專利名稱：從胎盤組織中提取造血干細(xì)胞用于建立造血干細(xì)胞庫(kù)的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于國(guó)際專利分類C12N、A61K領(lǐng)域的建立造血干細(xì)胞庫(kù)的方法，尤其是從胎盤組織中提取造血干細(xì)胞用于建立造血干細(xì)胞庫(kù)的新方法。
背景技術(shù)：
人體的受精卵細(xì)胞能在子宮內(nèi)發(fā)育成胚胎細(xì)胞，這種細(xì)胞具有分化成各種組織細(xì)胞的能力，像神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、血液細(xì)胞等，所以這種細(xì)胞也稱為多能干細(xì)胞。而定向某一組織分化的細(xì)胞亦稱為定向干細(xì)胞，像造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等。這些細(xì)胞能繼續(xù)分化為特定的細(xì)胞或組織、血液造血干細(xì)胞可以繼續(xù)分化為紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板。
腫瘤細(xì)胞是種具有無限增殖能力的細(xì)胞，臨床上常用的治療方法是大劑量的藥物和輻射，而像白血病這樣的血液病腫瘤，只有采用藥物、輻射和造血干細(xì)胞移植才能挽救病人的生命。外來的造血干細(xì)胞能在化療和放療后的病人骨髓內(nèi)重建造血。這種造血有幾個(gè)特點(diǎn)。(1)和外來造血干細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)，數(shù)量越多，越易植活。(2)和供體和受體的白細(xì)胞抗原(HLA)有關(guān)，HLA位點(diǎn)相符程度越高，越易植活，而且排斥反應(yīng)(GVHD)也越輕。(3)造血干細(xì)胞根據(jù)其成熟性的差異可分為二種一種為可分化成為短期造血干細(xì)胞，也稱為12天脾集落形成細(xì)胞(CFU-S)，另一種為長(zhǎng)期造血干細(xì)胞，病人造血干細(xì)胞移植能否長(zhǎng)期存活，和這類細(xì)胞密切相關(guān)。(4)和基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)，基質(zhì)細(xì)胞形成越早，越多，就越能促進(jìn)造血干細(xì)胞粘附于基質(zhì)細(xì)胞，加強(qiáng)細(xì)胞之間的相互接觸及相關(guān)因子的分泌，造血干細(xì)胞在基質(zhì)細(xì)胞表面呈現(xiàn)“鵝卵石”樣的形態(tài)、擴(kuò)增和分化。
目前較為成熟的造血干細(xì)胞移植，根據(jù)細(xì)胞的來源，可分為三類骨髓造血干細(xì)胞移植(BMT)，動(dòng)員周圍血干細(xì)胞移植(MPST)和臍帶血干細(xì)胞移植(UCBT)(Broxymeyer.PNAS 89；863828；32)。前二者干細(xì)胞來源豐富，一般有核細(xì)胞數(shù)可達(dá)5-10×108/Kg，CD34+細(xì)胞(一種造血干/祖細(xì)胞的表面標(biāo)記)可達(dá)1-5×106/Kg，可是由于供者和受體之間需HLA嚴(yán)格相符，才能保證移植的成功，否則供者造血干細(xì)胞不易在病人體內(nèi)植活，即使成活也會(huì)發(fā)生較嚴(yán)重的移植物排宿主病(GVHD)。在一個(gè)家庭的子女中，僅有1/4HLA相符的機(jī)率，而在非血緣關(guān)系的無關(guān)供者中，這種機(jī)率只有百分之一，這樣就極大的限制了BMT或MPST在臨床上廣泛的應(yīng)用。近十余年來臍帶血造血干細(xì)胞移植在臨床上成功的應(yīng)用(Gluckman e et al.NewEngl J Med 1989，3211174-1178)促進(jìn)了臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù)(UCBB)的成立和UCBT的發(fā)展。臍帶血來自于胎盤，通常在婦女分娩后廢棄，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)臍帶血中含豐富的造血干細(xì)胞，其CD34+細(xì)胞的濃度和骨髓類似，約占總細(xì)胞數(shù)的0.1-0.5％，而CD34-更早期的造血干細(xì)胞還較骨髓濃度為高。臨床上發(fā)現(xiàn)UCBT較BMT更大的優(yōu)越性為供體和受體間即使HLA有1-2個(gè)位點(diǎn)的差異，也不會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的GVHD反應(yīng)，同時(shí)像各種病毒的污染率在臍帶血中也較低。因而人們想到把臍血收集、體外濃縮和液氮深低溫保存，建立臍帶血庫(kù)(UCBB)。在病人需要時(shí)，可隨時(shí)融化保存的臍血細(xì)胞，提供臨床造血干細(xì)胞移植。至今，全世界已開展近千例UCBT，確切表明UCBT在兒童或體重較輕的病人是成功的，植活成功率可達(dá)80-90％，但對(duì)體重大的成年人，效果不太理想。表現(xiàn)在植活時(shí)間長(zhǎng)，有的可達(dá)40天才開始有細(xì)胞生長(zhǎng)，即使植活，供者的淋巴系統(tǒng)免疫功能也較低下。原因是每個(gè)臍血的含量有限，平均約為100毫升左右，CD34+細(xì)胞約在0.5-5.0×106。顯然，用于體重大的病人是不夠的，還有人認(rèn)為臍血造血干細(xì)胞的歸巢(Homing)和分化為基質(zhì)細(xì)胞的能力較低，這也是植入時(shí)間較長(zhǎng)的原因之一。同時(shí)，由于臍血淋巴系統(tǒng)未經(jīng)受出生后胸腺的影響，這也造成在成年人中，即使植活，也還有一段免疫功能減弱的時(shí)間。