專利名稱：疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的疫苗配制品，它們的制備方法和其在治療上的用途。具體地說，本發(fā)明涉及治療傳染性肝炎的新配制品和包括一種肝炎疫苗成分的組合疫苗配制品。
由A、B、C、D和E肝炎病毒引起的病毒性肝炎是一種非常普通的病毒病。特別是B和C病毒還引起許多肝癌病癥。因而開發(fā)有效的疫苗是關(guān)鍵的并且盡管有令人矚目的成功都仍然是一個持續(xù)的任務(wù)。包括大量關(guān)鍵參考資料的有關(guān)現(xiàn)代乙肝疫苗的綜述文章可從Lancet(May12th1990atpage1142ff(ProfA.L.W.F.Eddleston))中找到，也可參見“ViralHepatitisandLiverDisease”(Vyas，B.N.Dienstag，J.L.，andHoofnagle，J.H.，eds，GruneandStration，Inc.(1984))和“ViralHepatitisandLiverDisease”(Proceedingsofthe1990InternationalSymposium，edsF.B.Hollinger，S.M.LemonandH.Margolis，PublishedbyWilliamsandWilkins)。
本文中使用的“肝炎抗原”一詞用于指源于可用于誘導(dǎo)對人體病毒具有免疫作用的肝炎病毒的任何抗原物質(zhì)。該肝炎抗原可以是，例如，一種通過重組DNA技術(shù)獲得的鳥肽或者一種肝炎病毒(可以是用公知方法滅活過的或未滅活的)的減毒株。本發(fā)明覆蓋所有肝炎抗原，不管是A、B、C、D還是E，其實施例在下討論。
由肝炎A病毒(HAV)引起的傳染病是一個廣泛的問題，但能用于群體免疫的疫苗是可獲得的，例如從HAV[參見“InactivatedCandidateVaccinesforHepatitisA”byF.E.Andre，AHepburnandE.D′Hondt，ProgMed.Virol.Vol37，pages72-95(1990)和theProductmonograph“Havrix”publishedbySmithKlineBeechamBiologicals(1991)]的HM-175株獲得的被殺滅減毒的疫苗產(chǎn)品“Havrix”(SmithLlineBiologicals)Flehmig(等在上述引文中，pages56-71)回顧了肝炎A的臨床學(xué)。病毒學(xué).免疫學(xué)和流行病學(xué)，并討論了抗該普通病毒傳染病疫苗的研究方法。
本文使用的“HAV抗原”一詞系指能在人體內(nèi)刺激HAV中性抗體的任何抗原。該HAV抗原可包括活的減毒病毒顆?；驕缁畹臏p毒病毒顆粒，或者可以是，例如HAV病毒殼體或可以方便地通過重組DNA技術(shù)獲得的HAV病毒蛋白。
肝炎B病毒(HBV)感染是一個廣泛的問題，但能用于群體免疫的疫苗是可獲得的。例如，由基因工程技術(shù)獲得的產(chǎn)品“Engerix-B”(SmithKlineBeechamplc)。
肝炎B表面抗原(HBsAg)的制備文獻上有較多記載，參見如Harford等在Develop.Biol.Standard54，125頁(1983)上的文章、Gregg等在Biotechnology5，479頁(1987)上的文章、EP-A-0，226，846、EP-A-0，299，108和在其中的參考資料。
本文使用的“肝炎B表面抗原”或“HBsAg”包括表現(xiàn)出HBV表面抗原性的任何HBsAg抗原或其片斷。顯然，除了HBsAgS抗原(參見Tiollais等，Nature，317，489(1985)和其參考資料)的226氨基酸序列外，如需要，本文中所描述的HBsAg還可包括上述參考資料和EP-A-0278940中所描述的全部或部分pre-s序列。具體地說，HBsAg可以包括一種含有接有與ad血清型肝炎B病毒開放讀碼相關(guān)的HBsAg L-蛋白殘基12-52，再接殘基133-145再接殘基175-400的氨基酸序列的多肽(這一多肽被稱為＊L，參見EP 0 414 374)。本發(fā)明范圍內(nèi)的HBsAg也可以包括EP 0 198 474(Endotronics)中描述的pre S1-pre S2-S多肽或其類似物(例如EP 0 304 578(Mc Cormick and jones)中所描述的那些)。本文所說的HBsAg也可指突變體，例如WO 91/14703或公開號為0 511 855 A1的歐洲專利申請中描述的“逃跑突變體”(“escape mutant”)，特別是其145位以精氨酸取代甘氨酸的HBsAg。
