專利名稱：地黃提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥制劑領(lǐng)域，具體涉及中藥地黃提取物及其制備方法和應(yīng)用。
肥胖是由于能量物質(zhì)攝入超過(guò)消耗，體內(nèi)脂肪積聚過(guò)多造成的疾病。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示，美國(guó)的肥胖總?cè)藬?shù)達(dá)9700萬(wàn)，在20歲以上人口中，30％為肥胖，我國(guó)人民隨著生活水平的提高，肥胖發(fā)生率也逐年升高，肥胖人數(shù)達(dá)到7000萬(wàn)，青少年肥胖正在影響民族素質(zhì)，已成流行病。肥胖不僅降低患者的生活質(zhì)量，而且與高血壓、糖尿病、冠心病、高血脂、性功能障礙乃至腫瘤等多種疾病密切相關(guān)，所以，抗肥胖保健食品或藥物的研制，不僅可以減少肥胖人數(shù)，提高人民的生活、工作質(zhì)量，延長(zhǎng)壽命，還可防治與治療肥胖相關(guān)的病癥。目前，國(guó)外減肥藥作用于局部環(huán)節(jié)，有較多的副反應(yīng)，停藥后反彈嚴(yán)重。
本發(fā)明的目的是以中藥地黃為原料，提取有效組分，制成防治肥胖的保健食品，另一目的是將有效成份配以輔料制成有明確的作用機(jī)制的中藥制劑及其在防治肥胖及肥胖病藥中的應(yīng)用。
地黃Rehmannia glutinosa Libosch為常用中藥，始載于神農(nóng)本草經(jīng)，列位上品，主要含環(huán)烯醚萜類，功能清熱涼血，養(yǎng)陰生津，用于熱病舌絳，煩渴，陰虛內(nèi)熱，骨蒸勞熱，吐血，發(fā)斑發(fā)疹等。
本發(fā)明通過(guò)以下方法提取有效組分取生地黃用水浸泡過(guò)夜后，置80℃處理4小時(shí)，濾液濃縮為每毫升液體中含有1克地黃即得提取物地黃原液，高效液相測(cè)試，以2％乙晴為流動(dòng)相，210nm掃描波長(zhǎng)，測(cè)得在保留時(shí)間為t=9.1min左右有地黃主要成分梓醇的吸收峰；地黃原液色澤棕褐，聞之有濃香，味微苦，pH偏酸。本發(fā)明地黃提取物作為活性組分，配以各種輔料可制成膠囊、片劑、顆粒劑、丸劑、散劑、湯劑以及復(fù)方制劑。
本發(fā)明經(jīng)體外細(xì)胞及動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)地黃原液可抑制脂肪細(xì)胞分化，抑制動(dòng)物體內(nèi)脂肪組織的形成，降低血漿膽固醇、甘油三酯和血糖的濃度，并增加血漿高密度脂蛋白的濃度，作為活性組分，配以各種輔料，可制成防治肥胖的保健食品和防治肥胖的中藥制劑。
以下舉實(shí)施例說(shuō)明。
實(shí)施例1地黃原液抑制脂肪細(xì)胞的分化本發(fā)明試驗(yàn)用3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞系引自美國(guó)John HopKinsUniversity醫(yī)學(xué)院，建立誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞的模型在含10％小牛血清的DMEM培液中培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞成單層，然后加入MIX(甲基異丁基黃嘌呤)0.52mM、胰島素1.7uM、地塞米松1uM刺激培養(yǎng)2天，換以只含胰島素1.7uM的分化液，繼續(xù)培養(yǎng)，以后每隔2天換分化液。使梭形前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閳A而大，充滿了脂滴的脂肪細(xì)胞。
試驗(yàn)中，在刺激細(xì)胞的同時(shí)(0h)加入地黃原液可強(qiáng)烈抑制脂肪細(xì)胞的分化，在刺激后12h,24h加入藥物仍有明顯的抑制作用，在0h加入不同濃度(0.01％-4％)的地黃原液，抑制分化的效應(yīng)隨濃度的升高而加強(qiáng)，為了確定是否由于藥物的毒性而抑制脂肪細(xì)胞的分化，本發(fā)明進(jìn)行了藥物毒性測(cè)試從形態(tài)學(xué)上可見(jiàn)在有效濃度(0.01％-4％)范圍內(nèi)，3T3-L1前脂肪細(xì)胞，不加分化刺激劑，只加地黃原液，細(xì)胞生長(zhǎng)分裂旺盛，與不加地黃原液的3T3-L1前脂肪細(xì)胞沒(méi)有差別；用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活力配制5mg/ml的MTT溶液，閉光保存；3T3-L1細(xì)胞傳至96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后，加入含0.25％,1％,4％三種濃度的地黃原液培液中作用2天，然后加MTT溶液，作用4小時(shí)，去除培液，加入200ulDMSO和25ulSorensen’sGlysine buffer，于570nm波長(zhǎng)段分析其吸光率。結(jié)果顯示在有效濃度(0.01％-4％)范圍內(nèi)，藥物不影響細(xì)胞的活力，相反有益于細(xì)胞的生長(zhǎng)。