鑒于以上原因，科學(xué)家們開展相同或類似HLA位點(diǎn)的2個(gè)或多個(gè)臍血聯(lián)合應(yīng)用的混合移植，這可以增加一倍以上臍血造血干細(xì)胞數(shù)的含量，可臨床實(shí)踐表明，并不能縮短病人無白細(xì)胞的時(shí)間，而且即使植活，也往往是一個(gè)臍血細(xì)胞存活。另一個(gè)臍血細(xì)胞受到排斥。另一個(gè)解決途徑就是在體外造血干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)證明采用各種細(xì)胞刺激因子和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件可擴(kuò)增臍血細(xì)胞達(dá)數(shù)萬倍，但問題是這種擴(kuò)增需要花費(fèi)時(shí)間，費(fèi)用也高，更重要的是由于擴(kuò)增的同時(shí)，造血干細(xì)胞也發(fā)生分化，臨床應(yīng)用的結(jié)果表明臍血細(xì)胞擴(kuò)增前后對(duì)移植無多大差異。
胎盤是胎兒和母親血液交換的場(chǎng)所，含有非常豐富的方法血液微循環(huán)。人在母親子宮內(nèi)發(fā)育的階段，胎盤是首先形成的器官之一。這表明在胚胎干細(xì)胞的發(fā)育、分化過程中，在胎盤中滯留有大量的早期干細(xì)胞，而且很有可能這些干細(xì)胞在胎盤內(nèi)還繼續(xù)保存著分化造血干細(xì)胞的能力。盡管在胎兒周圍血(臍帶血)內(nèi)含有豐富的造血干細(xì)胞，可是這種干細(xì)胞和胎盤內(nèi)滯留的造血干細(xì)胞可能在細(xì)胞膜表明受體上存在有差異，即胎盤內(nèi)的造血干細(xì)胞具有和組織更強(qiáng)的親和力(歸巢功能)，這樣能提取胎盤組織內(nèi)的干細(xì)胞和臍帶血細(xì)胞一起用于移植，無疑的含有1)胎盤干細(xì)胞能像骨髓血細(xì)胞一樣提供造造血干細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，加速造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育(Hows JM.Lancet 1992；34073-6)。2)胎盤血干細(xì)胞是較為早期的干細(xì)胞，能在體內(nèi)分化成各種細(xì)胞(像脂肪細(xì)胞、纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等)，而正是這類細(xì)胞組成了骨髓的微環(huán)境，促進(jìn)血液細(xì)胞的生成和分化。3)胎盤血內(nèi)的造血干細(xì)胞有更強(qiáng)的歸巢(Homing)功能，這表明若提取這樣的細(xì)胞輸注給病人，這些細(xì)胞能更快、更有效的在病人骨髓中生長(zhǎng)、發(fā)育。4)胎盤血內(nèi)含有豐富的各種階段早期造血干細(xì)胞，若能和臍帶血細(xì)胞一起應(yīng)用于病人，無疑大大增加了造血干細(xì)胞的含量，使這種臍-胎盤血干細(xì)胞可應(yīng)用于成年病人。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是從胎盤組織中提取造血干細(xì)胞用于建立造血干細(xì)胞庫(kù)的新方法。這個(gè)方法包括(1)怎樣系統(tǒng)有序的電腦聯(lián)網(wǎng)儲(chǔ)存有關(guān)胎盤及臍帶血的資料。(2)怎樣無菌的處理胎盤，避免一切可能的細(xì)菌和霉菌的污染。(3)怎樣清除母親血液對(duì)胎盤和臍帶血細(xì)胞的混入。(4)怎樣采用機(jī)械的方法分離胎盤組織細(xì)胞。(5)怎樣采用酶消化的方法分離胎盤組織細(xì)胞。(6)怎樣采用CD34單克隆抗體-磁珠法純化胎盤組織干細(xì)胞。(7)怎樣冰凍長(zhǎng)期保存胎盤組織細(xì)胞。以及怎樣聯(lián)合應(yīng)用臍帶血和胎盤組織造血干/祖細(xì)胞，從靜脈、動(dòng)脈或直接注入骨髓腔或相應(yīng)組織的方法；以及胎盤組織細(xì)胞移植可以是來自于異體，也可以是來自于自體的方法；以及建立一種胎盤組織細(xì)胞和臍帶血干/祖細(xì)胞共同制備的過程；以及一種建立異體胎盤組織細(xì)胞和臍帶血干/祖細(xì)胞庫(kù)的系統(tǒng)過程以及方法，著重強(qiáng)調(diào)了怎樣把異體胎盤組織細(xì)胞和臍帶血干/祖細(xì)胞應(yīng)用于不同的病人；以及一種建立自體組織細(xì)胞和臍帶血干/祖細(xì)胞庫(kù)的系統(tǒng)過程及方法，著重強(qiáng)調(diào)自體儲(chǔ)存細(xì)胞不但適用于造血干細(xì)胞移植，也適用于干細(xì)胞向各種細(xì)胞的分化以及一種利用胎盤組織細(xì)胞，開展基因轉(zhuǎn)染及基因治療的方法以及一種用于制備富含造血干細(xì)胞的方法，該方法包括步驟(1)提取的胎盤組織細(xì)胞和羥乙基淀粉按1∶6比例混合。(2)在離心機(jī)中以500g離心10分鐘，去掉紅細(xì)胞。(3)和淋巴細(xì)胞分離液按1∶4的比例混合。(4)在離心機(jī)中以1000g離心30分鐘，去掉殘存紅細(xì)胞以及成熟的粒細(xì)胞。(5)收集和洗滌各個(gè)不同發(fā)育階段的造血干細(xì)胞群；以及一種采用含有臍帶血漿的培養(yǎng)液體外培養(yǎng)胎盤組織細(xì)胞，獲得能夠替代、冰凍保存的纖維狀基質(zhì)細(xì)胞的方法。
根據(jù)上述的方法且通過以下幾個(gè)方面去改善和提高UCBT的效果。(1)胎盤組織干細(xì)胞；(2)胎盤血和臍帶血造血干細(xì)胞。這方法完全是不同于以前的骨髓造血干細(xì)胞移植(BMT)，周圍血造血干細(xì)胞移植以及臍血造血干細(xì)胞移植，其差別在于首先收集臍帶血液細(xì)胞，然后去除各種可能的污染和感染，最后分離在胎盤中的組織細(xì)胞(其中含有支持造血細(xì)胞發(fā)育的各種基質(zhì)細(xì)胞以及能分化成造血細(xì)胞的干細(xì)胞)。當(dāng)病人臨床上需移植時(shí)，將以上二種和病人HLA相符的干/祖細(xì)胞從靜脈輸注病人。該發(fā)明的另一個(gè)方面就是何時(shí)注射這二類細(xì)胞給大劑量化療和放療后的病人，胎盤血干細(xì)胞可以同時(shí)和臍帶血干細(xì)胞通過靜脈輸入。也可在其前或其后輸入。
