專利名稱：一組抗hiv感染及防治艾滋病的核苷酸序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一組抗HIV感染及防治艾滋病的核苷酸序列及其應用。
背景技術：
近兩年的研究結果證實短的雙鏈RNA在多種哺乳動物細胞中具有干擾RNA功能，可以特異抑制特定基因在細胞內(nèi)的表達。通過該途徑也可抑制病毒(包括HIV病毒)基因在細胞內(nèi)的表達。但是由于HIV病毒具有極大的變異性，目前所使用的序列均只與少數(shù)HIV株序列同源，因此不能作為普遍有效的基因治療藥物使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一組抗HIV感染及防治艾滋病的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述核苷酸序列的應用。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下設計方案一組抗HIV感染及防治艾滋病的RNA序列及其片段，該組RNA序列如下(1)aucaaugaggaagcugcagaaugg；(2)gggaagugacauagcaggaacuacuag；(3)uaaauaaaauaguaagaauguauagcccu；(4)uaugggguaccugugugga；(5)gccaauucccauacauuauugugc；(6)uuaaauggcagucuagcagaa；(7)accacacacaaggcuacuucccugau；(8)acagccgccuagcauuucaucac；(9)ggauggugcuucaagcuaguaccaguu。
一組由所述的RNA序列及其片段和與之互補的序列雜交形成的雙鏈RNA序列。
一組由所述的RNA序列及其片斷在其5’端或3’端加核苷酸修飾的序列。
一組所述的RNA序列及其片段和與之反向互補的序列加上中間非互補連接序列形成的發(fā)夾樣RNA雙鏈。
一組所述序列對應的DNA序列。
包含所述的RNA序列的表達載體。
包含所述的DNA序列的表達載體。
包裹所述的RNA序列的脂質(zhì)體。
包裹所述的DNA序列的脂質(zhì)體。
包裹所述的表達載體的脂質(zhì)體。
將權所述的RNA序列在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
將所述的DNA序列在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
將所述的表達載體在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
將所述的脂質(zhì)體在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
所述的RNA序列及其片段用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
所述的DNA序列及其片段用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
所述的表達載體用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
所述的脂質(zhì)體用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
所述的方法用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
本發(fā)明的優(yōu)點是通過同源比較，獲得一系列與所有已經(jīng)發(fā)表的HIV序列高度同源的RNA序列片段，使用該系列片段衍生的雙鏈RNA序列可以有效地抑制HIV基因的表達；使用質(zhì)粒轉錄的該系列RNA也可在細胞內(nèi)抑制HIV基因的表達；攜帶該片段對應DNA腺病毒伴隨病毒感染細胞后可以轉錄出對應的雙鏈RNA并抑制HIV基因的表達。


圖1為報告質(zhì)粒pEGFP-gp120的構建圖。
圖2為通過熒光顯微鏡檢測的雙鏈干擾RNA可以降低EGFP-HIV gp120融合蛋白的表達圖。
圖3為通過Western-Blot檢測的雙鏈干擾RNA可以降低EGFP-HIV gp120融合蛋白的表達圖。
圖4為表達內(nèi)部雙鏈RNA的質(zhì)粒p-H1-gp120i的構建圖。
圖5為質(zhì)粒pAAV-120i的構建圖。
圖6為通過熒光顯微鏡檢測的攜帶可轉錄HIV gp120發(fā)夾樣雙鏈RNA的重組AAV病毒可抑制GFP-GP120融合蛋白的表達圖。
具體實施例方式
實施例中采用的方法均為本領域常規(guī)操作，詳見《分子克隆》第三版。
實施例1極度保守HIV RNA序列的獲得選擇已經(jīng)發(fā)表的HIV1典型序列，按功能基因分成每個約70個核苷酸(nt)的片段；每一個片段用NIH(美國國立衛(wèi)生研究院)提供的BLAST軟件(BLASTN 2.2.4/2.2.5)在英特網(wǎng)上分析其在GenBank(NCBI，美國國家生物技術信息中心)，EMBL(歐洲分子生物學實驗室核酸序列數(shù)據(jù)庫)，DDBJ(日本DNA數(shù)據(jù)庫)及GDB(基因組數(shù)據(jù)庫)不少于14萬個核苷酸序列中的同源序列；選擇出符合以下條件的核苷酸序列(1)該片段大于或等于19個核苷酸；(2)該片段在所比較的HIV序列中完全同源或至少有1000個以上公開序列中該片段完全同源；(3)不完全同源時，相應序列與該片段僅一個nt不同。所獲得的序列見表1，比較結果詳見表2。
表1.通過同源比較發(fā)現(xiàn)的HIV序列中極度保守的RNA序列

表2.極度保守RNA序列的同源比較結果

實施例2.使用合成RNA雙鏈，降低HIV env基因的表達。
