專利名稱：新化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多核苷酸(文中稱為“BASB132多核苷酸”)、這些多核苷酸編碼的多肽(文中稱為“BASB132”或“BASB132多肽”)，以及用于其產(chǎn)生的重組材料和方法。另一方面，本發(fā)明涉及這些多肽和多核苷酸的使用方法，其中包括抗細(xì)菌感染的疫苗。再一方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)某些病原體感染的診斷測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
粘膜炎莫拉氏菌(也叫粘膜炎布蘭漢氏球菌)是一種常分離自人類上呼吸道的革蘭氏陰性菌。它可引起數(shù)種疾病，主要是幼兒及兒童中耳炎和老年肺炎。它還能引起鼻竇炎和院內(nèi)感染，有時(shí)還可導(dǎo)致侵襲性疾病。
從發(fā)病數(shù)量和可能引發(fā)的后遺癥來(lái)看，中耳炎是一種重要的兒童期疾病。在美國(guó)，每年記錄在案的病例都在3,500,000例以上，估計(jì)有80％的兒童在3歲以前至少經(jīng)歷過(guò)一次耳炎發(fā)病(Klein，JO(1994)Clin.Inf.Dis19823)。這種疾病若不經(jīng)處理，或是轉(zhuǎn)為慢性，將會(huì)導(dǎo)致暫時(shí)性(液體在中耳內(nèi)累積時(shí))或永久性(聽(tīng)神經(jīng)損壞時(shí))的聽(tīng)力喪失。在幼兒中，這種聽(tīng)力喪失可能會(huì)造成語(yǔ)言學(xué)習(xí)延遲。
從患有中耳炎的兒童的中耳內(nèi)主要可分離出三種細(xì)菌肺炎鏈球菌、未分類流感嗜血菌(NTHi)和粘膜炎莫拉氏菌。這些細(xì)菌存在于60-90％的病例中。關(guān)于近期研究的一篇綜述顯示，肺炎鏈球菌和NTHi各占中耳炎病例的約30％，粘膜炎莫拉氏菌約占15％(Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60267)。從中耳內(nèi)還可分離出其他細(xì)菌(B型流感嗜血菌、釀膿鏈球菌等)，但出現(xiàn)率要低得多(占病例的2％或更低)。
流行病學(xué)的資料顯示，對(duì)中耳內(nèi)發(fā)現(xiàn)的病原體而言，在上呼吸道建群是耳炎產(chǎn)生的必需前提；但引起該疾病還需要其他因素(Dickinson，DPet al.(1988)J.Infect.Dis.158205，F(xiàn)aden，HL et al.(1991)Ann.Otorhinol.Laryngol.100612)。這些因素的重要性在于可引發(fā)細(xì)菌經(jīng)咽鼓管遷移到中耳內(nèi)，然后啟動(dòng)炎癥過(guò)程。目前對(duì)這些因素還不甚了解。據(jù)推測(cè)，例如病毒性感染后的免疫系統(tǒng)暫時(shí)性異?？赡軙?huì)造成無(wú)法控制呼吸道建群(Faden，HL et al(1994)J.Infect.Dis.1691312)。另一種解釋是，暴露于環(huán)境因素會(huì)使一些兒童出現(xiàn)更重要的建群，所以這些兒童因中耳病原體的持續(xù)存在而變得容易患中耳炎(Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60267)。
有關(guān)抗粘膜炎莫拉氏菌的免疫應(yīng)答的特性還了解得很少。從0歲生長(zhǎng)至2歲的幼兒的鼻咽中順序分離出菌株并進(jìn)行分析，其結(jié)果表明，他們經(jīng)常會(huì)感染新菌株，然后再將其清除。這說(shuō)明建群后的兒童能產(chǎn)生抗這種細(xì)菌的有效免疫應(yīng)答(Faden，HL et al(1994)J.Infect.Dis.1691312)。
在對(duì)成人的測(cè)試中，大多數(shù)都能鑒定出殺菌性抗體(Chapman，AJ etal.(1985)J.Infect.Dis.151878)。粘膜炎莫拉氏菌菌株在抵抗血清殺菌活性的能力上存在差異一般而言，患病個(gè)體的分離物要比只建群的個(gè)體的分離物更具有抗性(Hol，C et al.(1993)Lancet 3411281，Jordan，KLet al.(1990)Am.J.Med.88(suppl.5A)28S)。因此，可將血清抗性看作細(xì)菌的一種毒力因素。在中耳炎痊愈兒童的血清中發(fā)現(xiàn)了一種調(diào)理素活性。
OMP B1是一種84kDa的蛋白，其表達(dá)受鐵元素調(diào)控，它可被肺炎患者的血清識(shí)別(Sethi，S，et al.(1995)Infect.Immun.631516)，除了該蛋白以及UspA1和UspA2(Chen D.et al.(1999)，Infect.Immun.671310)之外，在人類中還未發(fā)現(xiàn)這些不同的免疫應(yīng)答所針對(duì)的其他抗原。
目前已利用生化方法對(duì)粘膜炎莫拉氏菌表面的其他一些膜蛋白進(jìn)行了特性鑒定，或是對(duì)這些膜蛋白在誘導(dǎo)保護(hù)性免疫方面的潛在作用進(jìn)行了研究(有關(guān)綜述可參考Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60267)。在小鼠肺炎模型中，針對(duì)其中一些膜蛋白(UspA、CopB)的抗體的存在有利于更快清除肺部感染。銅綠假單胞菌的孔蛋白能夠有效抵抗動(dòng)物模型中的這種細(xì)菌，有一種在粘膜炎莫拉氏菌菌株中高度保守的多肽(OMPCD)與孔蛋白具有同源性。
在過(guò)去幾十年中，粘膜炎莫拉氏菌感染的頻率大幅度提高。其原因是多重抗生素抗性菌株的出現(xiàn)和免疫系統(tǒng)薄弱人群的增加。分離出對(duì)某些或所有普通抗生素具有抗性的粘膜炎莫拉氏菌菌株已不再困難。這種現(xiàn)象使我們必須用新型抗微生物劑、疫苗、藥物篩選方法和診斷測(cè)試方法來(lái)滿足對(duì)該生物的醫(yī)療需求。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及BASB132，特別是BASB132多肽和BASB132多核苷酸，以及用于其產(chǎn)生的重組材料和方法。另一方面，本發(fā)明涉及這些多肽和多核苷酸的使用方法，其中特別包括微生物性疾病的預(yù)防和治療方法。再一方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)與微生物感染有關(guān)的疾病和病癥的診斷測(cè)定方法，如檢測(cè)BASB132多核苷酸或多肽的表達(dá)或活性的測(cè)定方法。
通過(guò)閱讀下文以及本公開(kāi)內(nèi)容的其他部分，該領(lǐng)域的技術(shù)人員將很容易了解在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的不同變化和改進(jìn)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及BASB132多肽和多核苷酸，下文將對(duì)此做更詳細(xì)的描述。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及粘膜炎莫拉氏菌的BASB132多肽和多核苷酸，其氨基酸序列與大腸桿菌假定外膜蛋白YtfN同源。本發(fā)明特別涉及分別具有序列編號(hào)1或3的核苷酸序列以及序列編號(hào)2或4的氨基酸序列的BASB132。應(yīng)該了解的是，下文“序列表”中列舉的“DNA”序列只代表本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案的一個(gè)范例，因?yàn)樵擃I(lǐng)域的技術(shù)人員都會(huì)承認(rèn)，這些序列一般都能夠在多核苷酸，包括多聚核糖核苷酸，中有效地使用。
多肽一方面，本發(fā)明提供文中稱為“BASB132”和“BASB132多肽”的粘膜炎莫拉氏菌多肽及其具有生物學(xué)、診斷、預(yù)防、臨床或治療作用的變異體，以及含有這些多肽的組合物。
本發(fā)明還提供(a)一種分離的多肽，該多肽含有一段氨基酸序列，該序列與序列編號(hào)2或4的序列具有至少85％的同一性，優(yōu)選的是至少90％的同一性，更優(yōu)選的是至少95％的同一性，最優(yōu)選的是至少97-99％的同一性或完全相同；(b)一種由分離的多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸包含一段多核苷酸序列，該序列與序列編號(hào)1或3的全長(zhǎng)序列分別具有至少85％的同一性，優(yōu)選的是至少90％的同一性，更優(yōu)選的是至少95％的同一性，再更優(yōu)選的是至少97-99％的同一性或完全相同；或(c)一種由分離的多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸包含一段可編碼一種多肽的多核苷酸序列，該多肽與序列編號(hào)2或4的氨基酸序列具有至少85％的同一性，優(yōu)選的是至少90％的同一性，更優(yōu)選的是至少95％的同一性，再更優(yōu)選的則至少97-99％的同一性或完全相同。
序列編號(hào)2或4提供的BASB132多肽為粘膜炎莫拉氏菌Mc2931菌株(ATCC43617)的BASB132多肽。
本發(fā)明還提供BASB132多肽的一種免疫原性片段，即BASB132多肽中與含有序列編號(hào)2或4所示氨基酸序列的多肽具有相同或基本相同的免疫原性的一段連續(xù)部分；也就是說(shuō)，該片段(如果需要，可與一種載體相聯(lián)接)可誘發(fā)一種能夠識(shí)別BASB132多肽的免疫應(yīng)答。這種免疫原性片段可包括，例如，缺少N端前導(dǎo)序列和(或)跨膜區(qū)和(或)C端錨定區(qū)的BASB132多肽。優(yōu)選地，本發(fā)明所述BASB132的該免疫原性片段基本上包含一種多肽的所有細(xì)胞外區(qū)域，這種多肽與序列編號(hào)2或4的全長(zhǎng)序列分別具有至少85％的同一性，優(yōu)選的是至少90％的同一性，更優(yōu)選的是至少95％的同一性，最優(yōu)選的是至少97-99％的同一性。
片段是指一種多肽，該多肽具有一段氨基酸序列，該序列與本發(fā)明的任何一種多肽的任意部分氨基酸序列完全相同，但不是與全部氨基酸序列都完全相同。與BASB132多肽一樣，片段可以是“獨(dú)立的”，也可以包含在一種較大的多肽中，從而構(gòu)成這種較大多肽的一部分或一個(gè)區(qū)域，最優(yōu)選的是構(gòu)成單一較大多肽的一段單一的連續(xù)區(qū)域。
優(yōu)選的片段包括，例如，具有序列編號(hào)2或4的一部分氨基酸序列的截?cái)喽嚯幕蚱渥儺愺w，如含有氨基端和(或)羧基端氨基酸序列的連續(xù)殘基鏈。優(yōu)選的片段還包括在宿主細(xì)胞內(nèi)或由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的本發(fā)明所述多肽的降解形式。其他優(yōu)選片段還包括用結(jié)構(gòu)或功能特性表征的片段，如含有α-螺旋和α-螺旋形成區(qū)、β-折疊和β-折疊形成區(qū)、轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)、卷曲和卷曲形成區(qū)、親水區(qū)、疏水區(qū)、α兩性區(qū)、β兩性區(qū)、撓性區(qū)、表面形成區(qū)、底物結(jié)合區(qū)及高抗原指數(shù)區(qū)的片段。
優(yōu)選的片段還包括一種分離的多肽，該多肽含有一段至少有15、20、30、40、50或100個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，這些連續(xù)氨基酸來(lái)自序列編號(hào)2或4的氨基酸序列，優(yōu)選的片段還包括另一種分離的多肽，該多肽含有一段至少有15、20、30、40、50或100個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，這些連續(xù)氨基酸是由序列編號(hào)2或4的氨基酸序列截?cái)嗷蛉笔Ф鴣?lái)。
本發(fā)明所述多肽的片段可通過(guò)肽合成方法用來(lái)產(chǎn)生相應(yīng)的全長(zhǎng)多肽；因此，這些片段可作為中間體來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的全長(zhǎng)多肽。
特別優(yōu)選的變異體是以任意組合方式取代、缺失或添加若干個(gè)、5-10個(gè)、1-5個(gè)、1-3個(gè)、1-2個(gè)或1個(gè)氨基酸的變異體。
本發(fā)明的多肽，或免疫原性片段，可以是“成熟”蛋白的形式，也可以是一種較大多肽的一部分，如前體或融合蛋白的一部分。通?？商砑右环N有益的額外氨基酸序列，該序列可含有分泌序列或前導(dǎo)序列、原序列、多組氨酸殘基等有助于純化的序列，或能夠在重組生產(chǎn)過(guò)程中保持穩(wěn)定的序列。此外，還可以考慮添加外源多肽，或脂類尾，或多核苷酸序列，以提高最終分子的免疫原性潛力。
一方面，本發(fā)明涉及可溶性基因工程融合蛋白，這些融合蛋白含有本發(fā)明的多肽或其片段，并含有不同亞類免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的不同部分。優(yōu)選的免疫球蛋白是人類IgG的重鏈恒定區(qū)，特別是IgG1的重鏈恒定區(qū)，并且融合出現(xiàn)在鉸鏈區(qū)。在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，去除Fc部分的方法只是簡(jiǎn)單地?fù)饺胍环N能被凝血因子X(jué)a剪切的酶切序列。
此外，本發(fā)明涉及利用基因工程方法制備這些融合蛋白的方法，以及這些融合蛋白在藥物篩選、診斷和治療中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明涉及編碼這些融合蛋白的多核苷酸。有關(guān)融合蛋白的技術(shù)可參考，例如，國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/29458和WO94/22914。
