粒度為大約110μm。
實(shí)施例8在明膠珠上培養(yǎng)細(xì)胞用50ml加熱到37℃的培養(yǎng)基(DMEM/10％ FBS或含有100μg/ml青霉素和鏈霉素的自體血清)預(yù)先洗滌具有250-500cm2表面積的明膠珠，然后放入125ml的旋轉(zhuǎn)瓶內(nèi)。將1×105細(xì)胞，即新分離的細(xì)胞、以前傳代的細(xì)胞或以前分離并且冷凍的細(xì)胞添加到所述珠或顆粒上。然后在37℃的孵育箱(含有5％ CO2)中以25rpm的速度攪拌所述旋轉(zhuǎn)瓶，每30分鐘間歇2分鐘，共攪拌3小時(shí)。然后以45rpm的速度攪拌，每30分鐘間歇2分鐘，再攪拌3小時(shí)，然后首先以45rpm的速度連續(xù)攪拌15分鐘，然后以50rpm的速度攪拌15分鐘，以55rpm的速度攪拌15分鐘，然后以60rpm的最終速度攪拌，然后在該速度下讓所述細(xì)胞生長到90％的鋪滿度，根據(jù)原始接種物，通常需要5-8天時(shí)間。為了收集所述珠或顆粒上的細(xì)胞，以便釋放和進(jìn)一步接種或用于制備輸送到患者體內(nèi)或進(jìn)一步處理，用37℃的熱的PBS洗滌所述細(xì)胞和珠，并且通過離心收集。圖1A表示在將軟骨細(xì)胞添加到所述明膠珠上7天之后在明膠珠上的細(xì)胞生長。
實(shí)施例9PLGA珠和顆粒的制備將聚(丙交酯-共-乙交酯)85∶15w/w(PLGA)溶解在四氫呋喃中，然后通過攪拌，乳化成含有1％聚乙烯醇的水溶液。通過使其沉淀收集PLGA珠，并且通過傾析用水洗滌5次。然后在真空條件下將所述珠干燥過夜。通常獲得30-300微米范圍內(nèi)的珠，平均粒度為105微米。通過篩分將珠分離成80-120微米的較小的粒度范圍。或者，通過使用溶解在500ml水中的1gPLGA懸浮液，在勻漿機(jī)中粉碎較大的顆粒，獲得理想粒度范圍內(nèi)的PLGA顆粒。篩分提供了在理想粒度范圍內(nèi)的不規(guī)則形狀的顆粒，例如50-250微米。通過在室溫下，用1小時(shí)時(shí)間吸收溶解在明膠緩沖的鹽溶液中的含有50μg/ml膠原的溶液中的I型或II型膠原，對PLGA珠和顆粒進(jìn)行表面修飾。然后在磷酸緩沖的鹽溶液中洗滌，除去結(jié)合松散的膠原。
實(shí)施例10在PLGA珠上培養(yǎng)細(xì)胞用50ml加熱到37℃的培養(yǎng)基(DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和鏈霉素的自體血清)預(yù)先洗滌具有250-500cm2表面積的PLGA珠，然后放入125ml的旋轉(zhuǎn)瓶內(nèi)。將1×105細(xì)胞，即新分離的細(xì)胞、以前傳代的細(xì)胞或以前分離并且冷凍的細(xì)胞添加到所述珠或顆粒上。然后在37℃的孵育箱(含有5％ CO2)中，以25rpm的速度攪拌所述瓶，每30分鐘間歇2分鐘，共攪拌3小時(shí)，然后以45rpm的速度攪拌，每30分鐘間歇2分鐘，再攪拌3小時(shí)，然后首先以45rpm的速度連續(xù)攪拌15分鐘，然后以50rpm的速度攪拌15分鐘，以55rpm的速度攪拌15分鐘，然后以60rpm的最終速度攪拌。然后讓所述細(xì)胞在該速度下生長到90％的鋪滿度，根據(jù)原始接種物通常需要5-8天時(shí)間。為了收集所述珠或顆粒上的細(xì)胞，以便釋放和進(jìn)一步接種或用于制備輸送到患者體內(nèi)或進(jìn)一步處理，用37℃的熱的PBS洗滌所述細(xì)胞和珠，并且通過離心收集。圖1B表示在將軟骨細(xì)胞添加到PLGA珠上14天之后在PLGA珠上的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物。業(yè)已用山羊抗II型膠原抗體對軟骨細(xì)胞進(jìn)行了染色，以便顯示II型膠原合成。
實(shí)施例11骨顆粒的制備對沒有粘附組織、并且用磷酸緩沖的鹽水(PBS)漂洗過的新鮮骨進(jìn)行干燥，然后壓碎并且研磨，以便提供顆粒，通過篩分分離顆粒，以便得到諸如能通過120微米篩子的組分，但是，該組份不能通過80微米的篩子。通過用甲醇、二氯甲烷和丙酮洗滌使所述顆粒脫脂。然后通過兩次更換PBS洗滌顆粒，再用水洗滌并且干燥。通過在0.5MEDTA，pH 7.4中攪拌骨顆粒20小時(shí)制備脫礦化的骨顆粒。通過柔和離心分離，然后再重復(fù)該過程至少2次。
實(shí)施例12在骨顆粒上培養(yǎng)細(xì)胞按實(shí)施例10所述方法在骨顆粒上培養(yǎng)細(xì)胞，所不同的是用未處理過的和脫礦化的骨顆粒代替PLGA珠。
實(shí)施例13在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞將實(shí)施例6或8或10或12所披露的結(jié)合有細(xì)胞的珠或顆粒放入生物反應(yīng)器中，如SyntheconTM旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的High AspectRatio容器，用DMEM/10％ FBS或含有100μg/ml青霉素和鏈霉素的自體血清填充所述容器，并且排除氣泡。在含有5％ CO2的潮濕孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，起始旋轉(zhuǎn)速度為15rpm。然后根據(jù)所述珠或顆粒的性質(zhì)和粒度進(jìn)一步調(diào)整旋轉(zhuǎn)速度，以便所述珠或顆粒既不會沉降，又不會碰撞容器邊緣，但是在該培養(yǎng)容器內(nèi)形成一個(gè)流體軌道。每隔1-2天更換或添加培養(yǎng)基。
實(shí)施例14從單層培養(yǎng)物中取出并且轉(zhuǎn)移細(xì)胞將溶解在PBS中的37℃的熱的0.3％ w/v胰蛋白酶直接添加到組織培養(yǎng)燒瓶中，每25cm2添加5ml。在放置5分鐘之后，通過柔和的移液動作或通過柔和的機(jī)械動作使細(xì)胞與塑料分離。通過以1000rpm的速度離心5分鐘，收集胰蛋白酶溶液中的細(xì)胞。然后除去上清液，并且將細(xì)胞柔和地重新懸浮在5ml培養(yǎng)基中。通過臺盼蘭方法對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
實(shí)施例15從聚合物珠上除去細(xì)胞將6ml熱的0.3％ w/v胰蛋白酶直接添加到收集的并且洗滌過的位于珠上的細(xì)胞中，并且在37℃下孵育10-15分鐘，不進(jìn)行攪拌。將20ml熱的PBS添加到該混合物中，并且柔和地進(jìn)行移液管吸入和排出，以便使細(xì)胞與珠或顆粒分離，所述顆粒的粒度大于70微米。通過70微米的濾膜將細(xì)胞和珠或顆粒轉(zhuǎn)移到50ml試管中。通過以1000rpm的速度離心5分鐘收集通過所述濾膜的細(xì)胞。除去上清液，并且將所述細(xì)胞柔和地重新懸浮在5ml培養(yǎng)基中。通過臺盼蘭方法對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
實(shí)施例16從明膠珠上除去細(xì)胞將6ml熱的0.3％w/v胰蛋白酶直接添加到收集的并且洗滌過的位于珠上的細(xì)胞中，并且在37℃下培養(yǎng)20分鐘。通過酶消化所述明膠珠，將細(xì)胞釋放到溶液中，而沒有必要使用充分的機(jī)械攪拌。通過以1000rpm的速度離心5分鐘收集細(xì)胞。除去上清液，并且將所述細(xì)胞柔和地重新懸浮在5ml培養(yǎng)基中。通過臺盼蘭方法對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
實(shí)施例17將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到再吸收珠上以便植入將新分離的或以前在單層培養(yǎng)物中或在非再吸收珠或顆粒上或在再吸收珠或顆粒上傳代的或以前分離的、培養(yǎng)的并且冷凍的諸如成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞或其他類型的細(xì)胞的細(xì)胞懸浮在加熱到37℃的熱培養(yǎng)基(DMEM/10％ FBS或含有100μg/ml青霉素和鏈霉素的自體血清)中，并且添加預(yù)先洗滌過的珠或顆粒上，如實(shí)施例7或9或11所述，并且通過逐漸加強(qiáng)的攪拌結(jié)合，如實(shí)施例6或8或10或12所述。
