專利名稱：Adamts－1蛋白質(zhì)的使用和聚集蛋白聚糖酶活性調(diào)節(jié)劑的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制造用于治療和預(yù)防軟骨重塑異常引發(fā)疾病的醫(yī)藥品時(shí)ADAMTS-1蛋白質(zhì)的使用以及聚集蛋白聚糖酶活性調(diào)節(jié)劑的篩選方法。
ADAM家族即具有單鏈蛇毒多肽結(jié)構(gòu)域和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)群，其核酸和氨基酸序列與蛇毒的單鏈蛇毒多肽以及金屬蛋白酶的核酸和氨基酸序列非常相似(J.Cell Biol.，131，275-278，1995；Cell，90，589-592，1997；Immunol.Today，278，278-284，1999)。發(fā)現(xiàn)ADAM家族時(shí)，認(rèn)為單鏈蛇毒多肽結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞間的相互作用起著非常重要的作用(Nature，356，248-252，1992；Nature，377，652-656，1995)，根據(jù)后來的研究，確認(rèn)ADAM家族的細(xì)胞膜結(jié)合型金屬蛋白酶活性具有切斷像腫瘤壞死因子α(TNFα)的前體和果蠅(Drosophila)6蛋白質(zhì)那樣的、存在于細(xì)胞表面的各種蛋白質(zhì)，并將它們從細(xì)胞表面放出的活性(Nature，385，729-733，1997；Nature，385，733-736，1997；Science，283，91-94，1999)。
ADAMTS-1蛋白質(zhì)為屬于ADAM家族的蛋白質(zhì)，具有一個(gè)reprolysin型的間質(zhì)蛋白金屬酶(MMP)結(jié)構(gòu)域，三個(gè)血小板反應(yīng)素(TSP)1型基序結(jié)構(gòu)。從在體外能夠引起惡性腫瘤的大腸致癌菌株colon26中離析得到了ADAMTS-1基因(J.Biol.Chem.，272，556-562，1997；Genomics，46，466-471，1997)。ADAMTS-1蛋白的TSP1型基序與肝素結(jié)合，ADAMTS-1蛋白質(zhì)則進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)并存在其中(J.Biol.Chem.，273，13912-13917，1998)。認(rèn)為MMP結(jié)構(gòu)域具有蛋白質(zhì)分解酶活性(J.Biol.Chem.，274，18821-18826，1999)。本發(fā)明者根據(jù)以前的研究，確認(rèn)ADAMTS-1蛋白質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合型金屬蛋白酶，能夠結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸化葡糖胺多糖。
進(jìn)一步得知在人的關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)炎組織中檢測(cè)到了ADAMTS-1基因的表達(dá)(J.Biol.Chem.，274，23443-23450，1999；Biochem.Biophys.Res.Comm.，260，318-322，1999)。
聚集蛋白聚糖是存在于關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)中的主要的蛋白多糖，其核心蛋白質(zhì)被硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素葡糖胺多糖所修飾。通過這種修飾向軟骨組織中提供水分，賦予柔軟性。(FASEB J.，6，861-870，1992；Trend.Cell Biol.，5，458-465，1995)。
聚集蛋白聚糖有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，即由N末端的球狀結(jié)構(gòu)域(G1和G2)、葡糖胺結(jié)合區(qū)域、以及C末端球狀結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域(G3)組成(J.Biol.Chem.，262，17757-17767，1987)。這些聚集蛋白聚糖作為各自獨(dú)立的單體通過G1結(jié)構(gòu)域與透明質(zhì)酸結(jié)合。以聚集蛋白聚糖聚集體的形式留在軟骨間質(zhì)中。
