專利名稱：新的n－取代吡啶基苯并異硒唑酮化合物及其制法和其藥物組合物與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的N-取代吡啶基苯并異硒唑酮化合物及其制備方法，含有它們的藥物組合物，及其作為藥物，尤其是作為抗缺血性心肌損傷藥物地用途。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)生活水平的提高和人口老齡化，心血管疾病，特別是缺血性心肌損傷的發(fā)病日益增加，已成為影響中老年人生活質(zhì)量和壽命的重要因素?，F(xiàn)今臨床應(yīng)用的擴(kuò)張血管的硝酸酯類藥物，二氫吡啶類鈣通道拮抗劑亦即β-腎上腺能阻滯劑等均伴隨有不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用的選擇余地小。
Na+-Ca2+交換蛋白是可興奮細(xì)胞膜上一種重要的雙向離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它的主要功能是排出細(xì)胞興奮過程中進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Ca2+，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+恢復(fù)到靜息狀態(tài)水平。在每排出1個(gè)Ca2+的同時(shí)，轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)3個(gè)Na+，因此有一個(gè)凈電荷的跨膜移動(dòng)，產(chǎn)生跨膜電流。心肌缺血再灌的初期，細(xì)胞膜的損傷導(dǎo)致膜電位異常，膜通透性改變，使大量的Na+進(jìn)入細(xì)胞，此時(shí)Na+-Ca2+交換反向轉(zhuǎn)運(yùn)被激活。鈉-鈣交換是個(gè)雙向過程，為了排出過多的Na+，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，從而加重細(xì)胞的損傷及死亡。這種情況下的反向轉(zhuǎn)運(yùn)，在病理狀態(tài)下，會(huì)引起嚴(yán)重的不良后果。因而Na+-Ca2+交換反向轉(zhuǎn)運(yùn)被認(rèn)為是缺血/再灌引起嚴(yán)重不良后果的重要機(jī)制。國(guó)內(nèi)外至今尚無特異性阻斷Na+-Ca2+交換反向轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物。因此，創(chuàng)制對(duì)鈉-鈣交換系統(tǒng)具有特異性阻斷作用的藥物對(duì)治療缺血性心肌損傷(冠心病)，保護(hù)心臟具有重要的臨床價(jià)值。
本發(fā)明在研究對(duì)Na+-Ca2+交換阻斷劑的過程中發(fā)現(xiàn)N-取代的吡啶苯并異硒唑酮具有明顯的阻滯作用。苯并異硒唑酮是一組模擬谷胱甘肽過氧化物還原酶的合成化合物，有代表性的依布硒啉(Ebselen)具有抗炎作用，并于臨床上用作治療蛛網(wǎng)膜下出血藥物(Hashizume T and Kato Y.JP 1988027431；Tanaka et bal.JP1989131113；Maruyama I et al.WO 9808511)，但未見關(guān)于阻止Na+-Ca2+交換系統(tǒng)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的空白，本發(fā)明的目的在于提供一種新的作用于鈉-鈣交換系統(tǒng)的N-取代吡啶基苯并異硒唑酮化合物；
本發(fā)明的另一目的在于提供一種新的N-取代吡啶基苯并異硒唑酮化合物的制備方法；
本發(fā)明的另一目的在于提供一種新的新的N-取代吡啶基苯并異硒唑酮化合物及其組合物作為抗缺血性心肌損傷藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明一方面涉及藥物組合物，其包括作為活性成份的通式(I)的化合物及其異構(gòu)體及制藥領(lǐng)域中常用的載體。
本發(fā)明再一方面涉及的是通式(I)化合物或含有它的藥物組合物在預(yù)防和/或治療缺血性心肌損傷的用途。
本發(fā)明再一方面涉及的是預(yù)防和/或治療缺血性心肌損傷的方法，其包括將通式(I)化合物或含有它的藥物組合物給藥于需預(yù)防和/或治療的宿主。
具體講，本發(fā)明涉及如通式(I)所示的化合物。
其中，R1選自氫，鹵素，C1-C4的直鏈或支鏈烷基或烷氧基；R1的取代位置是3-、4-、5-或6-位。
R2選自氫，鹵素，C1-C4的直鏈或支鏈烷基或烷氧基；R2的取代位置是2-位吡啶環(huán)上任一碳原子。
X代表氮原子，其取代位置是2-，3-或4-位。再具體講，本發(fā)明涉及但不限定如通式(I)的典型代表化合物包括(Ia)所示的化合物，
R1和R2的定義同上。通式(Ib)所示的化合物，
R1和R2的定義同上。以及通式(Ic)所示的化合物，
R1和R2的定義同上。
為制備本發(fā)明通式I所述的化合物，本發(fā)明方法包括，取代的鄰氨基苯甲酸經(jīng)重氮化得到的重氮鹽與二硒化鈉反應(yīng)，生成的2，2’-二硒化雙苯甲酸經(jīng)酰氯化，與氨基吡啶縮合而得。
具體地講，制備通式I所述的化合物的方法，包括入下步驟
(A)將取代的鄰氨基苯甲酸在酸性介質(zhì)中與亞硝酸鹽反應(yīng)，得到取代的苯甲酸重氮鹽；