實(shí)施例18通過alcian藍(lán)染色評估細(xì)胞在珠或顆粒上培養(yǎng)細(xì)胞(實(shí)施例6，8，10，12)的好處是能控制表型。對于關(guān)節(jié)軟骨來說，所述表型是通過使用能夠區(qū)分軟骨細(xì)胞和去分化的纖維軟骨細(xì)胞的多種組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)標(biāo)記監(jiān)測的。Alcian藍(lán)，即用于關(guān)節(jié)軟骨的糖胺聚糖的常見染料是以溶解在3％乙酸中的pH2.5的2％過濾溶液形式制備的。在中性的緩沖甲醛中固定2-3分鐘之后，在3％乙酸中孵育載玻片3分鐘。在37℃下添加alcian藍(lán)溶液至少20小時(shí)，用水漂洗載玻片，并且添加2分鐘的中性紅染料。在Histoclear中封固之前用乙醇漂洗。
實(shí)施例19通過免疫組織化學(xué)染色評估細(xì)胞通過特異性免疫學(xué)標(biāo)記監(jiān)測培養(yǎng)細(xì)胞的表型。對于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞來說，使用抗II型膠原的抗體監(jiān)測正確表型，并且，用抗I型膠原抗體監(jiān)測變化或去分化程度。如果用例如抗膠原抗體使細(xì)胞的基質(zhì)生產(chǎn)染色的話，每天必須向培養(yǎng)物中添加最終濃度為50μg/ml的新的抗壞血酸，至少添加6天時(shí)間。在用熱的PBS洗滌之后，用溶解在PBS中的50％(v/v)甲醇預(yù)先固定珠上的細(xì)胞1次，10分鐘，用溶解在PBS中的冷的70％(v/v)甲醇固定2次，每次10分鐘。最后用溶解在H2O中的70％(v/v)乙醇固定?？梢詫⒏栺R林或戊二醛用作替代固定試劑，以便與諸如Alcian藍(lán)的蛋白聚糖染料一起使用。用PBS稀釋第一抗體(例如，以1∶5的比例用PBS稀釋山羊抗II型膠原)，并且在室溫下添加1小時(shí)，然后在用PBS洗滌之后，在室溫下添加用PBS稀釋的FITC-偶聯(lián)的抗體(例如，以1∶200的比例用PBS稀釋的兔抗山羊FITC)1小時(shí)。用PBS稀釋2次，然后將所述珠重新懸浮在封固培養(yǎng)基(例如90％甘油，10％ PBS，0.025％ DABCO)中。用Optiscan共聚焦顯微鏡收集熒光圖象。
實(shí)施例20通過原位雜交和RT-PCR評估細(xì)胞用實(shí)施例19所述方法固定用于原位雜交表征的細(xì)胞。在原位雜交中，對于編碼諸如I型膠原或II型膠原的mRNA來說，優(yōu)選使用UTP-33P檢測，按照Bisucci T，Hewitson TD，Darby IA，(2000)的方法“cRNA探針，同位素和非同位素檢測方法的比較”，Methods inMolecular Biology，123291-303。使用由人膠原前α1(I)基因的372bp區(qū)組成的I型膠原核糖探針或由牛膠原α1(II)基因的200bp區(qū)組成的II型膠原核糖探針。
為了進(jìn)行RT-PCR，將細(xì)胞(豬軟骨細(xì)胞)以單層培養(yǎng)，并且按實(shí)施例5和實(shí)施例14的方法回收。通過渦旋攪拌在1ml RezolTMC & T(USA)中充分裂解細(xì)胞。將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到微型離心管中，并且在室溫下孵育5分鐘。然后讓細(xì)胞裂解物與0.2ml氯仿劇烈混合，并且在室溫下孵育2分鐘。在4℃下以12,000xg的速度離心15分鐘，然后將上部含水層轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的微型離心管中，并且添加等體積的異丙醇，并且柔和地混合。在室溫下孵育該樣品10分鐘，并且在4℃下以12,000xg的速度離心10分鐘。小心除去上清液，通過渦旋混合，用1ml 75％乙醇洗滌RNA沉淀，然后在4℃下以12,000xg的速度離心5分鐘。然后小心除去乙醇，并且通過空氣干燥RNA沉淀。將所述RNA沉淀溶解在20μl DEPC-處理過的水中。然后按照生產(chǎn)商的推薦方法(Life Technologies)，使用寡聚-dT引物和SUPERSCRIPTTMII將所述mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
將來自所述RT反應(yīng)的2μl的等份樣品用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄物，使用對分析基因特異的引物。PCR反應(yīng)是這樣進(jìn)行的在95℃下變性3分鐘，然后在95℃下變性1分鐘，在50℃下退火1分鐘，并且在72℃下延伸1分鐘，共進(jìn)行35輪。用于分析基因的引物被設(shè)計(jì)成以下形式β-肌動蛋白 5′-AACGGCTCCGGCATGTGC-3′(SEQ ID NO1)和5′-GGGCAGGGGTGTTGAAGG-3′(SEQ ID NO2)I型膠原 5′-GCTGGCCAACTATGCCTC-3′(SEQ ID NO3)和5′-GAAACAGACTGGGCCAATG-3′(SEQ ID NO4)II型膠原5′-TGCCTACCTGGACGAAGC-3′(SEQ ID NO5)和5′-CCCAGTTCAGGCTCTTAG-3′(SEQ ID NO6)SOX95′-CCCAACGCCATCTTCAAG-3′(SEQ ID NO7)和5′-CTTGGACATCCACACGTG-3′(SEQ ID NO8)聚集蛋白聚糖5′-CTGTTACCGCCACTTCCC-3′(SEQ ID NO9)和5′-GGTGCGGTACCAGTGCAC-3′(SEQ ID NO10)以上序列如圖2所示。
實(shí)施例21合成凝膠的制備可生物再吸收的合適的凝膠是用一種前體生產(chǎn)的，該前體由PEO組成，PEO在其末端與諸如乙醇酸或乳酸的α-羥酸的寡聚物聚合，并且在所有的寡聚(α-羥酸)末端用可聚合的丙烯酸基團(tuán)封端，使得所述前體能夠通過短時(shí)間暴露于長波長紫外光聚合形成凝膠。
施例22細(xì)胞和珠和合成凝膠混合物的制備將實(shí)施例8所述從明膠珠基質(zhì)中取出的細(xì)胞或從其他基質(zhì)中取出的細(xì)胞與新的按實(shí)施例7方法制備的明膠珠或?qū)嵤├?或?qū)嵤├?1所述的其他可生物再吸收的珠或顆?；旌?，混合是在含有自體血清或胎牛血清的DMEM中完成的，并且與諸如實(shí)施例21的凝膠前體的合成凝膠前體混合，以便形成均勻混合物，所述凝膠是通過短時(shí)間接觸紫外線形成的。
實(shí)施例23生物學(xué)(膠原)凝膠制備將4克I型膠原、II型膠原、或所述膠原的混合物溶解在1升50mM乙酸溶液中。在4℃下以9500rpm的速度將所述膠原溶液離心45分鐘。收集上清液。將所述膠原溶液放入透析袋中，并且用25升1M乙酸透析2天，然后用25升水透析4天，多次更換水。通過將密封的透析袋懸掛在層流罩中1天時(shí)間濃縮所述膠原溶液。所述膠原溶液的最終濃度為大約20mg/ml(2％w/v)。
實(shí)施例24細(xì)胞、珠和生物學(xué)凝膠混合物的制備在除去實(shí)施例8所述的明膠珠基質(zhì)或除去其他基質(zhì)之后，將細(xì)胞與按實(shí)施例7所述方法制備的新的明膠珠或其他可生物再吸收的珠或顆?；旌?，混合是在含有自體血清或胎牛血清的DMEM中進(jìn)行的，并且與生物學(xué)凝膠或前體混合，如按實(shí)施例23方法制備的2％膠原溶液，以便形成細(xì)胞和珠或顆粒均勻混合的均勻混合物，凝膠的形成是通過在37℃下培養(yǎng)該混合物實(shí)現(xiàn)的。
實(shí)施例25珠上的細(xì)胞和合成凝膠混合物的制備通過讓所述培養(yǎng)混合物沉淀，然后除去多余的培養(yǎng)基，收集與實(shí)施例8所述明膠珠基質(zhì)附著或與其他可生物再吸收珠或顆粒附著的細(xì)胞。然后將所述珠上的細(xì)胞與合成凝膠前體混合，如實(shí)施例21所述前體，以便形成均勻混合物，通過短時(shí)間暴露于紫外線形成凝膠。