已知關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致軟骨破壞時(shí)，聚集蛋白聚糖的球狀結(jié)構(gòu)域中的2個(gè)特定部位被切斷造成軟骨組織損失大量的聚集蛋白聚糖。發(fā)生上述切斷的部位是第341位的天冬酰胺殘基和第342位苯丙氨酸殘基之間(Asn341-phe342)、第373位谷氨酸殘基和第374位丙氨酸殘基之間(Glu373-Ala374)，稱切斷后者Glu373-Ala374鍵的酶為聚集蛋白聚糖酶(J.Biol.Chem.，266，8683-8685，1991；Biochim.J.，284，589-593，1992；J.Biol.Chem.，274，23443-23450，1999；J.Biochem.，126，449-455，1999)。
在軟骨和軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中(J.Biol.Chem.，266，8683-8685，1991；Biochim.J.，284，589-593，1992；Arch.Biochem.Biophys.，322，22-30，1995；J.Biol.Chem.，270，2550-2556，1995)以及各種關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑液中檢測(cè)出切斷Glu373-Ala374鍵而產(chǎn)生的分解物(J.Clin.Invst.，89，1512-1516，1992；Arthritis Rheum.，9，1214-1222，1993；J.Clin.Invst.，100，93-106，1997)。這樣一來認(rèn)為聚集蛋白聚糖酶在關(guān)節(jié)炎的軟骨破壞中起到重要的作用，已知當(dāng)聚集蛋白聚糖酶的活性亢進(jìn)時(shí)能夠引起各種關(guān)節(jié)炎疾病(例如慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕痛、變形性關(guān)節(jié)癥、干癬性關(guān)節(jié)炎、全身性硬化癥、全身性紅斑、以及關(guān)節(jié)損傷)。另外，聚集蛋白聚糖酶活性的亢進(jìn)，能夠引起腦梗塞時(shí)的組織損傷。
另外，已知聚集蛋白聚糖酶的活性低下，能夠引起軟骨的重塑(即、軟骨的破壞和再生)異常。軟骨的重塑異常導(dǎo)致的疾病已知有，例如軟骨形成不全癥或者肥大性骨關(guān)節(jié)炎癥。
在這種狀況下，本發(fā)明者在深入研究人ADAMTS-1蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的功能的過程中，新發(fā)現(xiàn)ADAMTS-1蛋白質(zhì)具有聚集蛋白聚糖酶活性。
利用本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的ADAMTS-1蛋白質(zhì)聚集蛋白聚糖酶活性，可以使軟骨的重塑異常正?；约爸委熁蝾A(yù)防由于軟骨的重塑異常引起的疾病。此外，使用ADAMTS-1蛋白質(zhì)可以篩選能夠調(diào)節(jié)(促進(jìn)或者阻礙)聚集蛋白聚糖酶活性的化合物。通過此篩選得到的聚集蛋白聚糖酶活性調(diào)節(jié)劑中，聚集蛋白聚糖酶活性促進(jìn)劑可以用于治療或者預(yù)防聚集蛋白聚糖酶活性低下引發(fā)的疾病，例如軟骨重塑異常導(dǎo)致的疾病。此外，聚集蛋白聚糖酶活性抑制劑可用于聚集蛋白聚糖酶活性亢進(jìn)引起的疾病的治療或者預(yù)防。例如軟骨破壞引起的疾病。本發(fā)明是基于此發(fā)現(xiàn)完成的。
因此，本發(fā)明提供ADAMTS-1蛋白質(zhì)的新用途，提供軟骨重塑異常引發(fā)疾病的治療和預(yù)防用醫(yī)藥組合物、軟骨重塑異常的正常化用醫(yī)藥組合物以及聚集蛋白聚糖分解用醫(yī)藥組合物，并且提供能夠篩選用于治療或者預(yù)防由于聚集蛋白聚糖酶的活性低下或者亢進(jìn)導(dǎo)致疾病的聚集蛋白聚糖酶活性調(diào)節(jié)劑的方法。
此外，本發(fā)明涉及在軟骨重塑異常的正?；冕t(yī)藥品的制造時(shí)，ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體的使用。