(B)得到的取代的苯甲酸重氮鹽與二硒化鈉反應(yīng)，酸化得到2，2’-二硒化雙苯甲酸；(C)得到的2，2’-二硒化雙苯甲酸與二氯亞砜反應(yīng)，生成取代的2-氯硒代苯甲酰氯；(D)得到的取代的2-氯硒代苯甲酰氯在不同溶劑介質(zhì)中與各種氨基吡啶縮合，得到取代的2-吡啶基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮。
本發(fā)明因此還涉及含有作為活性成份的有效劑量的至少一種通式(I)化合物和/或其立體異構(gòu)體以及常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1-90重量％的通式(I)化合物和/或其生理上可接受的鹽。
藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將通式(I)化合物和/或立體異構(gòu)體與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明的通式(I)化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等，可以是普通制劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分通式(I)化合物或其立體異構(gòu)體與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分通式(I)化合物或其立體異構(gòu)體制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
本發(fā)明通式(I)化合物或其立體異構(gòu)體的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重及個(gè)體反應(yīng)，所用的具體化合物，給藥途徑及給藥次數(shù)等。通常對(duì)體重約75公斤患者，所給通式(I)化合物的日劑量為0.001mg/kg體重-100mg/kg體重，優(yōu)選0.01mg/kg體重-20mg/kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥。
本發(fā)明的化合物經(jīng)過藥理研究可見心肌細(xì)胞的電生理研究表明本發(fā)明化合物對(duì)外向Na-Ca交換的抑制作用強(qiáng)于內(nèi)向抑制，具有特異性。抑制率大于40％，最強(qiáng)的接近60％。
在離體心臟缺血再灌實(shí)驗(yàn)中，以心律失常的持續(xù)時(shí)間，室早，室速和室顫的發(fā)生率作為心肌損傷的指標(biāo)，觀察化合物的心肌保護(hù)作用。結(jié)果表明本發(fā)明的化合物在濃度為10-6時(shí)，有顯著心肌保護(hù)作用。
靜脈注射本發(fā)明化合物，發(fā)現(xiàn)能顯著性延長(zhǎng)麻醉大鼠缺血-再灌注心律失常的潛伏期，降低VT和VF的發(fā)生率，縮短VT和VF的持續(xù)時(shí)間。說明本發(fā)明化合物對(duì)冠狀動(dòng)脈缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。
口服本發(fā)明化合物，以心臟損傷后出現(xiàn)心律失常的程度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)來觀察發(fā)現(xiàn)口服30mg/Kg，可顯著性縮短缺血-再灌注心律失常(P＜0.01)的持續(xù)時(shí)間，降低VT(P＜0.01)和VF(P＜0.05)的發(fā)生率，縮短VT(P＜0.01)的持續(xù)時(shí)間。口服100mg/Kg，可顯著性縮短缺血-再灌注心律失常(P＜0.05)的持續(xù)時(shí)間，降低VT(P＜0.05)的發(fā)生率，縮短VT(P＜0.01)的持續(xù)時(shí)間。說明本發(fā)明化合物對(duì)冠狀動(dòng)脈缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。
再對(duì)本發(fā)明化合物的急性毒性實(shí)驗(yàn)中各劑量組均未見動(dòng)物死亡，半數(shù)致死量LD50＞5g/kg，提示此類化合物毒性較低。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例及藥物活性實(shí)驗(yàn)用來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。
在本發(fā)明中，使用的原料為已知化合物或按本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備的化合物。制備雖然不生成本發(fā)明的化合物，但是合成制備本通式(I)化合物的有用中間體。步驟A、B實(shí)施例1 2，2’-二硒化雙苯甲酸的制備
硒粉17.6g溶解于含有8.8g氫氧化鈉的120ml水溶液，攪拌下加入17.6g雕白粉，室溫?cái)嚢?h，得二硒化鈉溶液，備用。鄰氨基苯甲酸34g(0.248mol)溶解于6N鹽酸100ml中，攪拌下0-5℃滴入含有18g亞硝酸鈉的40ml水溶液，攪拌20分鐘。過濾，得到的重氮鹽溶液在攪拌下滴入上制的二硒化鈉溶液，加畢，升溫至60℃，攪拌2h，再于室溫下攪拌3h，用稀鹽酸將反應(yīng)液酸化，濾集得到的紅色固體。該粗品溶解于碳酸鈉溶液，煮沸后濾除不溶物，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH＜1，水洗，干燥，得到2，2’-二硒化雙苯甲酸46g(92％)，mp294-296℃(文獻(xiàn)295℃)。實(shí)施例2 4，4’-二氯-2，2’-二硒化雙苯甲酸的制備
