專利名稱：細胞活化劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞活化劑、毛發(fā)細胞控制劑、毛發(fā)生長期延長劑、毛發(fā)細胞增殖活化劑、毛囊上皮細胞增殖活化劑、外毛根鞘細胞增殖活化劑。本發(fā)明用這些藥劑作為育發(fā)劑成分，在毛發(fā)細胞活化方面發(fā)揮效果。
給毛發(fā)施用育發(fā)劑的效果有例如誘導(dǎo)生發(fā)的效果(促進生發(fā)的效果、生長期誘導(dǎo)效果)、使毛發(fā)變粗的效果、延長毛發(fā)生長期的效果、抑制5α-還原酶的效果、促進血液循環(huán)的效果、殺菌效果、防止頭皮屑的效果、保濕效果、抗氧化效果等等。
然而，盡管在積極地開發(fā)育發(fā)劑，但以往育發(fā)劑的防止脫發(fā)、生發(fā)效果等的育發(fā)作用未必足夠。這是因為脫發(fā)等的原因分為很多種，而且生發(fā)的機制也非常復(fù)雜。
以往的育發(fā)劑將脫發(fā)作為比較粗略的概念，換句話說，糊里糊涂地抓住稱為“脫發(fā)”的現(xiàn)象進行開發(fā)，而著眼于其機理研究開發(fā)的不多。
其主要原因之一是因為沒有充分地建立著眼于機理的、能夠簡便檢測育發(fā)效果的育發(fā)藥物鑒定方法。特別是難以建立檢測毛發(fā)生長期延長效果等的育發(fā)藥物鑒定方法，結(jié)果迄今為止提供的育發(fā)劑多著眼于在毛周期的生長期內(nèi)誘導(dǎo)毛發(fā)進行育發(fā)的生發(fā)誘導(dǎo)效果。
本發(fā)明人建立了在體外進行的簡便的育發(fā)藥物鑒定方法，使用所述育發(fā)藥物鑒定方法研究多種化合物，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供成為養(yǎng)發(fā)劑等成分的育發(fā)相關(guān)效果藥物。
此外，本發(fā)明提供以牛磺酸作為有效成分的毛發(fā)細胞控制劑。
再者，本發(fā)明提供以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿l(fā)生長期延長劑。
此外，本發(fā)明提供以牛磺酸作為有效成分的毛發(fā)細胞增殖活化劑。
再者，本發(fā)明提供以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿疑掀ぜ毎鲋郴罨瘎?br> 此外，本發(fā)明提供以?；撬嶙鳛橛行С煞值耐饷始毎鲋郴罨瘎?br> 再者，本發(fā)明提供以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿l(fā)張力、彈性改善劑。
圖2顯示毛發(fā)的扭矩增加。
在本發(fā)明中所使用的?；撬崾且苑肿邮紿2NCH2CH2SO3H表示的化合物，以前未正確地確認其作為細胞活化劑、毛發(fā)細胞控制劑、毛發(fā)生長期延長劑、毛發(fā)細胞增殖活化劑、毛囊上皮細胞增殖活化劑、外毛根鞘細胞增殖活化劑、毛發(fā)張力、彈性改善劑的效果。
本發(fā)明為以牛磺酸作為有效必需成分的毛發(fā)相關(guān)藥物，具有作為混合到育發(fā)劑、養(yǎng)發(fā)劑中的“個別效能藥物”的特征；通過下述的育發(fā)藥物鑒定方法，能夠通過至少維持或促進毛囊上皮細胞的分裂增殖活性而確認?；撬嵊芯S持或延長毛發(fā)生長期的效果。
本發(fā)明是對例如由于毛根附近的毛囊上皮細胞增殖緩慢等而生長期變短，與生長期毛發(fā)相比休止期毛發(fā)的比例相對變多而引起的脫發(fā)特別有效的藥物。此外，通過與其它有個別效能的育發(fā)藥物聯(lián)用，有可能增強對各種脫發(fā)癥的綜合及協(xié)同效果。也就是說本發(fā)明藥物的用途與有著綜合育發(fā)效果概念的一般育發(fā)劑截然不同。