在誘導(dǎo)分化3天后，取對(duì)照的正常分化細(xì)胞和經(jīng)地黃原液處理的細(xì)胞，以異硫氰酸胍法抽提RNA，用DIG標(biāo)記C/EBPα和422/aP2基因探針(試劑盒購(gòu)自寶靈曼公司)，與細(xì)胞總RNA作核酸斑點(diǎn)雜交，(C/EBPα為脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可激活成熟脂肪細(xì)胞所具有的系列特異性蛋白的表達(dá)，如422/aP2為脂肪細(xì)胞特異的脂肪酸結(jié)合蛋白，這些特征蛋白的表達(dá)使前脂肪細(xì)胞獲得合成甘油三酯的能力，并形成脂滴聚集的圓形大脂肪細(xì)胞。)結(jié)果顯示，地黃原液處理后的細(xì)胞，C/EBPα基因的轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照細(xì)胞降低86.1％,422/aP2基因的轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照細(xì)胞降低37％。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，結(jié)果不變。
在誘導(dǎo)分化3天后，取對(duì)照的正常分化細(xì)胞和經(jīng)地黃原液處理的分化細(xì)胞，以異硫氰酸胍法抽提RNA，采用RT-PCR法，以β-actin為內(nèi)對(duì)照，分析藥物對(duì)leptin mRNA表達(dá)水平的影響。(leptin為肥胖基因的表達(dá)產(chǎn)物，在脂肪細(xì)胞中表達(dá)量最高，具有調(diào)節(jié)能量平衡、食欲、免疫和生殖等廣泛的生理學(xué)效應(yīng)，血漿leptin濃度增加，通過(guò)下丘腦，使食欲下降，因此與肥胖有很大的相關(guān)性。設(shè)計(jì)leptin引物為P15’-ACGCAGTCGGTATCCGCAA-3’P2 5’-GCTCTATGCCAACACAGTGC-3’；設(shè)計(jì)β-actin引物為P1 5’-CTCTATGCCAACACAGTGC-3’P2 5’-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3’。由總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，按以下方案PCR擴(kuò)增94℃變性后加入Taq酶，經(jīng)94℃30”,60℃1’,68℃1’30次循環(huán)，68℃延伸7’，結(jié)束后1.2％瓊脂糖凝膠電泳，用Pharmacia核酸蛋白自動(dòng)成像系統(tǒng)對(duì)電泳區(qū)帶灰度掃描，結(jié)果顯示地黃原液可促進(jìn)脂肪細(xì)胞中肥胖基因leptin表達(dá)。
脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，經(jīng)地黃原液處理后，采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的蛋白表達(dá)量的變化。以60mM Tris-HCl，1％SDS溶液提取全細(xì)胞組分；刺激0h加入1％地黃原液后，按照標(biāo)準(zhǔn)分化方案培養(yǎng)1天后，提取全細(xì)胞蛋白，檢測(cè)C/EBPβ蛋白的表達(dá)；培養(yǎng)3天、5天，檢測(cè)C/EBPα的表達(dá)；培養(yǎng)5天檢測(cè)422/aP2，Glut4蛋白的表達(dá)水平。(C/EBPβ為脂肪細(xì)胞分化的早期蛋白，可能具有促進(jìn)C/EBPα表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)分化的作用；Glut4也為脂肪細(xì)胞后期表達(dá)的特征蛋白，與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。)結(jié)果顯示這些蛋白的表達(dá)均受到不同程度的抑制。實(shí)施例2，地黃原液防止大鼠飲食性肥胖。采用重量為200克左右的SD雄性大鼠12只/批，(從上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部購(gòu)得)，其飲食方案如下配制，光照，晝夜節(jié)律等環(huán)境因素兩組一致。甜全脂奶粉 44％標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料 47％玉米油 8％玉米淀粉 1％地黃活性組分 1％培養(yǎng)10周后，對(duì)照組大鼠重約500克，明顯高于正常飲食的大鼠，說(shuō)明飲食誘導(dǎo)的肥胖動(dòng)物模型制造成功。將SD雄性大鼠隨機(jī)分為2組，每組12只對(duì)照組大鼠高脂飲食中不加地黃原液，給藥組大鼠高脂飲食合地黃原液。觀察并計(jì)算大鼠每天攝食量，給藥組和對(duì)照組的食量類似，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。每周稱重動(dòng)物并記錄，得到動(dòng)物的周生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，給藥組雄性大鼠的體重比對(duì)照組大鼠降低17.6％,P＜0.05。