該發(fā)明極大的加強(qiáng)了造血干細(xì)胞移植治療腫瘤疾病的效果。大劑量的化療和放療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也破壞了骨髓的微環(huán)境，而移植入的造血只有在重建微環(huán)境后才能開始分化和生長(zhǎng)。正因?yàn)檫@個(gè)原因，該發(fā)明的最重要方面就是分離、純化、深低溫保存、組織和造血干細(xì)胞。在HLA篩選相符時(shí)，輸送給病人用于重建骨髓微循環(huán)，加速造血干細(xì)胞的恢復(fù)以及保證移植物的存活。
本文的創(chuàng)新即是采用各種方法和簡(jiǎn)易設(shè)備，從胎盤中提取出更多的造血干細(xì)胞和類似的中胚層干細(xì)胞(mesenchymal stem cells CMSCs)，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件和細(xì)胞選擇下，這些細(xì)胞可分化成各種不同種類的細(xì)胞，像肝臟、皮膚、軟骨、骨髓的基質(zhì)細(xì)胞以及各種不同階段的造血細(xì)胞。骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以直接支持和指導(dǎo)血液細(xì)胞，像造血干細(xì)胞等的增植和分化(Herman P.LeuKemia 1998，12735-45)。因?yàn)椴∪嗽贐MT以前，需進(jìn)行大劑量的化療(藥物)和放療(同位素)去消滅病人體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞以及破壞了骨髓內(nèi)部的微環(huán)境。這樣怎樣加快和植活外來細(xì)胞在病人體內(nèi)存活就是個(gè)非常關(guān)鍵的問題。本發(fā)明的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)就是通過胎盤提取、純化這些MSC細(xì)胞及不同階段發(fā)育的造血干細(xì)胞，利用這些細(xì)胞的功能加強(qiáng)病人骨髓破壞后的微環(huán)境，增多移植時(shí)的造血干細(xì)胞的含量，使這種UCBT不但可以適用于一切人群，而且可以大大縮短病人移植后的零細(xì)胞期，從而提高了病人的存活率。
本發(fā)明制備的胎盤組織干細(xì)胞一般以靜脈輸入為主，但也可以局部直接進(jìn)入到骨髓組織內(nèi)，也可通過任何其它的途徑，像動(dòng)脈注入等方法輸注給病人。
本發(fā)明主要應(yīng)用的藥學(xué)成份或含量有生理鹽水、低分子右旋糖酐、臍帶血漿、DMEM(Dulbecco’s Modified Essential Medium)培養(yǎng)液、注射用水等。所有以上成份均是無菌、無熱原制備以及適用臨床移植的病人。
關(guān)于從胎盤中提取組織干細(xì)胞的方法可以采取多種途徑，特別是像(1)采用機(jī)械粉碎胎盤的方法；(2)應(yīng)用膠原酶或蛋白酶消化組織的方法；(3)以上二種方法的混合；(4)采用其它粉碎胎盤的方法。
本發(fā)明關(guān)于應(yīng)用胎盤組織干細(xì)胞的途徑，可以是靜脈注射、動(dòng)脈輸注，也可以是局部注射，當(dāng)然也不除外采用其它方式的應(yīng)用。
本發(fā)明關(guān)于胎盤組織干細(xì)胞的應(yīng)用時(shí)間，可以是(1)和臍帶血干細(xì)胞一起注入(2)在臍血干細(xì)胞注入前一天應(yīng)用；(3)多次在不同時(shí)間內(nèi)分別輸入胎盤組織干細(xì)胞。
使用在造血干細(xì)胞移植中胎盤組織干細(xì)胞的含量是十分重要的。一般講，每個(gè)胎盤組織可分離出1-4×109單個(gè)核細(xì)胞，這樣，即使對(duì)100公斤體重的病人，也至少可以有1×107/Kg的單個(gè)核細(xì)胞。這個(gè)數(shù)字是完全適合于骨髓移植的病人。在BMT的病人，大致只有1×104/Kg和基質(zhì)細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞，通常不超過7×105/Kg，因而胎盤組織干細(xì)胞和臍血干細(xì)胞的共同應(yīng)用必然會(huì)增強(qiáng)造血干細(xì)胞移植的效果。
本發(fā)明不論在造血干細(xì)胞移植中的質(zhì)和量上都是一個(gè)巨大的改進(jìn)，在臍血移植中它不但加速了臍血移植再生時(shí)間，也使造血干細(xì)胞的數(shù)量大大增多，不但可使臍血廣泛的用于各種患病人群，而且可大大縮短臍血移植中病人細(xì)胞數(shù)為零的時(shí)間，減少污染的發(fā)生率，可挽救更多病人的生命。
胎盤和臍帶逸出后，可在收集臍血的同時(shí)，收集胎盤，從胎盤中分離更多的各時(shí)期的造血干/祖細(xì)胞，加以深低溫保存，當(dāng)病人應(yīng)用時(shí)，可同時(shí)和臍血一起輸注給病人。
本發(fā)明主要的應(yīng)用范圍是各種惡性血液病，像白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤；遺傳性疾病，像先天性溶血性貧血；血液再生不良性疾病，像再生障礙性貧血；藥物或化學(xué)性元素，像苯、汞等；放射性疾病，像放射線意外等。治療方法是采用化療及放療等各種手段摧毀病人自身患病的骨髓細(xì)胞以及免疫系統(tǒng)，然后輸入健康的造血干細(xì)胞，由于同時(shí)摧毀了病人自身的骨髓內(nèi)環(huán)境，所以以后輸入的造血干細(xì)胞只有在重建骨髓內(nèi)環(huán)境以后才能開始造血細(xì)胞的重建。這樣就延緩了血細(xì)胞重建的時(shí)間，而如果事先就輸入HLA相符的相當(dāng)于骨髓內(nèi)環(huán)境的細(xì)胞，這就無疑加速了造血干細(xì)胞重建的時(shí)間，加快病人的恢復(fù)。