本發(fā)明的藥物包括?；撬?。在將牛磺酸作為有效成分混合到適當(dāng)基劑中制成制劑時，可根據(jù)用于發(fā)揮本發(fā)明效果的具體形式適當(dāng)?shù)卮_定其混合量。通常的混合量相對于基劑總量為0.00001-20％質(zhì)量，優(yōu)選0.01-10.0％質(zhì)量。在將本發(fā)明的藥物混合到毛發(fā)相關(guān)制品中時，優(yōu)選?；撬岬暮窟_到上述含量?；旌狭坎蛔?.00001％質(zhì)量，不能充分地發(fā)揮毛發(fā)細胞活化效果；混合量超過20％質(zhì)量，則不僅不能預(yù)期與含量增加相應(yīng)的效果增大，在制劑上造成困難的傾向變得顯著，因而不優(yōu)選。
本發(fā)明的藥物特別具有基于優(yōu)良的毛囊細胞增殖活化作用或者外毛根鞘細胞增殖活化作用的毛發(fā)生長期延長效果。例如，對于由毛根附近的毛囊上皮細胞增殖緩慢等而生長期變短、與生長期毛發(fā)相比休止期毛發(fā)的比例相對變多而引起的脫發(fā)癥特別有效。此外，通過與其它有個別效能的育發(fā)劑聯(lián)用，有可能增強對特定脫發(fā)癥的協(xié)同效果。
確認本發(fā)明藥物維持或延長毛周期中生長期的方法并沒有特別的限定，只要其測定方法本身對于指定作用而言是適當(dāng)?shù)?。例如，可以使用體外測定方法，也可以使用體內(nèi)測定方法，但考慮到其簡便性和有效性，優(yōu)選使用體外測定方法。
以下是體外測定方法之一，對特征為研究毛囊上皮培養(yǎng)細胞增殖效果的檢測方法進行簡單說明。所述方法是通過使試驗物質(zhì)在無血清培養(yǎng)基中與毛囊上皮培養(yǎng)細胞接觸，測定其細胞增殖活性的有無和強弱，從而鑒定所述試驗物質(zhì)延長毛周期中生長期的效果的育發(fā)藥物鑒定方法。這是一種著眼于與毛發(fā)伸長直接相關(guān)的毛囊上皮細胞，通過使用這種培養(yǎng)細胞，測定所需的延長毛周期中生長期的效果的體外育發(fā)藥物鑒定方法。
在這種育發(fā)藥物鑒定方法中，使試驗物質(zhì)與分離動物(包括人類)的毛囊上皮細胞得到的培養(yǎng)細胞即“毛囊上皮培養(yǎng)細胞”接觸，測定所述細胞有無增殖以及增殖的強弱。毛囊上皮細胞指特別是在毛根附近的外毛根鞘細胞和基層細胞等細胞，不包括內(nèi)側(cè)的毛乳頭細胞。毛周期中的生長期正好是該毛發(fā)伸長的時期，亦即毛囊上皮細胞分裂增殖的時期，毛周期中的退化期和休止期是所述細胞分裂增殖減弱停止的時期?？傊?，得出的結(jié)論是，在毛周期中延長生長期的物質(zhì)是通過其給予而維持毛囊上皮細胞分裂和增殖活性、從而防止毛發(fā)進入毛周期中的退化期和休止期的物質(zhì)，亦即持續(xù)促進或維持毛囊上皮細胞增殖的物質(zhì)。另外，其它的體外育發(fā)藥物檢測方法有例如使試驗物質(zhì)作用于動物的毛乳頭細胞、確定其增殖效果的方法。
體內(nèi)測定方法有例如將試驗物質(zhì)給予裸鼠，測定所述裸鼠體表生毛部位的狀態(tài)，檢測試驗物質(zhì)延長毛周期中生長期的效果的育發(fā)藥物鑒定方法等。在原則上無毛但其生毛部位隨時間而在體表移動的特征性生毛的裸鼠中，通過測定其生毛部位的大小和生毛部位的移動速度，鑒定毛周期中生長期的長度的方法等。
本發(fā)明藥物可采用的劑型，只要可以混合到育發(fā)劑中并可適用于皮膚，則沒有特別的限定。本發(fā)明的藥物可以混合到例如生發(fā)油、發(fā)乳、摩絲(注冊商標(biāo))、香波、護發(fā)素等制品中。
本發(fā)明的藥物在不損害本發(fā)明的效果的情況下，可以與化妝品、擬藥品、藥品等中常用的各種油性或水性成分、保濕劑、增稠劑、防腐劑、抗氧化劑、香料、色素、各種藥物等混合，用常規(guī)方法配制成制劑。實施例以下通過實施例等更具體地說明本發(fā)明。本發(fā)明不僅限于以下的實施例。在以下的實施例等中，以“％”表示并且顯示含量時，如無具體指明，則意指質(zhì)量百分比。