通常情況下HBsAg是顆粒形式。這種顆粒可以包括例如單獨的S蛋白，或者可以是組合粒子，例如(L＊，S)，其中L＊是如上定義的，S指HBsAg的S-蛋白。所說顆粒以酵母表達的形式存在是有好處的。
肝炎C病毒(HCV)在GB2212511B和其中的參考資料中專門討論過，已有報道這種疫苗可以源自HCVcDNA的一種或多種致免疫多肽制備。
肝炎D病毒在“ViralHepatitisandLiverDisease”(1990Sym-posium(在上述引文中))中討論過。
肝炎E病毒(HEV)在WO89/12462和其參考資料中專門討論過，疫苗組合物的一個例子包括在藥用佐劑中的源于HEV的重組蛋白或蛋白混合物。
只要是實驗或商業(yè)上可獲得的肝炎疫苗，例如Havix和En-gerix-B要產(chǎn)生突出效果的重要因素在于一種理想的疫苗不僅要刺激中性抗體，還要盡可能有效地刺激通過T-細(xì)胞中介的細(xì)胞免疫，對組合疫苗來說也需要含有一種肝炎成分，以便以這種方式刺激細(xì)胞免疫。本發(fā)明達到了這些目的。
本發(fā)明提供一種含有一種與3-0-脫?；瘑瘟柞Ｖ珹(本文簡稱MPL)連接的肝炎抗原和一種合適載體的疫苗。
3-0-脫?；瘑瘟柞Ｖ珹(或3′脫-0-酰化單磷酰脂A)被正式稱為3D-MPL或d3-MPL，表示還原末端葡糖胺的3位是脫-0-?；?。其制備方法參見GB 2，220，211A，從化學(xué)上來說，它是3-脫?；瘑瘟姿嶂珹與4，5或6?；湹幕旌衔?。本文中術(shù)語3D-MPL(或d3-MPL)被簡稱為MPL，因為“MPL”是Ribi Immunochem.，Montana公司的注冊商標(biāo)，被該公司用來明確表示它們的3-0-脫酰單磷酰脂A產(chǎn)品。
GB2220211A提到預(yù)先使用腸肝菌酯多糖(LPS)當(dāng)其致免疫部分被保留時，其內(nèi)毒性被降低。然而GB2220211僅在與細(xì)菌(革蘭氏陰性)系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)中引證這一發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明之前3-脫?；瘑瘟姿狨適于作為含有肝炎病毒抗原的疫苗的佐劑從未提及。
然而，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)按照本發(fā)明的含有肝炎病毒抗原的疫苗組合物具有優(yōu)異的本文所描述的性質(zhì)。
本發(fā)明疫苗配制品的一個優(yōu)點是即使在抗原很低劑量下也非常有效地誘導(dǎo)保護性免疫。
它們提供抗原發(fā)性感染的優(yōu)良保護，并且有利地刺激兩種特異體液(中性抗體)和效應(yīng)細(xì)胞中介(DTH)免疫應(yīng)答。
按照本發(fā)明的疫苗組合物另一個重要優(yōu)點是也可用作治療疫苗。
在每個劑量中，如上定義的MPL一般以10-100μg，優(yōu)選的是25-50μg的范圍存在，其中的肝炎抗原一般以每劑2-50μg的范圍存在。
載體可以是一種水包油型乳劑，一種脂質(zhì)載體或明礬(鋁鹽)。
在水包無毒性油乳劑中，優(yōu)選的包括一種在一種含水載體中的無毒性油例如角鯊烯和乳化劑例如Tween80。該含水載體可以是例如磷酸鹽緩沖鹽水。
本發(fā)明的一個實施方案是HAV抗原(例如在Havrix中)與MPL和氫氧化鋁的滲合物(如下在所描述的)。
本發(fā)明的另一個實施方案是HBsAgS抗原(例如在Engerix-B中)與MPL和氫氧化鋁的滲合物(如下面所描述的)。