實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行，不同在于用4-氯鄰氨基苯甲酸3.43g(20mmol)，硒粉1.72g(21.77mmol)代替上述的鄰氨基苯甲酸，得到本標(biāo)題化合物3.17g，收率67.6％，mp295-297℃。實(shí)施例3 5，5’-二羥基-2，2’-二硒化雙苯甲酸的制備
實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行，不同在于用5-羥基鄰氨基苯甲酸3.06g(20mmol)，硒粉1.72g(21.77mmol)代替上述的鄰氨基苯甲酸，得到本標(biāo)題化合物2.48g，收率57.4％，mp230-233℃。實(shí)施例4 4，4’-二氟-2，2’-二硒化雙苯甲酸的制備
實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行，不同在于用4-氟鄰氨基苯甲酸2.33g(15mmol)，硒粉1.5g(38.0mmol)代替上述的鄰氨基苯甲酸，得到本標(biāo)題化合物3.00g，收率45.9％，mp286-288℃。實(shí)施例5 5，5’-二氟-2，2’-二硒化雙苯甲酸的制備
實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行，不同在于用5-氟鄰氨基苯甲酸4.65g(30mmol)，硒粉5.97g(76.0mmol)代替上述的鄰氨基苯甲酸，得到本標(biāo)題化合物5.00g，收率38.2％，mp285-287℃。實(shí)施例6 5，5’-二氯-2，2’-二硒化雙苯甲酸的制備
實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行，不同在于用5-氯鄰氨基苯甲酸10.30g(60mmol)，硒粉5.21g(76.0mmol)代替鄰氨基苯甲酸和硒粉用量，得到本標(biāo)題化合物11.68g，收率41.5％，mp295-297℃。步驟C實(shí)施例7 2，2’-氯硒苯甲酰氯的制備2，2’-二硒化雙苯甲酸25.3g(63.25mmol)與二氯亞砜120ml混合，加熱回流5h，減壓蒸除二氯亞砜，剩余物用石油醚750ml加熱溶解，活性炭脫色，濾液減壓濃縮，得到橘紅色固體20g，收率62.0％，mp65℃，為本標(biāo)題化合物。實(shí)施例8 4-氯-2-氯硒苯甲酰氯的制備實(shí)施例7所述的方法進(jìn)行，不同在于用4，4’-二氯-2，2’-二硒化雙苯甲酸3.16g(6.74mmol)與二氯亞砜10ml代替2，2’-二硒化雙苯甲酸與二氯亞砜的用量，得到本標(biāo)題化合物2.8g，收率72％，mp82-86℃。實(shí)施例9 5-羥基-2-氯硒苯甲酰氯的制備實(shí)施例7所述的方法進(jìn)行，不同在于用5，5’-二羥基-2，2’-二硒化雙苯甲酸2.48g(5.74mmol)與二氯亞砜10ml代替2，2’-二硒化雙苯甲酸與二氯亞砜的用量，得到本標(biāo)題化合物2.17g，收率70％，mp100-103℃。實(shí)施例10 4-氟-2-氯硒苯甲酰氯的制備實(shí)施例7所述的方法進(jìn)行，不同在于用4，4’-二氟-2，2’-二硒化雙苯甲酸0.99g(2.27mmol)與二氯亞砜5ml代替2，2’-二硒化雙苯甲酸與二氯亞砜的用量，得到本標(biāo)題化合物1.19g，收率96.4％，油狀物。實(shí)施例11 5-氟-2-氯硒苯甲酰氯的制備實(shí)施例7所述的方法進(jìn)行，不同在于用5，5’-二氟-2，2’-二硒化雙苯甲酸5.00g(11.47mmol)與二氯亞砜105ml代替2，2’-二硒化雙苯甲酸與二氯亞砜的用量，得到本標(biāo)題化合物6.24g，收率100％，不必分離進(jìn)入下一步反應(yīng)。實(shí)施例12 5-氯-2-氯硒苯甲酰氯的制備實(shí)施例7所述的方法進(jìn)行，不同在于用5，5’-二氯-2，2’-二硒化雙苯甲酸5.00g(10.66mmol)與二氯亞砜25ml代替2，2’-二硒化雙苯甲酸與二氯亞砜的用量，得到本標(biāo)題化合物4.73g，收率82.0％，不必分離進(jìn)入下一步反應(yīng)。步驟D實(shí)施例13 2-(4-吡啶基)-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的制備
4-氨基吡啶1.0g(10.64mmol)，三乙胺2.60g(25.5mmol)和四氫呋喃25ml混合，攪拌下滴加2-氯硒苯甲酰氯2.7g(10.63mmol)的50ml四氫呋喃溶液。滴畢，升溫?cái)嚢?h，濾集生成的固體，先后用四氫呋喃、水和四氫呋喃洗滌，干燥，用DMF/乙醇結(jié)晶，得到本標(biāo)題化合物2.32g，收率80％，mp258-260℃。m/z276。實(shí)施例14 2-(3-吡啶基)-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的制備
實(shí)施例13所述的方法進(jìn)行，不同在于用3-氨基吡啶0.47g(5.0mmol)以及相應(yīng)的三乙胺和四氫呋喃用量，得到本標(biāo)題化合物0.88g，收率64.0％，mp260-272℃。m/z276。實(shí)施例15 6-氯-2-(4-吡啶基)-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的制備