可以用化學(xué)方法使蛋白結(jié)合，也可以作為重組融合蛋白來(lái)進(jìn)行表達(dá)，以使表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)量與非融合蛋白相比有所提高。融合配體的作用可以是協(xié)助提供輔助T細(xì)胞表位(免疫融合配體)，優(yōu)選的是能被人類識(shí)別的輔助T細(xì)胞表位，也可以是有助于以高于天然重組蛋白的產(chǎn)量來(lái)表達(dá)蛋白(表達(dá)增強(qiáng)子)。優(yōu)選的是融合配體既具有免疫融合配體的作用，又具有表達(dá)增強(qiáng)配體的作用。
融合配體包括流感嗜血菌的蛋白D和流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(血凝素)。另一種融合配體是被稱為L(zhǎng)ytA的蛋白。優(yōu)選的是使用該分子的C端部分。Lyta來(lái)自肺炎鏈球菌，該細(xì)菌可合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，即LytA酰胺酶，(由lytA基因編碼{Gene，43(1986)第265-272頁(yè)})這是一種可特異性降解肽聚糖骨架中特定化學(xué)鍵的自溶素。LytA蛋白的C端區(qū)域與膽堿或DEAE等某些膽堿類似物具有親和性。這種特性被用來(lái)產(chǎn)生可用于融合蛋白表達(dá)的大腸桿菌C-LytA表達(dá)質(zhì)粒。氨基端含有C-LytA片段的雜合蛋白的純化方法已有所描述{Biotechnology10，(1992)第795-798頁(yè))。也可以使用LytA分子中從第178位殘基開(kāi)始的C端重復(fù)部分，例如第188-305位殘基區(qū)域。
本發(fā)明還包括上述多肽的變異體，即通過(guò)保守氨基酸取代將參照多肽的一種殘基取代成另一種性質(zhì)類似的殘基而獲得的不同多肽。典型的保守取代是在Ala、Val、Leu和Ile之間；Ser和Thr之間；酸性殘基Asp和Glu之間；Asn和Gln之間；以及堿性殘基Lys和Arg之間；或芳香族殘基Phe和Tyr之間進(jìn)行。
本發(fā)明的多肽可采用任何適當(dāng)?shù)姆绞絹?lái)制備。這些多肽包括，分離的天然多肽、重組產(chǎn)生的多肽、合成的多肽，或由這些方法的組合方法產(chǎn)生的多肽。制備這些多肽的方法已為該領(lǐng)域所熟知。
本發(fā)明最優(yōu)選的多肽是來(lái)源于粘膜炎莫拉氏菌的多肽，但由分類上處于相同屬的其他生物獲得的多肽也是優(yōu)選的。本發(fā)明的多肽還可以從，例如，分類上處于相同科或相同目的其他生物獲得。
多核苷酸本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種可編碼BASB132多肽的多核苷酸，特別是可編碼文中指定的BASB132的多核苷酸。
在一項(xiàng)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸含有一段BASB132多肽編碼區(qū)，該編碼區(qū)含有序列編號(hào)1或3的一段全長(zhǎng)基因序列，或其變異體。
序列編號(hào)1或3的BASB132多核苷酸是來(lái)源于粘膜炎莫拉氏菌Mc2931菌株(ATCC43617)的BASB132多核苷酸。
另一方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，這些核酸分子可編碼和(或)表達(dá)BASB132多肽和多核苷酸，特別是粘膜炎莫拉氏菌的BASB132多肽和多核苷酸，其中包括，例如，未加工的RNAs、核酶RNAs、mRNAs、cDNAs、基因組DNAs、B型DNAs和Z型DNAs。本發(fā)明的其他實(shí)施方案還包括，具有生物學(xué)、診斷、預(yù)防、臨床或治療作用的多核苷酸和多肽及其變異體和含有這些多核苷酸和(或)多肽的組合物。
另一方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，該多核苷酸至少包括一個(gè)全長(zhǎng)基因，并且可編碼具有序列編號(hào)2或4所示推導(dǎo)氨基酸序列的BASB132多肽，以及與其密切相關(guān)的多核苷酸及其變異體。
在另一項(xiàng)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的粘膜炎莫拉氏菌BASB132多肽含有或包括序列編號(hào)2或4的氨基酸序列或其變異體。
利用文中提供的信息，如序列編號(hào)1或3所示多核苷酸序列，本發(fā)明的編碼BASB132多肽的多核苷酸可采用標(biāo)準(zhǔn)的克隆和篩選方法來(lái)產(chǎn)生，例如以粘膜炎莫拉氏菌Catlin細(xì)胞為原材料將細(xì)菌的染色體DNA片段克隆和測(cè)序，然后獲得全長(zhǎng)克隆。舉例來(lái)說(shuō)，為了獲得本發(fā)明的多核苷酸序列，如序列編號(hào)1或3的多核苷酸序列，典型的方法是利用由部分序列獲得的放射性標(biāo)記寡核苷酸，優(yōu)選的是含有17個(gè)或更多核苷酸的寡核苷酸，對(duì)大腸桿菌或其他適當(dāng)宿主中的粘膜炎莫拉氏菌Catlin菌株染色體DNA克隆庫(kù)進(jìn)行探測(cè)。然后用嚴(yán)格雜交條件鑒別出帶有與探針序列完全相同的DNA的克隆。然后利用由最初的多肽或多核苷酸序列設(shè)計(jì)出的測(cè)序引物對(duì)雜交鑒定出的克隆分別測(cè)序，這樣就可能使多核苷酸序列雙向延伸，從而確定全長(zhǎng)基因序列。這種測(cè)序方法可采用，例如，由質(zhì)?？寺≈苽涞碾p鏈變性DNA來(lái)方便地實(shí)現(xiàn)。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)在Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambrook et al.，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)中有所描述。(特別是第1.90節(jié)“通過(guò)雜交進(jìn)行篩選”和第13.70節(jié)“雙鏈變性DNA模板的測(cè)序”)。也可通過(guò)基因組DNA的直接測(cè)序來(lái)獲得全長(zhǎng)基因序列。需要說(shuō)明的是，序列編號(hào)1或3的多核苷酸是在粘膜炎莫拉氏菌的DNA庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的。
此外，序列編號(hào)1或3的DNA序列均包含一種可讀框，可編碼大致含有序列編號(hào)2或4的氨基酸殘基數(shù)量的一種蛋白，該蛋白的推導(dǎo)分子量可利用該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的氨基酸殘基分子量值來(lái)加以計(jì)算。
在序列編號(hào)1中，第1位核苷酸的起始密碼子與開(kāi)始于第5017位核苷酸的終止密碼子之間的多核苷酸可編碼序列編號(hào)2的多肽。
在序列編號(hào)3中，第2042位核苷酸的起始密碼子與開(kāi)始于第5014位核苷酸的終止密碼子之間的多核苷酸可編碼序列編號(hào)4的多肽。
另一方面，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有或包括(a)一段多核苷酸序列，該序列與序列編號(hào)1或3的全長(zhǎng)序列分別具有至少85％的同一性，優(yōu)選的是至少90％的同一性，更優(yōu)選的是至少95％的同一性，再更優(yōu)選的是至少97-99％的同一性或完全相同；或(b)一段多核苷酸序列，該序列可編碼一種多肽，該多肽與序列編號(hào)2或4的全長(zhǎng)氨基酸序列分別具有至少85％的同一性，優(yōu)選的是至少90％的同一性，更優(yōu)選的是至少95％的同一性，再更優(yōu)選的是至少97-99％的同一性或100％相同。
利用一種方法可獲得編碼本發(fā)明所述多肽的多核苷酸，其中包括由粘膜炎莫拉氏菌以外的物種獲得的同源物和直向同源物，該方法包括，在嚴(yán)格雜交條件下(如采用45-65℃的溫度和0.1-1％的SDS濃度)用一種含有或包括序列編號(hào)1或3所述序列或其片段的標(biāo)記探針或可檢測(cè)探針對(duì)適當(dāng)?shù)膸?kù)進(jìn)行篩選；分離出含有所述多核苷酸序列的全長(zhǎng)基因克隆和(或)基因組克隆。
本發(fā)明提供一種多核苷酸序列，該序列的全長(zhǎng)序列與序列編號(hào)1或3的編碼序列(可讀框)完全相同。本發(fā)明還提供一種可編碼成熟多肽或其片段的獨(dú)立序列，以及可編碼成熟多肽或其片段并且含有可讀框吻合的另一編碼序列的序列，另一編碼序列可編碼，例如，前導(dǎo)序列或分泌序列、前蛋白序列、原蛋白序列或前原蛋白序列。本發(fā)明的多核苷酸還可含有至少一種非編碼序列，其中包括，例如，至少一種5’和3’非編碼序列，如轉(zhuǎn)錄但不翻譯的序列，終止信號(hào)(如rho-依賴性和rho-非依賴性終止信號(hào))、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、Kozak序列、可保持mRNA穩(wěn)定的序列、內(nèi)含子以及多腺苷酸化信號(hào)，但不局限于此。多核苷酸序列還可含有編碼額外氨基酸的額外編碼序列。例如可編碼一種有利于融合多肽純化的標(biāo)記序列。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該標(biāo)記序列為Gentz etal，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 86821-824(1989)描述的由pQE載體(Qiagen，Inc.)提供的六組氨酸肽，或HA肽標(biāo)記(Wilson et al.，Cell37767(1984))，這兩種標(biāo)記均可用來(lái)純化與其融合的多肽序列。本發(fā)明的多核苷酸還包括，但不局限于，含有一種結(jié)構(gòu)基因以及調(diào)控該基因表達(dá)的天然相關(guān)序列的多核苷酸。
序列編號(hào)2或4所述BASB132多肽的核苷酸編碼序列可分別與序列編號(hào)1中第1-5016位核苷酸包含的多肽編碼序列或序列編號(hào)3中第1-5016位核苷酸包含的多肽編碼序列完全相同。作為選擇，也可以是由于遺傳密碼冗余(簡(jiǎn)并性)而同樣編碼序列編號(hào)2或4所述多肽的序列。
文中使用的術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”包括那些含有一種序列的多核苷酸，該序列可編碼本發(fā)明的多肽，特別是細(xì)菌多肽，更明確地說(shuō)是具有序列編號(hào)2或4所示氨基酸序列的粘膜炎莫拉氏菌BASB132多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括那些含有連續(xù)或不連續(xù)的單一區(qū)域以及附加區(qū)域的多核苷酸(例如，被整合噬菌體、整合插入序列、整合載體序列、整合轉(zhuǎn)座子序列打斷的多核苷酸，或由于RNA編輯或基因組DNA重排而被打斷的多核苷酸)，其中，單一區(qū)域可編碼本發(fā)明的多肽，附加區(qū)域也可以含有編碼序列和(或)非編碼序列。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，這些變異體可編碼一種具有序列編號(hào)2或4所述推導(dǎo)氨基酸序列的多肽的變異體。本發(fā)明所述多核苷酸的片段可用來(lái)，例如，合成本發(fā)明的全長(zhǎng)多核苷酸。
其他的特別優(yōu)選實(shí)施方案還包括可編碼BASB132變異體的多核苷酸，這些變異體具有序列編號(hào)2或4所述BASB132多肽的氨基酸序列，并且以任意組合方式取代、修飾、缺失和(或)添加若干個(gè)、幾個(gè)、5-10個(gè)、1-5個(gè)、1-3個(gè)、2個(gè)、1個(gè)或0個(gè)氨基酸殘基。其中，特別優(yōu)選的是不改變BASB132多肽的特性和活性的沉寂取代、添加和缺失。
本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施方案還包括一些多核苷酸及其互補(bǔ)多核苷酸，這些多核苷酸的全長(zhǎng)序列與具有序列編號(hào)2或4所述氨基酸序列的BASB132多肽的編碼多核苷酸至少有85％同一性。作為選擇，最優(yōu)選的是含有一種區(qū)域的多核苷酸及其互補(bǔ)多核苷酸，該區(qū)域的全長(zhǎng)序列與編碼BASB132多肽的多核苷酸至少有90％的同一性。由此來(lái)看，特別優(yōu)選的多核苷酸的全長(zhǎng)序列與編碼BASB132多肽的多核苷酸至少有95％的同一性。而在至少有95％的同一性的多核苷酸中，高度優(yōu)選的是至少有97％的同一性的多核苷酸，其中，特別高度優(yōu)選的是至少有98％的同一性和至少有99％的同一性的多核苷酸，而更優(yōu)選的是至少有99％的同一性的多核苷酸。
優(yōu)選的實(shí)施方案是可編碼一些多肽的多核苷酸，這些多肽可保持與序列編號(hào)1或3所述DNA編碼的成熟多肽基本相同的生物功能或活性。
本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案提供一些多核苷酸，這些多核苷酸能夠與BASB132多核苷酸序列雜交，明確地說(shuō)，是在嚴(yán)格條件下雜交，如序列編號(hào)1或3的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及一些能夠與文中提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸。因此，本發(fā)明特別涉及一些能夠在嚴(yán)格條件下與文中提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸。文中使用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”和“嚴(yán)格雜交條件”的含義是，只有在序列間至少有95％的同一性的條件下才發(fā)生雜交，優(yōu)選的是至少有97％的同一性的條件下才發(fā)生雜交。嚴(yán)格雜交條件的具體實(shí)例是，在含有50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/ml剪切的變性鮭魚(yú)精DNA的溶液中42℃保溫過(guò)夜，然后在約65℃的0.1×SSC中清洗雜交支持物。