實(shí)施例26珠上的細(xì)胞和生物學(xué)凝膠混合物的制備通過讓所述培養(yǎng)混合物沉淀，然后除去多余的培養(yǎng)基，收集與實(shí)施例8所述明膠珠基質(zhì)附著或與其他可生物再吸收的珠或顆粒附著的細(xì)胞。然后將所述珠上的細(xì)胞與生物學(xué)凝膠或前體混合，如按實(shí)施例23所述方法制備的2％膠原溶液，以便形成均勻混合物。將9份膠原溶液與1份10 X DMEM和0.1份1N NaOH混合。將4份該混合物與1份軟骨細(xì)胞-明膠珠復(fù)合物混合。凝膠形成是通過在37℃的孵育箱中孵育1小時(shí)完成的，或者對于植入的混合物來說，可以通過體溫實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例27細(xì)胞/珠/生物學(xué)凝膠混合物的體外培養(yǎng)例如，將按實(shí)施例24方法制備的含有細(xì)胞和珠的生物學(xué)凝膠轉(zhuǎn)移到24孔平板上，并且向每一種樣品中添加1.5ml的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基。每隔1天更換軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基，并且每天補(bǔ)充100μg/ml的抗壞血酸。為了進(jìn)行體外評估，在3天、7天、14天、21天和28天之后，收集樣品。
實(shí)施例28珠上的細(xì)胞/生物學(xué)凝膠混合物的體外培養(yǎng)將按實(shí)施例26方法制備的含有結(jié)合在珠上的細(xì)胞的生物學(xué)凝膠轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)平板上，并且按實(shí)施例27所述方法在存在抗壞血酸的條件下培養(yǎng)。與所述珠聯(lián)合的軟骨細(xì)胞在所述凝膠中從第三天開始增殖，并且分泌新的II型膠原和糖胺聚糖的基質(zhì)，與軟骨細(xì)胞表型一致。如圖3所示，所述珠的存在顯著降低了凝膠收縮的速度和程度。
實(shí)施例29細(xì)胞/珠/合成凝膠混合物的體外培養(yǎng)將按實(shí)施例22所述方法制備的含有細(xì)胞和珠的合成凝膠轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)平板上，并且按實(shí)施例27所述方法在存在抗壞血酸的條件下培養(yǎng)。
實(shí)施例30珠上的細(xì)胞/合成凝膠混合物的體外培養(yǎng)將按實(shí)施例25所述方法制備的含珠上的細(xì)胞的合成凝膠轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)平板上，并且按實(shí)施例27所述方法在存在抗壞血酸的條件下培養(yǎng)。
實(shí)施例31將細(xì)胞/珠/生物學(xué)凝膠混合物植入動物體內(nèi)將實(shí)施例24或26所述存在于I型膠原凝膠中的細(xì)胞和珠或珠上的細(xì)胞皮下注射到裸小鼠體內(nèi)。在1個(gè)月和2個(gè)月之后處死動物，以便對所形成的新組織進(jìn)行組織學(xué)和免疫組織學(xué)評估。來自裸小鼠的外植體表明，使用包括凝膠、具有I型膠原的修飾的凝膠和脫礦化的骨在內(nèi)的多種珠可以生產(chǎn)關(guān)節(jié)軟骨。使用I型膠原作為輸送凝膠，在1個(gè)月內(nèi)觀察到了良好的組織形成，并且持續(xù)到2個(gè)月。實(shí)施例18、19和20所述的組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)評估證實(shí)，具有正確的基質(zhì)和軟骨表型。圖4表示使用具有I型膠原凝膠的脫礦化骨顆粒上的培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的新組織形成的例子。
實(shí)施例32將體外培養(yǎng)的材料植入動物體內(nèi)通過手術(shù)將細(xì)胞和珠或存在于生物學(xué)凝膠混合物中的珠上的細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞和如實(shí)施例27或28所述的存在于I型膠原凝膠中的明膠珠，皮下植入裸小鼠體內(nèi)。在1個(gè)月和2個(gè)月之后處死動物，以便對所形成的新組織進(jìn)行組織學(xué)評估。
實(shí)施例33將珠上的細(xì)胞/合成的凝膠混合物植入動物體內(nèi)將存在于合成凝膠混合物中的細(xì)胞和珠或諸如實(shí)施例22或25所述的聚乙二醇-乳酸-乙醇酸/α-羥酸類型的珠上的細(xì)胞，皮下注射到裸小鼠體內(nèi)。在1個(gè)月和2個(gè)月之后處死動物，以便對所形成的新組織進(jìn)行組織學(xué)評估。
實(shí)施例34用含有細(xì)胞的混合物修復(fù)軟骨缺陷使用細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)和珠或顆粒和凝膠的制劑。將該混合物，例如實(shí)施例26所述的存在于2％I型膠原混合物中的與明膠珠基質(zhì)附著的軟骨細(xì)胞裝入帶有針頭的注射器中，所述針頭具有足夠大的直徑，以便所述珠或顆粒能方便地通過，如22號針頭。然后將該材料注射到在綿羊膝蓋中形成的軟骨缺陷內(nèi)。還可以通過在植入的含有軟骨細(xì)胞的材料上面附著一片自體骨膜將植入的材料保持在適當(dāng)?shù)奈恢?。在傷口愈合之后，暫時(shí)保持膝關(guān)節(jié)不活動，以便所述膠原形成半固體凝膠。
實(shí)施例35用含有細(xì)胞的混合物修復(fù)軟骨缺陷用實(shí)施例34所述方法，使用細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)和珠或顆粒和凝膠的制劑修復(fù)膝關(guān)節(jié)缺陷，所不同的是，使用實(shí)施例21所述的合成凝膠，凝膠的形成是通過在將所述材料放入軟骨缺陷中之后短時(shí)間暴露于紫外光而完成的。還可以通過在植入的含有軟骨細(xì)胞的材料上面附著一片自體骨膜將植入的材料保持在適當(dāng)?shù)奈恢谩?br> 實(shí)施例36用體外培養(yǎng)的植入物修復(fù)軟骨缺陷使用細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)和珠或顆粒和凝膠的制劑。將該混合物，如實(shí)施例27所述的存在于2％I型膠原混合物中的與明膠珠基質(zhì)結(jié)合的軟骨細(xì)胞，在補(bǔ)充了抗壞血酸的細(xì)胞培養(yǎng)物中保持10天時(shí)間，以便形成含有軟骨細(xì)胞和明膠珠的組織樣材料。然后通過手術(shù)將所述組織樣材料植入在綿羊膝關(guān)節(jié)中形成的軟骨缺陷內(nèi)。還可以通過在植入的含有軟骨細(xì)胞的材料上面連接一片自體骨膜將植入的材料固定在原位。
實(shí)施例37用含有細(xì)胞的混合物修復(fù)骨缺陷按實(shí)施例34所述方法制備一種材料，但是將作為細(xì)胞成分的成骨細(xì)胞和壓碎的骨顆粒注射到綿羊股骨的圓形缺陷。2個(gè)月之后通過組織學(xué)檢查證實(shí)骨修復(fù)。
實(shí)施例38用含有細(xì)胞的混合物修復(fù)骨缺陷按實(shí)施例37所述方法制備含有成骨細(xì)胞、壓碎的骨顆粒和I型膠原的材料，不過，其中添加了BMP2或其他生長因子。將該材料注射到綿羊股骨的圓形缺陷，并且在2個(gè)月之后通過組織學(xué)檢查證實(shí)骨修復(fù)。
實(shí)施例39用含有細(xì)胞的混合物修復(fù)組織缺陷按實(shí)施例34所述方法制備一種材料，但是將作為細(xì)胞成分的成纖維細(xì)胞和明膠珠皮下注射到綿羊體內(nèi)。在2個(gè)月之后通過組織學(xué)檢查證實(shí)組織修復(fù)。
實(shí)施例40用含有細(xì)胞的混合物修復(fù)組織缺陷按實(shí)施例34所述方法制備一種材料，但是將作為細(xì)胞成分的脂肪細(xì)胞和明膠珠皮下注射到綿羊體內(nèi)。在2個(gè)月之后通過組織學(xué)檢查證實(shí)組織修復(fù)。