實(shí)施例13所述的方法進(jìn)行，不同在于用4-氯-2-氯硒苯甲酰氯0.4g(1.39mmol)4-氨基吡啶0.13g(1.39mmol)以及相應(yīng)的三乙胺和四氫呋喃用量，得到本標(biāo)題化合物0.15g，收率35％，mp278-280℃。1H NMR(DMSO-d6)δ7.52(dd，J＝1.8Hz，6.6Hz，1H，6H)，7.79(d，J＝6.3Hz，2H，3’H+5’H)，7.88(d，J＝7.4Hz，1H，7H)，8.1(d，J＝1.8Hz，1H，4H)，8.55(d，J＝6.3Hz，2H，2’H+6’H)。EI-MS m/z310。實(shí)施例16 5-氯-2-(2-吡啶基)-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的制備
實(shí)施例13所述的方法進(jìn)行，不同在于用5-氯-2-氯硒苯甲酰氯6.37g(22.0mmol)2-氨基吡啶2.07g(22.0mmol)以及相應(yīng)的三乙胺和四氫呋喃用量，得到本標(biāo)題化合物4.40g，收率64.7％，mp278-280℃。1HNMR(DMSO-d6)1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.54(d，J＝8.4Hz，1H，ArH)，8.41dd，J＝4.8，1H，ArH)，8.06(d，J＝8.7Hz，1H，ArH)，7.87(m，2H’ArH)，7.71(d，d，J＝2.4Hz，J＝2.1Hz 1H ArH)，7.21(m，1H，ArH)，EI-MS m/z309。實(shí)施例17 5-氟-2-(2-吡啶基)-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的制備
實(shí)施例13所述的方法進(jìn)行，不同在于用5-氟-2-氯硒苯甲酰氯2.70g(9.9mmol)2-氨基吡啶0.93g(9.8mmol)以及相應(yīng)的三乙胺和四氫呋喃用量，得到本標(biāo)題化合物1.25g，收率43.2％，mp257-258.4℃。1HNMR(DMSO-d6)δ8.56(d，J＝8.4Hz，1H，ArH)，8.42(d，J＝5.7Hz，1H，ArH)，8.08(d，d J＝3.9Hz，J＝3.9Hz 1H，ArH)，7.89(t，J＝7.8Hz，1H，ArH)，7.61(m 2H，ArH)，7.22(d，d J＝4.8Hz，J＝5.1Hz，1H，ArH)，EI-MS m/z292。實(shí)施例18 5-氟-2-(3-吡啶基)-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的制備
實(shí)施例13所述的方法進(jìn)行，不同在于用5-氟-2-氯硒苯甲酰氯2.70g(9.9mmol)3-氨基吡啶0.93g(9.8mmol)以及相應(yīng)的三乙胺和四氫呋喃用量，得到本標(biāo)題化合物1.25g，收率43.2％，mp257-258.4℃。1H NMR(DMSO-d6)δ8.56(d，J＝8.4Hz，1H，ArH)，8.42(d，J＝5.7Hz，1H，ArH)，8.08(d，d J＝3.9Hz，J＝3.9Hz 1H，ArH)，7.89(t，J＝7.8Hz，1H，ArH)，7.61(m 2H，ArH)，7.22(d，d J＝4.8Hz，J＝5.1Hz，1H，ArH)，EI-MS m/z292。實(shí)施例19 5-氟-2-(4-吡啶基)-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的制備
實(shí)施例13所述的方法進(jìn)行，不同在于用5-氟-2-氯硒苯甲酰氯1.08g(4.0mmol)4-氨基吡啶0.38 g(4.0mmol)以及相應(yīng)的三乙胺和四氫呋喃用量，得到本標(biāo)題化合物0.4g，收率34.2％，mp310-313℃。1H NMR(DMSO-d6)δppm8.566(s，1H，ArH)，8.545(s，1H，ArH)，8.09(d，d J＝4.8Hz，J＝4.8Hz 1H，ArH)，7.814(s，1H，ArH)，7.79(s，1H，ArH)，7.63(m，2H，ArH)，實(shí)施例20 5-氯-2-(4-吡啶基)-1，2-苯并異硒唑3(2H)-酮的制備
實(shí)施例13所述的方法進(jìn)行，不同在于用5-氯-2-氯硒苯甲酰氯1.73g(6.0mmol)4-氨基吡啶0.57g(6.0mmol)以及相應(yīng)的三乙胺和四氫呋喃用量，得到本標(biāo)題化合物1。2g，收率64。62％，mp263-265℃。1H NMR(DMSO-d6)δppm7.57(d，J＝1.8Hz，1H，ArH)，7.55(d，J＝1.5Hz，1H，ArH)，8.09(d，J＝8.7Hz，1H，ArH)，7.87(d，J＝2.1Hz，1H，ArH)，7.78(m 3H，ArH)，J＝4.8Hz，。EI-MS m/z309。實(shí)施例21 6-氟-2-(4-吡啶基)-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的制備
實(shí)施例13所述的方法進(jìn)行，不同在于用4-氟-2-氯硒苯甲酰氯1.09g(4.0mmol)4-氨基吡啶0.38g(4.0mmol)以及相應(yīng)的三乙胺和四氫呋喃用量，得到本標(biāo)題化合物0.365g，收率31.0％，mp269-270℃。1HNMR(DMSO-d6)δ。EI-MS m/z293。實(shí)施22 6-氯-2-(3-吡啶基)-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的制備)