雜交和清洗條件已眾所周知，其實(shí)例可參考Sambrook，et al.，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，特別是其中的第11章。利用本發(fā)明的多核苷酸序列還可以進(jìn)行溶液雜交。
本發(fā)明還提供一種多核苷酸，該多核苷酸含有或包括一種多核苷酸序列，該序列的獲得方法是在嚴(yán)格雜交條件下用含有序列編號(hào)1或3所述多核苷酸序列或其片段的探針對(duì)含有序列編號(hào)1或3所述多核苷酸序列的完整基因的適當(dāng)庫(kù)進(jìn)行篩選；然后分離出所述多核苷酸序列?？捎脕?lái)獲得這種多核苷酸的片段包括，例如，文中其他地方詳細(xì)描述的探針和引物。
舉例來(lái)說(shuō)，按照文中有關(guān)本發(fā)明的多核苷酸測(cè)定方法的描述，本發(fā)明的多核苷酸可作為RNA、cDNA和基因組DNA的雜交探針用來(lái)分離編碼BASB132的全長(zhǎng)cDNA和基因組克隆，并且可用來(lái)分離與BASB132基因具有高度同一性的其他基因的cDNA和基因組克隆，特別是與BASB132基因具有高度序列同一性的其他基因的cDNA和基因組克隆。這些探針一般含有至少15個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)。優(yōu)選的是含有至少30個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)，也可以含有至少50個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)。特別優(yōu)選的是含有至少20個(gè)但又少于30個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)的探針。
為了合成寡核苷酸探針，可通過(guò)篩選方法用序列編號(hào)1或3的DNA序列分離出BASB132基因的一段編碼區(qū)。然后用含有與本發(fā)明所述基因互補(bǔ)的序列的標(biāo)記寡核苷酸來(lái)篩選cDNA庫(kù)、基因組DNA庫(kù)或mRNA庫(kù)，以確定與探針雜交的庫(kù)成分。
有幾種該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用來(lái)獲得全長(zhǎng)DNAs或延伸短DNAs，例如基于cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)的方法(可參考，例如，F(xiàn)rohman，et al.，PNAS USA 858998-9002，1988)。近期的改進(jìn)技術(shù)，例如MarathonTM技術(shù)(Clontech Laboratories Inc.)，能夠顯著簡(jiǎn)化對(duì)較長(zhǎng)cDNAs的搜索。MarathonTM技術(shù)是利用由選定組織提取的mRNA制備cDNAs并將“銜接”序列連接在每個(gè)末端上。然后用基因特異性和銜接序列特異性寡核苷酸引物的組合進(jìn)行核酸擴(kuò)增(PCR)，以擴(kuò)增出DNA中“丟失的”5’末端。然后用“嵌套”引物，即設(shè)計(jì)成可與擴(kuò)增產(chǎn)物退火的引物(通常是能夠與銜接序列的其他3’區(qū)退火的一個(gè)銜接序列特異性引物和能夠與選定基因序列的其他5’區(qū)退火的一個(gè)基因特異性引物)，重復(fù)PCR反應(yīng)。然后對(duì)該反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序分析，再將產(chǎn)物直接與已有的DNA連接而產(chǎn)生完整序列，或利用新序列信息設(shè)計(jì)出5’引物再進(jìn)行一次單獨(dú)的全長(zhǎng)PCR，由此構(gòu)建出全長(zhǎng)DNA。
按照文中有關(guān)本發(fā)明的多核苷酸測(cè)定方法的描述，可將本發(fā)明的多核苷酸和多肽作為研究試劑和研究材料用來(lái)，例如，探索疾病的治療和診斷方法，尤其是人類的疾病。
在本發(fā)明的多核苷酸中，來(lái)源于序列編號(hào)1或3所述序列的寡核苷酸可在文中描述的方法中使用，但優(yōu)選的是用于PCR，以確定感染組織內(nèi)的細(xì)菌是否轉(zhuǎn)錄完整的或部分的本文所述多核苷酸。應(yīng)該了解的是，這些序列還可用來(lái)診斷病原體所處的感染期和感染類型。
本發(fā)明還提供可編碼一種多肽的多核苷酸，該多肽為成熟蛋白加上氨基端的或羧基端的或成熟多肽內(nèi)部的額外氨基酸(例如當(dāng)成熟形式具有一條以上的多肽鏈時(shí))。這些序列可以在蛋白由前體變?yōu)槌墒煨问降募庸み^(guò)程中起一定的作用，也可以用于蛋白運(yùn)輸，或是延長(zhǎng)或縮短蛋白的半壽期，或是有利于測(cè)定或產(chǎn)生蛋白的操作，等等。額外氨基酸可以象體內(nèi)的通常情況那樣由細(xì)胞酶去除，以產(chǎn)生成熟蛋白。
本發(fā)明還提供所述各種多核苷酸的互補(bǔ)多核苷酸。優(yōu)選的是這些互補(bǔ)多核苷酸與各自的多核苷酸完全互補(bǔ)。
一種或多種原序列與成熟多肽融合成的前體蛋白可以是非活性的狀態(tài)。這些非活性前體在原序列被去除后一般會(huì)活化。在活化前可以將部分或所有原序列去除。這些前體通常稱為蛋白原。
除利用常規(guī)的A、G、C、T/U來(lái)表示核苷酸外，還可利用術(shù)語(yǔ)“N”來(lái)描述本發(fā)明的某些多核苷酸。“N”的含義是，在DNA或RNA序列的該指定位置可以是四種DNA核苷酸或RNA核苷酸中的任意一種，優(yōu)選的是不出現(xiàn)下述情況，即按照正確可讀框讀碼時(shí)，N與鄰近核苷酸的組合可導(dǎo)致該可讀框過(guò)早產(chǎn)生終止密碼子。
總之，由本發(fā)明所述多核苷酸編碼的蛋白可以是成熟蛋白、成熟蛋白加前導(dǎo)序列(可稱為前蛋白)、含有非前蛋白前導(dǎo)序列的一種或多種原序列的成熟蛋白前體、或前蛋白原，即含有一種前導(dǎo)序列和一種或多種原序列的蛋白原前體，這些序列通常在產(chǎn)生活性多肽和成熟多肽的加工過(guò)程中被去除。
一方面，本發(fā)明提供所述多核苷酸的治療或預(yù)防性應(yīng)用，特別是用于遺傳免疫。
將本發(fā)明所述多核苷酸應(yīng)用于遺傳免疫時(shí)，優(yōu)選的是采用一種適當(dāng)?shù)倪f送方法，例如直接把質(zhì)粒DNA注射到肌肉中(Wolff et al.，Hum MolGenet(1992)1363；Manthorpe et al.，Hum.Gene Ther.(1983)4419)、遞送與特定蛋白載體復(fù)合的DNA(Wu et al.，J Biol Chem.(1989)26416985)、DNA與磷酸鈣共沉淀(Benvenisty & Reshef，PNAS USA，(1986)839551)、將DNA封裝在不同形式的脂質(zhì)體中(Kaneda et al.，Science(1989)243375)、顆粒轟擊(Tang et al.，Nature(1992)356152，Eisenbraun et al.，DNA Cell Biol(1993)12791)以及用克隆化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行體內(nèi)感染(Seeger et al.，PNAS USA(1984)815849)。
載體、宿主細(xì)胞、表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的載體、用本發(fā)明的載體改造的基因工程宿主細(xì)胞，以及由重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。也可采用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，利用由本發(fā)明所述DNA構(gòu)建體獲得的RNAs產(chǎn)生這些蛋白。
本發(fā)明的重組多肽可采用該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法，由包含表達(dá)系統(tǒng)的基因工程宿主細(xì)胞來(lái)加以制備。因此，另一方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)、含有這些表達(dá)系統(tǒng)的基因工程宿主細(xì)胞，以及由重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
在利用重組方法產(chǎn)生本發(fā)明的多肽時(shí)，可對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，以摻入表達(dá)系統(tǒng)或其部分或本發(fā)明的多核苷酸。將多核苷酸引入宿主細(xì)胞可采用Davis，et al.，分子生物學(xué)基本方法，(1986)和Sambrooket al.，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)等常規(guī)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中描述的方法，如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)位、顯微注射、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、摩擦引入、沖擊引入和感染。
適當(dāng)宿主的代表性實(shí)例包括，細(xì)菌細(xì)胞，如鏈球菌、葡萄球菌、腸球菌、大腸桿菌、鏈霉菌、藍(lán)細(xì)菌、枯草芽孢桿菌、腦膜炎奈瑟菌和粘膜炎莫拉氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母菌、克魯維酵母、酵母屬、擔(dān)子菌、白色念珠菌和曲霉菌；昆蟲(chóng)細(xì)胞，如果蠅S2細(xì)胞和秋粘蟲(chóng)Sf9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑素瘤細(xì)胞；以及植物細(xì)胞，如裸子植物或被子植物的細(xì)胞。
有很多種表達(dá)系統(tǒng)可用來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。這些載體尤其包括來(lái)源于染色體、游離基因或病毒的載體，例如，來(lái)源于細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母游離基因、插入元件、酵母染色體元件的載體、來(lái)源于諸如桿狀病毒、乳頭多瘤空泡病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、雞痘病毒、假狂犬病病毒、小核糖核酸病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和甲病毒等病毒的載體，以及來(lái)源于其組合物的載體，如粘粒和噬菌粒等來(lái)源于質(zhì)粒與噬菌體遺傳因子的載體。表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建體可含有能夠引發(fā)并調(diào)控表達(dá)的調(diào)控區(qū)。一般而言，能夠維持、增殖或表達(dá)多核苷酸并且(或者)在宿主內(nèi)表達(dá)多肽的任何適當(dāng)系統(tǒng)或載體均可用于該表達(dá)。將適當(dāng)DNA序列插入表達(dá)系統(tǒng)的方法可采用多種眾所周知的常規(guī)技術(shù)中的任何一種，如Sambrooket al.，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，(見(jiàn)上文)中描述的技術(shù)。
在真核細(xì)胞的重組表達(dá)系統(tǒng)中，可將適當(dāng)?shù)姆置谛盘?hào)摻入到表達(dá)的多肽內(nèi)，以使翻譯的蛋白能夠分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、外周質(zhì)間隙或細(xì)胞外環(huán)境中。這些信號(hào)可以是多肽的內(nèi)源性信號(hào)，也可以是外源性信號(hào)。
由重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化本發(fā)明所述多肽的方法已眾所周知，其中包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸抽提法、陰離子或陽(yáng)離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水相互作用層析法、親和層析法、羥磷灰石層析法和外源凝集素層析法。最優(yōu)選的是用金屬離子親和層析法(IMAC)來(lái)進(jìn)行純化。若多肽在胞內(nèi)合成、分離和(或)純化的過(guò)程中變性，可利用眾所周知的蛋白重折疊技術(shù)來(lái)產(chǎn)生活性構(gòu)象。