動(dòng)物處死后，觀察腹腔脂肪組織，發(fā)現(xiàn)給藥組大鼠大網(wǎng)膜及附睪脂肪組織均明顯少于對(duì)照組大鼠。大鼠的體重和大鼠腹腔內(nèi)脂肪組織重量，給藥組大鼠顯著低于對(duì)照組大鼠，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
取同一部位緊貼附睪上的脂肪組織，經(jīng)HE染色后直接觀察大鼠體內(nèi)脂肪細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果顯示給藥組大鼠的脂肪細(xì)胞屬小脂肪細(xì)胞(對(duì)胰島素敏感)，而對(duì)照組大鼠的為含大量脂滴的大脂肪細(xì)胞(對(duì)胰島素不敏感)。兩組血脂濃度有明顯區(qū)別給藥組血漿甘油三酯，膽固醇，血糖濃度低于對(duì)照組，前兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，而高密度脂蛋白則比對(duì)照組高。
TC總膽固醇，TG總甘油三酯，G血糖，HDL高密度脂蛋白用原位免疫組化技術(shù)檢測(cè)組織中l(wèi)eptin蛋白表達(dá)的變化，給藥組大鼠脂肪組織中l(wèi)eptin陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)于對(duì)照組。用RT-PCR檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)脂肪組織leptin的mRNA表達(dá)水平，顯示給藥組大鼠的表達(dá)水平比對(duì)照組大鼠的升高。用Western Blot技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物脂肪組織中C/EBPα、422/aP2、leptin的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，給藥組大鼠C/EBPα、422/aP2的表達(dá)低于對(duì)照組，而leptin的表達(dá)高于對(duì)照組大鼠。
以上實(shí)施例說(shuō)明地黃原液具有明顯的抑制脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)leptin表達(dá)和降低血漿甘油三酯，膽固醇和血糖，并升高血漿高密度脂蛋白，具有防止肥胖的效用和防治動(dòng)脈粥樣硬化的效用。實(shí)施例3本發(fā)明通過(guò)下述不同方法從地黃提取有效成份。方法1，取地黃剪碎后，用水煎煮后取湯劑提取有效成分，溫度從常溫到100℃方法2，取地黃剪碎后，直接用稀乙醇(甲醇)溶液提取方法3，按上述方法提取地黃原液后，加入乙醇(或異丙醇/甲醇)至80％以上，取其沉淀部分。
圖2為加入不同濃度的地黃原液抑制脂肪細(xì)胞分化的情況，均為分化刺激5天后，1為對(duì)照組，有多量成熟的大脂肪細(xì)胞；2為用低濃度(0.25％)地黃原液處理的細(xì)胞；3為用高濃度(1％)地黃原液處理的細(xì)胞，隨底荒原液濃度升高，對(duì)脂肪細(xì)胞分化的抑制效果加強(qiáng)。
圖3為地黃原液對(duì)前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，1為在前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中加入1％的地黃原液；2為前脂肪細(xì)胞對(duì)照，加入地黃原液后沒(méi)有影響前脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，即地黃原液對(duì)前脂肪細(xì)胞的省長(zhǎng)無(wú)直接損害，只作用于分化。
圖4為用點(diǎn)雜交的方法檢測(cè)分化3天和5天時(shí)脂肪細(xì)胞中C/EBPαmRNA的表達(dá)水平和地黃原液對(duì)其表達(dá)的影響。A:1,4為對(duì)照細(xì)胞mRNA,2,3為1％地黃原液處理的細(xì)胞mRNA。B以雜交點(diǎn)的灰度掃描值為縱坐標(biāo)比較對(duì)照組和藥物處理組細(xì)胞mRNA，該圖顯示經(jīng)地黃原液處理后，脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中C/EBPαmRNA的表達(dá)量顯著降低。