然后，將毛囊置于包被膠原(I型)的培養(yǎng)皿中，進行外殖片培養(yǎng)。另外，此時的培養(yǎng)基使用無血清培養(yǎng)基[角質(zhì)形成細胞生長培養(yǎng)基(KGM)]。培養(yǎng)4-5天后，在可以確認毛囊附著于培養(yǎng)皿并且細胞增殖時更換培養(yǎng)基，此后每隔2天更換培養(yǎng)基。
用0.05％(重量)胰蛋白酶-0.02％EDTA于37℃處理如此增殖的細胞5分鐘，用等量的0.1％胰蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)，離心(800×g，5分鐘)回收細胞。然后，將細胞懸浮于上述無血清培養(yǎng)基中，以5000細胞/cm2的密度接種于包被膠原(I型)的培養(yǎng)皿中，每隔2天更換培養(yǎng)基，直到細胞亞融合。再用0.05％(重量)胰蛋白酶-0.02％EDTA于37℃處理5分鐘后，用等量的0.1％胰蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)，離心(800×g，5分鐘)，在如此獲得的人毛囊上皮細胞中添加細胞冷凍液(セルバンカ-ダイヤトロン生產(chǎn))，調(diào)至1.0×106細胞/ml的濃度，向各冷凍管中各加入1.0×106細胞，將其凍存。另外，用血細胞計數(shù)板計算出這些管的細胞數(shù)。2.試驗物質(zhì)的分析測定(3000倍，5個視野)通過上述程序獲得的毛囊上皮細胞中成纖維細胞的混入率(FB混入率)，最終FB混入率大于等于3％的毛囊上皮細胞不包括在分析對象中。然后，將所述毛囊上皮細胞接種于培養(yǎng)燒瓶中后，將其用0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA處理，然后用0.1％胰蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)，以1500rpm離心處理5分鐘，除去上清液，在沉淀中添加20ml KGM培養(yǎng)基，制備細胞懸浮液。
以0.2ml/孔的比率接種(1.0×104細胞/孔)于96孔板(I型膠原包被板フアルコン公司生產(chǎn))中，將細胞于室溫靜置20分鐘，直至細胞沉降至孔底。此后，于37℃、5％CO2下培養(yǎng)1天，獲得所需的人毛囊上皮培養(yǎng)細胞。B.大鼠毛囊上皮細胞1.大鼠毛囊上皮細胞的采集(1)毛囊的采集采集新生(3-4日齡)大鼠的背部皮膚，將此采集的背部皮膚每2片浸入含有1％PSF的PBS(-)中。此后，用解剖用剪刀從皮膚脂肪層除去下面的皮下脂肪、皮膜等。隨后，再將所述背部皮膚浸入含有1％PSF的PBS(-)中，再于含有0.25％胰蛋白酶的PBS(-)(含有0.02％EDTA。以下相同)中于4℃浸泡過夜。
在所述胰蛋白酶溶液中浸泡后，用鑷子剝下背部皮膚的真皮層和表皮層，將真皮層轉(zhuǎn)移到加入了含有0.35％膠原酶的Ham氏F12培養(yǎng)基[其組成(mg/L)1-丙氨酸(8.9)、1-精氨酸(HCl211)、1-天冬酰胺(13.2)、1-天冬氨酸(13.3)、1-半胱氨酸(HCl31.5)、1-谷氨酸(14.7)、1-谷氨酰胺(146)、甘氨酸(7.5)、1-組氨酸(HCl19)、1-異亮氨酸(3.9)、1-亮氨酸(13.1)、1-賴氨酸(HCl36.5)、1-甲硫氨酸(4.5)、1-苯丙氨酸(5.0)、脯氨酸(34.5)、1-絲氨酸(10.5)、1-蘇氨酸(11.9)、1-色氨酸(2.0)、1-酪氨酸(5.4)、1-纈氨酸(11.7)、生物素(0.0073)、膽堿(Cl14.0)、維生素B12(1.36)、葉酸(1.32)、肌醇(18.0)、煙酰胺(0.037)、泛酸(Ca0.477)、維生素B6(HCl0.062)、維生素B2(0.038)、維生素B1(HCl0.337)、CaCl2(2H2O44.0)、CuSO4·5H2O(0.0025)、FeSO4·7H2O(0.834)、KCl(224.0)、MgCl2(6H2O122)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，53，288(1965))，以下相同]的100mm培養(yǎng)皿中，用剪刀截斷。