本發(fā)明也適用于患有先天或后天免疫缺陷性疾病(AIDS)，這些病人是患有淋巴免疫系統(tǒng)的疾病，輸入正常免疫系統(tǒng)細(xì)胞，得到免疫系統(tǒng)功能重建，無疑也可治愈這些病人。
本發(fā)明也適用于基因轉(zhuǎn)染的治療。眾所周知，外體基因轉(zhuǎn)染，受基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞愈多愈好，而胎盤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的增生和分化能力，是基因轉(zhuǎn)染的理想細(xì)胞。
本發(fā)明也適用于多能干細(xì)胞向各種組織細(xì)胞分化的治療，現(xiàn)已證實(shí)胚胎干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、脂肪細(xì)胞都含有多能干細(xì)胞，這些細(xì)胞在一定的環(huán)境下可分化成各種組織細(xì)胞，像脂肪、骨髓、神經(jīng)、肝臟等。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在胎盤中也含有這樣的多能干細(xì)胞。
在本發(fā)明的所有操作步驟中，都是藥典允許的常規(guī)操作方法，這包括采用無菌操作、無菌生理鹽水洗滌、滅菌，無菌細(xì)胞濃縮和純化等標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容，所應(yīng)用的藥品，像二甲亞砜，無菌生理鹽水，低分子右旋糖酐，無菌蒸餾水等均是符合我國(guó)衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的要求，操作完畢后做常規(guī)病毒，細(xì)胞檢查及細(xì)菌、霉菌培養(yǎng)，只有合乎要求的胎盤血細(xì)胞才能應(yīng)用于臨床。
采用本方法提取的胎盤血細(xì)胞在2-4×109單個(gè)核細(xì)胞數(shù)，其中約有0.3-0.7％為CD34陽(yáng)性細(xì)胞，體外集落細(xì)胞培養(yǎng)(CFU-GM)，可見集落巨大的細(xì)胞群，一般在5-10×106之間。這種集落群和骨髓、動(dòng)員外周血以及臍帶血干細(xì)胞有著明顯的差異，表現(xiàn)在集落大，細(xì)胞呈重疊樣生長(zhǎng)，集落群出現(xiàn)的時(shí)間也不同，顯示出胎盤血干細(xì)胞存在有不同階段。而在長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)中，胎盤血細(xì)胞的擴(kuò)增能力約比臍血細(xì)胞多1-3倍。一般臍血細(xì)胞的采集量約為0.8-1.5×109，而CD34陽(yáng)性細(xì)胞約在0.1-0.5％之間，這樣若把胎盤血細(xì)胞和臍血細(xì)胞同時(shí)用于病人，則總細(xì)胞數(shù)可增加3-5倍，完全可適用于一切病人的需要。
通過下面的詳述，將對(duì)本發(fā)明的操作方法，特點(diǎn)和優(yōu)越性作進(jìn)一步的闡明。當(dāng)然，應(yīng)值得指出的是盡管本文描述了以下幾種案例，人們也可根據(jù)本發(fā)明的基礎(chǔ)，提出各種變化和個(gè)性的形式也是可能的。


圖1為胎盤組織細(xì)胞和臍帶血液細(xì)胞共同培養(yǎng)，可見胎盤血造血干細(xì)胞在胎盤組織貼壁細(xì)胞上呈“鵝卵石”樣生長(zhǎng)。
圖2胎盤組織細(xì)胞經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)一月的體外培養(yǎng)，形成貼壁的纖維樣細(xì)胞，該細(xì)胞開始為不規(guī)則，細(xì)胞巨大，單核或雙核，當(dāng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，細(xì)胞逐漸變成梭形。在體外培養(yǎng)多次傳代及深低溫保存、融化，細(xì)胞活性仍然很好。
圖3胎盤組織細(xì)胞的集落培養(yǎng)(CFU-GM)。胎盤組織細(xì)胞形成集落的時(shí)間較臍帶血細(xì)胞為晚，但一旦開始形成，細(xì)胞生長(zhǎng)很快，細(xì)胞間相互重疊分層，而且可有3次以上的再集落。
圖4對(duì)胎盤組織細(xì)胞進(jìn)行雙顯色一熒光激活細(xì)胞(FACS)分析，發(fā)現(xiàn)CD34+細(xì)胞在胎盤組織中較臍血細(xì)胞為高，平均值約高50％。
圖中圖1是指為從胎盤分離的組織細(xì)胞和臍帶血液細(xì)胞共同培養(yǎng)，可見胎盤血造血干細(xì)胞在胎盤組織貼壁細(xì)胞上呈“鵝卵石”樣生長(zhǎng)。
圖2是指胎盤組織形成貼壁狀的纖維樣細(xì)胞，其細(xì)胞在開始為不規(guī)則、細(xì)胞巨大，當(dāng)貼壁后，細(xì)胞逐漸呈梭深低溫保存、融化后，細(xì)胞活性仍然很好。
圖3是指胎盤組織細(xì)胞的集落培養(yǎng)(CFU-GM)培養(yǎng)時(shí)間為第9天，形成集落的時(shí)間較臍血細(xì)胞為晚(7天)，但一旦開始形成，細(xì)胞生長(zhǎng)很快，呈現(xiàn)相互重疊，可有3次以上的再集落形成。