表達(dá)系統(tǒng)也可以是病毒或細(xì)菌等活體重組微生物?？蓪⒛康幕虿迦氲交铙w重組病毒或細(xì)菌的基因組中。用這種活體載體進(jìn)行接種或體內(nèi)感染會(huì)使抗原在體內(nèi)表達(dá)，并且可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。可用于此目的的病毒和細(xì)菌包括，例如，痘病毒(如痘苗病毒、雞痘病毒、金絲雀痘病毒)、甲病毒(辛德畢斯病毒、塞姆利基森林病毒、委內(nèi)端拉馬腦脊髓炎病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、小核糖核酸病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒)、皰疹病毒(水痘帶狀皰疹病毒等)、李斯特桿菌、沙門(mén)菌、志賀氏菌、卡介菌。這些病毒和細(xì)菌可以是毒性的，為了獲得活體疫苗，也可以使用由不同方式減毒的病毒和細(xì)菌。這些活體疫苗也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
診斷、預(yù)防、血清型及突變測(cè)定本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述BASB132多核苷酸及多肽在作為診斷試劑方面的應(yīng)用。在真核細(xì)胞中，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是人類細(xì)胞中，檢測(cè)BASB132多核苷酸和(或)多肽可作為診斷疾病、病期或被感染生物對(duì)藥物的反應(yīng)的一種方法。利用眾所周知的技術(shù)以及文中提供的方法，可以在核酸或氨基酸水平上來(lái)檢測(cè)真核細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物，尤其是人類，特別是被含有BASB132基因或蛋白的生物感染的人或懷疑被感染的人。
用于預(yù)后、診斷或其他分析的多肽和多核苷酸可由懷疑被感染的個(gè)體和(或)感染個(gè)體的身體材料獲得。由任意的這些來(lái)源獲得的多核苷酸，特別是DNA或RNA，可直接用于檢測(cè)，也可以在分析前先用酶學(xué)方法由PCR或其他任何擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。RNA，特別是mRNA，以及cDNA和基因組DNA也可同樣使用。對(duì)生物的選定多核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增和基因型分析，由此可鑒定個(gè)體中存在的感染性或定居生物的物種和品系。將擴(kuò)增產(chǎn)物與選自相關(guān)生物的參考序列基因型進(jìn)行比較，優(yōu)選的是與選自同屬不同種或同種不同株系的生物的參考序列基因型進(jìn)行比較，由其尺寸的變化可檢測(cè)缺失和插入。將擴(kuò)增的DNA與標(biāo)記的BASB132多核苷酸序列雜交，由此可檢測(cè)點(diǎn)突變。分別用DNase或RNase對(duì)DNA或RNA進(jìn)行消化，或是檢測(cè)解鏈溫度或復(fù)性動(dòng)力學(xué)的差異，由此可以從不完全匹配甚至明顯錯(cuò)配的雙螺旋體中鑒別出完全匹配或明顯匹配的序列。將多核苷酸片段在凝膠中的電泳遷移率與參考序列進(jìn)行比較，由其變化可同樣檢測(cè)出多核苷酸序列的差異。這種檢測(cè)方法可使用變性劑，也可以不使用變性劑。直接對(duì)DNA或RNA測(cè)序也可以檢測(cè)多核苷酸的差異。可參考，例如，Myers et al.，Science，2301242(1985)。利用核酸酶保護(hù)測(cè)定法，如RNase、V1及S1保護(hù)測(cè)定法，或化學(xué)裂解法還可以檢測(cè)特定部位的序列變化?？蓞⒖?，例如，Cotton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，854397-4401(1985)。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，可將含有BASB132核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針排成陣列，以有效地篩選，例如，基因突變、血清型、系統(tǒng)分類或鑒定。有關(guān)陣列技術(shù)的方法已眾所周知，這些方法具有廣泛的適用性，可用來(lái)解決多種分子遺傳學(xué)問(wèn)題，其中包括基因表達(dá)、遺傳連鎖和遺傳變異性(可參考，例如，Chee et al.，Science，274610(1996))。
另一方面，本發(fā)明涉及一種診斷試劑盒，該試劑盒含有(a)本發(fā)明的一種多核苷酸，優(yōu)選的是序列編號(hào)1或3的核苷酸序列，或其片段；(b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列；(c)本發(fā)明的一種多肽，優(yōu)選的是序列編號(hào)2或4的多肽，或其片段；或(d)抗本發(fā)明所述多肽的一種抗體，優(yōu)選的是抗序列編號(hào)2或4的多肽。
應(yīng)該了解的是，所有這些試劑盒中的(a)、(b)、(c)或(d)均可以包含一種基本成分。這種試劑盒尤其適用于疾病或疾病易感性的診斷。
本發(fā)明還涉及所述多核苷酸在作為診斷試劑方面的應(yīng)用。對(duì)本發(fā)明中與疾病或致病性相關(guān)的多核苷酸的突變形式進(jìn)行檢測(cè)的方法，優(yōu)選的是對(duì)序列編號(hào)1或3所示多核苷酸的突變形式進(jìn)行檢測(cè)的方法，可作為一種診斷工具，該方法可以由這種多核苷酸的低表達(dá)、過(guò)表達(dá)或表達(dá)水平變化的結(jié)果來(lái)對(duì)疾病診斷、病程預(yù)后、病期或疾病易感性判定進(jìn)行補(bǔ)充或說(shuō)明。有多種技術(shù)，如文中描述的方法，可以在多核苷酸水平上檢測(cè)所述多核苷酸中含有突變的生物，特別是感染性生物。
還可以用多種技術(shù)對(duì)本發(fā)明所述多核苷酸和(或)多肽中含有突變或多態(tài)性(等位變異)的生物細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，由此為，例如，血清分型做準(zhǔn)備。舉例來(lái)說(shuō)，RT-PCR方法可檢測(cè)RNA中的突變。特別優(yōu)選的是將RT-PCR方法與諸如GeneScan等自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)合使用。為此也可以在PCR中使用RNA、cDNA或基因組DNA。例如，可利用與BASB132多肽的編碼多核苷酸互補(bǔ)的PCR引物來(lái)對(duì)突變進(jìn)行鑒定和分析。
本發(fā)明還提供5’和(或)3’端被去除1、2、3或4個(gè)核苷酸的引物。這些引物尤其適用于擴(kuò)增那些由個(gè)體的樣品，如身體材料，分離的BASB132 DNA和(或)RNA。這些引物可用來(lái)擴(kuò)增那些分離自感染個(gè)體的多核苷酸，繼而可通過(guò)不同的技術(shù)來(lái)闡明該多核苷酸的序列。這樣就可以檢測(cè)該多核苷酸序列中的突變，并可將其用于感染、感染期或感染過(guò)程的診斷和(或)預(yù)后，或用于感染物的血清分型和(或)分類。
本發(fā)明還提供一種方法，用于診斷疾病，優(yōu)選的是細(xì)菌性感染，更優(yōu)選的是由粘膜炎莫拉氏菌引起的感染，該方法包括，測(cè)定具有序列編號(hào)1或3所述序列的多核苷酸在個(gè)體的樣品，如身體材料，中的表達(dá)水平是否提高。BASB132多核苷酸的表達(dá)增加或降低情況可以用該領(lǐng)域熟知的任何一種多核苷酸定量方法來(lái)檢測(cè)，如擴(kuò)增、PCR、RT-PCR、RNase保護(hù)、RNA印跡、光譜測(cè)定和其他雜交方法。
此外，本發(fā)明的診斷測(cè)定法可檢測(cè)BASB132多肽相對(duì)于正常對(duì)照組織樣品的過(guò)表達(dá)，該方法可檢測(cè)，例如，是否存在一種感染?？蓹z測(cè)宿主樣品，如身體材料，中的BASB132多肽含量的測(cè)定技術(shù)已為該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這些測(cè)定方法包括，放射免疫測(cè)定法、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法、蛋白印跡分析法、抗體夾層測(cè)定法、抗體檢測(cè)法和ELISA測(cè)定法。
本發(fā)明的多核苷酸可用作多核苷酸陣列的成分，優(yōu)選的是用于高密度陣列或網(wǎng)格。這些高密度陣列特別適用于診斷和預(yù)后。舉例來(lái)說(shuō)，可利用各含有不同基因并且另含有本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的一組點(diǎn)來(lái)進(jìn)行探查，如利用一種來(lái)自身體樣品的探針進(jìn)行雜交或核酸擴(kuò)增，以確定個(gè)體中是否存在特定的多核苷酸序列或相關(guān)序列。如果存在，則表明存在病原體，特別是存在粘膜炎莫拉氏菌，這種方法適用于疾病或病程的診斷和(或)預(yù)后。優(yōu)選的網(wǎng)格可含有序列編號(hào)1或3所述多核苷酸序列的多種變異體。含有一種多核苷酸序列的多種變異體的網(wǎng)格也同樣優(yōu)選，這種多核苷酸序列可編碼序列編號(hào)2或4的多肽序列。
抗體本發(fā)明的多肽和多核苷酸，或其變異體，或表達(dá)這些多肽和多核苷酸的細(xì)胞可作為免疫原用來(lái)產(chǎn)生分別對(duì)這些多肽或多核苷酸具有免疫特異性的抗體。術(shù)語(yǔ)“免疫特異性”的含義是，這些抗體對(duì)本發(fā)明所述多肽的親和力基本上高于對(duì)先有技術(shù)中其他相關(guān)多肽的親和力。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗BASB132多肽或多核苷酸的抗體。
產(chǎn)生抗本發(fā)明所述多肽或多核苷酸的抗體的方法是，利用常規(guī)方案將本發(fā)明的多肽和(或)多核苷酸，或二者或二者之一的帶有表位的片段，或二者或二者之一的類似物，或表達(dá)二者或二者之一的細(xì)胞，向動(dòng)物給藥，優(yōu)選的是向非人類的動(dòng)物給藥。單克隆抗體的制備可采用該領(lǐng)域已知的任何能夠由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生抗體的技術(shù)。其實(shí)例包括多種技術(shù)，例如Kohler，G.and Milstein，C.，Nature 256495-497(1975)；Kozbor et al.，Immunology Today 472(1983)；《單克隆抗體與癌癥治療》，Alan R.Liss，Inc.(1985)的Cole et al.，第77-96頁(yè)中描述的技術(shù)。
可采用單鏈抗體生產(chǎn)技術(shù)(美國(guó)專利號(hào)4,946,778)來(lái)產(chǎn)生抗本發(fā)明所述多肽或多核苷酸的單鏈抗體。也可利用轉(zhuǎn)基因小鼠或其他生物或動(dòng)物，如其他哺乳動(dòng)物，來(lái)表達(dá)對(duì)本發(fā)明所述多肽或多核苷酸具有免疫特異性的人源化抗體。
作為選擇，也可以用噬菌體展示技術(shù)來(lái)篩選與本發(fā)明所述多肽具有結(jié)合活性的抗體基因，篩選可以在具有抗BASB132特性的人淋巴細(xì)胞的PCR擴(kuò)增v-基因庫(kù)中進(jìn)行，也可以在天然庫(kù)中進(jìn)行(McCafferty et al.，(1990)Nature 348，552-554；Marks，et al.，(1992)Biotechnology 10，779-783)。還可以通過(guò)，例如，鏈改組方法來(lái)提高這些抗體的親和力(Clackson et al.，(1991)Nature 352628)。
上述抗體可用來(lái)分離或鑒定那些可表達(dá)本發(fā)明所述多肽或多核苷酸的克隆，從而通過(guò)，例如，親和層析來(lái)純化這些多肽或多核苷酸。
因此，抗BASB132多肽或BASB132多核苷酸的抗體尤其可用來(lái)治療感染，特別是細(xì)菌性感染。
在抗原性、表位或免疫學(xué)方面等價(jià)的多肽變異體構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)特別方面。
優(yōu)選的是對(duì)抗體或其變異體進(jìn)行修飾，使其在個(gè)體中的免疫原性降低。舉例來(lái)說(shuō)，若個(gè)體為人類，則最優(yōu)選的是將抗體“人源化”，例如可按照J(rèn)one et al.(1986)Nature 321，522-525或Tempest et al.，(1991)Biotechnology 9，266-273所述，將來(lái)源于雜交瘤的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)移植到人單克隆抗體中。
拮抗劑和激動(dòng)劑——測(cè)定和分子本發(fā)明的多肽和多核苷酸還可用來(lái)評(píng)定，例如，細(xì)胞、無(wú)細(xì)胞制劑、化學(xué)庫(kù)和天然產(chǎn)物混合物中的小分子底物與配體的結(jié)合。這些底物和配體可以是天然的，也可以是結(jié)構(gòu)或功能模擬物。可參考，例如，Coligan etal.，Current Protocols in Immunology 1(2)第5章(1991)。
