一種富含造血干細(xì)胞的臨床用臍血單核細(xì)胞的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種富含造血干細(xì)胞的臨床用臍血單核細(xì)胞 的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞(StemCelIs，SC)是一類具有自我復(fù)制能力（self-renewing)的多潛能細(xì) 胞，是原始且未特化的細(xì)胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞，具有再生各種組 織器官和人體的潛在功能。干細(xì)胞存在所有多細(xì)胞組織里，能經(jīng)由有絲分裂與分化來分裂 成多種的特化細(xì)胞，而且可以利用自我更新來提供更多干細(xì)胞。干細(xì)胞的來源有很多，包括 胎盤、臍帶、臍帶血與骨髓等。
[0003] 嬰兒出生后遺留在胎盤和臍帶中的血是干細(xì)胞的重要來源。臍帶血中的造血干細(xì) 胞可以用來治療多種血液系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病，包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤(如:急性白血 病、慢性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓異常增殖綜合癥和淋巴瘤等）、血紅蛋白病(如:海洋性 貧血）、骨髓造血功能衰竭（如：再生障礙性貧血）、先天性代謝性疾病、先天性免疫缺陷疾 患、自身免疫性疾患、某些實(shí)體腫瘤(如：小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌和進(jìn)行性肌營(yíng) 養(yǎng)不良等）。自1988年臍血干細(xì)胞就用來治療根達(dá)綜合癥、亨達(dá)綜合癥、和拉綜合癥和急性 淋巴細(xì)胞性白血病等許多兒童疾病。截至2011年，臍帶血不僅已能有效地治療幾十種難治 性疾病和多種不治之癥，而且它所能治療的疾病種類還在不斷地增加。自體儲(chǔ)存的臍帶血 一旦需要使用時(shí)，不需配型，細(xì)胞活性強(qiáng)，無免疫排斥的危險(xiǎn)，移植成活率高，治愈率高，醫(yī) 療費(fèi)用低。
[0004] 在人臍血中有一類具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞群體，被稱為人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。 人間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的潛能，在不同誘導(dǎo)條件下可分化為三胚層細(xì) 胞，如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。此外，還表達(dá)IL6、G-CSF和SCF等 多種造血細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的因子，能夠維持長(zhǎng)期培養(yǎng)的造血祖細(xì)胞增殖，顯示MSC具有支持 造血和促進(jìn)造血恢復(fù)的作用。同時(shí)研究表明MSC具有免疫調(diào)節(jié)作用，在體外能夠抑制T淋巴 細(xì)胞增殖，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSCs移植可以抑制異體免疫反應(yīng)，減輕移植相關(guān)的排斥反應(yīng)， 并延長(zhǎng)異體移植物的存活時(shí)間。最近的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSCs聯(lián)合造血干細(xì)胞移植可以減輕 GVHD并降低移植失敗率。MSC的多向分化能力和免疫調(diào)節(jié)能力決定了其在細(xì)胞治療、組織工 程等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0005] 目前常規(guī)臍血單核細(xì)胞(富含造血干細(xì)胞)多用動(dòng)物血清加白蛋白凍存，如雞、豬、 牛等，其中胎牛血清因獲取量大、污染輕而被廣泛應(yīng)用。但近年隨著人畜共患病發(fā)病率的增 加，以異種血清培養(yǎng)的組織向臨床應(yīng)用的安全性受到質(zhì)疑，因此自體血清培養(yǎng)越來越受到 重視。
