專利名稱：經(jīng)修飾的wt1肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于維爾姆斯(Wilms)瘤抑制基因WT1的產(chǎn)物的癌抗原。該癌抗原可用作抗癌疫苗以抵抗血液癌癥如白血病、骨髓增生異常綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤和惡性淋巴瘤，實體癌如胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、生殖細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌和卵巢癌以及表達WT1的任何癌。
相關領域描述清除機體中的外來物的免疫機制一般由體液免疫(其中涉及巨噬細胞作為抗原呈遞細胞識別抗原，輔助性T-細胞通過識別上述巨噬細胞呈遞的抗原并產(chǎn)生各種淋巴因子來活化其他T-細胞，以及B淋巴細胞在上述淋巴因子作用下分化成產(chǎn)生抗體的細胞；)以及細胞免疫(借此，由抗原呈遞導致分化的殺傷性T-細胞(細胞毒性T-細胞(CTL)攻擊并摧毀靶細胞)組成。
現(xiàn)今，癌癥免疫被認為主要是殺傷性T-細胞參與的細胞免疫的結果。在受殺傷性T-細胞影響的癌癥免疫中，識別以主要組織相容性復合物(MHC)I類(MHC I類抗原，對于人也稱HLA抗原)和癌癥抗原的復合物形式呈遞的癌癥抗原的前體T-細胞分化并增生，結果所形成的殺傷性T-細胞攻擊并摧毀癌細胞。此時，癌細胞在細胞表面呈遞一個MHC I類抗原和癌癥抗原的復合物，其被殺傷性T-細胞所靶向(Cur.Opin.Immunol.，5，709，1993；Cur.Opin.Immunol.，5，719，1993；Cell，82，13，1995；Immunol.Rev.，146，167，1995)。
上述被作為靶細胞的癌細胞上的MHC I類抗原呈遞的癌癥抗原被認為是由約8-12個氨基酸組成的肽，其是由于在癌細胞內(nèi)合成的抗原蛋白被細胞內(nèi)的蛋白酶處理而產(chǎn)生的(Cur.Opin.Immunol.，5，709，1993；Cur.Opin.Immunol.，5，719，1993；Cell，82，13，1995；Immunol.Rev.，146，167，1995)。
現(xiàn)今，雖然進行了各種癌癥的抗原蛋白的研究，但是這些抗原蛋白很少被證實是癌癥特異性抗原。
已經(jīng)從染色體11p13中分離出了Wilms腫瘤的腫瘤抑制基因WT1(WT1基因)，基于對WAGR綜合癥(以Wilms腫瘤、無虹膜、泌尿生殖器異常、智力遲鈍等并發(fā)癥的形式出現(xiàn))的分析發(fā)現(xiàn)該基因是Wilms腫瘤的一個致病基因(Gessler，M.等，Nature，Vol.343，p.774-778(1990))。其基因組DNA約為50kb，由10個外顯子組成，然而其cDNA約為3kb。從cDNA估計的氨基酸序列見SEQ ID No.1(Mol.Cell.Biol.，11，1707，1991)。
在人白血病中，WT1基因高頻表達，且當白血病細胞用WT1反義寡聚體處理后，細胞的生長受到抑制(日本未審查的專利申請No.9-104627)。這樣，WT1基因被認為促進了白血病細胞的生長。此外，WT1也在實體癌如胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、生殖細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌和卵巢癌中高水平表達(日本專利申請No.9-191635)，并且已經(jīng)證明WT1基因是白血病和實體癌中的一個新的腫瘤標志。
由WT1基因表達產(chǎn)物的一部分組成的幾種癌癥特異性抗原肽在WO00/06602中描述，一個特別有希望的肽被命名為Db，在其中描述了下列氨基酸序列Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID No.2)(本發(fā)明中稱為“野生型WT1肽”)。
發(fā)明公開這樣，本發(fā)明的一個目的是提供一種肽，其有希望作為癌癥疫苗并且其活力高于以前所知道的癌癥特異性抗原肽的活力。
作為全力解決上述問題的各種研究的一個結果，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一種肽(稱作“經(jīng)修飾的WT1肽”)有更高的活力，其氨基酸序列是上述已知氨基酸序列(SEQ ID No.2)的第二個氨基酸Met改變?yōu)門yr所得到的，即Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID No.3)，因此導致了本發(fā)明的完成。
