專利名稱：疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗，特別是減毒活疫苗領(lǐng)域。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明涉及一種預(yù)防登革熱的四價疫苗組合物，其中與其它血清型的病毒量相比，血清型3的登革熱病毒的量降低了。
登革熱，及其嚴(yán)重形式——出血性發(fā)熱，是一種源于病毒的熱帶病。導(dǎo)致這種疾病的病毒是黃病毒科(黃病毒屬)的一部分，其還包括黃熱病病毒及日本腦炎病毒。能夠引起登革熱的四種血清型是已知的。而目前這種疾病在全世界范圍內(nèi)均有分布，且迄今為止在市場上還沒有有效的疫苗出售。事實上，為了能夠有效地預(yù)防登革熱，同時提供安全保證，疫苗必須能夠在已給藥的個體中誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答，并能夠在隨后的野生病毒感染過程中保護他們。優(yōu)選所述疫苗不但有效，而且與野生型病毒的血清型無關(guān)。然而，直到現(xiàn)在，在所研究的候選疫苗中，還沒有一種能夠表現(xiàn)出所有這些必需的品質(zhì)。
目前已經(jīng)在人身上試驗過四價疫苗，所述四價疫苗含有保藏在位于巴黎巴斯德研究所中的CNCM，保藏號為I-2480，I-2481，I-2482，I-2483的4種毒株，它們是血清型1，2，3和4的減毒登革熱毒株，這些內(nèi)容由Natth BHAMARAPRAVATI和Sutee YOKSAN在D.J.Gubler和G.Kuno，CAB INTERNATIONAL，1997年出版的《登革熱和登革熱出血性發(fā)熱》一書的第17章第373-374頁中描述。雖然根據(jù)該現(xiàn)有技術(shù)，臨床試驗中的所有受試者全部被血清轉(zhuǎn)化，僅經(jīng)歷輕微的副發(fā)應(yīng)，但人們還是希望能夠改進疫苗組合物的配比從而優(yōu)化它。事實上，我們希望能有這樣一種疫苗組合物，其可安全地給予人，同時可相對于絕大多數(shù)接種受試者的各血清型誘導(dǎo)血清轉(zhuǎn)化；此外，所述疫苗組合物必須能以較低的成本在工業(yè)條件下制備，以便使接種能夠為所有國家，特別是最易受這類疾病影響的貧窮國家所接受。
為了達到此目的，本發(fā)明提供了一種預(yù)防登革熱的四價疫苗組合物，其含有保藏在位于巴黎巴斯德研究所中的CNCM，保藏號為I-2480，I-2481，I-2482和I-2483的各減毒株的病毒，其特征在于各血清型的病毒相對量是這樣的，即血清型3的病毒量小于其它血清型的病毒量。
根據(jù)本發(fā)明的其中一個特征，當(dāng)以感染50％細(xì)胞所需的病毒稀釋度的log10表示病毒滴度時，每一疫苗劑量中，血清型3的病毒量至少小于其它血清型的病毒量1個單位。
根據(jù)本發(fā)明其中一個實施方案，當(dāng)以感染50％細(xì)胞所需的病毒稀釋度的log10表示病毒滴度時，每一疫苗劑量中，除血清型3之外的其它血清型病毒可以等量存在，或以這種比例存在，即血清型1的病毒量至少大于其它血清型的病毒量1個單位。
令人感到驚奇的是，我們已經(jīng)觀察到使用這種制劑在接種個體中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答十分令人滿意，而副發(fā)應(yīng)大大減少。
根據(jù)本發(fā)明一個具體實施方案，每一疫苗劑量中，各血清型1-4的病毒量與下列配比相對應(yīng)3，2，1，2或3，3，1，3，其中的數(shù)字表示感染50％細(xì)胞所需的病毒稀釋度的log10值。
根據(jù)本發(fā)明其中一個特征，所述疫苗組合物可通過皮下注射給藥。