含有所述截斷物的培養(yǎng)基于37℃浸透(60rpm)35分鐘。浸透后，進行吸打，直至在所述膠原酶反應(yīng)物中見不到塊狀物，將其轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，添加含有DNA酶(10000單位)的Ham氏F12培養(yǎng)基，放置5分鐘。
放置后，再吸打所得的懸浮液，然后用尼龍網(wǎng)(Nytex157網(wǎng))過濾，將其轉(zhuǎn)移到50ml離心管中。將懸浮液分成兩份，然后分別用PBS(-)稀釋懸浮液至30ml的體積，隨后將這種經(jīng)稀釋的懸浮液離心(4℃，400rpm，5分鐘)。離心后，除去上清液，從中除去脂肪部分。隨后，向沉淀中添加25ml PBS(-)將其懸浮，再將其離心[(4℃，400rpm，5分鐘)×3次]。通過這種離心操作獲得的沉淀是大鼠背部皮膚的毛囊。(2)毛囊上皮細胞的采集向通過上述操作獲得的毛囊中添加5ml含有0.25％胰蛋白酶的PBS(-)，將細胞懸浮液于37℃孵育5分鐘。孵育后，加入5ml等量的胎牛血清(FBS)和Ham氏F12培養(yǎng)基，細胞懸浮液通過セルストレ-ナ-(100μm，Nalgene公司生產(chǎn))過濾，然后加入到50ml離心管中，將所述細胞懸浮液離心(4℃，1500rpm，5分鐘)。從中除去上清液，得到為沉淀的所需毛囊上皮細胞。
向此毛囊上皮細胞中加入細胞冷凍液(セルバンカ-ダイヤトロン生產(chǎn))，調(diào)至1.5×107細胞/ml的濃度，向各冷凍管中分別加入1.5×107細胞，將其凍存。另外，用血細胞計數(shù)板計算出這些管中的細胞數(shù)。2.毛囊上皮細胞的預(yù)培養(yǎng)為了盡可能從系統(tǒng)中除去其中混入的成纖維細胞，將通過上述程序獲得的毛囊上皮細胞進行預(yù)培養(yǎng)。以下說明其步驟。用37℃的恒溫箱將通過上述程序獲得的冷凍細胞解凍。然后添加10ml FAD培養(yǎng)基[在Ham氏F12培養(yǎng)基(下述)和MEN培養(yǎng)基的3∶1混合物中含有胰島素(5.0μg/ml)、氫化可的松(0.45μg/ml)、表皮生長因子(EGF)(10.0ng/ml)、霍亂毒素(10-9M)和胎牛血清(10％)的培養(yǎng)基，以下相同]，稀釋細胞溶液，并進行離心處理(10℃以下，1500rpm，5分鐘)。離心后，除去上清液，添加10ml FAD培養(yǎng)基，反復(fù)吸打直至見不到細胞塊。
用血細胞計數(shù)板計算出所得的細胞數(shù)，用FAD培養(yǎng)基調(diào)至2.5×105細胞/ml的濃度。將細胞接種到I型膠原包被的75cm3燒瓶中，于37℃、5％CO2培養(yǎng)過夜。
培養(yǎng)后，用10ml PBS(-)將其洗滌2次，加入2ml含有0.25％胰蛋白酶的PBS(-)，于37℃、5％CO2孵育4分鐘。隨后，添加2ml胎牛血清(FBS)，輕搖一次后除去上清液，從而除去其中混入的成纖維細胞。