此外，本發(fā)明涉及在聚集蛋白聚糖分解用醫(yī)藥品的制造時(shí)，ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體的使用。
此外，本發(fā)明涉及軟骨重塑異常引起疾病的治療和預(yù)防用醫(yī)藥組合物，其中含有ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體和可藥用的載體或者稀釋劑。
此外，本發(fā)明涉及軟骨重塑異常正常化用醫(yī)藥組合物，其中含有ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體和可藥用的載體或者稀釋劑。
此外，本發(fā)明涉及聚集蛋白聚糖分解用醫(yī)藥組合物，其中含有ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體和可藥用的載體或者稀釋劑。
此外，本發(fā)明還涉及進(jìn)行聚集蛋白聚糖酶活性調(diào)節(jié)劑篩選的方法，其為在試驗(yàn)化合物存在以及試驗(yàn)化合物不存在的各種情況下，使ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體與聚集蛋白聚糖接觸，比較上述條件下由聚集蛋白聚糖分解反應(yīng)所產(chǎn)生變化的差異。
本說明書中的“聚集蛋白聚糖”指的是存在于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中、由N末端的2個(gè)球形結(jié)構(gòu)域(G1以及G2)、葡糖胺結(jié)合區(qū)域以及C末端的球狀結(jié)構(gòu)域(G3)組成的核心蛋白質(zhì)和由修飾此核心蛋白質(zhì)的硫酸軟骨素以及硫酸角質(zhì)素葡糖胺組成的蛋白多糖。
此外，本說明書中的“聚集蛋白聚糖酶活性”指的是分解聚集蛋白聚糖的活性，例如，切斷人聚集蛋白聚糖核心蛋白質(zhì)的第373位的谷氨酸殘基和第374位的丙氨酸殘基間(Glu373-Ala374)的鍵的活性。
圖的簡(jiǎn)單說明

圖1所示的是重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)含有組分和對(duì)照用組分與聚集蛋白聚糖反應(yīng)的反應(yīng)物的電泳照片。
實(shí)施發(fā)明的最佳狀態(tài)以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
本發(fā)明中，(1)在軟骨重塑異常引起的疾病的治療或者預(yù)防用醫(yī)藥品的制造方面、(2)在軟骨重塑異常的正常化用醫(yī)藥品的制造方面、以及(3)在聚集蛋白聚糖分解用醫(yī)藥品的制造方面使用ADAMTS-1蛋白質(zhì)及其功能等價(jià)變體。
在本說明書中的“ADAMTS-1蛋白質(zhì)”指的是特開平11-46781號(hào)公報(bào)上報(bào)道的人ADAMTS-1蛋白質(zhì)，以及相當(dāng)于此人ADAMTS-1蛋白質(zhì)的、存在于各種動(dòng)物中的蛋白質(zhì)，例如小鼠ADAMTS-1蛋白質(zhì)(J.Biol.Chem.，272，556-562，1997)。即是指包括人的各種動(dòng)物的天然型ADAMTS-1蛋白質(zhì)。上述ADAMTS-1蛋白質(zhì)由727個(gè)氨基酸殘基組成，上述特開平11-46781號(hào)公報(bào)公布了此氨基酸序列。
此外，在本發(fā)明書中的“ADAMTS-1蛋白質(zhì)的功能等價(jià)變體”指的是具有在天然型ADAMTS-1蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1個(gè)或者1個(gè)以上(優(yōu)選1個(gè)或數(shù)個(gè))氨基酸缺失、置換和/或添加所得的氨基酸序列，并且和上述天然型ADAMTS-1蛋白質(zhì)具有相同活性的蛋白質(zhì)。這里，“和天然型ADAMTS-1蛋白質(zhì)具有相同活性”指的是如上述特開平11-46781號(hào)公報(bào)所公布的那樣，影響造血功能的活性，例如造成白血球以及血小板的數(shù)量低下、同時(shí)使紅血球的數(shù)量增加的活性。