篩選方法可以是，通過(guò)與候選化合物直接或間接相連的標(biāo)記，簡(jiǎn)單地測(cè)量該候選化合物與多肽或多核苷酸、帶有多肽或多核苷酸的細(xì)胞或膜、或多肽的融合蛋白的結(jié)合。作為選擇，篩選方法也可涉及與標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)物的競(jìng)爭(zhēng)。此外，還可通過(guò)這些篩選方法，利用適合于含有本發(fā)明所述多肽或多核苷酸的細(xì)胞的檢測(cè)系統(tǒng)，來(lái)測(cè)試候選化合物能否隨多肽或多核苷酸的活化或抑制而產(chǎn)生一種信號(hào)。一般而言，在含有已知激動(dòng)劑的情況下可測(cè)定活化的抑制劑，而在含有候選化合物的情況下可測(cè)定激動(dòng)劑對(duì)活化作用的影響。在不含有激動(dòng)劑或抑制劑時(shí)，可利用組成型活性多肽和(或)組成型表達(dá)的多肽和多核苷酸來(lái)篩選反向激動(dòng)劑或抑制劑，方法是測(cè)試候選化合物能否對(duì)多肽或多核苷酸的活化產(chǎn)生抑制作用，其結(jié)果需視情況而定。此外，該篩選方法的步驟可簡(jiǎn)單地包括，將候選化合物與含有本發(fā)明所述多肽或多核苷酸的一種溶液相混合，以形成一種混合物，測(cè)量混合物中BASB132多肽和(或)多核苷酸的活性，并將測(cè)量結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較。還可利用上文所述的融合蛋白，例如Fc部分與BASB132多肽的融合蛋白，來(lái)進(jìn)行高通量的篩選測(cè)定，以鑒別本發(fā)明所述多肽的拮抗劑以及系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)多肽或功能相關(guān)多肽的拮抗劑(參考D.Bennett et al.，J Mol Recognition，852-58(1995)；和K.Johanson et al.，J Biol Chem，270(16)9459-9471(1995))。
還可利用本發(fā)明的多核苷酸、多肽以及能夠與本發(fā)明所述多肽結(jié)合和(或)相互作用的抗體來(lái)設(shè)計(jì)篩選方法，以檢測(cè)添加的化合物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生mRNA和(或)多肽的影響。例如可設(shè)計(jì)一種ELISA測(cè)定方法，用于通過(guò)該領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法由單克隆抗體和多克隆抗體對(duì)多肽分泌水平或細(xì)胞結(jié)合水平進(jìn)行測(cè)量。該方法可用于從適當(dāng)處理的細(xì)胞或組織中發(fā)現(xiàn)一些可抑制或提高多肽產(chǎn)量的作用劑(分別稱為拮抗劑或激動(dòng)劑)。
本發(fā)明還提供一種篩選化合物的方法，用于鑒別那些可提高(激動(dòng)劑)或阻斷(拮抗劑)BASB132多肽或多核苷酸的功能的化合物，特別是抑菌性和(或)殺菌性化合物。該篩選方法可涉及高通量技術(shù)。舉例來(lái)說(shuō)，為了篩選激動(dòng)劑或拮抗劑，可在不含或含有候選分子的情況下，即不含或含有BASB132的可能激動(dòng)劑或拮抗劑的情況下，將含有BASB132多肽及其標(biāo)記底物或標(biāo)記配體的合成反應(yīng)混合物、細(xì)胞間隔，如細(xì)胞膜、細(xì)胞被膜或細(xì)胞壁，或其制劑進(jìn)行保溫。標(biāo)記配體的結(jié)合量下降情況或標(biāo)記底物的產(chǎn)物的產(chǎn)量下降情況可反映出候選分子促進(jìn)或拮抗BASB132多肽的能力。最可能的優(yōu)良拮抗劑是能夠無(wú)償結(jié)合的分子，也就是在不影響B(tài)ASB132多肽情況下發(fā)生結(jié)合的分子。能夠良好結(jié)合并且，例如，提高底物生成產(chǎn)物的速率、加強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或提高化學(xué)通道活性的分子為激動(dòng)劑。利用報(bào)告系統(tǒng)可促進(jìn)對(duì)，例如，底物生成產(chǎn)物的速率、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平或化學(xué)通道活性水平的檢測(cè)?？捎糜诖朔矫娴膱?bào)告系統(tǒng)包括，但不局限于，該領(lǐng)域已知的比色法、測(cè)定標(biāo)記底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、可反映BASB132多核苷酸或多肽活性變化的報(bào)告基因，以及結(jié)合測(cè)定法。
測(cè)定BASB132激動(dòng)劑的另一實(shí)例為競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定法，該方法是在適當(dāng)條件下將BASB132和一種潛在的激動(dòng)劑與能夠結(jié)合BASB132或重組BASB132的分子、天然底物或配體，或底物模擬物或配體模擬物相混合，并進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)定?？梢杂梅派湫曰虮壬治龌衔锏葘ASB132標(biāo)記，以便精確測(cè)量與結(jié)合分子結(jié)合的或轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的BASB132分子的數(shù)量，由此來(lái)評(píng)定潛在拮抗劑的效力。
潛在的拮抗劑包括，例如，能夠與本發(fā)明的多核苷酸和(或)多肽結(jié)合從而抑制或消除其活性或表達(dá)的有機(jī)小分子、肽、多肽和抗體。潛在的拮抗劑還包括，能夠與結(jié)合分子的相同位點(diǎn)結(jié)合但不產(chǎn)生由BASB132誘導(dǎo)的活性的有機(jī)小分子、肽、多肽如密切相關(guān)的蛋白，或抗體，它們使BASB132多肽和(或)多核苷酸不能進(jìn)行結(jié)合，由此阻礙其功能或表達(dá)。
潛在的拮抗劑還包括一種小分子，這種小分子可結(jié)合并占據(jù)多肽結(jié)合位點(diǎn)，從而阻礙其與細(xì)胞結(jié)合分子結(jié)合，繼而阻礙正常生物學(xué)活性。這些小分子的實(shí)例包括，但不局限于，有機(jī)小分子、肽或肽樣分子。其他潛在的拮抗劑還包括反義分子(有關(guān)這些分子的描述可參考Okano，JNeurochem.56560(1991)；利用寡脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。優(yōu)選的潛在拮抗劑包括，與BASB132及其變異體相關(guān)的化合物。
另一方面，本發(fā)明涉及可溶性基因工程融合蛋白，這些融合蛋白含有本發(fā)明的多肽或其片段，并含有不同亞類免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的不同部分。優(yōu)選的免疫球蛋白是人類IgG的重鏈恒定區(qū)，特別是IgG1的重鏈恒定區(qū)，并且融合出現(xiàn)在鉸鏈區(qū)。在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，去除Fc部分的方法只是簡(jiǎn)單地?fù)饺胍环N能被凝血因子X(jué)a剪切的酶切序列。此外，本發(fā)明還涉及通過(guò)基因工程方法制備這些融合蛋白的方法，以及這些融合蛋白在藥物篩選、診斷和治療中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明涉及編碼這些融合蛋白的多核苷酸。有關(guān)融合蛋白技術(shù)的實(shí)例可參考國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/29458和WO94/22914。
文中提供的每種多核苷酸序列都可用來(lái)開(kāi)發(fā)和研制抗菌性化合物。這些多核苷酸被表達(dá)后，其編碼的蛋白可作為標(biāo)的物用于抗菌藥物的篩選。此外，還可利用編碼這些蛋白的氨基端區(qū)域的多核苷酸序列，或編碼相應(yīng)mRNA的Shine-Delgarno序列或其他促翻譯序列的多核苷酸序列來(lái)構(gòu)建反義序列，以調(diào)控目的編碼序列的表達(dá)。
本發(fā)明還提供所述多肽、多核苷酸、激動(dòng)劑或拮抗劑的一種應(yīng)用，即用來(lái)干擾一種或多種病原體與導(dǎo)致感染后遺癥的真核宿主之間的最初物理相互作用，優(yōu)選的是與哺乳動(dòng)物宿主之間的最初物理相互作用。詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明的這些分子可用來(lái)阻礙細(xì)菌，特別是革蘭氏陽(yáng)性菌和(或)革蘭氏陰性菌，粘附于留置裝置上或傷口內(nèi)的真核細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；阻斷真核細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，與介導(dǎo)組織損傷的細(xì)菌BASB132蛋白之間的細(xì)菌性吸附；以及(或者)阻斷感染的正常發(fā)病進(jìn)程，這些感染由留置裝置移植或其他外科技術(shù)以外的因素引起。
再一方面，本發(fā)明提供BASB132的激動(dòng)劑和拮抗劑，優(yōu)選的是抑菌性或殺菌性激動(dòng)劑和拮抗劑。
本發(fā)明的拮抗劑和激動(dòng)劑可用于，例如，疾病的預(yù)防、抑制和(或)治療。
另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明所述多肽的擬表位(mimotope)。擬表位是指與天然肽(在序列或結(jié)構(gòu)上)非常相似的一種肽序列，它可被能夠識(shí)別天然肽的抗體所識(shí)別；或可誘發(fā)出一些抗體，這些抗體與適當(dāng)載體結(jié)合后可識(shí)別天然的肽。
通過(guò)特定氨基酸的添加、缺失或取代可設(shè)計(jì)出用于特定目的的肽擬表位。因此，可以對(duì)肽進(jìn)行，使其便于與一種蛋白載體結(jié)合。例如，對(duì)一些化學(xué)結(jié)合方法而言，希望在肽的末端引入一個(gè)半胱氨酸。而對(duì)與蛋白載體結(jié)合的肽而言，希望在肽的結(jié)合端的遠(yuǎn)端引入一種疏水末端，使該肽的未結(jié)合游離末端能與載體蛋白表面保持結(jié)合。這樣就可獲得在構(gòu)象上與完整天然肽分子最為接近的肽。舉例來(lái)說(shuō)，可以對(duì)肽進(jìn)行改造，使其具有一個(gè)N-端半胱氨酸和一種疏水的C-端酰胺化尾。作為選擇，也可以添加或取代成一個(gè)或多個(gè)D-型氨基酸異構(gòu)體，以產(chǎn)生有利的衍生物，例如可提高肽的穩(wěn)定性的衍生物。
作為選擇，還可通過(guò)噬菌體展示等技術(shù)(EP0552267B1)，用自身能夠與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體來(lái)鑒別肽擬表位。利用該技術(shù)可產(chǎn)生大量能夠模擬天然肽結(jié)構(gòu)、從而能夠與抗-天然肽的抗體結(jié)合的肽序列，但這些肽序列本身不一定與天然多肽有明顯的序列同源性。
疫苗另一方面，本發(fā)明涉及一種方法，用于在個(gè)體中，特別是在哺乳動(dòng)物中，優(yōu)選的是在人體中，誘導(dǎo)一種免疫應(yīng)答，該方法包括，用足以產(chǎn)生抗體和(或)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的BASB132多核苷酸和(或)多肽或其片段或變異體對(duì)個(gè)體進(jìn)行接種，以保護(hù)該個(gè)體不受感染，特別是不受細(xì)菌性感染，最明確地說(shuō)是不受粘膜炎莫拉氏菌感染。另外還提供通過(guò)這種免疫應(yīng)答來(lái)延緩細(xì)菌復(fù)制的方法。再一方面，本發(fā)明還涉及一種在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括，用一種可指導(dǎo)BASB132多核苷酸和(或)多肽或其片段或變異體表達(dá)的核酸載體、核酸序列或核酶向所述個(gè)體給藥，使BASB132多核苷酸和(或)多肽或其片段或變異體能夠在體內(nèi)表達(dá)，以便誘導(dǎo)一種免疫應(yīng)答，如抗體免疫應(yīng)答和(或)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中包括，例如，產(chǎn)細(xì)胞因子T細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而無(wú)論該個(gè)體是否已形成該疾病，都可以保護(hù)該個(gè)體免得疾病，優(yōu)選的是保護(hù)人類免得疾病?；蚪o藥方法的實(shí)例是將基因作為顆粒的包被或以其他方式快速轟擊到目的細(xì)胞內(nèi)。所述核酸載體包括DNA、RNA、核酶、修飾的核酸、DNA/RNA雜合體、DNA-蛋白復(fù)合物或RNA-蛋白復(fù)合物。
另一方面，本發(fā)明涉及一種免疫組合物，該組合物被引入一種能夠在體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的個(gè)體時(shí)，優(yōu)選的是被引入人體時(shí)，可在該個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)一種抗BASB132多核苷酸和(或)其編碼的多肽的免疫應(yīng)答，其中該組合物含有一種重組BASB132多核苷酸和(或)其編碼的多肽，以及(或者)可編碼或表達(dá)該BASB132多核苷酸、其編碼的多肽，或本發(fā)明的其他多肽抗原的DNA和(或)RNA。這種免疫應(yīng)答可用于治療和預(yù)防，并且可采用抗體免疫和(或)細(xì)胞免疫的形式，例如由CTL或CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞免疫。
BASB132多肽或其片段可以與輔助蛋白或化學(xué)半分子(moiety)相融合，這些輔助蛋白或化學(xué)半分子可以自身產(chǎn)生抗體，也可以自身不產(chǎn)生抗體，它們可穩(wěn)定第一蛋白，并且可產(chǎn)生一種具有抗原性和(或)免疫原性的融合或修飾蛋白，優(yōu)選的是產(chǎn)生一種具有保護(hù)特性的融合或修飾蛋白。優(yōu)選的是這種融合重組蛋白另含有一種抗原性輔助蛋白，如來(lái)源于流感嗜血菌的脂蛋白D、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或β-半乳糖苷酶，或其他任何能夠穩(wěn)定蛋白并利于其產(chǎn)生和純化的較大的輔助蛋白。此外，輔助蛋白可以對(duì)接受該蛋白的生物的免疫系統(tǒng)進(jìn)行廣泛刺激，因而可作為一種佐劑。輔助蛋白可以聯(lián)接在第一蛋白的氨基端或羧基端。