圖5用RT-PCR的方法，檢測(cè)脂肪細(xì)胞中l(wèi)eptin mRNA表達(dá)的狀況，各組均為分化5天，A為電泳的結(jié)果，1為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，2為分化5天的對(duì)照組細(xì)胞，3為經(jīng)0.125％地黃原液處理，4為經(jīng)0.25％地黃原液處理，5為經(jīng)1％濃度地黃原液處理，6為β-actin內(nèi)對(duì)照，7為leptin DNA陽(yáng)性對(duì)照。B以leptin/β-actin mRNA的灰度掃描比值為縱坐標(biāo)直接比較地黃原液對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響，顯示隨著藥物濃度的升高，具有增強(qiáng)脂肪細(xì)胞中l(wèi)eptin mRNA表達(dá)的作用。
圖6用Western的方法檢測(cè)地黃原液對(duì)分化1天的脂肪細(xì)胞中C/EBPβ蛋白表達(dá)的影響，38KD和18KD分別為C/EBPβ蛋白的兩種異構(gòu)體蛋白，該圖顯示在分化1天時(shí)，地黃原液對(duì)細(xì)胞C/EBPβ蛋白的表達(dá)有明顯的抑制作用。
圖7用Western的方法檢測(cè)地黃原液對(duì)分化5天的脂肪細(xì)胞中422/aP2蛋白表達(dá)的影響，A:1,6用4％地黃原液處理，2,5用1％地黃原液處理，3,4為對(duì)照組細(xì)胞，B以蛋白條帶的灰度掃描值為縱坐標(biāo)比較不同濃度地黃原液處理對(duì)細(xì)胞表達(dá)422/aP2蛋白的影s相cv，顯示隨著藥物濃度的升高，其抑制422/aP2蛋白表達(dá)的效應(yīng)增強(qiáng)。
圖8大鼠的周體重變化曲線，橫坐標(biāo)代表周數(shù)，縱坐標(biāo)為大鼠的體重，菱形圖標(biāo)代表對(duì)照組的大鼠，方形圖標(biāo)代表給藥組的大鼠，顯示給藥組大鼠的體重明顯低于對(duì)照組大鼠的體重。
圖9大鼠喂養(yǎng)10周后，大鼠腹腔大網(wǎng)膜和副睪脂肪組織分布的情況，左為對(duì)照組的大鼠，右為給藥組大鼠，顯示給藥組的大鼠大網(wǎng)膜和副睪上脂肪組織量均明顯少于對(duì)照組。


圖10地黃原液對(duì)大鼠血脂的影響，顯示給藥組大鼠的血漿膽固醇、甘油三酯、血糖水平明顯降低，而高密度脂蛋白水平則升高。
圖11用RT-PCR方法，檢測(cè)大鼠脂肪中l(wèi)eptin mRNA表達(dá)水平，A1為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，2,3為對(duì)照組大鼠脂肪組織，4,5,6,7為經(jīng)給藥組大鼠的脂肪組織，8為β-actin內(nèi)對(duì)照，9為leptin陽(yáng)性對(duì)照。B以leptin/β-actin的灰度比值為縱坐標(biāo)直接比較地黃原液對(duì)脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中l(wèi)eptin mRNA水平的影響，給藥后大鼠脂肪組織中l(wèi)eptin mRNA表達(dá)增加。
權(quán)利要求
1.地黃提取物在制備防治肥胖藥物中的應(yīng)用。
2.地黃提取物在制備防治與肥胖相關(guān)疾病如高血脂，糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
3.地黃提取物在制備預(yù)防肥胖和降低血脂，血糖，升高高密度脂蛋白保健品中的應(yīng)用。
4.一種地黃提取物的制備方法，其特征在于通過(guò)下述不同方法提取方法(1)，取地黃剪碎后，用水煎煮后取湯劑和提取活性成分方法(2)，取地黃剪碎后，直接用稀乙醇(甲醇)溶液提取活性組分方法(3)，按上述方法提取地黃原液后，加入乙醇(或異丙醇/甲醇)至80％以上，取其沉淀部分精制。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的地黃提取物的制備方法，其特征在于，所述提取物可作為活性組分配以各種輔料制成膠囊、片劑、顆粒劑、丸劑、散劑、湯劑以及復(fù)方制劑。
全文摘要
本發(fā)明屬中藥制劑領(lǐng)域，具體涉及中藥地黃提取物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)水提取，醇精制等方法制備地黃提取物，配以各種輔料，可制成作用機(jī)制明確的保健食品和中藥制劑。本發(fā)明可用于防治肥胖和與肥胖相關(guān)的疾病如高血脂、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。
文檔編號(hào)A61P3/06GK1317337SQ0110585
公開(kāi)日2001年10月17日 申請(qǐng)日期2001年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月4日
發(fā)明者宋后燕, 湯其群, 張乃嫻 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)