根據(jù)上述env基因的保守序列(表1中4號序列)19核苷酸的RNA片斷，并根據(jù)互補原則合成該鏈的互補RNA鏈，在RNA鏈3’端加UU修飾5’ uaugggguaccuguguggauu3’uuauaccccauggacacaccu如圖1所示，質(zhì)粒pEGFPC1(Clontech，CA)用EcoRI和BamHI雙酶切(37℃ 1小時)后回收大片斷作為載體；以HIV-1 Bru株cDNA(2ng)為模板，加gp120引物1(5’cggaattctaaagagcacaaga cagtggac)；和引物2(5’cggatcctactctaccgtcagcgtcattga)各100ng，Pfu高保真酶2.5單位，dNTP 250μmol/L，2.5mol/L MgCl2，25mmol/LTrisHCl(pH8.3)進行PCR反應(94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 90秒，使用Perkin Elmer 9700型PCR儀，共30循環(huán))，PCR產(chǎn)物用Qiagen Gel Extraction Kit(購自Biolab)EcoRI和BamHI酶切后與上述載體連接后轉化大腸桿菌JM109(購自Promega)，獲得完全正確的質(zhì)粒pEGFP-gp120，該質(zhì)粒轉染細胞后可表達綠色熒光蛋白與HIV gp120的融合蛋白。
質(zhì)粒pEGFP-gp120 1μg和1μg上述合成的RNA雙鏈，使用LIPOFECTamine法(見Invitrogen說明書)共轉染HEK293細胞(購自ATCC)，36小時后與加1μg無關雙鏈(使用實施例3中的GAG雙鏈作為無關雙鏈)RNA的共轉染細胞用熒光照相法比較綠色熒光蛋白-GP120融合蛋白的表達量，并可通過使用抗GFP抗體(購自Clontech)進行免疫印跡(IB)，比較融合蛋白的表達產(chǎn)量。
結果如圖2所示，與對照比較，env基因特異的雙鏈RNA使融合蛋白的表達產(chǎn)量顯著降低；重復該實驗兩次，分別以DsRNA1和DsRNA2表示，如圖3所示，該dsRNA能降低GFP-HIV GP120融合蛋白的表達產(chǎn)量80％以上。
實施例3、合成RNA雙鏈抑制gag基因表達根據(jù)上述gag保守序列(表1中2號序列)合成19核苷酸的RNA片斷，并根據(jù)互補原則合成該鏈的互補RNA鏈，在互補RNA鏈3’端加UU，退火后形成RNA雙鏈5’ gugacauagcaggaacuacuu3’uucacuguaucguccuugaug按照實施例2的方法，通過PCR從HIV(LAV-1，Bru分離株)cDNA擴增出GAG基因，克隆至pEGFP C1質(zhì)粒(Clontech，CA)，該質(zhì)粒轉染細胞后可表達綠色熒光蛋白與HIV gag的融合蛋白。
所獲得質(zhì)粒與RNA雙鏈，使用LIPOFECTamine法共轉染HEK293細胞，36小時后與不加雙鏈RNA的轉染細胞通過熒光顯微鏡觀察比較綠色熒光蛋白-GAG融合蛋白的表達量，發(fā)現(xiàn)該RNA可使融合蛋白的表達產(chǎn)量顯著降低。
實施例4.合成雙鏈RNA抑制nef基因表達根據(jù)nef保守序列(表1中的7號序列)，合成19核苷酸的RNA片斷，并根據(jù)互補原則合成該鏈的互補RNA鏈，在互補RNA鏈3’端加UU，退火后形成RNA雙鏈5’accacacacaaggcuacuuuu3’ uuuggguguguuccgaugaa按照實施例2的方法，通過PCR從HIV(LAV-1，Bru分離株)cDNA擴增出nef基因，克隆至pEGFP C1質(zhì)粒(Clontech，CA)，該質(zhì)粒轉染細胞后可表達綠色熒光蛋白與HIV NEF的融合蛋白。
所獲得質(zhì)粒與RNA雙鏈使用LIPOFECTamine法共轉染HEK293細胞，36小時后與不加雙鏈RNA的轉染細胞通過熒光顯微鏡觀察比較綠色熒光蛋白-NEF融合蛋白的表達量，發(fā)現(xiàn)該RNA可使融合蛋白的表達產(chǎn)量顯著降低。
實施例5.使用合成雙鏈RNA降低其他HIV蛋白的產(chǎn)量按照實施例2所述的方法使用合成雙鏈RNA降低相應HIV蛋白的產(chǎn)量，結果見表3。
表3使用新型雙鏈核糖核酸制HIV其它基因表達的效率

注+++抑制60-80％；++++抑制80-100％。
實施例6、合成含有env基因保守序列對應的DNA片段及其雜交序列，克隆至真核表達載體，在細胞內(nèi)表達干擾RNA，抑制HIV膜蛋白的表達合成含有env基因保守序列(表1中5號序列)對應的DNA片段及其雜交序列(黑斜體)的DNA片斷，退火后形成DNA片段，5’端為BamHI位點的末端，3’端為HindIII位點的末端，在同源序列及其互補序列中間含有間隔序列。B為A的互補序列A5’gatccccttcccatacatttattgtgcttcaagagagcacaataatgtatgggaatttttggaaaB5’agcttttccaaaaa ttcccatacattattgtgctctcttgaagcacaataatgtatgggaaggg如圖4所示，通過PCR(以人基因組DNA 1μg為模板，引物15’-TAATTAATGCGGCCGCAATTCGAACGCTGACGTC-3’，引物2 5’-GCACTAGTAAGCT TGGATCCGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC-3’，擴增條件同實施例2)獲得人H1 RNA基因的啟動子區(qū)，質(zhì)粒pEGFPC1(Clontech)用AseI和XbaI酶切后回收大片段作為載體，上述擴增片段用AseI和SpeI酶切后回收，與載體連接，轉化大腸桿菌后獲得質(zhì)粒pH1。將上述合成的DNA片段(A，B)退火后克隆至pH1質(zhì)粒的BamHI和HindIII位點，構建質(zhì)粒pH1-gp120i。該質(zhì)粒在細胞中，在RNA聚合酶III的作用下，表達發(fā)夾狀RNA，形成RNA雙鏈。