本發(fā)明的另一個具體實施方案是如上定義的(L＊，S)顆粒形式的HBsAg抗原與MPL和氫氧化鋁的滲合物。
在上面的實施方案中，水包油乳劑可用以代替明礬。
其它實施方案在下面以實施例的形式給出。
本發(fā)明另一方面提供了本文所描述的疫苗配合物在醫(yī)療治療方面的用途，尤其是在治療或預(yù)防肝炎病毒感染方面的用途，按照本發(fā)明的疫苗的一個優(yōu)點是，它是一種對于治療染上肝炎傳染病，特別是肝炎B和/或肝炎C傳染病的病人有用的治療疫苗。
從所獲得的意外的效果來看，本發(fā)明的另一個優(yōu)點是提供了一種用于治療或預(yù)防肝炎A和/或B傳染病的疫苗組合物。
本發(fā)明的疫苗組合物最好含有其它抗原使其有效于治療或預(yù)防一種或多種其它細(xì)菌、病毒或真菌感染是有好處的。
因此，本發(fā)明的肝炎疫苗配制品較好是含有選自本領(lǐng)域公知的非肝炎抗原至少一種成分，以便具有預(yù)防下列一種或多種的預(yù)防作用白喉、破傷風(fēng)、百日咳、流感嗜血肝菌b(Hib)和骨髓灰質(zhì)炎。
按照本發(fā)明的較好的疫苗包括上文定義的HBsAg。
在本發(fā)明范圍內(nèi)的特定組合疫苗包括DTP(白喉-破傷風(fēng)-百日咳)-肝炎B組合疫苗配制品，Hib-肝炎B疫苗配制品、DTP-Hib-肝炎B疫苗配制品和IPV(滅活骨髓灰質(zhì)炎疫苗)-DTP-Hib-肝炎B疫苗配制品。
上述組合物可有益地包含一種預(yù)防肝炎A，特別是源于存在于Havrix中的HM-175株的殺滅減毒株成分。
用于這些疫苗的合適成分是商業(yè)上可獲得的，詳情可從世界衛(wèi)生組織獲得。例如IPV組分可以是Salk滅活骨髓灰質(zhì)炎疫苗。百日咳疫苗可以由全部細(xì)胞或非細(xì)胞產(chǎn)品組成。
按照本發(fā)明的肝炎或組合疫苗，一種兒科疫苗是有益的。
疫苗的制備在NewTrendsandDevelopmentsinVaccines(編者Voller等，UniversityParkPress，Baltimore，MarylandU.S.A.1978)一書中被全面描述。在脂質(zhì)體內(nèi)的內(nèi)膠囊(例如被Fullerton，US專利4，235，877描述。蛋白質(zhì)與大分子的軛合被例如Likhite，US專利4，372，945和Armor等US專利4，474，757描述。
每劑疫苗中抗原的量可選擇成為一種能在普通接受疫苗者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫預(yù)防應(yīng)答且無明顯的副作用的量。這種量將根據(jù)所使用的致免疫原而變化。一般來說希望每劑含有1-1000μg總的致免疫原，優(yōu)選是2-100μg，最好是4-40μg。對一種特定疫苗的最適宜的量可根據(jù)有關(guān)在受試者中的抗體滴度和其它應(yīng)答觀察的標(biāo)準(zhǔn)研究來確定。開始接種之后，受治療者在約4周后可接受一種輔助藥劑。
本發(fā)明另一方面提供了制造預(yù)防和治療肝炎傳染病有效的疫苗的方法，該方法包括將本文所定義的肝炎抗原與一種載體和MPL混合。
較好的是運用這種方法將一種和多種其它成分與HBsAg混合以提供最適宜兒科使用的組合疫苗。
下列實施例說明本發(fā)明和其優(yōu)點。
實施例1肝炎B疫苗配制品從RibiImmunochemResearchInc.獲得MPL，從Superfos(Alhydrogel)獲得氫氧化鋁。
為了以0.2-1mg/ml濃度注射，把MPL在水溶中通過聲處理直至顆粒達到80-500nm大小(以光相關(guān)光擴散(photocorrelationlightScatering)測定)在水中重新懸浮。
在室溫和攪拌下，1-20μg HBsAg(以Engerix B形式的S-抗原)在磷酸鹽緩沖溶液(1mg/ml)中被30-100μg氫氧化鋁(10.38 Al3+mg/ml溶液)吸附1小時。加入30-50μg DMPL(溶液1mg/ml)到上述溶液中。為用于注射，用水調(diào)節(jié)體積和滲透性至600μl，磷酸鹽緩沖液濃縮5倍，在室溫下培養(yǎng)溶液1小時，在室溫下保存直至應(yīng)用。貯藏使配制品熟化，這要產(chǎn)生了用于在鼠中試驗的10個注射劑。
