專利名稱：聚乳酸－聚乙二醇共聚物為佐劑的乙肝疫苗的制作方法
我國(guó)是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)攜帶者高達(dá)1億之多，現(xiàn)患慢性乙型肝炎已達(dá)2000萬(wàn)人，嚴(yán)重威脅著人民健康和民族身體素質(zhì)。目前有多種治療乙型肝炎的藥品，但尚無(wú)令人滿意的特效藥，急待研究適合于我國(guó)國(guó)情的、廉價(jià)、有效、使用方便的藥物。酵母重組乙型肝炎疫苗是廣泛使用的具有顯著預(yù)防效果的制品，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已在研究將乙型肝炎疫苗用于治療慢性乙型肝炎患者。我國(guó)正在生產(chǎn)釀酒酵母和CHO細(xì)胞重組的乙肝疫苗，并且進(jìn)一步研制和開發(fā)了另一種酵母重組疫苗(漢遜酵母表達(dá))，實(shí)驗(yàn)證明該疫苗可誘導(dǎo)較好的體液免疫(抗-HBsAg)和細(xì)胞免疫，而且對(duì)HBsAg和HBeAg雙陽(yáng)性母親生下的新生兒出生后在24小時(shí)內(nèi)按當(dāng)時(shí)、一個(gè)月、六個(gè)月間隔免疫接種三針10μg疫苗后保護(hù)效果高達(dá)95％，即所謂母嬰傳播阻斷率很高。這說(shuō)明以氫氧化鋁為佐劑的現(xiàn)行疫苗在圍產(chǎn)期接種后仍能消除新生兒已感染的乙肝病毒，因此從這一點(diǎn)來(lái)說(shuō)乙肝疫苗對(duì)乙型肝炎有一定的治療作用。
現(xiàn)有技術(shù)中只有鋁鹽為唯一準(zhǔn)許用于人類的佐劑。該佐劑具有成本低、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，然而大量研究表明鋁佐劑在提高疫苗的體液免疫水平(抗體滴度)的同時(shí)，抑制了細(xì)胞免疫活性。體液免疫主要是通過(guò)B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，可消除細(xì)胞外的病原體和毒素，主要起預(yù)防作用；細(xì)胞免疫—T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對(duì)胞內(nèi)感染的病原體和毒素有一定的清除能力，具有一定的治療作用。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種含新型佐劑的乙型肝炎疫苗，該疫苗可能具有治療乙型肝炎的用途。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備本發(fā)明所述的疫苗的方法。
在本發(fā)明中，采用的佐劑是聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)，它是一種可生物降解的、生物相容性優(yōu)良的高分子聚合物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)證明，把乙肝表面抗原包被在PELA內(nèi)部制備成微球，使用該微球和未包被HbsAg以適當(dāng)?shù)谋壤旌?，能夠制成一種新的疫苗，該疫苗可提高哺乳動(dòng)物包括人的免疫體液免疫和細(xì)胞免疫水平，此外，PELA微球具備一定的緩釋效果。因此，以PELA為佐劑的乙肝疫苗在預(yù)防上可能會(huì)減少免疫接種次數(shù)，并且可能增加新生兒出生后接種時(shí)間的靈活性，更有希望在臨床上起到較好的治療效果。此疫苗可作為凍干制劑和液體制劑，后者需要加上氨基酸或明膠保護(hù)劑，使疫苗便于保存及效期得以延長(zhǎng)。
具體講，本發(fā)明的技術(shù)方案是以下面所述的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的?？梢砸?jiàn)得，本發(fā)明涉及一種乙型肝炎疫苗，包括粒徑為0.5～5微米的包被乙型肝炎表面抗原的聚乳酸-聚乙二醇共聚物微球，其中被保被的乙型肝炎表面抗原與所述的聚合物的比例為1.5％～3％(重量％)。換言之，0.2～1毫升的疫苗中包被在微球中的乙型肝炎表面抗原的含量為1～40μg。
可以向上述的0.2～1毫升的疫苗中加入0～40μg的未包被(或相對(duì)于包被的抗原而言稱游離的)的乙型肝炎表面抗原。即每人份的上述疫苗中未包被的乙型肝炎表面抗原的最大加入量為40μg。