根據(jù)一個特別有利的實施方案，所述疫苗組合物是分2次至少間隔1個月進行給藥的。事實上，我們已經(jīng)觀察到這種給藥方式增加了抗體應(yīng)答且，完全意想不到的是，副發(fā)應(yīng)的頻率降低。
此外，我們還觀察到第二次給藥可“補充”在第一次給藥過程中誘導(dǎo)的應(yīng)答，即在第一次給藥過程中，沒能相對于特定血清型血清轉(zhuǎn)化的個體具有在第二次給藥過程中這樣做的能力；此觀察結(jié)果，結(jié)合細(xì)胞型免疫應(yīng)答的存在，表明本發(fā)明提供的疫苗組合物可有效預(yù)防登革熱，其中所述細(xì)胞型免疫應(yīng)答的存在是在先前的臨床試驗中，使用含與本發(fā)明相同的減毒活毒株的疫苗組合物加以證實的。
本發(fā)明的主題還在于病毒組合物在制備預(yù)防登革熱的疫苗組合物中的用途，其中所述病毒組合物含有保藏在位于巴黎巴斯德研究所中的CNCM，保藏號為I-2480，I-2481，I-2482，I-2483的各減毒株的病毒，其中各血清型的病毒相對量是這樣的，即血清型3的病毒量小于其它血清型的病毒量。
本發(fā)明的主題還在于預(yù)防登革熱的接種方法，其中給予人可預(yù)防登革熱的四價疫苗組合物，其中所述四價疫苗組合物含有保藏在位于巴黎巴斯德研究所中的CNCM，保藏號為I-2480，I-2481，I-2482，I-2483的各減毒株的病毒，其特征在于各血清型的病毒相對量是這樣的，即血清型3的病毒量小于其它血清型的病毒量。
本發(fā)明的病毒株全部是從東南亞感染了登革熱的患者血清中獲得的。使分離物在哺乳動物細(xì)胞上傳代，然后通過胸內(nèi)(IT)途徑接種到農(nóng)場蚊子(巨蚊(Toxorhynchites)或埃及伊蚊)上。該步驟可消除可能不是蟲媒病毒的潛在污染病毒；事實上，只有蟲媒病毒可在胸內(nèi)給藥后遷移到蚊子的唾液腺中；因此需將蚊子的頭部從其身體的其余部分分離下來并磨碎，從而得到純凈的病毒株。
接下來，每隔5-10天，在32℃時，使血清型1，2和4的病毒在原代狗腎細(xì)胞(PDK)上傳代，而血清型3的病毒是通過在猴腎細(xì)胞(PGMK)上傳代，然后在胎獼猴肺細(xì)胞(FRhL)上培養(yǎng)而減毒的。
所得減毒株具有下列特性-當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞，例如來源于猴腎的LLC-MK2細(xì)胞上進行滴定時，與其親代毒株相比，減毒株產(chǎn)生的噬斑較少。
-在新生的小鼠中，當(dāng)通過大腦內(nèi)途徑接種它們時，它們具有較低的毒性。
-在猴子中，當(dāng)通過皮下途徑接種它們時，它們較少引起(甚或檢測不到)病毒血癥。
-在接近40℃的溫度時，它們較敏感。
根據(jù)本發(fā)明，源于CNCM保藏的I-2480，I-2481，I-2482，I-2483的毒株是指從這些毒株得到的，但其已經(jīng)在允許病毒進入的細(xì)胞上經(jīng)歷了額外傳代，同時維持了上述性能的毒株。
血清型1的毒株16007是1964年在泰國，從患登革熱，并伴有休克綜合征的患者中分離出來的。在被接種到蚊子Toxorhynchites amboinensis中之前，在組織培養(yǎng)物上傳代原始的病毒血癥血清。接著，在PGMK上傳代所得的病毒，從而制備原病毒種子。然后在PDK細(xì)胞上傳代該種子43次。在PDK細(xì)胞上傳代13次后所得的毒株具有所有減毒特性，可用作疫苗；它是在位于巴黎巴斯德研究所中的CNCM保藏的，保藏號為I-2480。
雖然對于本發(fā)明的疫苗組合物而言，該毒株是優(yōu)選的，但也可使用從其衍生的毒株，特別是在PDK細(xì)胞上傳代過幾次的毒株，或隨后在細(xì)胞上培養(yǎng)，使其維持致免疫性，同時不增加毒性的毒株。因此，在VERO細(xì)胞上培養(yǎng)過的毒株也是適宜的。源于毒株I-2480的任何毒株均被看作本發(fā)明的組成部分。