圖4是指對(duì)同一份臍帶血分離后的組織細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀激光分析，CD34陽(yáng)性細(xì)胞(在圖上呈紅點(diǎn)符號(hào))在胎盤組織中較臍血高一倍左右。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及的技術(shù)方案包括從胎盤組織里提取組織細(xì)胞的方法。這個(gè)方法包括(1)怎樣系統(tǒng)有序的電腦聯(lián)網(wǎng)儲(chǔ)存有關(guān)胎盤及臍帶血的資料。(2)怎樣無菌的處理胎盤，避免一切可能的細(xì)菌和霉菌的污染。(3)怎樣清除母親血液對(duì)胎盤和臍帶血細(xì)胞的混入。(4)怎樣采用機(jī)械的方法分離胎盤組織細(xì)胞。(5)怎樣采用酶消化的方法分離胎盤組織細(xì)胞。(6)怎樣采用CD34單克隆抗體-磁珠法純化胎盤組織干細(xì)胞。(7)怎樣冰凍長(zhǎng)期保存胎盤組織細(xì)胞。以及怎樣聯(lián)合應(yīng)用臍帶血和胎盤組織造血干/祖細(xì)胞，從靜脈、動(dòng)脈或直接注入骨髓腔或相應(yīng)組織的方法；提供了胎盤組織細(xì)胞移植可以是來自于異體，也可以是來自于自體的方法。提供了胎盤組織細(xì)胞和臍帶血干/祖細(xì)胞共同制備的過程；提供了一種建立異體胎盤組織細(xì)胞和臍帶血干/祖細(xì)胞庫(kù)的系統(tǒng)過程以及方法，著重強(qiáng)調(diào)了怎樣把異體胎盤組織細(xì)胞和臍帶血干/祖細(xì)胞應(yīng)用于不同的病人；提供了一種建立自體組織細(xì)胞和臍帶血干/祖細(xì)胞庫(kù)的系統(tǒng)過程及方法，著重強(qiáng)調(diào)自體儲(chǔ)存細(xì)胞不但適用于造血干細(xì)胞移植，也適用于干細(xì)胞向各種細(xì)胞的分化；提供了一種利用胎盤組織細(xì)胞，開展基因轉(zhuǎn)染及基因治療的方法；提供了一種用于制備富含造血干細(xì)胞的方法，該方法包括的步驟是(1)提取的胎盤組織細(xì)胞和羥乙基淀粉按1∶6比例混合。(2)在離心機(jī)中以500g離心10分鐘，去掉紅細(xì)胞。(3)和淋巴細(xì)胞分離液按1∶4的比例混合。(4)在離心機(jī)中以1000g離心30分鐘，去掉殘存紅細(xì)胞以及成熟的粒細(xì)胞。(5)收集和洗滌各個(gè)不同發(fā)育階段的造血干細(xì)胞群；以及提供了一種采用含有臍帶血漿的培養(yǎng)液體外培養(yǎng)胎盤組織細(xì)胞，獲得能夠替代、冰凍保存的纖維狀基質(zhì)細(xì)胞的方法。如此，以下實(shí)施例析之案例一采用機(jī)械的方法分離胎盤組織干細(xì)胞胎盤和臍帶血均來自于當(dāng)?shù)貗D產(chǎn)醫(yī)院或科室。首先，征得孕婦或其直接親屬同意捐獻(xiàn)胎盤后，查閱孕婦的所有檢驗(yàn)報(bào)告，證實(shí)無任何的病毒、梅毒等和血液有關(guān)的病毒感染，然后詳細(xì)詢問孕婦的生育、疾病、遺傳、感染等病史，在一切均為正常后，開始按常規(guī)方法收集臍帶血(專利技術(shù)“使用軟質(zhì)兜垂直采集臍血的裝置”，專利號(hào)ZL99244936.7)。收集完后的臍帶血及胎盤均附有條形碼標(biāo)簽，存放于4℃冰箱。存放時(shí)間一般不超過24小時(shí)。
按照條形碼的編號(hào)，把有關(guān)資料輸入電腦中儲(chǔ)存。在無菌環(huán)境中，按條形碼的編號(hào)從相對(duì)臍血中，提取樣本，供以下檢測(cè)——肝炎病毒及相應(yīng)抗體像乙型肝炎，丙型肝炎等——性病檢測(cè)；像梅毒等——愛滋病(AIDs)毒抗體檢測(cè)——遺傳性溶血性疾病——有核白細(xì)胞及單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)——造血干/祖細(xì)胞定量檢測(cè)(CD34)——組織配型(HLA)——造血干/祖細(xì)胞定性檢測(cè)(CFU-GM)臍帶血細(xì)胞按國(guó)外常規(guī)的技術(shù)方法(Robinstein P.Blood 1993，801679-90)進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞濃縮處理，并加入冰凍保存液(DMSO)，在液氮深低溫中長(zhǎng)期保存。
相應(yīng)的胎盤組織按下列程序無菌環(huán)境和條件下進(jìn)行處理用無菌生理鹽水清洗胎盤，清洗掉所有的血凝塊及積血，采用消毒劑殺滅任何可能的細(xì)菌污染，然后再次應(yīng)用磷酸緩沖液(PH7.4)，低分子右旋糖酐及細(xì)胞培養(yǎng)液(Dulbecco’sModified Eagles Mediam)亦簡(jiǎn)稱DMEM按順序清洗，最后采用經(jīng)選擇后的臍帶血漿(AB血型)，DMEM培養(yǎng)液和胎盤共同混和過夜。剪除臍帶和表層的胎盤膜，應(yīng)用撕裂，研磨和DMEM培養(yǎng)液沖洗的方法，將胎盤細(xì)胞收集到50毫升的離心管內(nèi)，在離心機(jī)內(nèi)以1000rpm，5分鐘，4℃離心，棄去上清液再次用培養(yǎng)液清洗3次。最后采用16G、18G和20G的針頭過濾，將胎盤細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞，制備后的胎盤細(xì)胞做以下檢測(cè)
——細(xì)胞和霉菌培養(yǎng)——有核白細(xì)胞及單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)——造血干/祖細(xì)胞定量檢測(cè)(CD34)——造血干/祖細(xì)胞定性檢測(cè)(CFU-GM)——造血干/祖細(xì)胞的活性(臺(tái)盼蘭染色)從胎盤制取的單個(gè)核細(xì)胞以1×108/ml和DMSO混合。以10％的DMSO和低分子右旋糖酐濃度，在液氮低度降溫到零下80℃，然后轉(zhuǎn)移到液氮(-186℃)液相中深低溫保存。
案例二采用酶消化的方法提取胎盤血干細(xì)胞胎盤從醫(yī)院婦產(chǎn)科采用無菌的方法收集，并和相應(yīng)的臍帶血一起送入臍血干細(xì)胞中心，在收集胎盤以前，應(yīng)征得孕婦本人及相應(yīng)直系親屬的同意，并調(diào)查孕婦及家庭中有關(guān)的遺傳和傳染病史，以及醫(yī)院所有相關(guān)的病毒檢查為陰性后才能收集。