實(shí)施例13所述的方法進(jìn)行，不同在于用4-氯-2-氯硒苯甲酰氯0.4g(1.39mmol)3-氨基吡啶0.13g(1.39mmol)以及相應(yīng)的三乙胺和四氫呋喃用量，得到本標(biāo)題化合物0.32g，收率74.4％，mp292-294℃。1HNMR(DMSO-d6)δ7.50(dd，J＝4.9Hz，3.3Hz，1H，5H)，7.54(dd，J＝1.8，J＝6.6Hz，1H，6H)，7.88(d，J＝8.1Hz，1H，7H)，8.04(d，J＝8.1Hz，1H，4’H)，8.13(d，J＝1.8Hz，4H)，8.45(d，J＝4.8Hz，1H，6’H)，8.85(d，J＝2.7Hz，1H，2’H)。EI-MS m/z310。實(shí)施例23 6-氯-2-(2-吡啶基)-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的制備
實(shí)施例13所述的方法進(jìn)行，不同在于用4-氯-2-氯硒苯甲酰氯0.4g(1.39mmol)2-氨基吡啶0.13g(1.39mmol)以及相應(yīng)的三乙胺和四氫呋喃用量，得到本標(biāo)題化合物0.30g，收率70％，mp278-280℃。1HNMR(DMSO-d6)δ7.22(m，1H，4’H)，7.51(dd，J＝1.9Hz，J＝6.6，1H，3’6H)，7.88(m，2H，7H+5’H)，8.10(d，J＝1.8Hz，1H，4H)，8.41(m，1H，1H，3’H)，8.56(d，J＝7.5Hz，1H，6’H)。EI-MS m/z310。實(shí)施例24 5-羥基-2-(4-吡啶基)-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的制備
實(shí)施例13所述的方法進(jìn)行，不同在于用5-羥基-2-氯硒苯甲酰氯0.4g(1.48mmol)4-氨基吡啶0.139g(1.48mmol)以及相應(yīng)的三乙胺和四氫呋喃用量，得到本標(biāo)題化合物0.087g，收率20％，mp＞310℃。1H NMR(DMSO-d6)δ7.17(dd，J＝2.7Hz，6Hz，1H，5H)，7.28(d，J＝2.4Hz，1H，4H)，7.80(d，J＝6.3Hz，2H，3’H+5’H)，7.83(d，J＝5.7Hz，1H，7H)，8.52(d，J＝6.3Hz，2H，2’H+6’H)，9.92(s，1H，OH)。EI-MS m/z292。實(shí)施例25 5-羥基-2-(2-吡啶基)-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮的制備
實(shí)施例13所述的方法進(jìn)行，不同在于用5-羥-2-氯硒苯甲酰氯0.4g(1.48mmol)2-氨基吡啶0.139g(1.48mmol)以及相應(yīng)的三乙胺和四氫呋喃用量，得到本標(biāo)題化合物0.18g，收率42％，mp270-272℃。1HNMR(DMSO-d6)δ7.23(dd，J＝6.6Hz，J＝2.1Hz，1H，4’H)，7.61(dd，J＝2.4Hz，J＝6.3，1H，5H)，7.73(d，J＝2.7Hz，1H，3’4H)，7.89(m，1H，5’H)，8.13(d，J＝8.7Hz，1H，7H)，8.42(d，J＝5.1Hz，1H，3’H)，8.54(d，J＝8.4Hz，1H，6’H)。EI-MS m/z292。藥物試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)例1 細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
雄性豚鼠，體重250～280g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。藥品配置
無鈣液(Ca2+-free solution)成分(mM)NaCl 90，KCl 10，KH2PO41.2，MgSO45，NaHCO315，taurine 30，glucose 20，用1N的NaOH調(diào)pH值至7.4
正常臺(tái)氏液(normal Tyrode’s solution)成分(mM)NaCl 150，KCl5.4，MgCl22，CaCl21.8，HEPES 5，Glucose 10，用1N NaOH調(diào)pH值至7.35
記錄Na+-Ca2+交換電流的臺(tái)氏液成分(mM)NaCl 140，MgCl2 2，CaCl2 1.8，HEPES 5，Glucose 10，用1N CsOH調(diào)pH值至7.4
正常電極液(normal pipette solution)成分(mM)KCl 140，MgCl20.5，EGTA 10，HEPES 10，1 N KOH調(diào)pH值至7.2
記錄Na+-Ca2+交換電流的電極液成分(mM)EGTA 42，CaCl229，MgCl213，Aspartic acid 42，TEA 20，HEPES 5，Na2ATP 5，1N的CsOH調(diào)pH至7.4。實(shí)驗(yàn)時(shí)，根據(jù)電極內(nèi)液中不同的Na+濃度，分別加入NaCl 5，15和25mM，使電極液中的Na+濃度達(dá)到所要求的15，25和35mM。