實(shí)施例41用含有細(xì)胞的混合物修復(fù)組織缺陷制備一種材料，它具有作為細(xì)胞成分的兩種類型的細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，按實(shí)施例39和40所述方法分別在明膠珠上培養(yǎng)，將所述材料混合在膠原凝膠中，并且皮下注射到綿羊體內(nèi)。在2個(gè)月之后通過組織學(xué)檢查證實(shí)組織修復(fù)。
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本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在不超出廣義披露的本發(fā)明構(gòu)思和范圍的前提下，可以對本發(fā)明的所述具體實(shí)施方案進(jìn)行多種改變和/改進(jìn)。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案在所有方面都被認(rèn)為是說明性的，而不是限定性的。
序列表<110>聯(lián)邦科學(xué)及工業(yè)研究組織<120>用于組織修復(fù)的方法和器件<130>500219<150>AU PR2896<151>2001-02-05<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有序列<400>1aacggctccg gcatgtgc18<210>2<211>18<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>共有序列<400>2gggcaggggt gttgaagg18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有序列<400>3gctggccaac tatgcctc18<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有序列<400>4gaaacagact gggccaattg20<210>5<211>18<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>共有序列<400>5tgcctacctg gacgaagc18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有序列<400>6cccagttcag gctcttag18<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有序列<400>7cccaacgcca tcttcaag18<210>8<211>18<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>共有序列<400>8cttggacatc cacacgtg18<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有序列<400>9ctgttaccgc cacttccc18<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有序列<400>10ggtgcggtac cagtgcac18
權(quán)利要求
1.一種用于治療受試者中的病變或受損組織的方法，該方法包括給所述受試者的存在所述病變或受損組織的部位施用正常情況下存在于相當(dāng)于所述病變或受損組織的健康組織中的類型的細(xì)胞，和/或其合適的祖細(xì)胞，所述細(xì)胞與可生物再吸收的珠或顆粒聯(lián)合，并且任選與凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞通過結(jié)合而與所述珠或顆粒聯(lián)合。
3.如權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒是由可以藥用的聚合物組成的。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述聚合物是選自明膠和膠原的基于生物學(xué)的聚合物。
5.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述聚合物是選自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)的合成聚合物。
6.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述聚合物是基于生物學(xué)的聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物學(xué)的聚合物選自明膠和膠原，而所述合成聚合物選自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)。
7.如權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒由可以藥用的非聚合物質(zhì)組成。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中，所述非聚合物質(zhì)選自壓碎的骨和脫礦化的骨。
9.如權(quán)利要求3-8中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒業(yè)已用合適的細(xì)胞粘附增強(qiáng)材料功能化或包被。
10.如權(quán)利要求3-9中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒進(jìn)一步由選自生長因子、糖胺聚糖和親水性化合物的有益試劑組成。
11.如權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒的直徑或尺寸為大約20-2500微米。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒的平均粒度大約為50-200微米。
13.如權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)是可生物再吸收的。
14.如權(quán)利要求13的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括選自膠原、血纖蛋白、透明質(zhì)素、脫乙酰殼多糖的基于生物學(xué)的聚合物及其混合物。
15.如權(quán)利要求13的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括選自聚環(huán)氧乙烷和α-羥酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物的合成聚合物。
16.如權(quán)利要求13的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括基于生物學(xué)聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物學(xué)的聚合物選自膠原、血纖蛋白、透明質(zhì)素、脫乙酰殼多糖及其混合物，而所述合成聚合物選自聚環(huán)氧乙烷和α-羥酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物。
17.如權(quán)利要求13-16中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)進(jìn)一步由選自生長因子、糖胺聚糖和親水性化合物的有益試劑組成。
18.如權(quán)利要求13-17中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括粘性材料。
19.如權(quán)利要求1-18中任意一項(xiàng)的方法，其中，每個(gè)所述珠或顆粒與大約3-500個(gè)細(xì)胞和/或祖細(xì)胞聯(lián)合。
20.如權(quán)利要求1-19中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是軟骨細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求1-19中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是成纖維細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求1-19中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是脂肪細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