收集后的臍帶血及相應(yīng)的胎盤需在一定的溫度下(4-20℃)，在24小時(shí)以內(nèi)送到我中心。在中心需再次做相應(yīng)的病毒檢測(cè)，只有病毒陰性的臍血及胎盤才能進(jìn)入我電腦登記程序，在記錄相應(yīng)的條形碼編號(hào)以后，輸往我中心的無菌車間。
在無菌車間內(nèi)取臍帶血中的樣本做HLA檢測(cè)，并把記錄輸入到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，臍血按常規(guī)進(jìn)行分離、加冰凍保護(hù)劑、程控降溫，在液氮深低溫中保存。
相應(yīng)的胎盤，先用無菌生理鹽水洗滌，去除一切含有母血的細(xì)胞，然后在特殊的容器中加以無菌消毒，去除一切可能細(xì)胞污染的來源，此后采用細(xì)胞培養(yǎng)液，像DMEM(GIBCO，Grand Island.NY.USA)加以洗滌，再次去除可能的母血污染。然后剪碎胎盤，去掉胞膜和臍帶，應(yīng)用膠原酶(0.2g/ml)消化15分鐘、20分鐘及30分鐘。我們發(fā)現(xiàn)以消化15分鐘所取得的細(xì)胞為好。其中細(xì)胞的活性好、回收率高，最后收集消化后的胎盤細(xì)胞，在特殊的離心管內(nèi)離心，轉(zhuǎn)速為1000rpm，10分鐘，用低分子右旋糖酐洗滌三次，把所收集的細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞混懸液、白細(xì)胞及單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定細(xì)胞活性，計(jì)算CD34、CD4、CD8細(xì)胞含量及體外培養(yǎng)的白細(xì)胞集落(CFU-GM)，在加冰凍保護(hù)劑(10％DMSO)以前，取一份標(biāo)本做細(xì)胞培養(yǎng)。
案例三采用物理和生物學(xué)的方法濃縮和純化造血干細(xì)胞應(yīng)用上述二種方法人胎盤中分離的造血干細(xì)胞，實(shí)際上也是一群細(xì)胞，它含有紅細(xì)胞、血小板，具有分化成不同組織細(xì)胞的成人干細(xì)胞，不同時(shí)期的造血干細(xì)胞以及成熟的粒細(xì)胞和淋巴系統(tǒng)細(xì)胞。本發(fā)明采用以下方法濃縮和純化造血干細(xì)胞。
1.采用沉淀、離心的方法濃縮造血干細(xì)胞準(zhǔn)確測(cè)量按上述二種方法從胎盤中分離的組織細(xì)胞體積，應(yīng)用不含血清的DMEM液洗二次，按1∶6的比例加入羥乙基淀粉(HES)，在萬能搖床上混合5分鐘，然后在離心機(jī)內(nèi)以200g，溫度12℃，時(shí)間5分鐘，用血漿擠壓器壓迫富含組織細(xì)胞的液體到另一離心管，棄去富含紅細(xì)胞的沉淀物，上清液再次離心800g，溫度12℃，時(shí)間15分鐘，棄去上清液。收集沉于管底的細(xì)胞，加入DMEM液把沉淀細(xì)胞制成混懸液，以1∶4的比例加到淋巴細(xì)胞分離液的上層，然后以800g，溫度12℃，時(shí)間30分鐘離心。吸取在淋巴細(xì)胞分離液和上層液體間的細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)液，洗滌2次，最后做細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性檢測(cè)。
2.采用生物學(xué)的方法純化造血干細(xì)胞。
2.1應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選造血干細(xì)胞在造血干細(xì)胞及早期分化后的祖細(xì)胞膜表面都含有一種蛋白質(zhì)稱為CD34抗原。抗CD34單克隆抗體可以識(shí)別這類人造血細(xì)胞(Krause，Blood 1996 871-13)。因此可進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分類和分選細(xì)胞。首先，把上述經(jīng)過濃縮后的組織細(xì)胞和帶有熒光抗CD34抗原的單克隆抗體相混合，在室溫或4℃中孵育30分鐘，然后用不含血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌3次。這樣胎盤組織中的造血干/祖細(xì)胞就能和有熒光標(biāo)記的抗CD34單克隆抗體相結(jié)合。當(dāng)把這組細(xì)胞放入流式細(xì)胞儀后，每個(gè)細(xì)胞都通過激光照射，根據(jù)熒光發(fā)生的強(qiáng)弱，儀器可自動(dòng)收集這些帶有熒光的細(xì)胞，這種方法可以提供90％以上純度的造血干細(xì)胞。
2.2采用抗體-磁珠法純化造血干細(xì)胞本發(fā)明的另一個(gè)方案是采用抗CD34單克隆抗體和一種載體相結(jié)合，這種支持載體往往是磁珠。然后使上述濃縮的胎盤組織干細(xì)胞群和這抗體相接觸，這樣細(xì)胞群內(nèi)的造血干/祖細(xì)胞會(huì)和抗體相結(jié)合，并粘附于支持載體。此時(shí)，若是磁珠，可用吸鐵裝置吸附磁珠。同時(shí)也保留了造血干/祖細(xì)胞，洗滌去未和磁珠相結(jié)合的細(xì)胞。若采用和生物素相結(jié)合的單克隆抗體，則可應(yīng)用含抗生素抗體的生物柱，當(dāng)未結(jié)合抗體的細(xì)胞通過該生物珠時(shí)，均被洗滌出去。最后，改變洗滌液的PH值，洗滌下CD34+細(xì)胞。采用以上二種方法，獲得的造血干/祖細(xì)胞的純度可達(dá)80％以上。
3.濃縮純化后的造血干細(xì)胞生物特性。