本文中所述的0.2～1毫升的疫苗事實(shí)上是與現(xiàn)有技術(shù)人員公知的每人份的疫苗使用劑量相當(dāng)。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知在制備疫苗的過(guò)程中，疫苗中含有乙肝表面抗原的劑量是可以在熟知的范圍內(nèi)進(jìn)行濃縮或稀釋等等調(diào)整，以期達(dá)到接種人員實(shí)際使用的劑量。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明的乙型肝炎疫苗的方法，該方法包括(1)用聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)包被HBsAg制成0.5～5微米的微球，其中被包被的乙型肝炎表面抗原與所述的聚合物的比例為1.5％～3％(重量％)，制成凍干制劑；(2)將凍干制劑用生理鹽水懸浮，調(diào)成含有1～40μg/0.2～1毫升乙型肝炎表面抗原微球懸液。
根據(jù)本發(fā)明，可以向上述的微球懸液中加入游離的乙型肝炎表面抗原0～40μg(pH7.2-7.4)，制得乙型肝炎疫苗。
為了清楚理解本發(fā)明，以下將結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明之，但是以下的實(shí)施例并非限定本發(fā)明。


圖1為
ConA誘導(dǎo)不同制劑免疫小鼠脾細(xì)胞的體外增殖試驗(yàn)結(jié)果圖其中，A1.HBsAg(不含alum)免疫，2.PELA包裹HbsAg免疫，3.PELA免疫，4.HBsAg(含alum)免疫，5.對(duì)照組BSI＝ConA刺激孔的cpm/無(wú)ConA刺激孔的cpm圖2為L(zhǎng)PS誘導(dǎo)不同制劑免疫小鼠脾細(xì)胞的體外增殖試驗(yàn)結(jié)果圖其中，SI＝LPS刺激孔的cpm/無(wú)LPS刺激孔的cpm。
SI＝cpm of tube with ConA/cpm of tube without ConA。
圖3為不同制劑誘導(dǎo)小鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)結(jié)果圖其中，A1.對(duì)照，2.PELA包裹的HBsAg，3.HBsAg(含alum)，4.HBsAg(不含alum)，5.PELA。柱黑部分為平均值，虛線部分為MEAN+/-1.0SD。
B差值＝攻擊后足墊厚度-攻擊前足墊厚度。
*P＜0.05與對(duì)照組比較。
將制備好的所述微球疫苗懸浮于12ml生理鹽水中，得一微球懸液，取0.5ml微球懸液，用1～3毫升二氯甲烷萃取后，采用Lowry法測(cè)定該微球懸液的蛋白濃度為217μg/ml(即微球中HBsAg的濃度)，此微球中的聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)的含量為10633μg/ml。
取濃度為217μg/ml的微球懸液139μl，滴加2mg/mlHBsAg7.5μl，再加入753.5μl的生理鹽水，配成微球加游離HBsAg的懸浮液，其pH值為7.2，即制成乙型肝炎疫苗。該疫苗中微球中的HBsAg濃度為33.33μg/ml，游離HBsAg的濃度為16.67μg/ml。
實(shí)施例2采用溶劑蒸發(fā)技術(shù)將15mgHBsAg包被在585mgPELA中，用蒸餾水洗滌3次后，制成0.5微米的含有乙肝表面抗原的微球。
將制備好的所述微球懸浮于12ml生理鹽水中，得一微球懸液，即制得乙型肝炎疫苗。
取0.5ml微球懸液，用3毫升二氯甲烷萃取后，采用Lowry法測(cè)定該微球懸液的蛋白濃度為996μg/ml(即微球中HBsAg的濃度)，此微球中的聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)的含量為38844μg/ml。
實(shí)施例3取濃度為217μg/ml的微球懸液139μl，滴加20μg/ml含鋁鹽的HBsAg750μl，再加入11μl的生理鹽水，配成微球加含鋁鹽的HBsAg的懸浮液，得一疫苗，其中該疫苗中的HBsAg濃度為33.33μg/ml，含鋁鹽的HBsAg的濃度為16.67μg/ml，鋁鹽(AL(OH)3)的濃度為1.04mg/mL。