在本發(fā)明中使用的ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體的形狀，只要能夠維持其聚集蛋白聚糖酶活性即可，沒有特殊的限制，例如可以是天然型ADAMTS-1蛋白質(zhì)本身，也可以是使ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體與融合用伴侶(例如蛋白質(zhì)或者多肽)融合的融合蛋白質(zhì)。
上述融合用伴侶可舉出，例如純化用蛋白質(zhì)或者多肽[例如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)酶(GST)或者組氨酸六肽]、檢測(cè)用的蛋白質(zhì)或者多肽[例如β半乳糖苷酶α肽(LacZ)]、以及表達(dá)用蛋白質(zhì)或者多肽(例如信號(hào)肽序列)。
在本發(fā)明中使用的ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體，具有聚集蛋白聚糖酶活性，即具有分解聚集蛋白聚糖的活性。因此，ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體不僅能夠用于制造聚集蛋白聚糖分解用醫(yī)藥品，還可以用于制造聚集蛋白聚糖酶活性低下引發(fā)異常(例如軟骨重塑異常)的正?；冕t(yī)藥品，以及用于制造上述異常引起疾病(例如軟骨形成不全癥或肥大性骨關(guān)節(jié)癥)的治療或者預(yù)防用醫(yī)藥品。
在本發(fā)明(1)軟骨重塑異常引發(fā)的疾病的治療或者預(yù)防用醫(yī)藥組合物、(2)軟骨重塑異常正?；冕t(yī)藥組合物、以及(3)聚集蛋白聚糖分解用醫(yī)藥組合物(以下，總稱為本發(fā)明醫(yī)藥組合物)中，以ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體作為有效成分、含有藥劑學(xué)上或者獸醫(yī)學(xué)上允許的常規(guī)的載體或者稀釋劑。
給藥劑型沒有特殊限制，例如可舉出散劑、細(xì)粒劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、懸濁液、乳劑、糖漿、提取物浸膏或者丸劑等經(jīng)口劑，或者注射劑、外用液劑、軟膏劑、栓劑、局部給藥的膏、或者點(diǎn)眼藥等非經(jīng)口劑。
這些經(jīng)口劑使用例如明膠、藻朊酸鈉、淀粉、玉米淀粉、白糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、羧甲基纖維素、糊精、聚乙烯吡咯烷酮、結(jié)晶纖維素、大豆卵磷脂、蔗糖、脂肪酸酯、滑石、硬脂酸鎂、聚乙二醇、硅酸鎂、硅酸酐、以及合成硅酸鋁等賦形劑、結(jié)合劑、崩解劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、流動(dòng)性促進(jìn)劑、稀釋劑、保存劑、著色劑、香料、矯味劑、穩(wěn)定劑、保濕劑、防腐劑以及防氧化劑等，按照常規(guī)方法進(jìn)行制備。
非經(jīng)口劑的給藥方法有，例如注射、(皮下、靜脈內(nèi)等)以及直腸給藥等。其中最優(yōu)選采用注射劑。
例如在制備注射劑時(shí)，以上述的ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體為有效成分以外，可以任意使用生理鹽水或者林格液等的水溶性溶劑、植物油或者脂肪酸酯等非水溶性溶劑、葡萄糖或者氯化鈉等的等滲溶劑、溶解輔助劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、懸濁化劑以及乳化劑等。
此外，本發(fā)明醫(yī)藥組合物，也可以采用使用緩釋性聚合物等的緩釋性制劑的方法進(jìn)行給藥。例如將本發(fā)明醫(yī)藥組合物放入乙烯乙酸乙烯酯聚合物片中，將此片通過外科手術(shù)移植到需要治療或者預(yù)防的組織中去。
本發(fā)明醫(yī)藥組合物并不限定于此，可以含有AMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體0.01～99重量％、優(yōu)選0.1～80重量％的量。
使用本發(fā)明醫(yī)藥組合物時(shí)的給藥量，根據(jù)疾病的種類、患者的年齡、性別、體重、癥狀的程度以及給藥方法等恰當(dāng)決定，可以采用經(jīng)口給藥或者非經(jīng)口給藥。
此外，形態(tài)不限于醫(yī)藥品，可以是各種形態(tài)，例如可以是作為功能性食品和健康食品以及飼料等的飲食物形式。