可通過用以上定義的組合(L＊，S)抗原代替HBsAg組分制備一種相似配制品。
實施例2肝炎A疫苗配制品從RibiImmunochemResearchInc.獲得MPL，從Superfos(Alhydrogel)獲得氫氧化鋁。
將HAV(每劑360-22EU)被預(yù)吸附到10%的氫氧化鋁終濃度中(0.5mg/ml)，將MPL(每劑12.5-100μg)加到溶液中。
剩下的氫氧化鋁加到溶液中，在室溫下保留1小時。用磷酸鹽緩沖鹽水(磷酸鹽10mM，NaCl150mM)調(diào)節(jié)體積，最終配制品在4℃貯存，直至使用。
實施例3組合疫苗配制品-肝炎B+肝炎A將HBsAg吸附到氫氧化鋁終量的90%上，(0.5mg/ml)在室溫下保溫過夜。PH調(diào)至6.2，制備物在室溫下保留14天，使其熟化。
以HM-175株(以Havrix形式)的滅活衍生物形式將肝炎A抗原以每劑360-22uE，吸附到10%氫氧化鋁終濃度上(0.5mg/ml)。然后將剩下的氫氧化鋁在室溫和攪拌下加到溶液中并保留1小時。
將吸附到氫氧化鋁上的HAV加到HBsAg配制品中。
以每1ml藥物12.5-100μg的終濃度把MPL加到HAV/HBsAg溶液中。體積調(diào)至最終藥劑體積，將配制品貯存在4℃下直至使用。
實施例4含有附加抗原的組合疫苗加入一種或多種所期望的抗原到以上實施例1、實施例2或?qū)嵤├?所描述的配制品中制備含有DTP、IPV、Hib或非細(xì)胞的或全細(xì)胞的百日咳抗原的組合疫苗。
實施例5用HBsAg與氫氧化鋁和MPL配制品進行的鼠免疫的體液免疫的增加和細(xì)胞間質(zhì)免疫的誘導(dǎo)。
A.Al(OH)3+MPL在抗HBs抗體誘導(dǎo)中的作用經(jīng)皮下或經(jīng)真皮內(nèi)用以MPL為佐劑的、吸附在Al(OH)3上的重組HBsAg免疫Balb/c鼠。用HBsAg/Al/MPL配制品使鼠兩次免疫，在第一次和第二次用藥后測定抗體應(yīng)答。用ELISA或AUSAB藥盒(Abbott Lab，Ill.)測定總Ig，并且特別注意IgG2a同型抗體的誘導(dǎo)作用，因為這種同型主要被g-干擾素的分泌誘導(dǎo)。這樣，這種同型的誘導(dǎo)作用間接地反映細(xì)胞中介免疫的激活，稱為Thl激活。
HBsAg/MPL比率以及MPL粒子的大小已被研究，因為MPL在水中的懸浮產(chǎn)生＜100nm或＞500nm的粒子。實驗I-MPL(＞500nm)劑對吸附在Al(OH)3上的重組HB-sAg，致免疫性的影響。
由10個雌性Balb/c成為一組的幾組鼠經(jīng)皮下注射2.5mcg吸附在50mcg Al3+(以Al(OH)3形式)上的重組HBsAg和粒子大?。?00nm的遞增量的MPL(3.1到50mcg)，間隔2周注射兩次100mcl體積。鼠在第一次注射后兩周(部分放血)和加強劑量后一周被放血。通過ELISA用重組HBsAg作俘獲抗原測定總的抗-HBsIgG和特異IgG2a。滴度用相當(dāng)于50%最大體積稀度的倒數(shù)(中點釋放)表示。結(jié)果在表1中顯示。它們表明隨著MPL劑量的增加(特別是劑量從12.5-50mcg)，特異IgG和IgG2a兩者都增加。這種作用在第一和第二應(yīng)答中均可被看到，并且IgG2a特別明顯(增加高達20倍)這間接表明用MPL免疫誘導(dǎo)了g-干擾素的分泌。
實驗Ⅱ-含有或不含有MPL(＞500nm)的吸附重組HBsAg臨床組的比較制備3個臨床組的吸附在Al(OH)3上的重組HBsAg∶DSAH16組不含有MPL，作為對照，DSAR501和502用相似的方法制備(20mcg重組HBsAg吸附在以Al(OH)3形式存在的0.5mgAl3+上)，但含有50mcg MPL(＞500nm)。