血清型2的毒株16681是1964年，在泰國，從代表登革熱致死病例的患者中分離出來的。此毒株在Toxorhynchites amboinensis蚊子中傳代兩次，在猴腎細(xì)胞上傳代一次，從而產(chǎn)生原種子。毒株16681 PDK 53是在PDK細(xì)胞上，每周一次，連續(xù)傳代53周后得到的，其適于本發(fā)明的目的，并保藏在CNCM中，保藏號為I-2481。
雖然對于本發(fā)明的疫苗組合物而言，該毒株是優(yōu)選的，但也可使用從其衍生的毒株，特別是在PDK細(xì)胞上傳代過幾次的毒株，或隨后在細(xì)胞上培養(yǎng)，使其維持致免疫性，同時不增加毒性的毒株。因此，在VERO細(xì)胞上培養(yǎng)過的毒株也是適宜的。源于毒株I-2481的任何毒株均被看作本發(fā)明的組成部分。
血清型3的毒株16562是1972年，在馬尼拉，從登革熱患者中分離出來的。在PGMK細(xì)胞上連續(xù)傳代30次，然后在FRhL細(xì)胞上培養(yǎng)可使其減毒。疫苗毒株16562 PGMK 30 FRhL 3是在PGMK細(xì)胞上傳代30次后，在FRhL細(xì)胞上連續(xù)傳代3次得到的，其在CNCM保藏，保藏號I-2482，且適于本發(fā)明的目的。
血清型4的毒株1036是在印度尼西亞，從患有典型性登革熱的兒童中分離出來的。此毒株是通過在PDK細(xì)胞上連續(xù)傳代而減毒的。毒株1036 PDK 48是在PDK細(xì)胞上傳代48次得到的，其適于本發(fā)明的目的，并在CNCM保藏，保藏號為I-2483。
雖然對于本發(fā)明的疫苗組合物而言，該毒株是優(yōu)選的，但也可使用從其衍生的毒株，特別是在PDK細(xì)胞上傳代過幾次的毒株，或隨后在細(xì)胞上培養(yǎng)，使其維持致免疫性，同時不增加毒性的毒株。因此，在VERO細(xì)胞上培養(yǎng)過的毒株也是適宜的。源于毒株I-2483的任何毒株均被看作本發(fā)明的組成部分。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選各血清型的病毒量是根據(jù)專利申請WO98/45709中描述的方法得到的，即，在允許病毒進入但同時不會誘導(dǎo)各血清型之間的干擾的細(xì)胞，如VERO細(xì)胞上繁殖病毒，然后利用對所要滴定的血清型具有特異性的單克隆抗體測定各血清型的病毒量。所述病毒的滴度是通過Spearman和Karber方法測定的，并以感染50％細(xì)胞培養(yǎng)物的劑量表示(CCID50)。
還可使用與此方法等價的任何其它方法，特別是用pfu表示結(jié)果的噬斑方法。
同樣，還可使用以單位表示結(jié)果的，任何完全不同的方法(如接種到活的蚊子中)，但其應(yīng)與在申請WO98/45709中所述的方法相應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明，疫苗劑量是指同時給予所要接種的人時的疫苗組合物量。在皮下注射過程中，該量為0.5ml。
本發(fā)明的疫苗組合物可含有通常存在于疫苗中的所有成分，特別是穩(wěn)定劑，防腐劑和助劑。然而，沒有疫苗助劑也可獲得良好的結(jié)果。
下列實施例舉例說明了本發(fā)明的一個特殊實施方案。
具有下列配比的四價組合物是從含毒株16007 PDK13，16681PDK53，16562 PGMK30 FrhL3和1036 PDK48的大量病毒混懸液制備的，其中各血清型的滴度是以感染50％細(xì)胞所需的病毒稀釋度的log10(即，CCID50/劑量)表示的。
將所述疫苗組合物制備成0.5ml給藥劑量的形式。
試驗中的受試者是年齡在18-40歲之間的泰國成年人。