[0006] 中國(guó)發(fā)明專利【申請(qǐng)?zhí)枴?01510159307.0公開了一種臍血單個(gè)核細(xì)胞凍存液、應(yīng)用、 制備方法。本發(fā)明提供的一種臍血單個(gè)核細(xì)胞凍存液，包括二甲基亞砜(DMS0)聯(lián)合勃脈力A (復(fù)方電解質(zhì)注射液）、羥乙基淀粉(HES)，該方案相比傳統(tǒng)配方，可避免動(dòng)物源性病原體的 污染，同時(shí)避免采用細(xì)胞培養(yǎng)基作為凍存液組成成分，并保證了良好的細(xì)胞凍存效果，凍存 2個(gè)月后，用本發(fā)明凍存液凍存的CBMC復(fù)蘇后細(xì)胞活率平均值為94.73%，顯著(P<0.05)高 于用傳統(tǒng)凍存液（10%DMS0+90%FBS)的凍存效果。細(xì)胞復(fù)蘇后可直接進(jìn)行臨床移植，在細(xì) 胞治療臨床應(yīng)用方面頗具實(shí)用價(jià)值。
[0007] 中國(guó)發(fā)明專利【申請(qǐng)?zhí)枴?2103676.4公開了臍血造血干細(xì)胞的制作方法，按如下步 序進(jìn)行：（1)采集臍血，將出生的胎兒的臍血采到臍血采集袋內(nèi)；（2)加入紅細(xì)胞沉淀劑；（3) 離心分離1，將臍血采集袋中臍血中的紅細(xì)胞分離；（4)移出紅細(xì)胞，將紅細(xì)胞輸送到紅細(xì)胞 收集袋內(nèi)；（5)離心分離2,將白細(xì)胞包括造血干細(xì)胞與血漿再一次分離；（6)移出血漿，將被 分離的血漿輸入到血漿收集袋內(nèi)，臍血收集袋內(nèi)剩余的臍血為含富集白細(xì)胞的臍血；（7)加 入冷凍劑，將臍血收集袋中的富集白細(xì)胞臍血中加入冷凍劑；（8)包裝；（9)降溫；（10)入庫 保存。用本發(fā)明方法制作的造血干細(xì)胞可長(zhǎng)期存放，以便于隨時(shí)取用，大大地方便了治療， 及時(shí)解除病人痛苦，適用于制作在臍血庫中長(zhǎng)期存放的造血干細(xì)胞。
[0008] 但目前公開的各類間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法雖均能獲得臍血單核細(xì)胞（富含造血干 細(xì)胞），但都不符合臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明擬從原料采集開始直至細(xì)胞制備完成的全過程 進(jìn)行臨床級(jí)、統(tǒng)一、系統(tǒng)監(jiān)控，以實(shí)現(xiàn)臍血單核細(xì)胞(富含造血干細(xì)胞)的臨床標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種富含造血干細(xì)胞的臨床用臍血單核細(xì)胞的制 備方法，本發(fā)明制備方法在臍帶采集前對(duì)產(chǎn)婦進(jìn)行篩選，以符合條件的健康足月產(chǎn)婦志愿 者作為采集目標(biāo)，之后進(jìn)行分離直接進(jìn)行冷凍保存，對(duì)分離過程及冷凍過程的的中間品進(jìn) 行一系列質(zhì)量檢測(cè)，冷凍后細(xì)胞復(fù)蘇洗滌待用，活率無明顯降低。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 本發(fā)明提供了一種富含造血干細(xì)胞的臨床用臍血單核細(xì)胞的制備方法，包括如下 步驟：
[0012] 步驟A，取適量分娩獲得的臍帶血，置于臍血保存袋中冷藏保存；
[0013]步驟B，臍血分離:將臍血通過兩步離心法去掉絕大多數(shù)紅細(xì)胞，分離出我們要的 單核細(xì)胞層，用高溫滅菌過的超純水裂解兩次，去除分離出的紅細(xì)胞，以及保留分離出的血 漿;采用高溫消毒滅菌的超純水去除紅細(xì)胞，可以避免回輸時(shí)紅細(xì)胞引起的負(fù)面作用。