所有溶液均用雙蒸水配制，無鈣液和臺(tái)氏液每次用時(shí)新鮮配制，電極內(nèi)液配好后，用0.22μm的微孔濾膜過濾，分裝于Eppendorf管，凍存?zhèn)溆谩?br> 單個(gè)豚鼠心室肌細(xì)胞的制備把豚鼠擊昏、頸動(dòng)脈放血后，迅速開胸，取出心臟，在4℃無鈣液(Ca2+-free solution)中去除脂肪組織和心包膜，進(jìn)行Langendorff灌流。灌流具體過程首先用無鈣液經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流6min，使心臟內(nèi)的殘血徹底排盡，心臟膨大，呈粉紅色時(shí)再用含有鏈霉蛋白酶E(pronase E)0.1mg/ml，脫脂牛血清白蛋白(BSA)0.5mg/ml，Ca2+濃度為150μM的無鈣液(酶液)灌流2～3min，至心臟完全膨大松軟后停止灌流。去除心房，將心室肌剪碎，用酶液37℃溫孵攪拌5～10min，倒出上清液，用無鈣液稀釋5倍，其中含有BSA 0.5mg/ml，Ca2+濃度為1.8mM，室溫下(20～24℃)靜置1h后開始實(shí)驗(yàn)。在整個(gè)灌流過程中，壓力維持在70cm水柱，37℃恒溫，持續(xù)通95％的O2和5％的CO2混合氣。膜片鉗全細(xì)胞記錄
選取桿狀、橫紋清晰、膜良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞池體積約1ml，平放在連有微操縱器(MO-303)的倒置顯微鏡(Olympus IMT-2)上，細(xì)胞充分貼壁后，用臺(tái)氏液(Tyrode’s solution)灌流，速度約為1～2ml/min。電極用玻璃毛細(xì)管(中科院上海腦所)經(jīng)微電極拉制儀(PP-83)分兩步拉制，充灌電極液后電阻為2～4MΩ。膜片鉗全細(xì)胞記錄過程中，刺激脈沖的產(chǎn)生和信號(hào)采集均由pCLAMP5.5.1軟件(Axon Instrument)完成，離子通道電流通過膜片鉗放大器(L/MEPC-7)放大，經(jīng)AD/DA轉(zhuǎn)換板(Axon TL-1)輸入計(jì)算機(jī)。
記錄Na+-Ca2+交換電流(INa-Ca)時(shí)，細(xì)胞鉗制在-40mV，給予從+60mV復(fù)極化至-100mV、速度為80mV/s持續(xù)2s的反向斜坡脈沖(declining ramp pulse)，刺激頻率為0.05Hz。由于刺激形式是緩慢復(fù)極化的斜坡脈沖，因此細(xì)胞膜電容和串聯(lián)電阻無需補(bǔ)償。同時(shí)，為了減少其它電流成分的干擾，實(shí)驗(yàn)時(shí)臺(tái)氏液中加入ouabain 20μM以阻斷生電性Na+-K+.ATP酶；BaCl2 1mM和CsCl2 mM阻斷鉀離子通道電流；verapamil 1μM阻斷L型鈣電流；電極內(nèi)液中20mM的TEA也可以阻斷鉀離子通道電流。電極內(nèi)液中高濃度的EGTA(42mM)和CaCl2(29mM)根據(jù)Fabiato & Fabiato公式計(jì)算得胞內(nèi)游離Ca2+濃度為153nM。生電性的雙向Na+-Ca2+交換電流可被細(xì)胞外高濃度的Ni2+(2或5mM)特異性阻斷，用Ni2+前后的電流相減所得的電流曲線即Na+-Ca2+交換電流(INa-Ca)。為了排除因細(xì)胞體積大小不同而對(duì)電流值造成的影響，我們用電流密度(pA/pF)來表示電流值的大小，所有實(shí)驗(yàn)均在31℃～32℃之間進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
用pCLAMP 5.5.1和pCLAMP 6.0.1軟件對(duì)原始電流圖進(jìn)行測(cè)量分析，所有數(shù)據(jù)均為Mean±SE表示，n表示細(xì)胞數(shù)；配對(duì)和組間t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性。1正常Na+-Ca2+交換電流的記錄
將細(xì)胞鉗制在-40mV，先去極化至+60mV，再給以持續(xù)2s速度為80mV/s的反向斜坡刺激，復(fù)極化至-100mV，刺激頻率為0.05Hz。在該刺激條件下，用臺(tái)氏液灌流時(shí)，記錄到一個(gè)由外向到內(nèi)向的電流-電壓關(guān)系曲線(I-V curve)，由于其它時(shí)間依賴性的電流都被阻斷，因此記錄到的電流幾乎呈線性[14，23，28]。在細(xì)胞外應(yīng)用5mM的Ni2+時(shí)，該電流的外向成分和內(nèi)向成分顯著減小，用Ni2+前后記錄到的兩條電流-電壓曲線相減，得到對(duì)Ni2+敏感的電流即生電性Na+-Ca2+交換電流(Na+-Ca2+exchange current，INa-Ca)2.Amiloride、KB-R7943和SZA對(duì)Na+-Ca2+交換電流的抑制作用的比較
電極內(nèi)液中的Na+濃度是25mM時(shí)，形成全細(xì)胞記錄后，通過離子交換作用使細(xì)胞內(nèi)Na+增加，激活Na+-Ca2+交換體的反向轉(zhuǎn)運(yùn)方式，使INa-Ca的外向成份顯著增加，于3min左右達(dá)到最大，持續(xù)5min未見”衰減”(run-down)現(xiàn)象。此時(shí)，在灌流液中加入Na+-H+交換抑制劑Amiloride 10，30和100μM，KB-R79431和10μM，SZA 0.1，1和10μM，比較三者對(duì)INa-Ca的抑制作用。