用4μg pH1-gp120i質(zhì)粒(使用同量pH1質(zhì)粒作為對照)與表達EGFP-HIV GP120融合蛋白的質(zhì)粒共轉染HEK293細胞，通過如實施例2所述方法比較融合蛋白的表達產(chǎn)量的差異，結果表明EGFP-gp120融合蛋白的表達產(chǎn)量有顯著降低；該結果說明使用質(zhì)粒載體攜帶編碼上述RNA的DNA序列可以有效抑制HIV靶基因的表達。
實施例7.使用腺病毒伴隨病毒載體，攜帶如實施例6中所述的H1啟動子及編碼發(fā)夾狀雙鏈RNA的DNA片段，重組病毒感染細胞后抑制HIV GP120基因的表達。
如圖5所示，質(zhì)粒pAAV-MCS(購于Stratagene)用NotI和HindIII酶切；含H1啟動子和編碼gp120的發(fā)夾狀RNA的DNA片段從質(zhì)粒pH1-gp120i中用NotI和HindII酶切獲得，并克隆至pAAV-MCS的相應位點。構建質(zhì)粒pAAV-gp120i，將該質(zhì)粒(4μg)(對照病毒載體用pAAV-MCS)與輔助質(zhì)粒pHelper(1μg，Stratagene)和質(zhì)粒pAAV-RC(2μgStratagene)一起用LIPOFECTamine法共轉染HEK 293FT細胞，48小時后取上清制備“重組AAV病毒”及對照病毒；將pEGFP-GP120(1μg)的質(zhì)粒轉染HEK293細胞，然后加入上述含重組病毒的制備上清，24小時后用熒光顯微鏡分析細胞內(nèi)GFP發(fā)光強度。
結果如圖6所示，表明攜帶可轉錄HIV gp120發(fā)夾樣雙鏈RNA的重組AAV病毒可使GFP-GP120融合蛋白表達水平顯著降低。
序列表<110>北京昭衍新藥研究中心<120>一組抗HIV感染及防治艾滋病的核苷酸序列及其應用<130>
<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>RNA<213>慢病毒屬(Lentivirus genera)<400>1aucaaugagg aagcugcaga augg24<210>2<211>27<212>RNA<213>慢病毒屬(Lentivirus genera)<400>2gggaagugac auagcaggaa cuacuag 27<210>3<211>29<212>RNA<213>慢病毒屬(Lentivirus genera)<400>3uaaauaaaau aguaagaaug uauagcccu 29
<210>4<211>19<212>RNA<213>慢病毒屬(Lentivirus genera)<400>4uaugggguac cugugugga 19<210>5<211>24<212>RNA<213>慢病毒屬(Lentivirus genera)<400>5gccaauuccc auacauuauu gugc24<210>6<211>21<212>RNA<213>慢病毒屬(Lentivirus genera)<400>6uuaaauggca gucuagcaga a 21<210>7<211>26<212>RNA<213>慢病毒屬(Lentivirus genera)<400>7accacacaca aggcuacuuc ccugau 26
<210>8<211>23<212>RNA<213>慢病毒屬(Lentivirus genera)<400>8acagccgccu agcauuucau cac 23<210>9<211>27<212>RNA<213>慢病毒屬(Lentivirus genera)<400>9ggauggugcu ucaagcuagu accaguu 2權利要求
1.一組抗HIV感染及防治艾滋病的RNA序列及其片段，該組RNA序列如下(1)aucaaugaggaagcugcagaaugg；(2)gggaagugacauagcaggaacuacuag；(3)uaaauaaaauaguaagaauguauagcccu；(4)uaugggguaccugugugga；(5)gccaauucccauacauuauugugc；(6)uuaaauggcagucuagcagaa；(7)accacacacaaggcuacuucccugau；(8)acagccgccuagcauuucaucac；(9)ggauggugcuucaagcuaguaccaguu。
2.一組由權利要求1所述的RNA序列及其片段和與之互補的序列雜交形成的雙鏈RNA序列。
3.一組由權利要求1或2所述的RNA序列及其片斷在其5’端或3’端加核苷酸修飾的序列。
4.一組由權利要求1或2所述的RNA序列及其片段和與之反向互補的序列加上中間非互補連接序列形成的發(fā)夾樣RNA雙鏈。
5.一組權利要求1或2所述序列對應的DNA序列。
6.一組權利要求3所述序列對應的DNA序列。
7.一組權利要求4所述序列對應的DNA序列。
8.包含權利要求1或2所述的RNA序列的表達載體。
9.包含權利要求3所述的RNA序列的表達載體。
10.包含權利要求4所述的RNA序列的表達載體。
11.包含權利要求5所述的DNA序列的表達載體。
12.包含權利要求6或7所述的DNA序列的表達載體。
13.包裹權利要求1或2所述的RNA序列的脂質(zhì)體。
14.包裹權利要求3所述的RNA序列的脂質(zhì)體。
15.包裹權利要求4所述的RNA序列的脂質(zhì)體。
16.包裹權利要求5所述的DNA序列的脂質(zhì)體。
17.包裹權利要求6或7所述的DNA序列的脂質(zhì)體。
18.包裹權利要求8所述的表達載體的脂質(zhì)體。
19.包裹權利要求9或10或11所述的表達載體的脂質(zhì)體。
20.包裹權利要求12所述的表達載體的脂質(zhì)體。