本發(fā)明的篩選聚集蛋白聚糖酶活性調(diào)節(jié)劑的方法中，使用ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體和聚集蛋白聚糖酶的底物聚集蛋白聚糖。在試驗(yàn)化合物不存在的情況下以及試驗(yàn)化合物存在的各條件下，使ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體與聚集蛋白聚糖相接觸，比較在上述各種條件下聚集蛋白聚糖分解反應(yīng)所引起變化的差異。上述“聚集蛋白聚糖分解反應(yīng)所引起變化的差異”可以舉出例如減少或者增加聚集蛋白聚糖分解產(chǎn)物的量。
能用于本發(fā)明篩選方法中的聚集蛋白聚糖，并不限于人聚集蛋白聚糖，可以使用人以外的物種[例如，哺乳類(例如，牛、鼠或者兔子)]的聚集蛋白聚糖。
此外，可用于本發(fā)明篩選方法中的ADAMTS-1蛋白質(zhì)也不限于人ADAMTS-1蛋白質(zhì)，可以使用人以外的物種[例如，哺乳類(例如，牛、小鼠或者兔子)]的ADAMTS-1蛋白質(zhì)。
并且，在本發(fā)明的篩選方法中，上述聚集蛋白聚糖和上述ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體的組合也沒有特殊的限制，例如可以用同種來源的聚集蛋白聚糖以及ADAMTS-1蛋白質(zhì)，也可以用異種來源的聚集蛋白聚糖以及ADAMTS-1蛋白質(zhì)。
因?yàn)锳DAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體在聚集蛋白聚糖的核心蛋白質(zhì)的第373位的谷氨酸殘基與第374位丙氨酸殘基之間的鍵處切斷，作為上述聚集蛋白聚糖分解產(chǎn)物，生成具有硫酸軟骨素的約100kd的多肽。作為比較聚集蛋白聚糖分解產(chǎn)物的量的方法，可以采用眾所周知的蛋白質(zhì)分析方法，例如可以采用Western blot法。
ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體與聚集蛋白聚糖的接觸，只要是在確保ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體的聚集蛋白聚糖酶活性的條件下實(shí)施即可，沒有特殊的限制，例如后述的實(shí)施例1(2)所記載的可以在聚集蛋白聚糖酶反應(yīng)用緩沖液中進(jìn)行。
在上述比較中，當(dāng)在試驗(yàn)化合物存在的條件下聚集蛋白聚糖分解產(chǎn)物的量比在試驗(yàn)化合物不存在(即，對(duì)照)時(shí)的聚集蛋白聚糖分解產(chǎn)物的量少時(shí)，可以判定上述化合物對(duì)聚集蛋白聚糖酶活性具有抑制作用。對(duì)聚集蛋白聚糖酶活性具有抑制作用的試驗(yàn)化合物(即聚集蛋白聚糖酶活性抑制劑)可以作為聚集蛋白聚糖酶活性亢進(jìn)引發(fā)的疾病例如軟骨破壞引發(fā)的疾病(例如慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕痛、變形性關(guān)節(jié)癥、干癬性關(guān)節(jié)炎、全身性硬化癥、全身性紅斑以及關(guān)節(jié)損傷)的治療或者預(yù)防劑的有效成分來使用。
另一方面，當(dāng)在試驗(yàn)化合物存在的條件下聚集蛋白聚糖分解產(chǎn)物的量比在實(shí)驗(yàn)化合物不存在(對(duì)照)的聚集蛋白聚糖分解產(chǎn)物的量多時(shí)，可以判定上述化合物對(duì)聚集蛋白聚糖酶活性具有促進(jìn)作用。對(duì)聚集蛋白聚糖酶活性具有促進(jìn)作用的試驗(yàn)化合物(即聚集蛋白聚糖酶活性促進(jìn)劑)，可以用作聚集蛋白聚糖酶活性低下引發(fā)的疾病例如軟骨重塑異常引發(fā)的疾病(例如軟骨形成不全癥或者肥大性骨關(guān)節(jié)癥)的治療或者預(yù)防劑的有效成分。
本發(fā)明中用于聚集蛋白聚糖酶活性調(diào)節(jié)劑篩選方法的試驗(yàn)化合物沒有特殊的限制，天然化合物或者合成化合物均可。此外，用于本發(fā)明篩選方法中的狀態(tài)也沒有特殊的限制，可以采用純化狀態(tài)之外，也可以采用未純化的狀態(tài)例如發(fā)酵產(chǎn)物或者細(xì)胞或組織提取液的形式。