在+50mV時(shí)，Amiloride 10，30和100μM對(duì)INa-Ca的抑制率分別是15％，23％和41％，-80mV時(shí)的抑制率則分別是6％，15％和23％，說明Amiloride對(duì)外向INa-Ca的抑制作用更明顯。在+50mV時(shí)，KB-R79431，和10μM對(duì)INa-Ca的抑制率分別是29％和61％，-80mV時(shí)的抑制率則分別是22％和57％，說明KB-R7943在雙向離子條件下對(duì)內(nèi)、外向INa-Ca無選擇性。SZA 0.01，1和10μM，對(duì)外向INa-Ca的抑制率在+50mV時(shí)分別是28％，48％和66％，對(duì)內(nèi)向INa-Ca的抑制率在-80mV時(shí)則分別是15％，24％和42％，說明SZA對(duì)外向INa-Ca的抑制作用明顯強(qiáng)于其對(duì)內(nèi)向INa-Ca的抑制作用。3.本發(fā)明化合物對(duì)心肌Na+-Ca2+交換電流的作用比較及篩選
因?yàn)镾ZA比KB-R7943和Amiloride選擇性更高，抑制外向Na+-Ca2+交換電流作用更強(qiáng)，我所藥化室以SZA為母核，合成了多個(gè)化合物，用上述膜片鉗方法，建立胞內(nèi)Na+負(fù)荷模型、激活I(lǐng)Na-Ca，以SZA為陽性對(duì)照藥，比較這些化合物對(duì)Na+-Ca2+交換電流的抑制作用，以期找到比SZA更好的選擇性作用于外向Na+-Ca2+交換電流的化合物。結(jié)果見表1
表1. 10個(gè)本發(fā)明化合物對(duì)Na+-Ca2+交換電流的抑制作用化合物歸檔n 外向INa-Ca抑 內(nèi)向INa-Ca抑制率(％)號(hào)制率(％)實(shí)施例15 3 50* 28實(shí)施例16 3 52* 44實(shí)施例17 5 43* 21實(shí)施例18 3 44* 42實(shí)施例19 3 59* 57*實(shí)施例20 3 44* 14實(shí)施例22 4 電流增大5％ 2實(shí)施例23 3 46 57實(shí)施例24 3 電流增大14％ 電流增大35％實(shí)施例25 4 14 19*P＜0.05
在本發(fā)明的10個(gè)化合物中，經(jīng)電生理(心肌細(xì)胞水平)篩選，找到7個(gè)活性更高的化合物，它們對(duì)外向Na-Ca交換的抑制作用強(qiáng)于內(nèi)向抑制，具有特異性，抑制率40％以上的為作用較強(qiáng)化合物，作用最強(qiáng)的化合物活性接近60％。見下表。實(shí)驗(yàn)例2離體心臟缺血再灌實(shí)驗(yàn)
根據(jù)前期電生理細(xì)胞模型篩選的結(jié)果，從本發(fā)明化合物中，經(jīng)對(duì)Na/Ca交換反向轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生的外向電流的抑制率的比較，挑選出6個(gè)活性相對(duì)較高的化合物進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)，即結(jié)構(gòu)式中含氯元素的實(shí)施例15，實(shí)施例16，實(shí)施例20；結(jié)構(gòu)式中含氟元素的實(shí)施例17，實(shí)施18，實(shí)施例19。實(shí)驗(yàn)采用大鼠離體心臟缺血再灌注(I/R)損傷模型。以心律失常的持續(xù)時(shí)間，室早，室速和室顫的發(fā)生率作為心肌損傷的指標(biāo)，觀察化合物的心肌保護(hù)作用。結(jié)果如表所示AAT出現(xiàn)時(shí)間 VPS室性早博次數(shù)VT室速 VF室顫*p＜0.05，**p＜0.01與對(duì)照組比較結(jié)論實(shí)施例15和實(shí)施例16在濃度為10-6時(shí)，有顯著心肌保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)例3大鼠靜脈注射給藥大鼠靜脈注射3mg/kg上述化合物，對(duì)冠狀動(dòng)脈缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。以心臟損傷后出現(xiàn)心律失常的程度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，如表3。表3靜脈注射N-取代吡啶基苯并異硒唑酮類化合物對(duì)麻醉大鼠心臟缺血-再灌注心律失常的保護(hù)作用
VT室速
VF室顫
VE室早
*P＜0.05，**P＜0.01與對(duì)照組比較實(shí)驗(yàn)例4大鼠口服給藥大鼠口服給藥10-30mg/kg上述化合物，對(duì)冠狀動(dòng)脈缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。以心臟損傷后出現(xiàn)心律失常的程度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，如表4。實(shí)驗(yàn)例16、17的化合物溶于乙醇∶PEG(體積比)＝1∶9的溶劑中，并以該溶劑為對(duì)照組，灌胃容積均為10ml/Kg，灌胃后60min時(shí)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支造成心臟缺血，15min后實(shí)現(xiàn)再灌注。1)實(shí)驗(yàn)例16