23.如權(quán)利要求1-19中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是成骨細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求1-19中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是細(xì)胞類型和/或祖細(xì)胞類型的混合物。
25.如權(quán)利要求1-19中任意一項(xiàng)的方法，其中，與所述可生物再吸收的珠或顆粒和凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合的所述細(xì)胞和/或其合適的祖細(xì)胞，是通過在所述存在病變或受損組織的部位將凝膠和/或成凝膠物質(zhì)捕集在組織內(nèi)或組織下施用的。
26.如權(quán)利要求1-19中任意一項(xiàng)的方法，其中，與所述可生物再吸收的珠或顆粒和凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合的所述細(xì)胞和/或其合適的祖細(xì)胞是通過在所述存在病變或受損組織的部位將凝膠和/或成凝膠物質(zhì)捕集在組織瓣或其他膜瓣下面使用的。
27.如權(quán)利要求25或26的方法，其中，所述細(xì)胞和/或合適的祖細(xì)胞是軟骨細(xì)胞，而所述要治療的病變或受損組織是關(guān)節(jié)軟骨。
28.一種用于治療受試者中的病變或受損組織的方法，所述方法包括以下步驟(i)獲得正常情況下存在于相當(dāng)于所述病變或受損組織的健康組織中的類型的細(xì)胞和/或其合適的祖細(xì)胞，(ii)在存在可生物再吸收的珠或顆粒的條件下擴(kuò)增所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，以便所述擴(kuò)增的細(xì)胞和/或祖細(xì)胞結(jié)合于所述珠或顆粒，和(iii)在存在所述病變或受損組織的部位給所述受試者施用在它上面結(jié)合了所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的珠或顆粒，任選處于凝膠和/或成凝膠物質(zhì)中。
29.如權(quán)利要求28的方法，其中，步驟(ii)是在裝有合適培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中進(jìn)行的，并且所述培養(yǎng)基是被攪拌的并且通氣的。
30.如權(quán)利要求29的方法，其中，所述生物反應(yīng)器是裝有內(nèi)部脈管的翻轉(zhuǎn)型生物反應(yīng)器，以便幫助所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞、培養(yǎng)基和可生物再吸收的珠或顆粒的運(yùn)動。
31.如權(quán)利要求29的方法，其中，所述生物反應(yīng)器是旋轉(zhuǎn)燒瓶。
32.一種用于治療受試者中的病變或受損組織的方法，所述方法包括以下步驟(i)獲得正常情況下存在于相當(dāng)于所述病變或受損組織的健康組織中的類型的細(xì)胞和/或其合適的祖細(xì)胞，(ii)擴(kuò)增所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，(iii)將所述擴(kuò)增的細(xì)胞和/或祖細(xì)胞與生物再生珠或顆粒結(jié)合，和(iv)在存在所述病變或受損組織的部位給所述受試者施用在它上面結(jié)合了所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的珠或顆粒，任選處于凝膠和/或成凝膠物質(zhì)中。
33.如權(quán)利要求28-32中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒由可以藥用的聚合物組成。
34.如權(quán)利要求33的方法，其中，所述聚合物是選自明膠和膠原的基于生物學(xué)的聚合物。
35.如權(quán)利要求33的方法，其中，所述聚合物是選自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)的聚合物。
36.如權(quán)利要求33的方法，其中，所述聚合物是基于生物學(xué)的聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物學(xué)的聚合物選自明膠和膠原，而所述合成聚合物選自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)。
37.如權(quán)利要求28或32的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒由可以藥用的非聚合物質(zhì)組成。
38.如權(quán)利要求37的方法，其中，所述非聚合物質(zhì)選自壓碎的骨和脫礦化的骨。
39.如權(quán)利要求28-38中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒業(yè)已用合適的細(xì)胞粘附增強(qiáng)材料功能化或包被。
40.如權(quán)利要求28-39中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒進(jìn)一步由選自生長因子、糖胺聚糖和親水性化合物的有益試劑組成。
41.如權(quán)利要求28-40中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒的直徑或尺寸為大約20-2500微米。
42.如權(quán)利要求41的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒的平均粒度大約為50-200微米。
43.如權(quán)利要求28-42中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)是可生物再吸收的。
44.如權(quán)利要求43的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括選自膠原、血纖蛋白、透明質(zhì)素、脫乙酰殼多糖的基于生物學(xué)的聚合物及其混合物。
45.如權(quán)利要求43的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括選自聚環(huán)氧乙烷和α-羥酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物的合成聚合物。
46.如權(quán)利要求43的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括基于生物學(xué)聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物學(xué)的聚合物選自膠原、血纖蛋白、透明質(zhì)素、脫乙酰殼多糖及其混合物，而所述合成聚合物選自聚環(huán)氧乙烷和α-羥酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物。
47.如權(quán)利要求43-46中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)進(jìn)一步由選自生長因子、糖胺聚糖和親水性化合物的有益試劑組成。
48.如權(quán)利要求43-47中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括粘性材料。
49.如權(quán)利要求28-48中任意一項(xiàng)的方法，其中，每個(gè)所述珠或顆粒與大約3-500個(gè)細(xì)胞和/或祖細(xì)胞結(jié)合。