在本發(fā)明的疫苗組合物中，BASB132多肽和(或)多核苷酸、或其片段或擬表位或變異體可以由一種載體來(lái)提供，如上文描述的活細(xì)菌載體等活體重組載體。
BASB132多肽也可使用適當(dāng)?shù)姆腔铙w載體，例如細(xì)菌的外膜小泡或“大泡”。OM大泡來(lái)源于革蘭氏陰性菌雙層膜的外膜，據(jù)資料顯示，OM大泡在多種革蘭氏陰性菌中都存在(Zhou，L et al.1998.FEMSMicrobiol.Lett.163223-228)，其中包括沙眼衣原體和鸚鵡熱衣原體。據(jù)報(bào)道，可產(chǎn)生大泡的部分細(xì)菌變異體包括百日咳博德特氏菌、博氏疏螺旋體、馬爾他布氏桿菌、綿羊布氏桿菌、大腸桿菌、流感嗜血菌、嗜肺軍團(tuán)菌、粘膜炎莫拉氏菌、淋病奈瑟球菌、腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。
大泡的優(yōu)點(diǎn)是能提供天然構(gòu)象的外膜蛋白，因而特別適用于疫苗。在疫苗應(yīng)用方面，還可以對(duì)大泡進(jìn)行改良，方法是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行改造，以改變外膜的一種或多種分子的表達(dá)。舉例來(lái)說(shuō)，利用這種方法可引入BASB132多肽等所需免疫原性蛋白或?qū)ζ浔磉_(dá)進(jìn)行增量調(diào)節(jié)(如改變啟動(dòng)子)。另外，還可以對(duì)無(wú)關(guān)外膜分子(如非保護(hù)性抗原或可變的優(yōu)勢(shì)免疫蛋白)或有害外膜分子(如LPS等毒性分子或潛在的自身免疫應(yīng)答誘導(dǎo)劑)的表達(dá)進(jìn)行減量調(diào)節(jié)。這些方法將在下文做更詳細(xì)地描述。
BASB132基因的非編碼側(cè)翼區(qū)含有對(duì)該基因表達(dá)十分重要的調(diào)控元件。這種調(diào)控可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上進(jìn)行。這些區(qū)域無(wú)論處在基因可讀框的上游還是下游，都可通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)獲得其序列。該序列信息能用來(lái)確定可能的調(diào)控基元，如不同的啟動(dòng)子元件、終止子序列、可誘導(dǎo)序列元件、阻抑物、負(fù)責(zé)相變異的元件、SD序列、具有潛在二級(jí)結(jié)構(gòu)并參與調(diào)控的區(qū)域，以及其他類型的調(diào)控基元或序列。該序列構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。
該序列信息可用來(lái)調(diào)變BASB132基因的天然表達(dá)?；虮磉_(dá)的增量調(diào)節(jié)可通過(guò)改變啟動(dòng)子、SD序列、潛在的阻抑物或操縱子序列或其他任何有關(guān)元件來(lái)實(shí)現(xiàn)。也可通過(guò)類似的修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)表達(dá)的減量調(diào)節(jié)。作為選擇，也可以改變相變異序列，使基因表達(dá)受相變異的調(diào)控或是脫離這種調(diào)控。另一方法是用一種或多種能夠?qū)崿F(xiàn)受控表達(dá)的可誘導(dǎo)元件來(lái)控制基因的表達(dá)。這種調(diào)控的實(shí)例包括，但不局限于，用溫度的改變進(jìn)行誘導(dǎo)、添加誘導(dǎo)劑底物，如選定的糖類或其衍生物、微量元素、維生素、輔助因子、金屬離子，等等。
有幾種不同的方法可用來(lái)引入上述修飾。對(duì)參與基因表達(dá)的序列進(jìn)行修飾的體內(nèi)實(shí)現(xiàn)方法是，進(jìn)行隨機(jī)誘變，然后篩選預(yù)期表型。另一種方法的步驟包括，分離出目的區(qū)域，并通過(guò)隨機(jī)誘變或定點(diǎn)取代、插入或缺失誘變對(duì)其進(jìn)行修飾。然后用同源重組方法將修飾區(qū)域重新引入細(xì)菌基因組，并評(píng)定對(duì)基因表達(dá)的影響。另一種方法是，根據(jù)目的區(qū)域的序列信息，將所有或部分天然調(diào)控序列替換或去除。這種方法需要分離出靶調(diào)控區(qū)并進(jìn)行修飾，使其含有另一種基因的調(diào)控元件、來(lái)自不同基因的組合調(diào)控元件、合成調(diào)控區(qū)或其他任何調(diào)控區(qū)，或?qū)⑵湟吧驼{(diào)控序列的選定部分去除。然后用同源重組方法將這些修飾序列重新引入細(xì)菌基因組?？捎糜趯?duì)基因表達(dá)進(jìn)行增量調(diào)節(jié)的部分優(yōu)選啟動(dòng)子包括，來(lái)源于腦膜炎奈瑟菌或淋病奈瑟球菌的啟動(dòng)子porA、porB、lbpB、tbpB、p110、1st、hpuAB；ompCD、copB、lbpB、ompE、UspA1；UspA2；來(lái)源于粘膜炎莫拉氏菌的TbpB；來(lái)源于流感嗜血菌的p1、p2、p4、p5、p6、lpD、tbpB、D15、Hia、Hmw1、Hmw2。
在一項(xiàng)實(shí)施例中，基因表達(dá)的調(diào)變可通過(guò)將其啟動(dòng)子與一種強(qiáng)啟動(dòng)子互換的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)(包括分離該基因的上游序列，對(duì)該序列進(jìn)行體外修飾，并用同源重組方法將其重新引入基因組)。在細(xì)菌及細(xì)菌脫落(或產(chǎn)生)的外膜小泡中均可以實(shí)現(xiàn)對(duì)表達(dá)的增量調(diào)節(jié)。
其他實(shí)施例中描述的方法可用來(lái)產(chǎn)生一些重組細(xì)菌菌株，這些重組細(xì)菌菌株的特性更適合于疫苗應(yīng)用。這些菌株包括，但不局限于，減毒菌株、選定抗原的表達(dá)水平增強(qiáng)的菌株、干擾免疫應(yīng)答的基因被敲除(或表達(dá)水平降低)的菌株、優(yōu)勢(shì)免疫蛋白的表達(dá)被調(diào)變的菌株、外膜小泡的脫落被調(diào)變的菌株。
因此，本發(fā)明還提供一種修飾的BASB132基因上游區(qū)域，該區(qū)域含有一種可改變外膜BASB132蛋白表達(dá)水平的異種調(diào)控元件。該區(qū)域構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面，其中包括BASB132基因的上游序列。該區(qū)域從緊接著B(niǎo)ASB132基因的上游位置開(kāi)始，通常持續(xù)到該基因上游的一個(gè)離ATG起始密碼子不足約1000bp的位置。當(dāng)基因處在多順?lè)醋有蛄?操縱子)中時(shí)，該區(qū)域可以從緊接著該基因的上一位置開(kāi)始，也可以從緊接著該操縱子的第一個(gè)基因的上一位置開(kāi)始。優(yōu)選的是，這種修飾的上游區(qū)域在ATG上游500-700bp之間含有一種異種啟動(dòng)子。
因此，本發(fā)明提供一種位于修飾的細(xì)菌大泡內(nèi)的BASB132多肽。本發(fā)明還提供改良的宿主細(xì)胞，這些宿主細(xì)胞可產(chǎn)生非活性膜泡載體。本發(fā)明還提供含有BASB132基因的核酸載體，該BASB132基因含有一段修飾的上游區(qū)域，該區(qū)域中含有一種異種調(diào)控元件。
本發(fā)明還提供所述宿主細(xì)胞及細(xì)菌大泡的制備方法。
本發(fā)明還提供一些組合物，特別是疫苗組合物，以及這些組合物的制備方法，這些組合物中含有本發(fā)明的多肽和(或)多核苷酸以及免疫刺激性DNA序列，如Sato，Y.et al.Science 273352(1996)中描述的DNA序列。
此外，本發(fā)明還提供一些方法，這些方法是將已證明能夠編碼細(xì)菌表面蛋白非可變區(qū)的所述多核苷酸或其特定片段構(gòu)建成多核苷酸構(gòu)建體，并利用這些構(gòu)建體在粘膜炎莫拉氏菌感染的動(dòng)物模型中進(jìn)行遺傳免疫實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)特別適用于鑒別那些可激發(fā)預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答的蛋白表位。相信該方法還可隨后用于從成功抵抗或清除感染的動(dòng)物的必需器官中制備具有特定用途的單克隆抗體，以獲得可用于哺乳動(dòng)物，特別是人類的細(xì)菌性感染，特別是粘膜炎莫拉氏菌感染的預(yù)防藥或治療方法。
本發(fā)明還提供一種疫苗制劑，該疫苗制劑含有本發(fā)明的一種免疫原性重組多肽和(或)多核苷酸，同時(shí)含有一種適當(dāng)?shù)妮d體，如藥學(xué)容許的載體。由于多肽和多核苷酸在胃內(nèi)可被降解，因而優(yōu)選的是均以胃腸外方式給藥，包括皮下給藥、肌內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥或真皮內(nèi)給藥。適于胃腸外給藥的制劑包括水性和非水性的無(wú)菌注射液，其中可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌化合物以及使制劑與個(gè)體的體液等滲的溶液，優(yōu)選的是與血液等滲的溶液；以及水性和非水性的無(wú)菌懸浮液，其中可含有懸浮劑或增稠劑。該制劑可以在諸如密封安瓿瓶和小藥水瓶等單位劑量或多劑量容器中提供，并且可在凍干條件下保存，在使用前只需直接添加無(wú)菌流質(zhì)載體。
為了提高制劑的免疫原性，本發(fā)明的疫苗制劑還可含有佐劑系統(tǒng)。優(yōu)選的是用優(yōu)選佐劑系統(tǒng)來(lái)誘發(fā)TH1型應(yīng)答。
免疫應(yīng)答可大致分為兩大類，即體液介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(傳統(tǒng)的鑒定方法是保護(hù)機(jī)制分別為抗體效應(yīng)劑和細(xì)胞效應(yīng)劑)。這兩類應(yīng)答被稱為T(mén)H1型應(yīng)答(細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)和TH2型免疫應(yīng)答(體液應(yīng)答)。
TH1型免疫應(yīng)答的特征在于，可產(chǎn)生抗原特異性單倍體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞以及天然殺傷細(xì)胞應(yīng)答。小鼠TH1型應(yīng)答的特征是產(chǎn)生IgG2a亞型抗體，而相應(yīng)的人類TH1型應(yīng)答則產(chǎn)生IgG1型抗體。TH2型免疫應(yīng)答的特征是產(chǎn)生廣泛的同種免疫球蛋白，小鼠中產(chǎn)生的免疫球蛋白包括IgG1、IgA和IgM。
細(xì)胞因子被認(rèn)為是產(chǎn)生這兩種免疫應(yīng)答類型的驅(qū)動(dòng)力。高水平的TH1型細(xì)胞因子傾向于產(chǎn)生針對(duì)給定抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而高水平的TH2型細(xì)胞因子傾向于產(chǎn)生針對(duì)抗原的體液免疫應(yīng)答。
TH1型免疫應(yīng)答與TH2型免疫應(yīng)答的區(qū)別并不是絕對(duì)的。實(shí)際上，個(gè)體可維持TH1占優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答，也可以維持TH2占優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答。但為了方便，通常是根據(jù)Mosmann和Coffman(Mosmann，T.R.andCoffman，R.L.(1989)TH1與TH2細(xì)胞不同的淋巴因子分泌方式導(dǎo)致不同的功能特性。Annual Review of Immunology，7，p145-173)對(duì)鼠CD4+ve T細(xì)胞克隆的描述來(lái)研究細(xì)胞因子家族。根據(jù)傳統(tǒng)觀點(diǎn)，TH1型應(yīng)答與T-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的INF-γ和IL-2細(xì)胞因子有關(guān)。但是，常與誘導(dǎo)TH1型免疫應(yīng)答直接相關(guān)的其他細(xì)胞因子不由T細(xì)胞產(chǎn)生，如IL-12。相比之下，TH2型應(yīng)答與IL-4、IL-5、IL-6和IL-13的分泌有關(guān)。
已知某些疫苗佐劑特別適用于刺激TH1型或TH2型細(xì)胞因子應(yīng)答。能夠在接種或感染后顯示免疫應(yīng)答TH1∶TH2平衡的最佳方法通常包括，在用抗原重新刺激后，直接對(duì)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TH1或TH2細(xì)胞因子進(jìn)行體外測(cè)量，以及(或者)對(duì)抗原特異性抗體應(yīng)答的IgG1∶IgG2a比率進(jìn)行測(cè)量。
因此，用抗原對(duì)分離的T細(xì)胞群體重新進(jìn)行體外刺激時(shí)，TH1型佐劑可優(yōu)先刺激這些T細(xì)胞產(chǎn)生高水平的TH1型細(xì)胞因子，并且可促進(jìn)CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生以及與TH1型相關(guān)的抗原特異性同種免疫球蛋白應(yīng)答的產(chǎn)生。
可優(yōu)先刺激TH1型細(xì)胞應(yīng)答的佐劑在國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/00153和WO95/17209中有所描述。