將該3組制劑間隔兩周兩次皮下注射到10個鼠為一組的幾組鼠(200mcl含有2.5mcg HBsAg，100mcg Al3+和6.25mcg MPL)。第14天和在加強劑量后1周被放血。抗-HBs抗體使用AUSAB藥盒測定。用in-house ELISA測定IgG或IgG2a。結(jié)果示于表2。它們說明，在第一次注射后兩周，含有MPL的2組明顯誘導(dǎo)抗-HBs應(yīng)答(12.4和41.9mIU/ml)，而不含有MPL和那組僅誘導(dǎo)邊緣應(yīng)答(0.75mIU/ml)，帶有MPL的應(yīng)答者數(shù)目也較多(9/10和9/10，而無MPL的為1/10)。加強劑量后MPL的使用被確認(rèn)，因從DSAR501和502組獲得的滴度比從無MPL觀察到的高出約6倍。
它表明，至少在鼠中，MPL(＞500nm)能改進抗-HBs應(yīng)答的動力學(xué)和抗-HBs應(yīng)答的水平。當(dāng)在用DSAH16(無MPL)和DSAR502(含MPL)免疫后測定特異IgG和IgG2a時確認(rèn)了這些結(jié)果當(dāng)存在MPL時，抗-HBs IgG滴度高5(首次應(yīng)答)和3(第2次應(yīng)答)倍。
對于IgG2a應(yīng)答，至少在第2次用藥后，MPL的作用更明顯，說明IgG2a的一種優(yōu)先誘導(dǎo)作用。這時掃反映出通過含MPL制劑引起的細(xì)胞中介免疫(g干擾素的分泌)的激活作用。
實驗Ⅲ-MPL(＜100nm)藥劑對吸附在Al(OH)3上的重組HBsAg免疫性的影響由于＜100nm粒子較＞500nm粒子MPL更容易用復(fù)制方法獲得，因而研究了＜100nm MPL粒子對預(yù)先吸附在Al(OH)3上的重組HBsAg的免疫性的影響。
10支鼠的各組(Balb/c，雌性，7周齡)皮下注射1mcg吸附在50mcg Al3+(以Al(OH)3形式)上重組HBsAg和遞增量(3.1-25mcg)的MPL(＜100nm)。以2周的間隙給鼠兩次注射200mcl體積。在它們第一次注射后兩周和在加強劑量后1周被放血。在收集的血清上用ELISA(總Ig，IgG，IgG2a)估介抗-HBs應(yīng)答。滴度以中點稀度(給出最高值的50%稀度的倒數(shù))表示，結(jié)果表明，少至3.1mcg的MPL顯著誘導(dǎo)了首次和第二次應(yīng)答的抗體應(yīng)答增加。當(dāng)使用高劑量的MPL(25mcg)時，在6.25mcg應(yīng)答達到頂點，然后降低到類似無MPL時所見到的。對IgG，IgG2a和總IgG來說，其抗體應(yīng)答格式類似。這與從大顆粒MPL(＞500nm)(參見實施例1)獲得的結(jié)果相反，說明MPL的小尺寸粒子(＜100nm)較大尺寸粒子(＞500nm)更有效(至少對體液免疫而言)，因較少的MPL可期望獲得最大的作用。在幾個實驗中證實了小尺寸MPL的最大活性。
如有關(guān)大尺寸RMRL(＞500nm)結(jié)果所示，MPL對IgG2a的佐劑作用比對總IgG或Ig要高。在第二次應(yīng)答(6.25mcgMPL)最大作用時，對IgG2a來說增加25倍，而對IgG或總Ig來說分別增加7.6和4.3倍。
B.通過吸附在Al(OH)3上的重組HBsAg的細(xì)胞中介免疫的誘導(dǎo)作用-MPL的影響如果體液免疫足以預(yù)防肝炎B，那么細(xì)胞中介免疫(CTL，Thl)的誘導(dǎo)對這種病的治療來說會特別重要。
然而仍需要治療疫苗的新的配制品，因Al(OH)3能改進體液免疫而不能改進細(xì)胞中介免疫。
我們研究了MPL對用吸附在Al(OH)3上的重組HBsAg免疫的Balb/c鼠中能分泌IL-2和g-(即γ干擾素)的Thl細(xì)胞的誘導(dǎo)作用的影響。
實驗I-MPL(＞500nm)對于用吸附了HBsAg的Al(OH)3免疫后的Balb/c鼠的Thl細(xì)胞誘導(dǎo)作用的影響10支Balb/c鼠組(雌性，5周齡)每支腳掌注射含10mcg HBsAg，15mcg Al3+(以Al(OH)3形式)和15mcg MPL30mcl進行免疫。對照鼠類似地注射相同量的與FCA混合的重組HBsAg(正對照)或無MPL吸附在Al(OH)3上的重組HBsAg(負(fù)對照)。