50.如權(quán)利要求48-49中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是軟骨細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
51.如權(quán)利要求28-49中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是成纖維細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
52.如權(quán)利要求28-49中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是脂肪細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
53.如權(quán)利要求28-49中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是成骨細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
54.如權(quán)利要求28-49中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是細(xì)胞類型和/或祖細(xì)胞類型的混合物。
55.如權(quán)利要求28-54中任意一項(xiàng)的方法，其中，步驟(ii)將所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞擴(kuò)增了5-2000倍。
56.如權(quán)利要求55的方法，其中，步驟(ii)將所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞擴(kuò)增了10-100倍。
57.如權(quán)利要求28-49中任意一項(xiàng)的方法，其中，與所述可生物再吸收的珠或顆粒和凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合的所述細(xì)胞和/或其合適的祖細(xì)胞，是通過在所述存在病變或受損組織的部位將凝膠和/或成凝膠物質(zhì)捕集在組織內(nèi)或組織下施用的。
58.如權(quán)利要求28-49中任意一項(xiàng)的方法，其中，與所述可生物再吸收的珠或顆粒和凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合的所述細(xì)胞和/或其合適的祖細(xì)胞是通過在所述存在病變或受損組織的部位將凝膠和/或成凝膠物質(zhì)捕集在組織瓣或其他膜瓣下面使用的。
59.如權(quán)利要求57或58的方法，其中，所述細(xì)胞和/或合適的祖細(xì)胞是軟骨細(xì)胞，而所述要治療的病變或受損組織是關(guān)節(jié)軟骨。
60.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述受試者是人類受試者。
61.一種用于治療受試者中的病變或受損組織的具有組織樣特征的器件，其中，所述器件包括正常情況下存在于相當(dāng)于所述病變或受損組織的健康組織中的類型的細(xì)胞，和/或其合適的祖細(xì)胞，所述細(xì)胞與可生物再吸收的珠或顆粒聯(lián)合，并且任選與凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合。
62.一種用于增大受試者中組織的具有組織樣特征的器件，其中，所述器件包括正常情況下存在于要增大的組織中的類型的細(xì)胞和/或其合適的祖細(xì)胞，所述細(xì)胞與可生物再吸收的珠或顆粒聯(lián)合，并且任選與凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合。
63.如權(quán)利要求61或62的器件，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞通過結(jié)合而與所述珠或顆粒聯(lián)合。
64.如權(quán)利要求61-63中任意一項(xiàng)的器件，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒是由可以藥用的聚合物組成的。
65.如權(quán)利要求64的器件，其中，所述聚合物是選自明膠和膠原的基于生物學(xué)的聚合物。
66.如權(quán)利要求64的器件，其中，所述聚合物是選自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)的合成聚合物。
67.如權(quán)利要求64的器件，其中，所述聚合物是基于生物學(xué)的聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物學(xué)的聚合物選自明膠和膠原，而所述合成聚合物選自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)的聚合物。
68.如權(quán)利要求61-63中任意一項(xiàng)的器件，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒由可以藥用的非聚合物質(zhì)組成。
69.如權(quán)利要求68的器件，其中，所述非聚合物質(zhì)選自壓碎的骨和脫礦化的骨。
70.如權(quán)利要求64-69中任意一項(xiàng)的器件，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒業(yè)已用合適的細(xì)胞粘附增強(qiáng)材料功能化或包被。
71.如權(quán)利要求61-70中任意一項(xiàng)的器件，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒進(jìn)一步由選自生長因子、糖胺聚糖和親水性化合物的有益試劑組成。
72.如權(quán)利要求61-70中任意一項(xiàng)的器件，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒的直徑或尺寸為大約20-2500微米。
73.如權(quán)利要求72的器件，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒的平均粒度大約為50-200微米。
74.如權(quán)利要求61-73中任意一項(xiàng)的器件，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)是可生物再吸收的。
75.如權(quán)利要求74的器件，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括選自膠原、血纖蛋白、透明質(zhì)素、脫乙酰殼多糖的基于生物學(xué)的聚合物及其混合物。
76.如權(quán)利要求75的器件，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括選自聚環(huán)氧乙烷和α-羥酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物的合成聚合物。
77.如權(quán)利要求74的器件，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括基于生物學(xué)聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物學(xué)的聚合物選自膠原、血纖蛋白、透明質(zhì)素、脫乙酰殼多糖及其混合物，而所述合成聚合物選自聚環(huán)氧乙烷和α-羥酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物。
78.如權(quán)利要求61-77中任意一項(xiàng)的器件，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)進(jìn)一步由選自生長因子、糖胺聚糖和親水性化合物的有益試劑組成。
79.如權(quán)利要求61-78中任意一項(xiàng)的器件，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括粘性材料。