21.將權利要求1或2所述的RNA序列在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
22.將權利要求3所述的RNA序列在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
23.將權利要求4所述的RNA序列在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
24.將權利要求5所述的DNA序列在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
25.將權利要求6或7所述的DNA序列在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
26.將權利要求8所述的表達載體在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
27.將權利要求9或10或11所述的表達載體在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
28.將權利要求12所述的表達載體在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
29.將權利要求13所述的脂質(zhì)體在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
30.將權利要求14或15或16或18或20所述的脂質(zhì)體在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
31.將權利要求17所述的脂質(zhì)體在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
32.將權利要求19所述的脂質(zhì)體在體內(nèi)或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
33.權利要求1或2所述的RNA序列及其片段用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
34.權利要求3所述的RNA序列及其片段用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
35.權利要求4所述的RNA序列及其片段用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
36.權利要求5所述的DNA序列及其片段用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
37.權利要求6或7所述的DNA序列及其片段用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
38.權利要求8所述的表達載體用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
39.權利要求9或10或11所述的表達載體用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
40.權利要求12所述的表達載體用于制備抗HIV感染及艾磁病診斷、治療和預防的藥物的應用。
41.權利要求13所述的脂質(zhì)體用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
42.權利要求14或15或16或18或20所述的脂質(zhì)體用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
43.權利要求17所述的脂質(zhì)體用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
44.權利要求19所述的脂質(zhì)體用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
45.權利要求21所述的方法用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
46.權利要求22或23或24或26或28或29或31或32所述的方法用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
47.權利要求25所述的方法用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
48.權利要求27所述的方法用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
49.權利要求30所述的方法用于制備抗HIV感染及艾滋病診斷、治療和預防的藥物的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組抗HIV感染及防治艾滋病的核苷酸序列及其應用，該序列如序列表所示，本發(fā)明的優(yōu)點是通過同源比較，獲得一系列與所有已經(jīng)發(fā)表的HIV序列高度同源的RNA序列片段，使用該系列片段衍生的雙鏈RNA序列可以有效地抑制HIV基因的表達；使用質(zhì)粒轉錄的該系列RNA也可在細胞內(nèi)抑制HIV基因的表達；攜帶該片段對應DNA腺病毒伴隨病毒感染細胞后可以轉錄出對應的雙鏈RNA并抑制HIV基因的表達。
文檔編號A61P31/00GK1508141SQ0215678
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月18日 優(yōu)先權日2002年12月18日
發(fā)明者周志文, 馮宇霞, 左叢林, 李月娟 申請人:北京昭衍新藥研究中心