本發(fā)明分別比較來自于胎盤的組織細(xì)胞、骨髓細(xì)胞以及臍帶血細(xì)胞的生物特性。正如表1為細(xì)胞集落培養(yǎng)來自于胎盤的組織細(xì)胞集落形成較晚，但集落生長(zhǎng)快，集落細(xì)胞大，能形成多次集落。當(dāng)把這三類細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，來自胎盤的組織細(xì)胞能很快的形成貼壁細(xì)胞，而且這些貼壁細(xì)胞很易多次傳代。這三類細(xì)胞在和含有造血干細(xì)胞刺激因子，像SCF(10μg/ml)，IL-3(100μg/ml)以及FLT-3(50ng/ml)，長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，胎盤組織細(xì)胞維持時(shí)間長(zhǎng)，造血干/祖細(xì)胞增生量多。本發(fā)明分別采用胎盤組織細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞，等量混合的胎盤組織細(xì)胞和臍帶血細(xì)胞注射于同位素并致死量的免疫功能缺陷的小鼠，發(fā)現(xiàn)這三類細(xì)胞都能在小鼠骨髓內(nèi)生長(zhǎng)，胎盤組織細(xì)胞注入小鼠后無任何不良反應(yīng)。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞、臍血細(xì)胞以及胎盤組織細(xì)胞在和含造血刺激因子的共同培養(yǎng)中(CFU-GM)，所形成的造血細(xì)胞集落有明顯的差異，如表1所示表1骨髓細(xì)胞、臍血細(xì)胞和胎盤組織細(xì)胞CFU-GM的比較

案例四建立異體胎盤——臍帶血庫(kù)自Robinstein(Rubinstein P，et al；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，10 119-10122，1995)建立臍帶血庫(kù)以來，在世界范圍內(nèi)已開展2,000多例臍血造血干細(xì)胞移植，挽救了許多患者的生命，可是由于(1)臍帶血內(nèi)的有核細(xì)胞及干/祖細(xì)胞的有限，并不太適宜于體重較大病人移植；(2)可能由于臍帶血內(nèi)細(xì)胞含基質(zhì)細(xì)胞或能轉(zhuǎn)化成基質(zhì)細(xì)胞較骨髓內(nèi)為少，從而移植后的臍血在患者內(nèi)生長(zhǎng)緩慢。胎盤組織細(xì)胞正是可以彌補(bǔ)臍帶血的特點(diǎn)，從而可建立一個(gè)大型的胎盤——臍帶血庫(kù)，供任何年齡和體重的病人開展造血干細(xì)胞移植，其步驟有下述組成(周勝利，中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)2001，2153-160)。
1.建立電腦聯(lián)網(wǎng)和條形碼系統(tǒng)便于資料儲(chǔ)存，保證所有數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確，而且也可以迅速根據(jù)病人的HLA配型結(jié)果查詢到和病人HLA相符的胎盤——臍帶血干細(xì)胞，用以臨床移植。
2.和醫(yī)院共同合作收集胎盤和臍帶血在征求得孕婦同意的情況下，收集各項(xiàng)檢測(cè)及孕婦家庭中無相關(guān)遺傳病史的臍帶血和胎盤。
3.檢測(cè)所有從醫(yī)院收集的臍帶血均需再做一次和病毒細(xì)胞、霉菌和遺傳病有關(guān)的各項(xiàng)檢測(cè)，只有各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)陰性的臍血才能提供給臨床移植。
4.組織配型(HLA)HLA配型的準(zhǔn)確性是關(guān)系到移植是否成功的主要因素之一，常用于臍血移植的HLA抗原有I類A，B和II類DR。這二類HLA配型需采用分子生物學(xué)(DNA)檢測(cè)，而對(duì)II類DR更需應(yīng)用高分辨檢測(cè)。
5.胎盤及臍血干/祖細(xì)胞保存、提取、純化濃縮的臍帶血干/祖細(xì)胞及胎盤組織干/祖細(xì)胞和冰凍保存劑(DMSO)混合，在液氮內(nèi)深低溫降溫到-80℃，然后轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)(-196℃)長(zhǎng)期保存。
6.凍融和造血干細(xì)胞移植當(dāng)臨床確認(rèn)需應(yīng)用造血干細(xì)胞庫(kù)內(nèi)的某例臍血和胎盤組織干細(xì)胞/祖細(xì)胞時(shí)，在病人床前從液氮內(nèi)取出臍血及胎盤組織干/祖細(xì)胞，于37℃電動(dòng)水浴箱內(nèi)融化，在血細(xì)胞幾乎即將凍融完畢時(shí)，加入低分子右旋糖酐等量混合，按順序給病人輸注。
案例五建立自體胎盤——臍帶血庫(kù)自體胎盤——臍帶血庫(kù)是孕婦在新生兒出生后，貯存胎盤組織細(xì)胞及臍帶血干/祖細(xì)胞，其目的是(1)因?yàn)樘ケP和臍帶血內(nèi)含有豐富的造血干/祖細(xì)胞，出生以后貯存就避免了孩子長(zhǎng)大以后，若患有腫瘤，尤其是血液疾病時(shí)，缺乏供體時(shí)的危險(xiǎn)，這特別適合于家庭中有腫瘤或血液病的新生兒；(2)目前，大量的科學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，在組織中含有早期能分化成各種組織細(xì)胞，像肝臟、皮膚、神經(jīng)等的干細(xì)胞。生命越早期，這種干細(xì)胞的含量就越高。若能保存胎盤中的組織細(xì)胞，無疑是給新生兒建立了一個(gè)生命銀行。在新生兒的成長(zhǎng)發(fā)育過程中，由于各種原因，像外傷、臟器衰竭等，而需要臟器細(xì)胞移植，均可通過胎盤組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)，分化成所需要的細(xì)胞，供臨床應(yīng)用。由于這些細(xì)胞是來自于新生兒的自體細(xì)胞，不存在排斥和不能生長(zhǎng)等問題，在某種意義上講，可以為新生兒提供第二次生命的機(jī)會(huì)。具體程序除以下幾點(diǎn)外，其余的和異體胎盤——臍帶血庫(kù)一樣。
1.在收集胎盤和臍血時(shí)，孕婦或其直系親屬要和我方簽訂協(xié)議書，同意由我方有價(jià)保存新生兒的胎盤和臍血干細(xì)胞，而我方也需保證未得孕婦家屬同意，不得把該份臍血細(xì)胞用于任何人。