這樣，本發(fā)明提供了由9-30個氨基酸組成且含有氨基酸序列Cys TyrThr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID No.3)的肽(經(jīng)修飾的WT1肽)。該肽優(yōu)選為由9-12個氨基酸組成且含有SEQ ID No.3所示氨基酸序列的多肽，更優(yōu)選由SEQ ID No.3所示氨基酸序列組成的肽。
此外，本發(fā)明提供了具有上述經(jīng)修飾的WT1肽作為活性成分的癌癥疫苗。
此外，本發(fā)明還提供了將編碼上述肽的DNA作為活性成分的DNA疫苗。
而且，本發(fā)明提供了在其上呈遞HLA抗原(MHC I類抗原)和上述肽的復合物的抗原呈遞細胞。
此外，本發(fā)明還提供了識別HLA抗原和上述肽的復合物的細胞毒性T-細胞。
附圖簡述

圖1所示為用野生型WT1肽(SEQ ID No.2)或本發(fā)明的經(jīng)修飾的WT1肽(SEQ ID No.3)刺激過的效應細胞(E)對用或未用肽脈沖的C1R2402靶細胞(T)的細胞殺傷效果(特異溶胞活力)。圖中，黑色圓圈表示用經(jīng)修飾的WT1肽刺激的效應細胞對用野生肽脈沖過的C1R2402靶細胞的溶胞效果，黑色方塊表示用野生型WT1肽刺激的效應細胞對用野生肽脈沖過的C1R2402靶細胞的溶胞效果，白色圓圈表示用經(jīng)修飾的WT1肽刺激的效應細胞對沒有用野生肽脈沖過的C1R2402靶細胞的溶胞效果，白色方塊表示用野生型WT1肽刺激的效應細胞對沒有用野生肽脈沖過的C1R2402靶細胞的溶胞效果。
圖2所示為用野生型WT1肽或本發(fā)明經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的效應細胞對內(nèi)源性表達WT1抗原的急性粒細胞白血病細胞或不表達WT1抗原的急性粒細胞白血病細胞的溶胞活力。
圖3所示為用野生型WT1肽或本發(fā)明經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的效應細胞對用或未用肽脈沖過的C1R2402靶細胞的細胞殺傷效果(特異性溶胞活性)。圖中，黑色圓圈表示用經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的效應細胞對用野生肽脈沖過的C1R2402細胞的溶胞效果，黑色方塊表示用野生型WT1肽刺激過的效應細胞對用野生肽脈沖過的C1R2402靶細胞的溶胞效果，白色圓圈表示用經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的效應細胞對沒有用野生肽脈沖過的C1R2402靶細胞的溶胞效果，白色方塊表示用野生型WT1肽刺激過的效應細胞對沒有用野生肽脈沖過的C1R2402靶細胞的溶胞效果。
圖4所示為用野生型WT1肽或本發(fā)明經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的效應細胞對內(nèi)源性表達WT1或不表達WT1的肺癌細胞系的溶胞活力。
圖5所示為針對用野生型WT1肽或本發(fā)明經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的效應細胞對用野生肽脈沖過的C1R2402靶細胞的細胞殺傷效果(特異性溶胞活性)，抗HLA I類抗體、抗HLA II類抗體和抗CD8抗體的抑制作用。
優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明的肽為由9-30個氨基酸組成的肽，它含有由SEQ ID No.3所示的9個氨基酸組成的氨基酸序列。此外，從結合HLA抗原而被呈遞這個觀點看，該肽優(yōu)選為含有SEQ ID No.3所示氨基酸序列的9-12個氨基酸組成的肽，更優(yōu)選地，它是具有可通過結合HLA抗原而被呈遞的抗原肽序列中的規(guī)則(基元)的肽(J.Immunol.，152，p.3913，1994；Immunogenetics，41，p.178，1995；J.Immunol.，155，p.4307，1994；J.Immunol.，155，p.4749，1995)。此外，該肽最優(yōu)選為由具有SEQ ID No.3所示的9個氨基酸的氨基酸序列組成的肽。
此外，上述的“含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的肽”特別地指，例如含有SEQ ID No.3所示氨基酸序列且從WT1上的適當位點(SEQ IDNo.1)(位置編號235-243)或從人WT1上的相應位點(NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號XP012009)以N-端和/或C-端方向延伸的具有癌癥抗原肽活性的肽。