各組受試者數(shù)是組A為n＝11，組B為n＝5，組C為n＝6。
所述疫苗組合物的給藥是通過皮下注射到三角肌區(qū)域中進行的，第一次給藥量為0.5ml，第二次給藥量為0.5ml，第二次給藥是在第一次給藥6個月后進行的。
采集血液樣品，從而進行中和抗體的測定，病毒血癥的檢測及各種生物參數(shù)的測定。
此外，觀察接種過程中涉及不良反應(yīng)的所有癥狀，并在第一次給藥或第二次給藥之后，在下面的表1中，以用平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差表示的耐受指數(shù)形式記錄，圓括號中是最小值和最大值。
所述耐受指數(shù)是根據(jù)各受試者的全身反應(yīng)計算的。計算下列全身反應(yīng)的持續(xù)時間與嚴(yán)重度的結(jié)果發(fā)熱，寒戰(zhàn)，不適，頭痛，肌痛，關(guān)節(jié)痛，皮疹，瘙癢，目痛，畏光和結(jié)膜炎。對于各受試者而言，選擇發(fā)熱和寒戰(zhàn)，肌痛和關(guān)節(jié)痛，皮疹和瘙癢，目痛，畏光和結(jié)膜炎之間的最大值，并將其與不適和頭痛的值相加。最后，計算各組受試者的平均值(+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差)。因此，對于各受試者而言，該指數(shù)可在考慮到反應(yīng)數(shù)，他們的嚴(yán)重程度及持續(xù)時間的情況下，評估其耐受性。表1耐受指數(shù)
這些結(jié)果清楚地表明，本發(fā)明的疫苗組合物可比所有血清型以等量存在的疫苗組合物產(chǎn)生更低的指數(shù)。
還可見到不良反應(yīng)越來越少，甚至在第二次給藥過程中就不存在了。
下面表2和3提供了以GMT表示的，涉及各血清型的中和抗體的結(jié)果。所述結(jié)果是按照Russel等，“登革熱病毒中和抗體的噬斑減少試驗”，Journal ofImmunology，1967；99285-290所述的方法，通過噬斑減少試驗得到的，且所述結(jié)果是以LLC-MK2細(xì)胞上，溶菌噬斑減少50％時的稀釋度的倒數(shù)表示的。此方法是將血清稀釋度與確定的病毒顆粒數(shù)聯(lián)系起來，其中所述的病毒顆粒被接種到允許的細(xì)胞LLCMK2中，產(chǎn)生溶菌噬斑，也就是說一種細(xì)胞菌苔部分定位的毀壞。當(dāng)試驗在標(biāo)準(zhǔn)條件下進行時，中和抗體的存在可使溶菌噬斑的數(shù)量減少。所述結(jié)果是以使噬斑總數(shù)減少50％時的血清最后稀釋度表示的，其是通過與使用陰性對照血清進行的試驗相比較而評估的。表2血清型1和2的中和抗體滴度的結(jié)果(幾何平均數(shù))
滴度為5則相當(dāng)于陰性結(jié)果。表3血清型3和4的中和抗體滴度的結(jié)果(幾何平均數(shù))
這些結(jié)果表明，本發(fā)明的疫苗組合物可使中和抗體的免疫應(yīng)答令人滿意，且第二次給藥具有補充此免疫應(yīng)答的作用。
如果這些結(jié)果是以血清轉(zhuǎn)化水平，即，中和抗體滴度大于或等于10的受試者的百分比表示的，那么相對于血清型3，可觀察到所有受試者的血清轉(zhuǎn)化，相對于血清型4，可觀察到75％接受本發(fā)明疫苗組合物的受試者的血清轉(zhuǎn)化。
因此，可利用本發(fā)明的疫苗組合物預(yù)防登革熱，且其可提高安全分布，并維持免疫原性。
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2In the cases referred to in Rule 10.2(a)(ii)and(lii)，refer to the most recent viability test.