2.臍血干/祖細(xì)胞及胎盤組織細(xì)胞要分多袋儲(chǔ)存，以便于在不同時(shí)間分次給新生兒應(yīng)用。
3.當(dāng)需要除造血干細(xì)胞移植以外的用途時(shí)，例如需要用于肝臟損傷、皮膚移植等，按臨床要求凍融胎盤組織細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)液(如1640、DMEM)內(nèi)培養(yǎng)，待胎盤組織細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，換用相應(yīng)的含刺激因子的培養(yǎng)液，如肝臟細(xì)胞刺激因子、神經(jīng)細(xì)胞刺激因子，促使胎盤組織細(xì)胞向相應(yīng)的細(xì)胞分化，待細(xì)胞分化完全后，給病人應(yīng)用。
4.當(dāng)新生兒在生長(zhǎng)、發(fā)育過程中，任何原因引起需造血干細(xì)胞移植來挽救其生命時(shí)，可隨時(shí)應(yīng)用其儲(chǔ)存的臍血及組織干細(xì)胞來替代其患病的細(xì)胞?；蛑委煘楫?dāng)前治療各種疾病的有效手段。胎盤組織細(xì)胞及臍血干/祖細(xì)胞是基因轉(zhuǎn)染的很好載體。帶有正?；蛑尾』虻馁|(zhì)?？梢杂行У那逗先胩ケP組織細(xì)胞的DNA鏈中，并隨著細(xì)胞的分裂而不斷的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄成能表達(dá)蛋白質(zhì)的RNA，從而起到治療疾病的效果。
權(quán)利要求
1.一種從胎盤組織中提取造血干細(xì)胞用于建立造血干細(xì)胞庫(kù)的新方法，其特征是所述的方法包括從胎盤組織里提取組織細(xì)胞的方法并有如下步驟(1)怎樣系統(tǒng)有序的電腦聯(lián)網(wǎng)儲(chǔ)存有關(guān)胎盤及臍帶血的資料，(2)怎樣無菌的處理胎盤，避免一切可能的細(xì)菌和霉菌的污染，(3)怎樣清除母親血液對(duì)胎盤和臍帶血細(xì)胞的混入，(4)怎樣采用機(jī)械的方法分離胎盤組織細(xì)胞，(5)怎樣采用酶消化的方法分離胎盤組織細(xì)胞，(6)怎樣采用CD34單克隆抗體-磁珠法純化胎盤組織干細(xì)胞，(7)怎樣冰凍長(zhǎng)期保存胎盤組織細(xì)胞；所述的方法還包括怎樣聯(lián)合應(yīng)用臍帶血和胎盤組織造血干/祖細(xì)胞，從靜脈、動(dòng)脈或直接注入骨髓腔或相應(yīng)組織的方法；提供的胎盤組織細(xì)胞移植可以是來自于異體，也可以是來自于自體的方法；建立胎盤組織細(xì)胞和臍帶血干/祖細(xì)胞共同制備的過程；建立異體胎盤組織細(xì)胞和臍帶血干/祖細(xì)胞庫(kù)的系統(tǒng)過程以及方法，著重強(qiáng)調(diào)了怎樣把異體胎盤組織細(xì)胞和臍帶血干/祖細(xì)胞應(yīng)用于不同的病人；建立自體組織細(xì)胞和臍帶血干/祖細(xì)胞庫(kù)的系統(tǒng)過程及方法，著重強(qiáng)調(diào)自體儲(chǔ)存細(xì)胞不但適用于造血干細(xì)胞移植，也適用于干細(xì)胞向各種細(xì)胞的分化；利用胎盤組織細(xì)胞，丌展基因轉(zhuǎn)染及基因治療的方法。
2.一種從胎盤組織中提取造血干細(xì)胞用于建立造血干細(xì)胞庫(kù)的新方法的用于制備富含造血干細(xì)胞的方法，其特征是，所述方法包括如下步驟(1)提取的胎盤組織細(xì)胞和羥乙基淀粉按1∶6比例混合；(2)在離心機(jī)中以500g離心10分鐘，去掉紅細(xì)胞；(3)和淋巴細(xì)胞分離液按1∶4的比例混合；(4)在離心機(jī)中以1000g離心30分鐘，去掉殘存紅細(xì)胞以及成熟的粒細(xì)胞；(5)收集和洗滌各個(gè)不同發(fā)育階段的造血干細(xì)胞群。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從胎盤組織中提取造血干細(xì)胞用于建立造血干細(xì)胞庫(kù)的新方法，其特征是所述的方法還包括采用含有臍帶血漿的培養(yǎng)液體外培養(yǎng)胎盤組織細(xì)胞，獲得能夠替代、冰凍保存的纖維狀基質(zhì)細(xì)胞的方法。
全文摘要
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了從健康產(chǎn)婦的胎盤中提取干細(xì)胞建立造血干細(xì)胞庫(kù)的新方法。本發(fā)明變廢為寶，采用機(jī)械、酶消化及單克隆抗體－磁珠法從胎盤中提取、濃縮和純化活性好、濃度高、數(shù)量多的血液干細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞標(biāo)記檢測(cè)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，胎盤中提取的干細(xì)胞能加強(qiáng)造血干細(xì)胞移植的短期和長(zhǎng)期長(zhǎng)活。從而可用于凍存建立胎盤和臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù)，在胎盤供者本人(自體)或其他人(異體)患各種造血干細(xì)胞移植適應(yīng)癥時(shí)應(yīng)用，也可結(jié)合著各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子在臨床上開展細(xì)胞修復(fù)。本發(fā)明為臨床提供了造血干細(xì)胞和干細(xì)胞的新來源，促進(jìn)了細(xì)胞移植和組織修復(fù)的發(fā)展。
文檔編號(hào)A61P7/00GK1407088SQ01131190
公開日2003年4月2日 申請(qǐng)日期2001年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月6日
發(fā)明者周勝利, 宋劍秋, 胡玉蘭 申請(qǐng)人:周勝利, 胡玉蘭