測定本發(fā)明癌癥抗原肽的活力的方法的一個例子是1995年J.Immunol.154，p.2257所描述的方法。下面用HLA型的HLA-A24作為例子對該方法概要地進行說明。首先，從HLA-A24抗原陽性個體中分離外周血淋巴細胞。然后通過體外加入本發(fā)明的肽刺激外周血淋巴細胞從而誘導CTL(細胞毒性T-細胞)，此CTL可特異識別被抗原呈遞細胞呈遞的本發(fā)明肽與HLA-A24的復合物。
CTL的誘導可通過例如測量由于CTL和抗原肽與HLA-A24的復合物反應而產(chǎn)生的各種細胞因子(例如，γ干擾素)的量而研究。而且，也可通過測量CTL對用51Cr或銪標記的抗原肽呈遞細胞的細胞毒性來研究CTL的誘導(51Cr釋放試驗，Int.J.Cancer，58，p.317，1994；銪釋放試驗，J.Immunol.，154，p.3991，1995)。此外，也可參考后面描述的實施例研究CTL的誘導。
本發(fā)明還涉及含有上述抗原作為其活性成分的癌癥疫苗。該疫苗可用于預防或治療血液癌癥如白血病、骨髓增生異常綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤和惡性淋巴瘤以及實體癌如胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、生殖細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌和卵巢癌。特別地，該疫苗可施用給HLA-A24陽性患者。該疫苗可以口服或胃腸外給藥，例如，通過腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或鼻內(nèi)給藥。
此外，本發(fā)明疫苗的給藥也可通過如下方法進行從病人外周血中收集單核細胞，從單核細胞中提取樹突細胞，將樹突細胞用本發(fā)明的肽脈沖后通過皮下給藥返回到病人體內(nèi)等等。
該方法稱作細胞治療或樹突細胞(DC)治療，在后述題為“抗原呈遞細胞”的部分將進一步做詳細的介紹。
該疫苗除了作為上述活性成分給藥的肽外還可以含有藥學上可接受的載體如合適的輔藥(Clin-Microbiol.Rev.，7，277-289，1994)，其中的例子包括礦物凝膠如氫氧化鋁，表面活性劑如溶血卵磷脂和pluronic polyole、聚陰離子、肽和油性乳劑。備選的，該疫苗可含有其他的混合到脂質(zhì)體或摻和到多糖或該疫苗中的聚集物。典型劑量為每天0.1μg/kg到1mg/kg。
本發(fā)明中，編碼上述多肽疫苗的DNA也可以用作疫苗(DNA疫苗)。即將包含編碼本發(fā)明經(jīng)修飾的WT1肽的核酸的核酸(優(yōu)選DNA)插入合適的載體(優(yōu)選表達載體)中后，可通過給動物施用本載體而使其具有癌癥免疫性。WO 00/6602或J.Immunol.，160，p.1717，1998等可作為用于該DNA疫苗的特定技術的參考。
此外，本發(fā)明涉及抗原呈遞細胞，HLA抗原和上述肽的復合物在其上呈遞。在該實例中，盡管由于本發(fā)明的肽的刺激而觀察到有效的殺細胞活力，但這是由于外周血單核細胞內(nèi)存在其上呈遞有本發(fā)明肽和HLA抗原(HLA-A24抗原)的復合物的抗原呈遞細胞以及能特異識別這些抗原呈遞細胞的CTL(細胞毒性T-細胞)的誘導的結果。這些其上呈遞有HLA抗原和本發(fā)明肽的復合物的抗原呈遞細胞在下述細胞治療(DC治療)中得到有效應用。
細胞治療中使用的抗原呈遞細胞的生產(chǎn)方法為從腫瘤患者分離具有呈遞抗原的能力的細胞，體外用本發(fā)明的肽脈沖這些細胞，并使HLA抗原和本發(fā)明肽的復合物呈遞到細胞的表面上。這里，盡管對“具有呈遞抗原的能力的細胞”沒有特別限制，但它們應表達能夠呈遞本發(fā)明肽到細胞表面上的HLA抗原，優(yōu)選樹突細胞，因為它們被認為有高的抗原呈遞能力。
此外，用于脈沖上述有能力呈遞抗原的細胞的本發(fā)明肽可以不只是肽的形式，還可以是編碼所述肽的DNA或RNA的形式。
用于制備本發(fā)明的抗原呈遞細胞的一個特定方法可參考例如，CancerImmunol.Immunother.，46，82，1998，J.immunol.，158，p.1796，1997和Cancer Res.，59，p.1184，1999。在使用樹突細胞的情況下，用Fycoll方法從腫瘤病人的外周血液中分離淋巴細胞，在GM-CSF和IL-4存在的條件下培養(yǎng)淋巴細胞，除去非貼壁細胞，從貼壁細胞中得到樹突細胞，之后通過用本發(fā)明肽培養(yǎng)樹突細胞以進行脈沖可以制得本發(fā)明的抗原呈遞細胞。