80.如權(quán)利要求61-79中任意一項(xiàng)的器件，其中，每個(gè)所述珠或顆粒與大約3-500個(gè)細(xì)胞和/或祖細(xì)胞結(jié)合。
81.如權(quán)利要求61-80中任意一項(xiàng)的器件，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是軟骨細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
82.如權(quán)利要求61-80中任意一項(xiàng)的器件，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是成纖維細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
83.如權(quán)利要求61-80中任意一項(xiàng)的器件，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是脂肪細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
84.如權(quán)利要求61-80中任意一項(xiàng)的器件，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是成骨細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
85.如權(quán)利要求61-80中任意一項(xiàng)的器件，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是細(xì)胞類型和/或祖細(xì)胞類型的混合物。
86.一種用于治療受試者中的病變或受損組織的方法，該方法包括將一種具有組織樣特征的器件植入所述受試者中存在所述病變或受損組織的部位，其中，所述器件包括正常情況下存在于相當(dāng)于所述病變或受損組織的健康組織中的類型的細(xì)胞，和/或其合適的祖細(xì)胞，所述細(xì)胞與可生物再吸收的珠或顆粒聯(lián)合，并且任選與凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合。
87.一種用于增大受試者中組織的方法，該方法包括將一種具有組織樣特征的器件植入所述受試者的要增大組織的部位，其中，所述器件包括正常情況下存在于要增大組織中的類型的細(xì)胞，和/或其合適的祖細(xì)胞，所述細(xì)胞與可生物再吸收的珠或顆粒聯(lián)合，并且任選與凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合。
88.如權(quán)利要求86或87的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞通過結(jié)合而與所述珠或顆粒聯(lián)合。
89.如權(quán)利要求86-88中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒是由可以藥用的聚合物組成的。
90.如權(quán)利要求89的方法，其中，所述聚合物是選自明膠和膠原的基于生物學(xué)的聚合物。
91.如權(quán)利要求89的方法，其中，所述聚合物是選自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)的合成聚合物。
92.如權(quán)利要求89的方法，其中，所述聚合物是基于生物學(xué)的聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物學(xué)的聚合物選自明膠和膠原，而所述合成聚合物選自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)。
93.如權(quán)利要求86-88中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒由可以藥用的非聚合物質(zhì)組成。
94.如權(quán)利要求93的方法，其中，所述非聚合物質(zhì)選自壓碎的骨和脫礦化的骨。
95.如權(quán)利要求89-94中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒業(yè)已用合適的細(xì)胞粘附增強(qiáng)材料功能化或包被。
96.如權(quán)利要求86-95中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒進(jìn)一步由選自生長因子、糖胺聚糖和親水性化合物的有益試劑組成。
97.如權(quán)利要求86-95中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒的直徑或尺寸為大約20-2500微米。
98.如權(quán)利要求97的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒的平均粒度大約為50-200微米。
99.如權(quán)利要求86-88中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)是可生物再吸收的。
100.如權(quán)利要求99的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括選自膠原、血纖蛋白、透明質(zhì)素、脫乙酰殼多糖的基于生物學(xué)的聚合物及其混合物。
101.如權(quán)利要求100的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括選自聚環(huán)氧乙烷和α-羥酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物的合成聚合物。
102.如權(quán)利要求99的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括基于生物學(xué)聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物學(xué)的聚合物選自膠原、血纖蛋白、透明質(zhì)素、脫乙酰殼多糖及其混合物，而所述合成聚合物選自聚環(huán)氧乙烷和α-羥酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物。
103.如權(quán)利要求86-102中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)進(jìn)一步由選自生長因子、糖胺聚糖和親水性化合物的有益試劑組成。
104.如權(quán)利要求86-103中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括粘性材料。
105.如權(quán)利要求86-104中任意一項(xiàng)的方法，其中，每個(gè)所述珠或顆粒與大約3-500個(gè)細(xì)胞和/或祖細(xì)胞聯(lián)合。
106.如權(quán)利要求86-105中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是軟骨細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
107.如權(quán)利要求86-105中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是成纖維細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
108.如權(quán)利要求86-105中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是脂肪細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
109.如權(quán)利要求86-105中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是成骨細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