再向其中加入15ml KGM培養(yǎng)基[表皮角質(zhì)形成細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Keratinocyto growth medium)向角質(zhì)形成細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Keratinocyto basal medium){KBM培養(yǎng)基(改良的MCDB153培養(yǎng)基クロ-ネテイツクス公司生產(chǎn))}中添加牛腦垂體提取物(BPE)(0.4％體積)、胰島素(0.5μm/ml)、氫化可的松(0.5μm/ml)、h-EGF(0.1ng/ml)的培養(yǎng)基。以下相同]，于37℃、5％CO2下培養(yǎng)3天。3.試驗物質(zhì)的分析測定(3000倍，5個視野)接種有通過上述程序獲得的毛囊上皮細胞的培養(yǎng)燒瓶中成纖維細胞的混入率(FB混入率)，如果最終FB混入率大于等于3％，則從分析對象中將其除去。
用10ml PBS(-)將其洗滌2次，添加2ml含有0.25％胰蛋白酶的PBS(-)，并于37℃孵育3分鐘。隨后，為了利用上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶反應(yīng)性的不同，從中除去成纖維細胞，除去胰蛋白酶，再加入2ml含有0.25％胰蛋白酶的PBS(-)，于37℃以20rpm振蕩5分鐘。
然后，在顯微鏡下確認細胞脫落后，加入10ml含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，在50ml離心管中進行吸打，以1500rpm離心5分鐘。除去上清液，加入20ml KGM培養(yǎng)基，吸打直至無細胞塊。
細胞懸浮液通過セルストレ-ナ-(100μm，Nalgene公司生產(chǎn))過濾，然后加入到50ml離心管中，用血細胞計數(shù)板計算出懸浮液中的活細胞數(shù)，向其中加入KGM培養(yǎng)基，將細胞濃度調(diào)節(jié)至5.0×104細胞/ml。隨后，以0.2ml/孔的比率接種(1.0×104細胞/孔)于96孔板(I型膠原包被板フアルコン公司生產(chǎn))中，于室溫下放置約20分鐘，直至細胞沉降至孔底。此后，于37℃、5％CO2下培養(yǎng)1天，得到所需的大鼠毛囊上皮培養(yǎng)細胞。C.試驗培養(yǎng)基的制備(1)添加試驗物質(zhì)的培養(yǎng)基的制備稱量約1.5mg牛磺酸，用KBM培養(yǎng)基配制成1％的溶液，通過0.45μm濾器過濾除菌。隨后，在KBM培養(yǎng)基中添加10000倍量的上述溶液[試驗物質(zhì)的濃度1.0×10-5％]。(2)對照培養(yǎng)基的制備用KBM培養(yǎng)基作為陰性對照。作為陽性對照，使用在陰性對照即KBM培養(yǎng)基中添加2μl胰島素(5mg/ml)、2μl氫化可的松(0.5mg/ml)的細胞增殖因子的培養(yǎng)基。D.試驗物質(zhì)培養(yǎng)基的更換將上述A、B中配制了人毛囊上皮培養(yǎng)細胞和大鼠毛囊上皮培養(yǎng)細胞的96孔板中的KGM培養(yǎng)基更換為添加試驗物質(zhì)的培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基(200μl孔)，更換后于37℃、5％CO2下培養(yǎng)2天。另外，如下進行所述培養(yǎng)基的更換吸出孔內(nèi)的KGM培養(yǎng)基，小心不損傷附著于底部的細胞，隨后立即從孔的兩端加入添加了試驗物質(zhì)的培養(yǎng)基。E.細胞增殖測定以相對于培養(yǎng)基體積為1/10的量加入alamar blue(アラマ-バイオサイエンス公司生產(chǎn))，于37℃(5％CO2)孵育6小時。孵育后，用微量培養(yǎng)板讀數(shù)儀(Bio Rad公司生產(chǎn))測定其595nm和570nm的吸光度，根據(jù)以下公式，計算出細胞增殖度。(試驗樣品的細胞增殖度)＝(試驗樣品的alamar blue還原率)/(陰性對照的alamar blue還原率)×100(％)再根據(jù)下述公式，確定牛磺酸的毛囊上皮細胞增殖促進作用。