口服30mg/Kg，可顯著性縮短缺血-再灌注心律失常(P＜0.01)的持續(xù)時(shí)間，降低VT(P＜0.01)和VF(P＜0.05)的發(fā)生率，縮短VT(P＜0.01)的持續(xù)時(shí)間。
口服100mg/Kg，可顯著性縮短缺血-再灌注心律失常(P＜0.05)的持續(xù)時(shí)間，降低VT(P＜0.05)的發(fā)生率，縮短VT(P＜0.01)的持續(xù)時(shí)間。2)實(shí)驗(yàn)例17
口服10mg/Kg，可顯著性縮短VT(P＜0.05)的持續(xù)時(shí)間。
口服30mg/Kg，可顯著性縮短缺血-再灌注心律失常(P＜0.01)的持續(xù)時(shí)間，降低VF(P＜0.05)的發(fā)生率，縮短VT(P＜0.01)和VF(P＜0.05)的持續(xù)時(shí)間。
口服100mg/Kg，可顯著性降低VT(P＜0.05)，縮短VT(P＜0.01)的持續(xù)時(shí)間。
大鼠口服給藥10、30、100mg/kg上述化合物，對(duì)冠狀動(dòng)脈缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。以心臟損傷后出現(xiàn)心律失常的程度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，如表4。表4口服實(shí)施例16和實(shí)施例17對(duì)麻醉大鼠心臟缺血—再灌心律失常的保護(hù)作用
結(jié)論以上實(shí)驗(yàn)證明，該類化合物靜脈注射和口服，對(duì)心臟缺血損傷均有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)例5急性毒性實(shí)驗(yàn)
以實(shí)施例16和實(shí)施例17化合物進(jìn)行了急性毒性實(shí)驗(yàn)，選雄性昆明種小鼠，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，體重19±2g。于動(dòng)物房適應(yīng)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)前14小時(shí)禁食后隨機(jī)分成2組，每組10只動(dòng)物?？诜o藥30min后，大劑量組動(dòng)物活動(dòng)減少。24h后，各劑量組動(dòng)物恢復(fù)正常。觀察7天，結(jié)果如表5
表5急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)論實(shí)施例16各劑量組未見動(dòng)物死亡，半數(shù)致死量LD50＞5g/kg，提示此類化合物毒性較低。
權(quán)利要求
1、如通式(I)所示的化合物，
其特征在于，該通式中R1選自氫，鹵素，C1-C4的直鏈或支鏈烷基或烷氧基；R1的取代位置是3-、4-、5-或6-位；
R2選自氫，鹵素，C1-C4的直鏈或支鏈烷基或烷氧基；R2的取代位置是2-位吡啶環(huán)上任一碳原子；
X代表氮原子，其取代位置是2-，3-或4-位。
2、根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其特征在于，包括以下如通式(Ia)所示的化合物
其中，R1和R2的定義同上；
通式(Ib)所示的化合物
R1和R2的定義同上；以及通式(Ic)所示的化合物
其中，R1和R2的定義同上。
3、制備如權(quán)利要求1的化合物的方法，其特征在于，包括以下步驟取代的鄰氨基苯甲酸經(jīng)重氮化得到的重氮鹽與二硒化鈉反應(yīng)，生成的2，2’-二硒化雙苯甲酸經(jīng)酰氯化，與氨基吡啶縮合而得本發(fā)明化合物。
4、如權(quán)利要求3的制備方法，其特征在于，包括以下步驟
(A)將取代的鄰氨基苯甲酸在酸性介質(zhì)中與亞硝酸鹽反應(yīng)，得到取代的苯甲酸重氮鹽；
(B)得到的取代的苯甲酸重氮鹽與二硒化鈉反應(yīng)，酸化得到2，2’-二硒化雙苯甲酸；
(C)得到的2，2’-二硒化雙苯甲酸與二氯亞砜反應(yīng)，生成取代的2-氯硒代苯甲酰氯；
(D)得到的取代的2-氯硒代苯甲酰氯在溶劑介質(zhì)中與各種氨基吡啶縮合，得到取代的2-吡啶基-1，2-苯并異硒唑-3(2H)-酮。
7、如權(quán)利要求1-4任一化合物在制備缺血性心肌損傷藥物中的應(yīng)用。
8、一種抗缺血性心肌損傷的藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1-4任一化合物作為活性成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。
9、根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在所述的藥物組合物可以是片劑，膠囊，丸劑或注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的N－取代吡啶基苯并異硒唑酮化合物及其制備方法，含有它們的藥物組合物，及其作為藥物，尤其是作為抗缺血性心肌損傷藥物的用途。
文檔編號(hào)A61P9/10GK1463972SQ0212266
公開日2003年12月31日 申請(qǐng)日期2002年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月19日
發(fā)明者郭宗儒, 王曉良, 褚鳳鳴, 馮楠 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所