免疫后6天，處死鼠，移出腘淋巴節(jié)。淋巴節(jié)細(xì)胞(LNC2.105/ml)在用1%陰性鼠血清和含有5mcg/ml重組HBsAg補充的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時間(24小時到74小時)。培養(yǎng)終止后，測定分泌到培養(yǎng)基中的IL-2，INF-g和IL-4。由刺激IL-2-依賴CTL系(VDA2細(xì)胞)增殖(由3H-胸苷摻入估計)的能力估計IL-2，滴度以刺激指數(shù)(SI＝在被刺激細(xì)胞中摻入的3H-胸苷的量/在未被刺激細(xì)胞中摻入的3H-胸苷的量)表示。使用市售ELISA藥盒(Holland Biotechnology for IFN-g和Endogen for IL-4)測定IL-4和INF-g的量。滴度用IFNpg-Ag/ml表示。
結(jié)果表明，或用吸附在Al(OH)3上的HBsAg免疫鼠得來的LNC沒有分泌有效量的IL-2，IL-4或INF-g。相反，高水平的IL-2(在48小時時I，S＝38)，和從用吸附在Al(OH)3上的HBsAg+MPL免疫鼠得來的LNC分泌顯著量的INF-g。這種分泌類似于(INF-g)或高于(IL-2)從以HBsAg+FCA免疫鼠觀察到的值和早期發(fā)生的體外分泌。
甚至在MPL存在下用吸附在Al(OH)3上的HBsAg免疫后，沒檢測出IL-4。
這種分泌情形說明，這種特異Th1細(xì)胞(IL-2，INF-g)在有MPL存在時已被用吸附在HBsAg免疫誘導(dǎo)，而無MPL出現(xiàn)時不被誘導(dǎo)。然而，在這種免疫條件下沒有檢測到Th2(IL-4)。
實驗Ⅱ-MPL(＜100nm)劑量對用吸附在重組HBsAg上的Al(OH)3免疫后的Balb/c鼠的Th1細(xì)胞的誘導(dǎo)作用的影響。
5支Balb/c鼠組在其2個腳掌的每一支用30mcl含有10mcg吸附在15mcg Al3+(以Al(OH)3形式)上的重組HBsAg和遞增量的MPL(100nm，0-15mcg)免疫。
注射后6天;處死鼠，將腘淋巴結(jié)細(xì)胞(LNC)以2.106細(xì)胞/ml在有5mcg/ml重組HBsAg存在下在用1%陰性鼠血清添補的RPMI中培養(yǎng)不同時期(24小時到96/25)。
通過VDA2細(xì)胞增殖的刺激作用測定IL-2的分泌。IL-2的濃度以刺激指數(shù)(SI)表示，用市售藥盒測定INF-g的分泌并以pg/ml表示。
可發(fā)現(xiàn)IL-2的分泌隨較低劑量的MPL(7.5mcg)明顯增加，在MPL為15mcg時獲得最大作用。
IL-2的分泌一般在24小時時較在48小時或72小時時更重要。
當(dāng)在無MPL存在HBsAg被吸附在Al(OH)3上時，無INF-g分泌。小劑量的(7.5mcg)MPL誘導(dǎo)INF-g的分泌和再分泌，MPL為15mcg時獲得最大效應(yīng)。與有關(guān)IL-2觀察到的相反，INF-g在培養(yǎng)中延遲分泌，并且隨時間增加直至96小時。
這些數(shù)據(jù)結(jié)合起來表明，當(dāng)與吸附在Al(OH)3的HBsAg結(jié)合時MPL(100nm)是Thl的一種強烈的誘導(dǎo)劑。
C.結(jié)論含有吸附在Al(OH)3上的HBsAg和MPL的配合物對Balb/c鼠的體液和細(xì)胞中介免疫兩者的誘導(dǎo)作用的影響已被研究。結(jié)果表明，MPL明顯改進抗-HBs應(yīng)答的動力學(xué)因在首次和第二次兩次免疫后發(fā)現(xiàn)了更多的抗-HBs抗體?？?HBs的質(zhì)量也被改進，以及觀察到的IgG2a的優(yōu)先誘導(dǎo)作用，直接反映INF-g的分泌和被調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)作用。
Thl細(xì)胞被含HBsAg、Al(OH)3和MPL的配制品誘導(dǎo)的直接估價明顯表明MPL是分泌IL-2和INF-g兩者的Thl細(xì)胞的強烈誘導(dǎo)劑。這種配制品在治療疫苗的發(fā)展上是重要的。
對于上述實驗的結(jié)果，參見下面的表1到6。
實驗例6.