接著，用限制性內(nèi)切酶Xbal和限制性內(nèi)切酶Notl切斷上述cDNA的末端后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠中回收約3kbp的DNA，連接到動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)用載體pcDNA 3.1/V5-His(InvitrogenCorporation；美國(guó)加利福尼亞州Carlsbad)的Xbal/Not1位點(diǎn)，構(gòu)建ADAMTS-1表達(dá)載體。并且，通過此ADAMTS-1表達(dá)載體表達(dá)的蛋白質(zhì)是在ADAMTS-1蛋白質(zhì)的C末端添加有6個(gè)組氨酸(His)殘基的重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)(以下，簡(jiǎn)稱“重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)”)。
將所得到的ADAMTS-1表達(dá)載體，用轉(zhuǎn)化試劑(Iipofectamin；Life Technologies Inc.，美國(guó)馬里蘭州Gaithetrsburg)、按照附帶的操作流程手冊(cè)、導(dǎo)入到動(dòng)物細(xì)胞株HEK293中。自導(dǎo)入8小時(shí)后，用含有肝素(5μg/mL)的無血清的ダルベツコ改變イ-グル培養(yǎng)基(DMEM)(日水，日本東京)洗滌細(xì)胞，再培養(yǎng)2天。重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)的C末端存在6個(gè)組氨酸(His)殘基，所以用鎳絡(luò)合柱(AmershamPharmacia Biotech；瑞典，烏普薩拉)按照附帶的操作手冊(cè)，可以純化上述重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)(即，得到含有重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)的組分)。
此外，為了在后述的“聚集蛋白聚糖活性評(píng)價(jià)”中作對(duì)照，除了代替將ADAMTS-1表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，而將上述載體pcDNA3.1/V5-His(不含有編碼重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)的基因)導(dǎo)入的動(dòng)物細(xì)胞以外，其它重復(fù)上述培養(yǎng)和純化步驟，得到與上述重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)含有組分相當(dāng)?shù)膶?duì)照組分。(2)聚集蛋白聚糖酶活性評(píng)價(jià)按照眾所周知的方法(Hardingham方法；Biochem.J.177，237-247，1979)制備用于聚集蛋白聚糖酶活性評(píng)價(jià)的聚集蛋白聚糖。即，從牛鼻軟骨組織中，用鹽酸胍4mol/L抽提后，用氯化銫濃度梯度超離心法進(jìn)行純化。
10μg聚集蛋白聚糖和上述實(shí)施例1(1)制備的重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)含有組分(重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)的量為0.5μg)或?qū)φ战M分放置在100μL聚集蛋白聚糖反應(yīng)用緩沖液中[Tris-HCl-20mmol/L(pH7.6)，NaCl-150mmol/L，CaCl25mmol/L，NaN30.01％]，37℃下反應(yīng)12小時(shí)。
反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)一步添加軟骨素酶ABC(生化學(xué)工業(yè)；日本東京)(0.05U/蛋白多糖10μg)和角質(zhì)素酶(生化學(xué)工業(yè))(0.05U/蛋白多糖10μg)，放置在200μL糖鏈分解反應(yīng)液中[Tris-HCl-50mmol/L(pH8.0)，醋酸鈉30mmol/L，四乙酸乙二胺(EDTA)10mmol/L，苯甲基磺酰氟(PMSF)5mmol/L，胃泌素(ペプスタチン)A0.36mmol/L，N-乙基馬來酸酐縮亞胺10mmol/L)]，37℃下反應(yīng)3小時(shí)以分解糖鏈。