實(shí)施例4取濃度為217μg/ml的微球懸液208μl，滴加20μg/ml含鋁鹽的HBsAg1500μl，再加入92μl的生理鹽水，配成微球疫苗加含鋁鹽的HbsAg的懸浮液，其中微球疫苗中的HBsAg濃度為50μg/ml，含鋁鹽的HbsAg的濃度為33.33μg/ml，鋁鹽(AL(OH)3)的濃度為2.08mg/mL。
實(shí)驗(yàn)例1取實(shí)施例1得到的疫苗懸浮液皮下免疫8-10周的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠60μl，其中疫苗中HBsAg含量為2μg/只，未包被的HBsAg含量為1μg/只，PELA的含量為98μg/只。
實(shí)驗(yàn)例2取此經(jīng)實(shí)施例2得到的疫苗皮下免疫8-10周的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠60μl，其中微球疫苗中HBsAg含量為3μg/只，游離HBsAg含量為2μg/只，PELA的含量為148μg/只。
實(shí)驗(yàn)例3取實(shí)施例3制得的疫苗懸浮液皮下免疫8-10周的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠60μl，其中微球疫苗中HBsAg含量為2μg/只，游離HbsAg含量為1μg/只，PELA的含量為98μg/只，鋁鹽的含量為62.4μg/只，此組作為對(duì)照組。
實(shí)驗(yàn)例4取經(jīng)實(shí)施例4制得的疫苗懸浮液皮下免疫8-10周的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠60μl，其中微球疫苗中HBsAg含量為3μg/只，游離HBsAg含量為2μg/只，PELA的含量為148μg/只，鋁鹽的含量為124.8μg/只，此組作為對(duì)照組。
同時(shí)設(shè)立微球疫苗、游離HBsAg、以鋁鹽為佐劑的HBsAg作為對(duì)照組，這幾組對(duì)照組中的HbsAg免疫小鼠的量為3μg/只或5μg/只。
檢測(cè)以上幾組的體液免疫效果及細(xì)胞免疫的效果，體液免疫的效果包括不同佐劑與乙肝表面抗原(HBsAg)配比免疫小鼠一個(gè)月后抗HBsAg的水平細(xì)胞免疫的效果包括免疫小鼠的脾細(xì)胞體外經(jīng)HBsAg刺激對(duì)T細(xì)胞增殖的影響、LPS誘導(dǎo)不同制劑免疫小鼠脾細(xì)胞的體外增殖試驗(yàn)、ConA誘導(dǎo)不同制劑免疫小鼠脾細(xì)胞的體外增殖試驗(yàn)、不同制劑誘導(dǎo)小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)、不同制劑誘導(dǎo)小鼠后的脾臟重量指數(shù)。
下表1顯示不同佐劑與乙肝表面抗原(HBsAg)配比免疫小鼠一個(gè)月后體液免疫的效果表1免疫類型HBsAg 抗-HBsAg(cpm)S/N 血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)(μg/mouse)(X±SD) No. ％AL(OH)3-HBsAg 37622.71±5047.3220.11±13.31 9/10 90AL(OH)3-HBsAg 57318.99±5628.1719.31±14.810/101005PELA-HbsAg 32690.44±3889.827.10±10.264/10 40PELA-HbsAg 55956.63±5065.6815.71±13.38/10 806PELA-HBsAg+316583.72±5024.59 43.76±13.210/10100HBsAg 5PELA-HBsAg+517149.73±5747.71 45.23±15.19/9 100HBsAg 6PELA-HBsAg+3 437.98±266.871.16±0.70 2/10 20AL(OH)3PELA-HBsAg+5 334.15±223.390.88±0.60 1/10 10AL(OH)3PELA-HBsAg+310433.58±7061.86 27.52±18.69/10 90AL(OH)3-HBsAg 3PELA-HBsAg+5 9648.77±8600.04 25.45±22.68/10 80AL(OH)3-HBsAg 