作為HBsAg佐劑的MPL的臨床應(yīng)用-初步結(jié)果研究MPL-HBV-002(進行性)本研究在年輕健康未接觸抗原的成年自愿者中比較了HB-sAg-MPL與Engerix-B末端-致免疫性抗-HBs抗體應(yīng)答高度-抗-HBs抗體應(yīng)答動力學(xué)-被兩種疫苗(體外和體內(nèi))誘導(dǎo)的細(xì)胞中介免疫。
-Reactogenicity，毒性和安全性材料和方法a)疫苗HBsAg(在EngerixB中)礬MPLI20μg500μg50μgII20μg500μg無b)人群＊健康成年志愿者，年齡在18到30歲之間。
＊他們必須對HBV標(biāo)記陰性，必須沒接種過預(yù)防肝炎B的疫苗。
c)設(shè)計-雙盲，隨機取樣研究-接種疫苗的時間安排0，1，6月-隨后直到12月-取血樣＊在每一次接種疫苗前后7天、15天、30天進行抗-HBs抗體試驗。
＊在每次用藥之前和后2天估測生物化學(xué)和血液病學(xué)參數(shù)。
＊在首次接種疫苗期間和加強劑之前和之后取出供估價細(xì)胞中介免疫的血樣。
-Reactogenicity主要目標(biāo)是在每日卡片上記載接種疫苗當(dāng)天和接下來的7天期間在局部和整體上所出現(xiàn)的標(biāo)記和癥狀。
結(jié)果第二次用藥后直到2個月的結(jié)果在下面給出。
人群共29個受試者表示同意，但僅27個(15個男性和12個女性)進入判斷標(biāo)準(zhǔn)，15個受試者被分到Ⅰ組，12個受試者被分到Ⅱ組。其平均年齡為22歲。
安全性沒有嚴(yán)重的不適感覺被報道，沒有受試者從研究中退出或不得不退出。沒觀察到血液病學(xué)或生物化學(xué)參數(shù)臨床明顯改變。局部和全身性體癥和癥狀的發(fā)生率和嚴(yán)重程序在兩個疫苗組中相似。
致免疫性測定抗-HBs抗體滴度直至第90天，即第二次用藥后2個月。在開始呈血清陰性的受試者中出現(xiàn)抗體時確定血清轉(zhuǎn)化率(SC，以%表示)。
血清保護率被定義為具有保護性抗-HBs抗體滴度的百分率。如果用GMTs在兩組之間可比較的抗體應(yīng)答幅度上沒有明顯不同，則應(yīng)答的動力學(xué)是不同的，并且含有MPL的疫苗具有明顯優(yōu)點。事實上，在第2次用藥7天后，93%和80%的接受MPL-HBV疫苗的受試者血清轉(zhuǎn)化并分別被保護，而在Engerix-B組中為95%的血清轉(zhuǎn)化率和58%血清轉(zhuǎn)化率。這種不同一直保持到第二次用藥后兩個月，并且血清轉(zhuǎn)化率非常明顯。這表明所有接受MPL-HBV疫苗的受試者都得到保護，而用礬佐劑疫苗免疫的受試者僅58%得到保護。
研究MPL-HBV-003(進行性)材料和方法與MPL-HBV-002研究中的那些類似(見上)免疫時間安排上不同
組受試者數(shù)疫苗時間I25MPL-HBsAg/礬0-2月II25Engerix-B0-2月III25MPL-HBsAg/礬0-6月IV25Engerix-B0-6月結(jié)果盡管抗-HBs抗體應(yīng)答的動力學(xué)與前面研究的并不緊密相關(guān)，但表現(xiàn)出從本研究可得出相同的結(jié)論。那些接受MPL佐劑疫苗的受試者第二次用藥后應(yīng)答較那些用無MPL疫苗注射的受試者要好。除一個外的所有受試者(95.8%)在MPL-HBV疫苗第二次用藥后具有保護性滴度，而Engerix-B組只有72.7%。而且，與前面的試驗不同，MPL-HBV疫苗似乎誘導(dǎo)較Engerix-B更高的抗體滴度(分別為214和72mIU/ml)，說明在兩次用藥之間的間隔更長可能是重要的。
結(jié)論在這兩個研究中，按照不同的時間安排，在健康成年志愿者中估價了佐以MPL的肝炎B疫苗(含有在EngerixB中的HB-sAg和礬)，并與Engerix-B(HBsAgs-抗元與礬組方)比較。如果第一次用藥后在兩種藥劑之間在致免疫性上看上去沒有不同，MPL-HBV疫苗在第二次用藥后顯示出明顯優(yōu)勢，特別是更高百比數(shù)的受試者具有保護性抗體滴度，當(dāng)兩種藥劑在兩個月間隙(而不是一個月間隙)給藥時，這一組中GMTs也較高。
這能說明當(dāng)MPL加到抗原上時，應(yīng)答達到較佳狀態(tài)。因而這種疫苗在對肝炎B疫苗接種有緩慢和低的應(yīng)答者中有重大價值，例如對老年人或受免疫損害的人。
顯示了上述實驗的結(jié)果的表見于下表7-9。
實施例7肝炎A-MPL在鼠中的研究下列實驗說明MPL加到肝炎A中的疫苗具有有益的作用這一點反映在較低的ED50-值(劑量，以ELISA單位-EU-表示，它給出了被注射動物的50%的血清學(xué)應(yīng)答)上。