(試驗樣品的細胞增殖促進指標(biāo))＝((試驗樣品的細胞增殖度)-(陰性對照的alamar blue還原率))/((陽性對照的alamar blue還原率)-(陰性對照的alamar blue還原率))結(jié)果細胞增殖促進作用以陰性對照為0，陽性對照為1，則?；撬釋τ趤碜匀说拿疑掀づ囵B(yǎng)細胞的細胞增殖促進作用為0.8，對于來自大鼠的毛囊上皮培養(yǎng)細胞而言也為0.8。根據(jù)這一結(jié)果，確實證明有毛囊上皮培養(yǎng)細胞的增殖活性。亦即明確斷定?；撬嵊忻l(fā)生長期延長活性。
結(jié)果，未感染病毒的外毛根鞘細胞到傳代5代左右時停止增殖。導(dǎo)入了T抗原的毛乳頭細胞在克隆后傳代7代左右時，從外表上看來好像增殖停止了，但若再繼續(xù)培養(yǎng)，從外表上看來似乎又開始增殖了。推測大概是到傳代7代時達到了臨界，在此發(fā)生了某些變異，變?yōu)闊o限增殖化細胞。克隆時，雖然選出數(shù)個克隆，但僅得到一個克隆的越過臨界期繼續(xù)增殖的細胞株。細胞增殖評價外毛根鞘細胞用PBS(-)洗滌2次。用胰蛋白酶處理，使細胞脫落。用胰蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)，離心，棄去上清液，回收外毛根鞘細胞。加入KGM培養(yǎng)基，制備細胞懸浮液。在包被膠原的24孔培養(yǎng)板中接種細胞，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天，更換為添加了試驗物質(zhì)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)4天后，用PBS(-)洗滌細胞，用胰蛋白酶使細胞脫落。在這種狀態(tài)下冷凍各培養(yǎng)板的細胞。試驗物質(zhì)的制備試驗物質(zhì)?；撬嵊媒琴|(zhì)形成細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(KBM)配制為50mM，進行過濾除菌。將其作為母液，用KBM培養(yǎng)基稀釋，將試驗物質(zhì)的濃度配制為10nM、1μM、100μM、10mM。陰性對照僅用KBM培養(yǎng)基。細胞DNA的測定將細胞解凍后，向各孔中加入Hoechst33258，經(jīng)超聲處理破碎細胞。將其轉(zhuǎn)移到比色杯中，在激發(fā)波長356nm、熒光波長460nm下測定熒光強度。以陰性對照的熒光強度作為100，通過計算DNA量的相對值，計算出細胞增殖程度。
結(jié)果示于

圖1。根據(jù)該結(jié)果，可知?；撬嵊袩o限增殖化外毛根鞘細胞活化作用。
隨后，測試基于毛發(fā)生長期延長作用的育發(fā)效果。實施例3 液態(tài)毛發(fā)生長期延長劑將0.8％?；撬?、90％的70％乙醇、0.05％油酸鈉、0.49％十二烷基苯磺酸、0.5％氫化蓖麻油環(huán)氧乙烷(40摩爾)加成物和離子交換水(余量)混合攪拌，使其溶解。再加入離子交換水(10％)進行混合，獲得液態(tài)的毛發(fā)生長期延長劑。用這種液態(tài)育發(fā)劑配方中除牛磺酸以外的其他成分配制液體制劑，作為對照(比較例1)。實施例4 乳液狀毛發(fā)生長期延長劑制備以下配方的乳液狀毛發(fā)生長期延長劑。成分 混合量(質(zhì)量％)(A相)牛磺酸 0.05聚氧乙烯(60摩爾)加成氫化蓖麻油 2.0甘油 10.0雙丙甘醇 10.01，3-丁二醇5.0聚乙二醇1500 5.0(B相)異辛酸鯨蠟酯 10.0角鯊?fù)?5.0凡士林 2.0對羥基苯甲酸丙酯 2.0(C相)羧基乙烯基聚合物1％水溶液 30.0六偏磷酸鈉 0.03離子交換水 9.3(D相)離子交換水 4.5(E相)KOH 0.12離子交換水 5.0<制備方法>將A相和B相分別于60℃加熱溶解，混合，并用均化器進行處理，制成凝膠。