此外，對于通過將編碼本發(fā)明肽的DNA或RNA插入能夠呈遞抗原的上述細胞中而制備本發(fā)明的抗原呈遞細胞的情況，對于DNA可參考例如，Cancer Res.，56，p.5672，1996或J.Immunol.，161，p.5607，1998，而對于RNA可參考例如，J.Exp.Med.，184，p.465，1996進行插入。
這些抗原呈遞細胞可用作腫瘤治療劑的活性成分。此時，為了保持抗原呈遞細胞的穩(wěn)定，治療劑優(yōu)選含有生理鹽水、磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)或介質(zhì)等等。給藥方法的實例包括靜脈給藥、皮下給藥和皮內(nèi)給藥。
而且，本發(fā)明還涉及可識別HLA抗原和上述肽的復合物的細胞毒性T-細胞(CTL)。本發(fā)明的CTL可有效用于下述的過繼性免疫治療。
換句話說，對于黑素瘤，通過體外培養(yǎng)大量的已經(jīng)體外攻擊腫瘤的病人T細胞，然后將它們返回到病人體內(nèi)，過繼性免疫治療已經(jīng)被認識到具有療效(J.Natl.Cancer Inst.，86，1159，1994)。此外，對于小鼠黑素瘤的情況，通過體外用腫瘤抗原肽TRP-2刺激脾細胞，使特異CTL在腫瘤抗原肽中增殖，然后將所述CTL施于移植有黑素瘤的小鼠中，觀察到轉(zhuǎn)移受到抑制(J.Exp.Med.，185，453，1997)。這是基于使特異識別抗原呈遞細胞上HLA抗原和腫瘤抗原肽所形成的復合物的CTL體外增殖所導致的結果。這樣，將病人的外周血液淋巴細胞在體外用本發(fā)明的肽刺激以增加腫瘤特異CTL、然后將這些細胞返回到病人體內(nèi)的這種治療方法被認為是有用的。
以這種方式，本發(fā)明的CTL可用作腫瘤治療劑的活性成分。此時，為了保持CTL的穩(wěn)定，治療劑優(yōu)選含有生理鹽水、磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)或介質(zhì)等等。給藥方法的實例包括靜脈給藥、皮下給藥和皮內(nèi)給藥。
下面的實施例用于闡釋本發(fā)明肽作為癌癥抗原和癌癥疫苗的有用性。
實施例1外周血單核細胞分離自HLA-A*2402陽性供體，將其分裝在24孔平板的孔中，2×106細胞/孔，然后加入野生型WT1肽或經(jīng)修飾的WT1肽使其濃度為20μM并培養(yǎng)1周。此時所用培養(yǎng)基由45％RPMI，45％AIV，10％FCS，1x非必需氨基酸和SM/PCG組成。上述培養(yǎng)之后，將細胞調(diào)節(jié)到2×106細胞/孔并用作效應細胞。
另一方面，從相同的HLA-A*2402陽性供體中類似地分離其他外周血單核細胞，然后通過和20μM上述肽之一培養(yǎng)4天以進行肽脈沖。之后在30Gy下輻射，將細胞調(diào)節(jié)到4×106個細胞/孔并用作刺激細胞。
然后將以上述方式制備的效應細胞和刺激細胞混合培養(yǎng)1周后加入IL-2至50U/ml。結果所得細胞的狀態(tài)見下表。
表1

然后，根據(jù)51Cr釋放方法(J.Immunol.，164，1873，2000)進行殺傷試驗。C1R2402細胞和用上述肽脈沖過的C1R2402細胞用作靶細胞。然后讓前述被野生型WT1肽或經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的細胞(效應細胞(E))作用于這些靶細胞(T)的每一個，E∶T比例為1、5或20，然后測定細胞的溶解。這些結果見圖1。從該圖中可清除的看出，用經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的細胞比用野生型WT1肽刺激過的細胞顯示出更強的細胞殺傷活力。
實施例2根據(jù)51Cr釋放方法檢驗用經(jīng)修飾的WT1肽或野生型WT1肽刺激過的效應細胞對內(nèi)源性表達WT1抗原的白血病細胞的細胞殺傷活力。WT1+/A*2402+細胞(從AML病人1#得到的白血病細胞)、WT1-/A*2402+細胞(從AML病人2#得到的白血病細胞)、WT1+/A*2402-細胞(從AML病人3#得到的白血病細胞)、WT1-/A*2402-細胞(從AML病人4#得到的白血病細胞)用作靶細胞。
將實施例1中制備的效應細胞(E)和上述靶細胞(T)以20∶1的E∶T比例混合后培養(yǎng)4小時，之后測定細胞的溶解程度。結果見圖2。