9注將不同制劑皮下免疫小鼠，一個(gè)月后采血，分離血清，用放免試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)例5ConA誘導(dǎo)不同制劑免疫小鼠脾細(xì)胞的體外增殖試驗(yàn)試驗(yàn)方法用PELA包裹的HBsAg、HBsAg(含alum)、HBsAg(不含alum)、PELA皮下免疫小鼠(Balb/c，♀，8-10周)，分別于第5日、10日、15日、20日、25日處死，制備脾懸液，于96孔培養(yǎng)板上每孔加入200μl該懸液(2×106個(gè)細(xì)胞·ml-1)和20μlConA，ConA的終濃度為5μg·ml-1，對(duì)照孔用完全培養(yǎng)基代替ConA，試驗(yàn)和對(duì)照均設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)板置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)72小時(shí)，培養(yǎng)終止前6小時(shí)，加入3H-TDR，每孔1μCi。收獲細(xì)胞，用β液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)cpm值。數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定采用方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，加ConA的cpm值/不加ConA的cpm值表示刺激指數(shù)(SI)，受試組的SI顯著高于對(duì)照組的SI，即可判定其結(jié)果陽(yáng)性。結(jié)論從5個(gè)天數(shù)來(lái)看，PELA包裹的HBsAg免疫小鼠后，對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)在第25天時(shí)SI最高，且顯著高于對(duì)照組及其它制劑組，說(shuō)明PELA包裹的HBsAg對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)有加強(qiáng)作用，即對(duì)T細(xì)胞的增殖有加強(qiáng)作用。同時(shí)，隨著天數(shù)的增加，此種制劑對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)有逐漸增強(qiáng)的作用，而HBsAg(含alum)、HBsAg(不含alum)并無(wú)此作用，說(shuō)明其具備一定的緩釋作用。
其結(jié)果見(jiàn)圖1。
實(shí)驗(yàn)例6 LPS誘導(dǎo)不同制劑免疫小鼠脾細(xì)胞的體外增殖試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)例5相同的方法實(shí)施本實(shí)施例，得出的結(jié)果見(jiàn)圖2。參照?qǐng)D2可得出以下結(jié)論1.對(duì)于LPS的反應(yīng)性，PELA包裹的HBsAg隨天數(shù)的增加，有增加的趨勢(shì)，并且在第25天時(shí)達(dá)到最高，與其它組比較均有顯著性差異，說(shuō)明其對(duì)B細(xì)胞的增殖有加強(qiáng)作用。
2.對(duì)于LPS的反應(yīng)性，PELA在第10天、15天、20天的SI均較高，與其它組比較均有顯著性差異，說(shuō)明單純佐劑對(duì)B細(xì)胞的增殖有增強(qiáng)作用。實(shí)驗(yàn)例7免疫小鼠的脾細(xì)胞體外經(jīng)HBsAg刺激對(duì)T細(xì)胞增殖的影響本試驗(yàn)方法同ConA誘導(dǎo)不同制劑免疫小鼠脾細(xì)胞的體外增殖試驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)例5)相同表2HBsAgmedium 50μg/ml30μg/ml 5μg/mln (cpm)cpmSI cpm SI cpm SI正常動(dòng)物 838±93 274±700.3266±9 0.3 374±66 0.4HBsAg(含alum)542±232 673±217 1.2472±144 0.9 406±22 0.7PELA包被HBsAg388±62 1802±1038 4.6*605±411.6 664±57 1.7HBsAg(不含alum) 622±242 315±139 0.5338±153 0.5 402±86 0.6表中SI＝HBsAg刺激孔的cpm/無(wú)HBsAg刺激孔的cpm*SI＞2.1為陽(yáng)性通過(guò)表2可以得出以下結(jié)論P(yáng)ELA包裹的HBsAg免疫小鼠后，體外用HBsAg刺激后T細(xì)胞增殖增強(qiáng)，說(shuō)明此制劑對(duì)T細(xì)胞的增殖、活化有加強(qiáng)作用。