方法給NMRI鼠注射1劑含有與不同濃度MPL(0-1，5-6-12.5μg/劑)的360-120-40-13.3EU/劑結(jié)合的實驗HAV疫苗。接種后28天取血樣，血清用于HAVAB試驗(使用20%切斷(cutoff)，計算ED50(以EU表示)和相當(dāng)于誘導(dǎo)50%被試動物血清學(xué)應(yīng)答的劑量。
結(jié)果結(jié)果總結(jié)在下表中，不含MPL的疫苗的ED50值為123.7EU，而含有1.5μgMPL/劑的疫苗ED50為154，較高劑量的MPL具有有益的作用(ED50在較低EU值下被觀察到)。在12.5μgMPL/劑，觀察到的ED50為47.1EU。
結(jié)論合適量的MPL與HAV的組合疫苗在鼠藥效試驗0-6個月中改善這種疫苗的性能。
表MPL加到肝炎A疫苗中的作用加到HAV疫苗中MPL的劑量(μg/劑)ED50(EU/劑)0123.71.51546101.112.547.1表1MPL(＞500nm)增加劑量對吸附在Al(OH)3的重組HBsAg的致免疫性的影響
＊在Al上的HBsAg
表23組含有或不含有MPL的臨床藥劑AUSAB應(yīng)答的比較
表32份含有或不含有MPL(＞500nm)的臨床藥劑抗-HBsIgG和IgG2A應(yīng)答的比較
表4MPL(＜100nm)劑量對吸附在Al(OH)3上的重組HBsAg致免疫性的影響
權(quán)利要求
1.一種疫苗組合物，它含有一種與3-0-脫?；瘑瘟姿嶂珹連接的肝炎抗原和一種合適載體。
2.一種如權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中的載體是明礬。
3.一種如權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中的載體是一種水包油乳劑或其它脂質(zhì)基載體。
4.一種如上述任一權(quán)利要求的疫苗組合物，其中的肝炎抗原是一種抗肝炎A的抗原。
5.一種如權(quán)利要求4的疫苗組合物，其中的肝炎A抗原是一種源于HM-175株的滅活的全細(xì)胞組合物。
6.一種如權(quán)利要求1-3的任一疫苗配制品，其中的肝炎抗原是一種抗肝炎B的抗原。
7.一種如權(quán)利要求6的疫苗組合物，其中的抗原包括肝炎B表面抗原(HBsAg)或其突變體。
8.一種如權(quán)利要求7的疫苗組合物，其中的HBsAg包括HBsAg的S抗原(226個氨基酸)。
9.一種如權(quán)利要求8的疫苗組合物，其中的HBsAg還包括一個Pre-S序列。
10.一種如權(quán)利要求8或9的疫苗組合物，其中的HBsAg是通式為(L＊，S)的組合粒子，其中L＊指肝炎B病毒的具有L蛋白質(zhì)的殘基12-52，再接殘基133-145的殘基175-400的氨基酸序列的修飾L-蛋白質(zhì)，S指HBsAg的S-蛋白質(zhì)。
11.一種如權(quán)利要求6-10的任一疫苗組合物，還包括一種肝炎A抗原。
12.一種如上任一權(quán)利要求的疫苗組合物，它含有一種或多種肝炎抗原和選自具有預(yù)防白喉、破傷風(fēng)、百日咳、流感嗜血肝菌B(Hib)和骨髓灰質(zhì)炎中一種和多種的預(yù)防作用的非肝炎抗原的至少一種其它組分。
13.一種如權(quán)利要求12的疫苗組合物，它選自DTP(白喉-破傷風(fēng)-百日咳)-HBsAg組合、Hib-HBsAg組合、DTB-Hib-HBsAg組合和IPV(滅活骨髓灰質(zhì)炎疫苗)-DTP-Hib-HBsAg組合。
14.一種如權(quán)利要求12的疫苗組合物，還包含肝炎A抗原。
15.一種如權(quán)利要求1-3的任一疫苗組合物，其中的肝炎抗原是抗肝炎C或肝炎D或肝炎E的抗原。
16.一種如上述任一權(quán)利要求的疫苗組合物其中的3-0-脫?；瘑瘟柞Ｖ珹的含量范圍是每劑10μg-100μg。
17.一種用作醫(yī)藥的本權(quán)利要求書中的一種疫苗組合物。
18.與3-0-脫?；瘑瘟柞Ｖ珹連接的肝炎抗原在制造用于預(yù)防和治療肝炎傳染病的藥物上的用途。
19.一種治療患有肝炎傳染病和對肝炎傳染病敏感的人患者的方法，包括使用有效量的按照權(quán)利要求1-16的任一疫苗。
20.一種治療患有進行性肝炎傳染病人患者的方法，包括使用有效量的按照權(quán)利要求1-16的任一治療疫苗。
全文摘要
提供了一種用于治療或預(yù)防肝炎，尤其是肝炎B的疫苗配方，包括肝炎抗原和一種合適載體(例如膠)以及3-O-脫?；瘑瘟柞ｕ。也描述了包括所說疫苗配方的組合疫苗。
文檔編號G01N33/00GK1085805SQ9310523
公開日1994年4月27日 申請日期1993年3月26日 優(yōu)先權(quán)日1992年3月27日
發(fā)明者N·M·-J·C·加康-約翰遜, P·豪澤, C·蒂里阿特, P·沃埃特 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司