3Mark with a cross the applicable box.
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BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONALRECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMSFOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDUREINTERNATIONAL FORMADDRESSEEMr.Hervé TAINTURIER VIABILITY STATEMENTDirecteur Juridiqueissued pursuant to Rule 10.2 by theAventis PasteurINTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY2，avenue du Pont Pasteur identified at the bottom of this page69367 LYON CEDEX 07NAME AND ADDRESS OF THE PARTYTO WHOM THE VIABILITY STATEMENTIS ISSUED 1Indicate the date of the original deposit or，where a new deposit or a transfer has been made，the most recentrelevant date(date of the new deposit or date of the transfer).
2In the cases referred to in Rule 10.2(a)(ii)and(iii)，refer to the most recent vlability test.
3Mark with a cross the applicable box.
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2In the cases referred to in Rule 10.2(a)(ii) and(iii)，refer to the most recent viabllity test.
3Mark with a cross the applicable box.
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2In the cases referred to in Rule 10.2(a)(ii)and(iii)，refer to the most recent viability test.
3Mark with a cross the applicable box.
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權(quán)利要求
1.預(yù)防登革熱的四價疫苗組合物，其含有保藏在位于巴黎巴斯德研究所中的CNCM，保藏號為I-2480，I-2481，I-2482和I-2483的各減毒株的病毒，其特征在于各血清型的病毒相對量是這樣的，即血清型3的病毒量小于其它血清型的病毒量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中當(dāng)以感染50％細(xì)胞所需的病毒稀釋度的log10表示病毒的滴度時，每一疫苗劑量中，血清型3的病毒量至少小于其它血清型的病毒量1個單位。
3.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其中當(dāng)以感染50％細(xì)胞所需的病毒稀釋度的log10表示病毒的滴度時，每一疫苗劑量中，血清型1的病毒量至少大于其它血清型的病毒量1個單位。
4.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其中每一疫苗劑量中，各血清型1-4的病毒量與下列配比相對應(yīng)3，2，1，2或3，3，1，3，其中的數(shù)字表示感染50％細(xì)胞所需的病毒稀釋度的log10值。
5.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其特征在于以至少1個月的時間間隔將其分開兩次給藥。
6.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其特征在于可將其皮下給藥。
7.病毒組合物在制備預(yù)防登革熱的疫苗組合物中的用途，所述病毒組合物含有保藏在位于巴黎巴斯德研究所中的CNCM，保藏號為I-2480，I-2481，I-2482和I-2483的各減毒株的病毒，其中各血清型的病毒相對量是這樣的，即血清型3的病毒量小于其它血清型的病毒量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預(yù)防登革熱的四價疫苗組合物，其含有保藏在位于巴黎巴斯德研究所中的CNCM，保藏號為I－2480，I－2481，I－2482和I－2483的各減毒株的病毒。本發(fā)明的特征在于各血清型的病毒相對量是這樣的，即血清型3的病毒量小于其它血清型的病毒量。特別是，本發(fā)明涉及一種四價組合物，其中每一接種劑量中，各血清型1－4的病毒量與下列配比相對應(yīng)3，2，1，2或3，3，1，3，其中的數(shù)字表示感染50％細(xì)胞所需的病毒稀釋度的log10值。
文檔編號A61P31/12GK1431913SQ01810409
公開日2003年7月23日 申請日期2001年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月30日
發(fā)明者J·朗, J·F·薩盧佐 申請人:艾文蒂斯巴斯德公司