3-脫氧-?；瘑瘟柞Ｖ珹(3D-MPL)就是這樣一種佐劑。它公開(kāi)于GB2220211(Ribi)。從化學(xué)角度來(lái)看，它是帶有4、5或6個(gè)?；湹?-脫氧-?；瘑瘟柞Ｖ珹的混合物，這種混合物由Ribi Immunochem，Montana制造。3-脫氧-?；瘑瘟柞Ｖ珹的優(yōu)選形式公開(kāi)于歐洲專利0689454B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)。
優(yōu)選的是，3D-MPL的顆粒足夠小，使其能夠通過(guò)0.22微米濾膜過(guò)濾除菌(歐洲專利0689454)。3D-MPL的提供量為每劑10μg-100μg，優(yōu)選的是每劑25-50μg，其中抗原的提供量一般為每劑2-50μg。
另一種優(yōu)選佐劑包括QS21，它是用HPLC方法由Quillaja SaponariaMolina的樹(shù)皮純化出的一種無(wú)毒成分。作為選擇，可將QS21與3-脫氧-酰化單磷酰脂A(3D-MPL)相混合，也可選擇再與一種載體混合。
美國(guó)專利5,057,540公開(kāi)了產(chǎn)生QS21的方法。
有關(guān)含有QS21的反應(yīng)原性佐劑，前人已有所描述(WO96/33739)。當(dāng)與一種抗原混合時(shí)，這些含有QS21和膽固醇的制劑表現(xiàn)為一種有效的TH1刺激佐劑。
可優(yōu)先刺激TH1型細(xì)胞應(yīng)答的其他佐劑還包括免疫調(diào)制寡核苷酸，如WO96/02555中公開(kāi)的未甲基化CpG序列。
還可考慮將如上所述的不同TH1刺激佐劑的組合作為優(yōu)先產(chǎn)生TH1型細(xì)胞應(yīng)答的刺激佐劑。例如QS21可以與3D-MPL配制在一起。QS21∶3D-MPL的典型比率為1∶10到10∶1；優(yōu)選的是1∶5到5∶1，通常情況下基本為1∶1。產(chǎn)生最佳協(xié)同作用的優(yōu)選3D-MPL∶QS21比率為2.5∶1到1∶1。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的疫苗組合物中還含有一種載體。該載體可以是一種水包油乳劑，或一種鋁鹽，如磷酸鋁或氫氧化鋁。
優(yōu)選的水包油乳劑可含有一種可代謝的油，如角鯊烯、α-生育酚和Tween80。在一項(xiàng)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述疫苗組合物中的抗原可以在這種乳劑中與QS21和3D-MPL混合。此外，該水包油乳劑可含有Span85和(或)卵磷脂和(或)三辛酸甘油酯。
當(dāng)用于人類給藥時(shí)，疫苗中的QS21及3D-MPL含量通常為每劑1μg-200μg，如每劑10-100μg，優(yōu)選的是每劑10μg-50μg。水包油乳劑一般可含有2-10％的角鯊烯、2-10％的α-生育酚和0.3-3％的Tween80。角鯊烯∶α-生育酚的優(yōu)選比率為等于或小于1，因?yàn)檫@樣的乳劑更加穩(wěn)定。此外還可含有1％的Span85。本發(fā)明的疫苗可另含有一種穩(wěn)定劑，這在某些情況下是有益的。
優(yōu)選地，無(wú)毒水包油乳劑可以在一種水性載體中含有一種無(wú)毒的油，如角鯊?fù)榛蚪酋徬约耙环N乳化劑，如Tween80。該水性載體可以是，例如，磷酸緩沖鹽溶液。
在WO95/17210中描述了一種特別有效的佐劑，該佐劑是在一種水包油乳劑中含有QS21、3D-MPL和生育酚。
本發(fā)明還提供一種多價(jià)疫苗組合物，該疫苗組合物同時(shí)含有本發(fā)明的疫苗制劑和其他抗原，特別是可用來(lái)治療癌癥、自身免疫疾病及其相關(guān)病情的抗原。這種多價(jià)疫苗組合物可含有上文所述的一種TH-1誘導(dǎo)佐劑。
盡管本發(fā)明是依據(jù)某些BASB132多肽和多核苷酸來(lái)進(jìn)行描述，但應(yīng)該了解的是，本發(fā)明還包括天然的多肽和多核苷酸的片段，以及帶有添加、缺失或取代的類似多肽和多核苷酸，這些添加、缺失或取代基本不影響重組多肽或多核苷酸的免疫原性。
組合物、試劑盒與給藥方法另一方面，本發(fā)明提供含有BASB132多核苷酸和(或)BASB132多肽的組合物，用于向細(xì)胞或多細(xì)胞生物給藥。
本發(fā)明還涉及一些組合物，這些組合物含有文中描述的一種多核苷酸和(或)多肽或其激動(dòng)劑或拮抗劑。本發(fā)明的多肽和多核苷酸可以與未滅菌或滅菌的一種或多種載體形成組合物，以供細(xì)胞、組織或生物使用，例如適于向個(gè)體給藥的藥用載體。這些組合物可含有例如介質(zhì)添加劑或藥學(xué)有效劑量的本發(fā)明所述多肽和(或)多核苷酸，以及一種藥學(xué)容許的載體或賦形劑。這些載體包括，但不局限于，鹽溶液、緩沖鹽溶液、葡糖、水、甘油、乙醇及其組合。制劑需適應(yīng)其給藥方式。本發(fā)明還涉及含有一個(gè)或多個(gè)容器的診斷及藥用的包和試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明所述組合物成分。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其他化合物可以單獨(dú)使用，或與諸如治療化合物等其他化合物結(jié)合使用。
藥用組合物可采用任何有效而又便利的方式進(jìn)行給藥，其中尤其包括，例如，通過(guò)局部、口腔、肛門(mén)、陰道、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑進(jìn)行給藥。
當(dāng)用于治療或預(yù)防時(shí)，可將活性劑作為可注射的組合物向個(gè)體給藥，例如無(wú)菌的水性分散體，優(yōu)選的是等滲的無(wú)菌的水性分散體。
另一方面，本發(fā)明提供一些藥用組合物，這些組合物含有藥學(xué)有效劑量的多肽和(或)多核苷酸，例如可溶形式的本發(fā)明所述多肽和(或)多核苷酸，以及顯效肽或拮抗肽或小分子化合物，同時(shí)含有一種藥學(xué)容許的載體或賦形劑。這些載體包括，但不局限于，鹽溶液、緩沖鹽溶液、葡糖、水、甘油、乙醇及其組合。本發(fā)明還涉及含有一個(gè)或多個(gè)容器的藥用包和藥用試劑盒，容器中裝有一種或多種上述組合物成分。本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其他化合物可以單獨(dú)使用，或與諸如治療化合物等其他化合物結(jié)合使用。
組合物需適應(yīng)其給藥途徑，如通過(guò)全身或口腔途徑給藥。優(yōu)選的全身給藥方式包括注射，一般為靜脈內(nèi)注射。也可采用其他注射方法，如皮下注射、肌內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射。全身給藥的替代方法還包括，利用諸如膽汁鹽或梭鏈孢酸或其他去污劑等滲透劑進(jìn)行穿粘膜給藥和穿皮給藥。此外，若能將本發(fā)明的多肽或其他化合物配制成腸溶制劑或膠囊制劑，則也可以進(jìn)行口服給藥。也可將這些化合物以油膏劑、糊劑、凝膠、溶液、粉末等形式進(jìn)行局部和(或)局限性給藥。
當(dāng)給藥于哺乳動(dòng)物，特別是給藥于人類時(shí)，活性劑的日劑量應(yīng)為0.01mg/kg-10mg/kg，通常約為1mg/kg。醫(yī)生必須確定最適合某一個(gè)體的實(shí)際劑量，該劑量隨特定個(gè)體的年齡、體重和反應(yīng)而有所不同。以上提供的劑量為典型的平均劑量。當(dāng)然，在個(gè)別情況下應(yīng)采用更高或更低的劑量，這些情況也處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
所需劑量范圍取決于選擇的肽、給藥途徑、制劑性質(zhì)、主體狀況的特性和主治醫(yī)師的判斷。但適當(dāng)?shù)膭┝糠秶鸀?.1-100μg/kg主體。
為方便起見(jiàn)，疫苗組合物可以是可注射的形式?？梢杂脗鹘y(tǒng)的佐劑來(lái)加強(qiáng)免疫應(yīng)答。適于接種的單位劑量為0.5-5μg/kg的抗原，優(yōu)選的是以該劑量給藥1-3次，間隔1-3周。以所述劑量給藥時(shí)，本發(fā)明的化合物不會(huì)產(chǎn)生可阻礙將其給藥于適當(dāng)個(gè)體的毒副作用。
但考慮到可用化合物的多樣性和不同給藥途徑的效率差異，所需劑量會(huì)有很大的不同。舉例來(lái)說(shuō)，與靜脈內(nèi)注射給藥相比，口服給藥需要更大的劑量。利用該領(lǐng)域熟知的以常規(guī)經(jīng)驗(yàn)為依據(jù)的優(yōu)化方法可對(duì)這些劑量水平的變化進(jìn)行調(diào)整。
序列庫(kù)、有形介質(zhì)中的序列以及算法多核苷酸與多肽的序列是一種重要的信息資源，可用來(lái)確定其二維及三維結(jié)構(gòu)，以及鑒別具有類似同源性的其他序列。實(shí)現(xiàn)這些方法的最便利途徑是，將序列儲(chǔ)存在可被計(jì)算機(jī)讀取的介質(zhì)中，然后用已知的大分子結(jié)構(gòu)程序中的存儲(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，或利用眾所周知的搜索工具，如GCG程序包，對(duì)序列庫(kù)進(jìn)行搜索。
本發(fā)明還提供字符序列或字符串的分析方法，特別是遺傳序列或編碼的蛋白序列的分析方法。優(yōu)選的序列分析方法包括，例如，序列同源性分析方法，如同一性或相似性分析方法，DNA、RNA及蛋白結(jié)構(gòu)分析方法、序列裝配方法、分支分析方法、序列基元分析方法、可讀框判定方法、核酸堿基調(diào)用方法、密碼子選擇分析方法、核酸堿基修剪方法，以及序列層析譜峰值分析方法。
本發(fā)明提供一種用計(jì)算機(jī)進(jìn)行同源性鑒定的方法。該方法的步驟包括在可被計(jì)算機(jī)讀取的介質(zhì)中提供一種含有本發(fā)明所述多核苷酸序列的第一多核苷酸序列；并將所述第一多核苷酸序列至少與另一種多核苷酸或多肽序列進(jìn)行比較，以確定同源性。
本發(fā)明還提供一種用計(jì)算機(jī)進(jìn)行同源性鑒定的方法，該方法的步驟包括在可被計(jì)算機(jī)讀取的介質(zhì)中提供一種含有本發(fā)明所述多肽序列的第一多肽序列；并將所述第一多肽序列至少與另一種多核苷酸或多肽序列進(jìn)行比較，以確定同源性。
該申請(qǐng)書(shū)引用的所有出版物和參考文獻(xiàn)均在此全面引入作為參考，其中包括專利和專利申請(qǐng)，但不局限于此，這等同于對(duì)每個(gè)出版物或參考文獻(xiàn)都特別單獨(dú)標(biāo)明要在此完整引入作為參考。在該申請(qǐng)書(shū)中要求優(yōu)先權(quán)的所有專利申請(qǐng)也在此全面引入作為參考，其方式與上述出版物和參考文獻(xiàn)的方式相同。
定義在該領(lǐng)域中，“同一性”是指通過(guò)序列比較而確定的兩種或多種多肽序列之間的關(guān)系、或兩種或多種多核苷酸序列之間的關(guān)系，這種關(guān)系視具體情況而定。在該領(lǐng)域中，“同一性”還表示通過(guò)序列串之間的匹配情況而確定的多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度，這種相關(guān)程度同樣視具體情況而定。利用已知的方法能夠很容易地計(jì)算出“同一性”，這些方法包括，但不局限于，《計(jì)算分子生物學(xué)》，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；《生物計(jì)算信息學(xué)與基因組計(jì)劃》，Smith，D.W，ed.，Academic Press，New York，1993；《序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析》，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；《分子生物學(xué)中的序列分析》，von Heine，G.，AcademicPress，1987；以及《序列分析入門(mén)》，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math，481073(1988)中描述的方法。計(jì)算同一性的方法可以給出測(cè)試序列間最大的匹配程度。此外，計(jì)算同一性的方法還被編寫(xiě)成公用的計(jì)算機(jī)程序。能夠計(jì)算兩個(gè)序列間同一性的計(jì)算機(jī)程序包括，但不局限于，GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.，et al.，Nucleic AcidsResearch 12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN(Altschul，S.F.et al.，J.Molec.Biol.215403-410(1990))，以及FASTA(Pearson and LipmanProc.Natl.Acad.Sci.USA 852444-2448(1988))。由NCBI和其他資源可獲得共用的BLAST系列程序(BLAST手冊(cè)，Altschul，S.，et al.，NCBINLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990))。還可使用眾所周知的Smith Waterman算法來(lái)計(jì)算同一性。
用于多肽序列比較的參數(shù)包括算法Needleman and Wunsch，J.Mol Biol.48443-453(1970)對(duì)比矩陣Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915-10919(1992)中的BLOSSUM62間隔損失8間隔長(zhǎng)度損失2采用這些參數(shù)的有效程序有Genetics Computer Group，Madison WI的公用“gap”程序。以上參數(shù)是進(jìn)行肽比較的默認(rèn)值(對(duì)末端間隔不計(jì)算損失)。