[0014]步驟C，臍血有核凍存:收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)和活率，按3X10%1/管進(jìn)行冷凍保存;并 將細(xì)胞上清進(jìn)行無菌檢測(cè)、支原體檢測(cè)，取5X106細(xì)胞做細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)；
[0015] 步驟D，臍血單核細(xì)胞成分鑒定:臍血單個(gè)核細(xì)胞⑶34/CD45抗原表達(dá)及HSC-CFU培 養(yǎng)；
[0016]步驟E，臨床用臍血單核細(xì)胞使用：取冷凍細(xì)胞，復(fù)蘇后紅細(xì)胞會(huì)全部破碎，用生理 鹽水洗滌兩遍，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果按臨床需要將細(xì)胞和復(fù)方電解質(zhì)溶 液混勻待用;并留樣進(jìn)行內(nèi)毒素和細(xì)菌檢測(cè)。該凍存細(xì)胞復(fù)蘇后紅細(xì)胞會(huì)全部破碎，可以避 免回輸時(shí)紅細(xì)胞引起的負(fù)面作用。
[0017]優(yōu)選地，步驟A中，所述分離獲得的臍帶通過篩選、采集健康足月產(chǎn)婦志愿者臍帶 獲得，所述篩選的檢測(cè)項(xiàng)目包括攜帶病毒或遺傳家族史。所述病毒如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒 等。
[0018] 優(yōu)選地，步驟A中，所述臍血保存袋只有標(biāo)準(zhǔn)量的血液抗凝劑，不含有血清培養(yǎng)基， 不含抗生素?？删S持臍血活性長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)，避免了臨床應(yīng)用時(shí)的抗生素過敏問題。
[0019] 優(yōu)選地，步驟A中，所述臍帶置于臍血保存袋中4°C冷藏保存，并在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分 離處理。
[0020] 優(yōu)選地，步驟B中，所述兩步離心法采用醫(yī)用級(jí)別淋巴分離液。所述分離液成分明 確，符合臨床級(jí)別。
[0021]優(yōu)選地，步驟C中，所述冷凍處理采用的細(xì)胞冷凍保護(hù)液由90%血漿和10%的二甲 基亞砜(體積百分比）配制而成，保護(hù)細(xì)胞活性。所述血漿為自體血漿。我們采用臍血本身血 漿作為凍存防護(hù)劑，可以避免其他動(dòng)物源蛋白的影響，更符合臨床標(biāo)準(zhǔn)。
[0022] 優(yōu)選地，步驟C中，所述無菌檢測(cè)包括用血培養(yǎng)儀進(jìn)行細(xì)菌和真菌檢測(cè);所述支原 體檢測(cè)包括用PCR法進(jìn)行支原體檢測(cè)。
[0023] 本發(fā)明完全沒有使用外援蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞處理。以及冷凍保護(hù)也用自體血漿，避 免不明動(dòng)物源蛋白進(jìn)入人體引起的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0025] 1、全過程全面質(zhì)量監(jiān)控，從臍帶采集前的篩選開始直至細(xì)胞制備成成品中間品及 終產(chǎn)品的質(zhì)量全部受控。
[0026] 2、無其他動(dòng)物血清蛋白質(zhì)等，不使用抗生素，避免異源蛋白及抗生素可能引起的 疾病或過敏風(fēng)險(xiǎn)。
[0027] 3、剔除所有紅細(xì)胞避免了回輸時(shí)紅細(xì)胞引起的負(fù)面作用。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 本實(shí)施例提供一種臨床用臍血單核細(xì)胞(富含造血干細(xì)胞)的制備方法，具體包括 如下步驟：
[0031] 步驟一、臍血篩選與保存:篩選、采集健康足月產(chǎn)婦志愿者臍帶(樣本1)，置于臍血 保存袋中4°C冷藏，并于24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分離處理；
[0032] 步驟二、臍血分離:將臍血通過兩步離心法去掉絕大多數(shù)紅細(xì)胞，分離出我們要的 單核細(xì)胞層，用高溫滅菌過的超純水裂解兩次，去除分離出的紅細(xì)