進(jìn)行了兩階段反應(yīng)的反應(yīng)液放置在laemmli樣品緩沖液[Tris-HCl-60mmol/L(pH6.8)，十二烷基硫酸鈉(SDS)2％，巰基乙醇5％，甘油10％]在100℃下處理5分鐘后，進(jìn)行濃度梯度聚丙烯酰氨凝膠電泳(凝膠濃度梯度＝2～15％)。
按照常規(guī)方法，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜后，此膜放置在封閉溶液(Block ACE；大日本制藥；日本，大阪)中、37℃下處理1晚。
Western blot法用抗硫酸4-軟骨素抗體作為一抗(2-B-6抗體；能夠識(shí)別性地結(jié)合聚集蛋白聚糖的核心蛋白質(zhì))，來自以辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合羊的、抗小鼠IgG多克隆抗體(AmershamPharmacia Biotech)作為二抗，使用ケミルミネツセン(ECL體系；Amersham Pharmacia Biotech)作為檢測(cè)系統(tǒng)。
Western blot法的結(jié)果如圖1所示。在圖1中，泳道1是使用對(duì)照用組分時(shí)的結(jié)果，泳道2是使用重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)含有組分時(shí)的結(jié)果。此外，在圖1中，泳道1的左側(cè)沿著上下方向排成一列的各橫線表示的是分子量標(biāo)記用的蛋白質(zhì)的位置，上述各橫線左側(cè)的各數(shù)字表示的是所用的分子量標(biāo)記用的蛋白質(zhì)各自的分子量(單位＝kd)。
在泳道2大約100kd的位置出現(xiàn)的條帶(用箭頭標(biāo)志的條帶)是被重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)分解的聚集蛋白聚糖的核心蛋白質(zhì)。雖然沒有標(biāo)示數(shù)字，不過在聚集蛋白聚糖酶反應(yīng)用緩沖液中聚集蛋白聚糖與各組分反應(yīng)時(shí)，如添加絡(luò)合試劑EDTA(已知為了表現(xiàn)聚集蛋白聚糖酶活性，Ca離子是必須的)，則檢測(cè)不到上述的大約100kd的條帶。從此結(jié)果可以斷定ADAMTS-1蛋白質(zhì)具有聚集蛋白聚糖酶活性。制備實(shí)施例1將上述實(shí)施例1(1)中制備的重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)含有組分溶解到生理鹽水中、并使ADAMTS-1蛋白質(zhì)的量為25mg/mL，然后將得到的重組ADAMTS-1蛋白質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移到安瓿管中，進(jìn)行封管制備本發(fā)明醫(yī)藥組合物。
生產(chǎn)上應(yīng)用的可能性在本發(fā)明中的ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的變體可用于(1)軟骨的重塑異常引發(fā)疾病的治療或者預(yù)防用醫(yī)藥品、(2)軟骨重塑異常的正?；冕t(yī)藥品，或者(3)聚集蛋白聚糖分解用醫(yī)藥品。
此外，如果根據(jù)本發(fā)明的篩選聚集蛋白聚糖酶活性調(diào)節(jié)劑的方法，能夠選擇出聚集蛋白聚糖酶活性促進(jìn)劑或者聚集蛋白聚糖酶活性抑制劑。上述的聚集蛋白聚糖酶活性促進(jìn)劑可以用作治療或者預(yù)防由于聚集蛋白聚糖酶活性低下造成的異常(例如軟骨重塑異常)引發(fā)的疾病(例如軟骨形成不全癥或者肥大性骨關(guān)節(jié)癥)的藥物的有效成分。此外，上述的聚集蛋白聚糖酶活性的抑制劑可以作為治療或者預(yù)防由于聚集蛋白聚糖酶活性亢進(jìn)造成的疾病例如軟骨破壞引發(fā)的疾病(例如慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕痛、變形性關(guān)節(jié)癥、干癬性關(guān)節(jié)炎、全身性硬化癥、全身性紅斑以及關(guān)節(jié)損傷)的藥物的有效成分。序列表說明序列表序列號(hào)1的序列所記載的堿基序列是人工合成的正向引物序列。
序列表序列號(hào)2的序列所記載的堿基序列是人工合成的反向引物序列。
以上，對(duì)本發(fā)明以特定的狀態(tài)進(jìn)行了說明，該領(lǐng)域中的從業(yè)人員自己的修飾和改良也包括在本發(fā)明中。