從該圖中可以清楚的看出，盡管用野生型WT1肽或經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的細胞都顯示出對WT1+/A*2402細胞的細胞毒活力，但經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的細胞的活力水平較高。
實施例3使用從不同HLA-A*2402陽性健康供體的外周血液制得的效應細胞進行與實施例1相同的實驗。其結果見圖3。
從該圖中可以清楚的看出，和實施例1類似，用經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的細胞比用野生型WT1肽刺激過的細胞顯示出更強的細胞毒活力。
實施例4用51Cr釋放方法檢驗用野生型WT1肽或經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的效應細胞對內(nèi)源性表達WT1抗原的、與肺癌有關的癌細胞系(靶細胞)的細胞毒性活力。RERF-LCAI(WT1+/A*2402+)，LC1sq(WT1+/A*2402+)，11-18(WT1-/A*2402+)和LK87(WT1+/A*2402-)細胞用作靶細胞。
將使用與實施例1相同的方式制備的效應細胞(E)和上述用51Cr標記的靶細胞(T)以E∶T為20∶1的比例按和實施例2相同的方式培養(yǎng)4小時后測定細胞的溶解程度。結果見圖4。
從圖中可以清楚的看出，盡管用野生型WT1肽或經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的細胞都顯示出僅對WT1+/A*2402+細胞的細胞毒活力，但經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的細胞的活力水平更高。
實施例5利用抗體通過阻斷試驗(blocking assay)確認用野生型WT1肽或經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的效應細胞是和HLA I類結合的CD8陽性殺傷細胞。所用抗體由抗HLA I類抗體、抗HLA II類抗體和抗CD8抗體組成。將用與實施例1相同的方式制備的效應細胞(E)和用51Cr標記過的靶細胞(T)(C1R2402細胞或用野生肽脈沖過的C1R2402細胞)以E∶T為20∶1的比例與抗體混合后，培養(yǎng)4小時，然后根據(jù)51Cr釋放方法測定細胞溶解的程度。其結果見圖5。
從圖中可以清楚的看出，對于用野生型WT1肽或經(jīng)修飾的WT1肽刺激過的細胞，其細胞毒活力都被抗HLA I類抗體和抗CD8抗體所阻斷，這表明顯示出細胞毒活力的細胞是和HLA I類結合的CD8陽性殺傷細胞。
實施例6我們研究了經(jīng)修飾的WT1肽和野生型WT1肽結合HLA-A*2402的親和力。在用緩沖液(131mM檸檬酸，66mM磷酸鈉，290m滲透壓摩爾，pH3.3)處理C1RA2402細胞1分鐘后，向這些細胞加入含0.5％牛血清白蛋白的DMEM培養(yǎng)基以進行中和。用該培養(yǎng)液洗滌細胞后，將其懸浮于含200nM β2-微球蛋白(Sigma)和0.5％牛血清白蛋白的DMEM培養(yǎng)基中，使細胞濃度為2×106個細胞/ml。將15μl細胞懸浮液和含不同濃度WT1肽的50μl培養(yǎng)基混合，在室溫下培養(yǎng)4小時。洗滌細胞后，將它們用FITC標記的抗HLA-A24單克隆抗體(克隆名7A12)染色，用流式細胞儀FACS系統(tǒng)分析表現(xiàn)出的HLA-A24量。用相似的步驟研究已報道結合HLA-A*2402的黑素瘤抗原pmel 15的抗原肽(Ala Tyr Gly Leu Asp Phe Tyr Ile Leu)(SEQID No.4)(J.Immunol.，154，5994，1995)，用此作為標準，根據(jù)文獻(Immunogenetics，51，816，2000)描述的方法計算得到WT1肽的解離常數(shù)(Kd)。這些結果見表2。
表2

從該表可清楚的看出，經(jīng)修飾的WT1肽比野生型WT1肽顯示出對HLA-A*2402更強的結合親和力。
基于上述結果，證明本發(fā)明的肽無疑可起癌癥抗原的作用，并且能引起針對癌細胞的殺傷性T-細胞(癌細胞的細胞毒性T-細胞)的誘導和增殖。這樣，本發(fā)明的癌癥抗原肽可用作癌癥疫苗，抵抗伴有WT1基因表達增加的白血病和實體癌。