向其中緩慢加入D相，用均化器分散。隨后加入溶解的C相，最后加入溶解的E相，用均化器乳化，制備水包油型乳液型毛發(fā)生長期延長劑。實施例5 膏狀毛發(fā)生長期延長劑成分混合量(質(zhì)量％)(A相)液體石蠟5.0十六醇十八醇混合物 5.5一硬脂酸甘油酯 3.0EO(20摩爾)-2-辛基十二烷基醚 8.0對羥基苯甲酸丙酯0.3香料0.1(B相)牛磺酸 5.0甘油8.0雙丙甘醇20.0聚乙二醇40005.0十二烷基硫酸鈉 0.1六偏磷酸鈉 0.005離子交換水 39.995<制備方法>將A相和B相分別加熱溶解，混合，用均化器乳化，得到膏狀毛發(fā)生長期延長劑。毛發(fā)生長期延長劑的育發(fā)作用的研究為了調(diào)查通過上述方法獲得的毛發(fā)生長期延長劑的防止脫發(fā)、生發(fā)效果等的育發(fā)作用，用下述方法對人進行トリコグラム試驗和實際使用試驗。受試樣品和對照樣品是實施例3-5的本發(fā)明毛發(fā)生長期延長劑、70％乙醇、比較例1。試驗方法在顯微鏡下觀察在上述樣品使用前和使用后所拔取毛發(fā)的毛根，根據(jù)毛根的形態(tài)，對停止生長的毛發(fā)的毛根即“休止期毛根”進行計數(shù)，通過其比率的增減，比較這些樣品的育發(fā)作用。亦即在10名男性受試者頭皮上每日2次，每次2ml連續(xù)6個月涂抹試驗樣品和對照樣品，臨涂抹前和6個月涂抹一結(jié)束時，每名受試者各拔取100根頭發(fā)，在顯微鏡下觀察各個毛根。試驗結(jié)果示于下表1中。
表1

由這一結(jié)果可以確認本發(fā)明的毛發(fā)生長期延長劑有基于毛發(fā)生長期延長效果的育發(fā)效果。賦予毛發(fā)張力和彈性的效果以牛磺酸作為必需成分的本發(fā)明具有賦予毛發(fā)張力和彈性的效果，可以用作毛發(fā)張力、彈性改善劑。首先說明試驗方法。試驗樣品毛發(fā)使用未經(jīng)過電燙發(fā)、染發(fā)、漂白等化學(xué)處理的19歲女性的頭發(fā)。約20cm的發(fā)梢部分在規(guī)定香波液中浸漬1小時后，在流水中沖洗1分鐘，在正常環(huán)境下干燥24小時以上，以此作為健康正常毛發(fā)的樣品。對上述健康正常毛發(fā)使用規(guī)定漂白劑，在室溫下漂白處理30分鐘，隨后在流水中沖洗1分鐘。重復(fù)4次漂白處理，沖洗后在正常環(huán)境下干燥，作為漂白處理的毛發(fā)(BL處理)。?；撬崽幚韺?根毛發(fā)在20ml 1mol/L的牛磺酸水溶液中浸漬過夜，在25℃、50％相對濕度環(huán)境下干燥試驗樣品的毛發(fā)。扭矩的測定使用カト-テツク公司生產(chǎn)的扭矩試驗機KES-YN-1，在25℃、50％相對濕度環(huán)境下進行測定。測定在用?；撬崴芤禾幚碇斑M行，以此作為對照。設(shè)定扭轉(zhuǎn)角為±1080°，扭轉(zhuǎn)速度為18°/秒。當(dāng)扭轉(zhuǎn)角θ＝360°～720°時，以相對于扭轉(zhuǎn)角θ的扭矩Tf的增加部分B＝tan(Tf/θ)作為扭轉(zhuǎn)剛性B值，評價用?；撬崴芤禾幚砬昂蟮腂值比。結(jié)果示于圖2。
根據(jù)所述結(jié)果，表明牛磺酸處理后毛發(fā)扭矩增加、賦予毛發(fā)張力和彈性。