序 列 表<110>吳羽化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社。<120>ADAMTS-1蛋白質(zhì)的使用和聚集蛋白聚糖酶活性調(diào)節(jié)劑的篩選方法<130>KRH-649<140>JP2000-122650<141>2000-04-24<160>2<210>1<211>33<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>Description of Artificial Sequencean artificially synthesizedforward primer sequence<400>1gtggcggccg cggctccaat gcagcgagct gtg 33<210>2<211>32<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>Description of Artificial Sequencean artificially synthesizedreverse primer sequence<400>2cactctagac tccagccttc ttgctttccc tg 3權(quán)利要求
1.ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體的應(yīng)用，其用于制造軟骨重塑異常引發(fā)疾病的治療或預(yù)防用醫(yī)藥品。
2.ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體的應(yīng)用，軟骨重塑異常的正?；冕t(yī)藥品。
3.ADAMTS-1蛋白質(zhì)及其功能等價(jià)變體的應(yīng)用，聚集蛋白聚糖分解用醫(yī)藥品。
4.起因于軟骨重塑異常的疾病的治療或預(yù)防用醫(yī)藥組合物，其含有ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體和藥劑學(xué)上允許的載體或者稀釋劑。
5.軟骨重塑異常正?；冕t(yī)藥組合物，其含有ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體和藥劑學(xué)上允許的載體或者稀釋劑。
6.聚集蛋白聚糖分解用醫(yī)藥組合物，其含有ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體和藥劑學(xué)上允許的載體或者稀釋劑。
7.篩選聚集蛋白聚糖酶活性調(diào)節(jié)劑的方法，其為在試驗(yàn)化合物不存在以及試驗(yàn)化合物存在的各種條件下，使ADAMTS-1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體與聚集蛋白聚糖接觸，比較上述各個(gè)條件下聚集蛋白聚糖分解反應(yīng)變化的差異。
全文摘要
本發(fā)明介紹了ADAMTS－1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體的新用途，即，以ADAMTS－1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)變體為有效成分，作為用于治療和預(yù)防軟骨重塑異常引發(fā)的疾病的醫(yī)藥組合物，用于軟骨重塑異常的正?；尼t(yī)藥組合物、以及用于聚集蛋白聚糖分解的醫(yī)藥組合物，同時(shí)闡述了用于治療和預(yù)防聚集蛋白聚糖酶活性低下或者亢進(jìn)引發(fā)的疾病的聚集蛋白聚糖酶活性調(diào)節(jié)劑的篩選方法。ADAMTS－1蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)修飾體用于制造軟骨重塑異常引起的疾病的治療和預(yù)防用醫(yī)藥品、軟骨重塑異常的正?；冕t(yī)藥品，或者聚集蛋白聚糖分解用醫(yī)藥品。
文檔編號(hào)A61P19/00GK1426308SQ01808554
公開日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2001年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月24日
發(fā)明者廣瀨國(guó)孝, 久野耕嗣, 松島綱治 申請(qǐng)人:吳羽化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社