110.如權(quán)利要求86-105中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是細(xì)胞類型和/或祖細(xì)胞類型的混合物。
111.如權(quán)利要求86-110中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述受試者是人類受試者。
112.一種用于增大受試者中的組織的方法，該方法包括給所述受試者的要增大組織的部位施用正常情況下存在于要增大組織中的類型的細(xì)胞，和/或其合適的祖細(xì)胞，所述細(xì)胞與可生物再吸收的珠或顆粒聯(lián)合，并且任選與凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合。
113.如權(quán)利要求112的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞通過結(jié)合與所述珠或顆粒聯(lián)合。
114.如權(quán)利要求112或113的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒包括可以藥用的聚合物。
115.如權(quán)利要求114的方法，其中，所述聚合物是選自明膠和膠原的基于生物學(xué)的聚合物。
116.如權(quán)利要求114的方法，其中，所述聚合物是選自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)的合成聚合物。
117.如權(quán)利要求114的方法，其中，所述聚合物是基于生物學(xué)的聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物學(xué)的聚合物選自明膠和膠原，而所述合成聚合物選自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)。
118.如權(quán)利要求112或113中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒由可以藥用的非聚合物質(zhì)組成。
119.如權(quán)利要求118的方法，其中，所述非聚合物質(zhì)選自壓碎的骨和脫礦化的骨。
120.如權(quán)利要求114-119中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒業(yè)已用合適的細(xì)胞粘附增強(qiáng)材料功能化或包被。
121.如權(quán)利要求114-120中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒進(jìn)一步由選自生長因子、糖胺聚糖和親水性化合物的有益試劑組成。
122.如權(quán)利要求112-121中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒的直徑或尺寸為大約20-2500微米。
123.如權(quán)利要求122的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或顆粒的平均粒度大約為50-200微米。
124.如權(quán)利要求112-123中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)是可生物再吸收的。
125.如權(quán)利要求124的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括選自膠原、血纖蛋白、透明質(zhì)素、脫乙酰殼多糖的基于生物學(xué)的聚合物及其混合物。
126.如權(quán)利要求124的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括選自聚環(huán)氧乙烷和α-羥酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物的合成聚合物。
127.如權(quán)利要求124的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括基于生物學(xué)聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物學(xué)的聚合物選自膠原、血纖蛋白、透明質(zhì)素、脫乙酰殼多糖及其混合物，而所述合成聚合物選自聚環(huán)氧乙烷和α-羥酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物。
128.如權(quán)利要求124-127中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)進(jìn)一步由選自生長因子、糖胺聚糖和親水性化合物的有益試劑組成。
129.如權(quán)利要求124-128中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述凝膠和/或成凝膠物質(zhì)包括粘性材料。
130.如權(quán)利要求112-129中任意一項(xiàng)的方法，其中，每個(gè)所述珠或顆粒與大約3-500個(gè)細(xì)胞和/或祖細(xì)胞結(jié)合。
131.如權(quán)利要求112-130中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是軟骨細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
132.如權(quán)利要求112-130中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是成纖維細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
133.如權(quán)利要求112-130中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是脂肪細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
134.如權(quán)利要求112-130中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是成骨細(xì)胞和/或其祖細(xì)胞。
135.如權(quán)利要求112-130中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是細(xì)胞類型和/或祖細(xì)胞類型的混合物。
全文摘要
披露了用于治療受試者中的病變或受損組織的方法，包括在受試者的存在病變或受損組織的部位，施用正常存在于相當(dāng)于所述病變或受損組織的健康組織中的類型的細(xì)胞，和/或其合適的祖細(xì)胞，所述細(xì)胞與可生物再吸收的珠或顆粒聯(lián)合，并且任選與凝膠和/或成凝膠物質(zhì)聯(lián)合。當(dāng)所述細(xì)胞和/或其合適的祖細(xì)胞是軟骨細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明的方法適合治療，例如，與原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的關(guān)節(jié)軟骨變性。還披露了用于治療受試者中的病變或受損組織的具有組織樣特征的器件，其中，所述器件包括正常存在于相當(dāng)于所述病變或受損組織的健康組織中的類型的細(xì)胞，和/或其合適的祖細(xì)胞，所述細(xì)胞與可生物再吸收的珠或顆粒結(jié)合，并且任選與凝膠和/或成凝膠物質(zhì)結(jié)合。
文檔編號A61K45/00GK1520306SQ02807860
公開日2004年8月11日 申請日期2002年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月5日
發(fā)明者J·A·維爾克梅斯特, 蔡偉博, J·A·M·拉姆肖, H·W·蒂森, 張根源, J A 維爾克梅斯特, M 拉姆肖, 蒂森 申請人:聯(lián)邦科學(xué)及工業(yè)研究組織, 財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院