序列表<110>杉山治夫(Haruo Sugiyama)<120>經(jīng)修飾的WT1肽<130>J939<150>JP 2001-83250<151>2001-03-22<160>4<210>1<211>449<212>PRT<213>小鼠<400>1Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser5 10 15Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Pro Val Ser Gly Ala20 25 30Arg Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala35 40 45Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Phe85 90 95Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Ala Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Gln His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser245 250 255Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile Gly Tyr Glu260 265 270Ser Glu Asn His Thr Ala Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile275 280 285His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Ser290 295 300Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys325 330 335Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp355 360 365Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys405 410 415Arg Trp His Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val420 425 430Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala435 440 445Leu449<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>2Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>3Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu1 5<210>4<211>9
<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>
<223>抗原肽<400>4Ala Tyr Gly Leu Asp Phe Tyr Ile Leu1 權利要求
1.一種癌癥抗原肽，其含有由9-30個氨基酸組成且包含下列氨基酸序列的肽作為活性成分Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(序列IDNO.3)。
2.根據(jù)權利要求1的癌癥抗原肽，其由9-12個氨基酸組成且含有序列ID NO.3所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權利要求1的癌癥抗原肽，其由序列ID NO.3所示的氨基酸序列組成。
4.一種癌癥疫苗，其含有權利要求1到3之任何一項的肽作為活性成分。
5.一種抗癌的DNA疫苗，其含有編碼權利要求1到3之任何一項的肽的DNA作為活性成分。
6.抗原呈遞細胞，其上呈遞有HLA抗原和權利要求1到3之任何一項的肽的復合物。
7.細胞毒性T細胞，其能識別HLA抗原和權利要求1到3之任何一項的肽的復合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種癌癥抗原肽，其含有下列氨基酸序列Cys Tyr ThrTrp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO.3)，并公開了含有該肽作為其活性成分的一種癌癥疫苗，以及將編碼該肽的DNA作為其活性成分的一種DNA疫苗。
文檔編號A61P35/00GK1531553SQ0280702
公開日2004年9月22日 申請日期2002年3月22日 優(yōu)先權日2001年3月22日
發(fā)明者杉山治夫 申請人:杉山治夫