下面是混合本發(fā)明藥物的優(yōu)選制劑配方。混合有?；撬岬囊韵孪悴ā⒆o發(fā)素是泡沫持久性、泡沫質(zhì)量優(yōu)良的洗發(fā)劑，也是根據(jù)毛發(fā)生長前細胞的水平來看可以預(yù)期有使毛發(fā)健康成為長出后即具有張力和彈性的健康毛發(fā)的效果的育發(fā)洗發(fā)劑。配方例1 香波配方成分 混合量(質(zhì)量％)?；撬? 8.0聚氧乙烯烷基銨 15.0氨基丙基二甲基乙酸 3.0椰油脂肪酸單乙醇酰胺 1.6二硬脂酸乙二醇酯 0.6二甲基硅酮(5000cs)乳膠40％乳液 1.8苯甲酸鈉 0.2陽離子化纖維素 0.3離子交換水 69.5配方例2 護發(fā)素配方成分 混合量(質(zhì)量％)牛磺酸 0.6エキセコ-ルD-5 3.4二甲基硅酮 0.5硬脂醇 7.5硬脂酸二甲氨基丙基酰胺 2.5離子交換水 85.5配方例3 香波配方成分 混合量(質(zhì)量％)?；撬? 3N-椰油脂肪酸-N-甲基?；撬徕c 10椰油脂肪酸二乙醇酰胺 4椰油脂肪酸酰胺丙基甜菜堿鈉 10マ-コ-ト550(約8％水溶液) 5檸檬酸 0.5苯甲酸鈉 適量香料 適量精制水 余量配方例4 香波配方成分 混合量(質(zhì)量％)N-椰油脂肪酸-N-甲基牛磺酸?；撬徕c鹽12椰油脂肪酸酰胺丙基甜菜堿鈉鹽 5月桂酸丙二醇酯 1.5陽離子化纖維素 0.3檸檬酸 0.5苯甲酸鈉 適量香料 適量精制水 余量配方例5 香波配方成分 混合量(質(zhì)量％)牛磺酸 0.3聚氧乙烯月桂基醚鈉鹽 10椰油脂肪酸酰胺丙基甜菜堿鈉鹽 5椰油脂肪酸單乙醇酰胺 2陽離子化纖維素 0.5マ-コ-ト550(約8％水溶液) 3.0檸檬酸 0.3苯甲酸鈉 適量香料 適量精制水 余量配方例6 香波配方成分 混合量(質(zhì)量％)?；撬?.5聚氧乙烯月桂基醚鈉鹽 8咪唑鎓甜菜堿鈉鹽 3椰油脂肪酸二乙醇酰胺 4陽離子化纖維素0.3檸檬酸0.5ケ-ソンCG 適量香料 適量精制水余量配方例7 護發(fā)素配方成分 混合量(質(zhì)量％)?；撬?.1二甲基硅酮5硬脂醇2硬脂基三甲基氯化銨0.7甘油 2.0對羥基苯甲酸酯適量香料 適量精制水余量配方例8 護發(fā)素配方成分 混合量(質(zhì)量％)?；撬?.3二甲基硅酮10山萮醇1.5硬脂醇 1硬脂基三甲基氯化銨 1.0甘油5.0對羥基苯甲酸酯 適量香料適量精制水 余量配方例9 護發(fā)素配方成分混合量(質(zhì)量％)?；撬? 0.1二甲基硅酮 5石蠟2鯨蠟醇 1.5硬脂醇 0.3山萮基三甲基氯化銨 0.5異戊二烯二醇3.0ケ-ソンCG 適量香料適量精制水 余量工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供通過使細胞增殖活化，控制毛發(fā)細胞、延長毛周期中的生長期、活化毛發(fā)細胞的毛囊上皮細胞和外毛根鞘細胞的增殖，從而賦予毛發(fā)張力和彈性的毛發(fā)相關(guān)藥劑。
權(quán)利要求
1.以?；撬嶙鳛橛行С煞值募毎罨瘎?br> 2.以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿l(fā)細胞控制劑。
3.以牛磺酸作為有效成分的毛發(fā)生長期延長劑。
4.以牛磺酸作為有效成分的毛發(fā)細胞增殖活化劑。
5.以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿疑掀ぜ毎鲋郴罨瘎?br> 6.以?；撬嶙鳛橛行С煞值耐饷始毎鲋郴罨瘎?。
7.以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿l(fā)張力、彈性改善劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及以牛磺酸作為有效成分的細胞活化劑、毛發(fā)細胞控制劑、毛發(fā)生長期延長劑、毛發(fā)細胞增殖活化劑、毛囊上皮細胞增殖活化劑、外毛根鞘細胞增殖活化劑。本發(fā)明用這些藥劑作為育發(fā)劑成分，在毛發(fā)細胞活化方面發(fā)揮效果。
文檔編號A61P17/14GK1458842SQ01815800
公開日2003年11月26日 申請日期2001年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月19日
發(fā)明者浜田千加, 田島正裕, 中間康成, 高橋唯仁 申請人:株式會社資生堂