實(shí)驗(yàn)例8 不同制劑誘導(dǎo)小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)方法分別用PELA包裹的HBsAg、HBsAg(含alum)、HBsAg(不含alum)、PELA皮下免疫小鼠(Balb/c，♀，8-10周)(每只5μg)，2周后腹腔免疫綿羊紅細(xì)胞(SRBC約1×108)，4天后測(cè)量左后足跖部厚度，然后在測(cè)量部位皮下注射SRBC(約1×108)，注射后24小時(shí)分別測(cè)量左后足跖部厚度，同一部位測(cè)量三次，取平均值。數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定采用方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，以攻擊前后足跖厚度的差值來(lái)表示DTH的程度。受試組的差值顯著高于對(duì)照組的差值，即可判定該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。結(jié)論以PELA為佐劑的HBsAg、PELA免疫小鼠后的遲發(fā)型超敏反應(yīng)顯著優(yōu)于對(duì)照組(正常小鼠)及以alum為佐劑HBsAg、HBsAg(不含alum)，說(shuō)明PELA對(duì)SRBC所引起的遲發(fā)型超敏反應(yīng)有增強(qiáng)作用，而遲發(fā)型超敏反應(yīng)是由TDTH細(xì)胞引起的，所以PELA對(duì)TDTH細(xì)胞的功能有增強(qiáng)作用。其詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎疫苗，它含有粒徑為0.5～5微米包被乙型肝炎表面抗原的聚乳酸-聚乙二醇共聚物微球，其中包被的乙型肝炎表面抗原與所述的聚合物的比例為1.5％～3％(重量％)。
2.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎疫苗，其特征在于可以向所述的疫苗中加入未包被乙型肝炎表面抗原，加入量為0～40μg/0.2～1毫升疫苗。
3.一種制備乙型肝炎疫苗的方法，該方法包括(1)用聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)包被乙型肝炎表面抗原制成粒徑為0.5～5微米的微球，其中被包被的乙型肝炎表面抗原與所述的聚合物的比例為1.5％～3％(重量％)，制成凍干制劑；(2)將凍干制劑用生理鹽水懸浮，調(diào)成含有1～40μg/0.2～1毫升的乙型肝炎表面抗原的微球懸液，制得乙型肝炎疫苗。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于可以向上述的微球懸液中加入未包被的乙型肝炎表面抗原0～40μg/0.2～1毫升疫苗。
5.如權(quán)利要求1所述的乙肝疫苗在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種具有預(yù)防和治療作用的乙型肝炎疫苗,它含有包被乙型肝炎表面抗原的,做為佐劑的聚乳酸－聚乙二醇共聚物微球,其中保被的乙型肝炎表面抗原與所述的聚合物的比例為1.5%～3%(重量%)。可以向疫苗中加入未包被的乙型肝炎表面抗原,加入量為0～40μg/0.2～1毫升疫苗。
文檔編號(hào)A61P1/16GK1387914SQ01118448
公開日2003年1月1日 申請(qǐng)日期2001年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月30日
發(fā)明者李河民, 廖雪雁, 梁爭(zhēng)論, 張華遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:中國(guó)藥品生物制品檢定所