用于多核苷酸序列比較的參數(shù)包括算法Needleman and Wunsch，J.Mol Biol.48443-453(1970)對(duì)比矩陣匹配＝+10，錯(cuò)配＝0間隔損失50間隔長(zhǎng)度損失3可用程序Genetics Computer Group，Madison WI的“gap”程序。這些參數(shù)是進(jìn)行核酸比較的默認(rèn)值。
下文(1)和(2)分別為多核苷酸和多肽的“同一性”的優(yōu)選含義。
(1)多核苷酸實(shí)施方案還包括一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有一段多核苷酸序列，該序列與序列編號(hào)1的參考序列至少有50、60、70、80、85、90、95、97或100％的同一性，其中，所述多核苷酸序列可以與序列編號(hào)1的參考序列完全相同，也可以與參考序列相比含有多至特定整數(shù)個(gè)核苷酸改變，其中，所述改變可選自，至少有一個(gè)核苷酸缺失、至少有一個(gè)核苷酸被取代，包括轉(zhuǎn)換和顛換，或至少插入一個(gè)核苷酸，并且該改變可出現(xiàn)在參考核苷酸序列的5’或3’端位置或其間的任意位置，可單個(gè)地散布在參考序列的核苷酸中，也可分布在參考序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)基團(tuán)中，并且所述核苷酸改變數(shù)量的計(jì)算方法是，序列編號(hào)1的總核苷酸數(shù)乘以確定同一性的整數(shù)除以100所得的百分率，然后用序列編號(hào)1的總核苷酸數(shù)減去所得結(jié)果，或
nn≤xn-(xn·y)，其中nn為核苷酸改變數(shù)量，xn為序列編號(hào)1的總核苷酸數(shù)，y用0.50表示50％，用0.60表示60％，用0.70表示70％，用0.80表示80％，用0.85表示85％，用0.90表示90％，用0.95表示95％，用0.97表示97％，用1.00表示100％，而·為乘法運(yùn)算符，其中xn和y的任何非整數(shù)結(jié)果都先舍成最接近的整數(shù)，然后用xn減去該整數(shù)。通過(guò)改變序列編號(hào)2所述多肽的多核苷酸編碼序列，可以在該編碼序列內(nèi)產(chǎn)生無(wú)義、錯(cuò)義或移碼突變，從而由此改變?cè)摱嗪塑账峋幋a的多肽。
舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的多核苷酸序列可以與序列編號(hào)1的參考序列完全相同，即100％相同，也可以與參考序列相比而含有多至特定整數(shù)個(gè)核苷酸改變，從而使同一性百分率小于100％。這些改變可選自，至少有一個(gè)核苷酸缺失、至少有一個(gè)核苷酸被取代，包括轉(zhuǎn)換和顛換，或至少插入一個(gè)核苷酸，其中該改變可出現(xiàn)在參考多核苷酸序列的5’或3’端位置或其間的任意位置，可單個(gè)地散布在參考序列的核酸中，也可分布在參考序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)基團(tuán)中。特定同一性百分率的核苷酸改變數(shù)量的計(jì)算方法是，序列編號(hào)1的總核苷酸數(shù)乘以確定同一性的整數(shù)除以100所得的百分率，然后用序列編號(hào)1的總核苷酸數(shù)減去所得結(jié)果，或nn≤xn-(xn·y)，其中nn為核苷酸改變數(shù)量，xn是序列編號(hào)1的總核苷酸數(shù)，y是，例如，用0.70表示70％，用0.80表示80％，用0.85表示85％等等，·為乘法運(yùn)算符，其中xn和y的任何非整數(shù)結(jié)果都先舍成最接近的整數(shù)，然后用xn減去該整數(shù)。
(2)多肽實(shí)施方案還包括一種分離的多肽，該多肽含有一段與序列編號(hào)2的參考多肽序列至少有50、60、70、80、85、90、95、97或100％同一性的多肽，其中所述多肽序列可以與序列編號(hào)2的參考序列完全相同，也可以與參考序列相比而含有多至特定整數(shù)個(gè)氨基酸改變，其中，所述改變可選自，至少有一個(gè)氨基酸缺失、至少有一個(gè)氨基酸被取代，包括保守和非保守取代，或至少插入一個(gè)氨基酸，并且該改變可出現(xiàn)在參考多肽序列的氨基端或羧基端位置或其間的任意位置，可單個(gè)地散布在參考序列的氨基酸中，也可分布在參考序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)基團(tuán)中，并且所述氨基酸改變數(shù)量的計(jì)算方法是，序列編號(hào)2的總氨基酸數(shù)乘以確定同一性的整數(shù)除以100所得的百分率，然后用序列編號(hào)2的總氨基酸數(shù)減去所得結(jié)果，或na≤xa-(xa·y)，其中na為氨基酸改變數(shù)量，xa為序列編號(hào)2的總氨基酸數(shù)，y用0.50表示50％，用0.60表示60％，用0.70表示70％，用0.80表示80％，用0.85表示85％，用0.90表示90％，用0.95表示95％，用0.97表示97％，用1.00表示100％，而·為乘法運(yùn)算符，其中xa和y的任何非整數(shù)結(jié)果都先舍成最接近的整數(shù)，然后用xa減去該整數(shù)。
舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的多肽序列可以與序列編號(hào)2的參考序列完全相同，即100％相同，也可以與參考序列相比而含有多至特定整數(shù)個(gè)氨基酸改變，從而使同一性百分率小于100％。這些改變可選自，至少有一個(gè)氨基酸缺失、至少有一個(gè)氨基酸被取代，包括保守和非保守取代，或至少插入一個(gè)氨基酸，并且該改變可出現(xiàn)在參考多肽序列的氨基端或羧基端位置或其間的任意位置，可單個(gè)地散布在參考序列的氨基酸中，也可分布在參考序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)基團(tuán)中。特定同一性百分率的氨基酸改變數(shù)量的計(jì)算方法是，序列編號(hào)2的總氨基酸數(shù)乘以確定同一性的整數(shù)除以100所得的百分率，然后用序列編號(hào)2的總氨基酸數(shù)減去所得結(jié)果，或na≤xa-(xa·y)，其中na為氨基酸改變數(shù)量，xa是序列編號(hào)2的總氨基酸數(shù)，y是，例如，用0.70表示70％，用0.80表示80％，用0.85表示85％等等，·為乘法運(yùn)算符，其中xa和y的任何非整數(shù)結(jié)果都先舍成最接近的整數(shù)，然后用xa減去該整數(shù)。
文中使用的關(guān)于生物的“個(gè)體”是指一種多細(xì)胞真核生物，其中包括，但不局限于，后生動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、ovid、牛、猿、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人。
“分離的”是指由天然狀態(tài)被“人工”改變的，即如果天然存在，則已發(fā)生改變或已由最初環(huán)境轉(zhuǎn)移，或兩種情況都發(fā)生。舉例來(lái)說(shuō)，在活體生物中天然存在的多核苷酸或多肽不屬于本文使用的術(shù)語(yǔ)“分離的”，但由其天然共存物分離出的相同多核苷酸或多肽則屬于“分離的”。此外，通過(guò)轉(zhuǎn)化、遺傳操作或其他任何重組方法被引入生物體的多核苷酸或多肽即使在該生物體中仍然存在，也是屬于“分離的”，其中該生物體可以有生命或無(wú)生命。
“多核苷酸”通常指任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，它可以是含有單鏈和雙鏈區(qū)的未修飾或修飾的RNA或DNA。
“變異體”是指與參考多核苷酸或多肽不同，但仍保持基本特性的多核苷酸或多肽。典型的多核苷酸變異體與其參考多核苷酸的核苷酸序列不同。變異體中的核苷酸序列變化可以改變或不改變由參考多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下文所述，核苷酸變化的結(jié)果可以是參考序列編碼的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截?cái)?。典型的多肽變異體與其參考多肽的氨基酸序列不同。其差異通常有限，因而參考多肽與其變異體的序列整體上非常相似，并且有許多區(qū)域完全相同。變異體與參考多肽在氨基酸序列上的差異可以是一個(gè)或多個(gè)取代、添加、缺失的任意組合。取代或插入的氨基酸殘基可以被遺傳密碼編碼，也可以不能被遺傳密碼編碼。多核苷酸或多肽的變異體可以是天然的，如等位變異體，也可以是不知是否天然的變異體。多核苷酸和多肽的非天然變異體可通過(guò)誘變技術(shù)或直接合成的方法來(lái)獲得。
“疾病”是指由細(xì)菌感染引起或與其相關(guān)的任何疾病，其中包括，例如，幼兒及兒童中耳炎、老年肺炎、鼻竇炎、院內(nèi)感染以及侵襲性疾病、慢性中耳炎伴聽(tīng)力喪失、中耳內(nèi)液體累積、聽(tīng)神經(jīng)損傷、語(yǔ)言學(xué)習(xí)延遲、上呼吸道感染和中耳炎癥。
實(shí)施例除詳細(xì)描述的地方外，以下實(shí)施例均采用該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的和常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些實(shí)施例均作為說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1來(lái)源于粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株的BASB132基因的DNA序列A粘膜炎莫拉氏菌中的BASB132序列編號(hào)1顯示來(lái)源于粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株(也稱為MC2931菌株)的BASB132基因的DNA序列。序列編號(hào)2顯示BASB132多核苷酸序列的翻譯結(jié)果。
B粘膜炎莫拉氏菌43617菌株中的BASB132確定粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株中的BASB132基因的序列。為此，用Big Dyes試劑盒(Applied biosystems)對(duì)含有截?cái)嘈问降恼衬ぱ啄暇鶤TCC 43617菌株BASB132基因編碼區(qū)(相當(dāng)于3’端的最后2977個(gè)核苷酸)的質(zhì)粒DNA(見(jiàn)實(shí)施例2A)進(jìn)行DNA測(cè)序，并按照供應(yīng)商提供的條件在ABI 373/A DNA測(cè)序儀上進(jìn)行分析，所用引物是對(duì)粘膜炎莫拉氏菌BASB132基因有特異性的oli5 YtfN(5’-CCC ACC GTTTGC CCT TCA AT-3’)〔序列編號(hào)5〕、oli6 YtfN(5’-CAT TTT TCC CGAGCA TTC AAA C-3’)〔序列編號(hào)6〕和oli7 YtfN(5’-AAT CAG CCA CTTATC GCC AC-3’)〔序列編號(hào)7〕，以及對(duì)載體有特異性的M13通用測(cè)序引物(5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’)〔序列編號(hào)8〕和M13反向測(cè)序引物(5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’)〔序列編號(hào)9〕。結(jié)果是獲得了分別稱為序列編號(hào)3和序列編號(hào)4的多核苷酸序列及其推導(dǎo)多肽序列。
利用DNASTAR軟件包的MegAlign程序?qū)π蛄芯幪?hào)1和3的多核苷酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示于

圖1；成對(duì)比較的同一性結(jié)果顯示，兩種BASB132多核苷酸基因序列在重疊區(qū)100％相同。利用該MegAlign程序?qū)π蛄芯幪?hào)2和4的多肽序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示于圖2；成對(duì)比較的同一性結(jié)果顯示，兩種BASB132多肽序列在重疊區(qū)100％相同。
實(shí)施例2構(gòu)建質(zhì)粒以表達(dá)截?cái)嘈问降闹亟MBASB132A截?cái)郆ASB132的克隆正向擴(kuò)增引物oli1 YtfN(5’-TCA TGA ATG ACT CAG GCA AAG-3’)〔序列編號(hào)10〕和反向擴(kuò)增引物oli2 YtfN(5’-AGA TCT AAA CTTCCA ACG ATA AAT C-3’)〔序列編號(hào)11〕中分別設(shè)計(jì)了BspHI和BglII限制位點(diǎn)，使PCR產(chǎn)物能夠定向克隆到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pQE60中，從而可將截?cái)嘈问降腂ASB132蛋白作為C-端含有(His)6親和層析標(biāo)記的融合蛋白來(lái)加以表達(dá)。由于基因較大，所以用兩組并行的PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)擴(kuò)增整個(gè)編碼序列，第一組擴(kuò)增使用oli1 YtfN(5’-TCA TGA ATG ACT CAGGCA AAG-3’)〔序列編號(hào)10〕和oli3 YtfN(5’-AAA CAA ATC GCA CCCACG CC-3’)〔序列編號(hào)12〕，第二組擴(kuò)增使用oli2 YtfN(5’-AGA TCTAAA CTT CCA ACG ATA AAT C-3’)〔序列編號(hào)11〕和oli4 YtfN(5’-ACAAAT TGC AGC GCA TTG TTG G-3’)〔序列編號(hào)13〕。擴(kuò)增的兩組片段都具有一段含BstXI單一限制位點(diǎn)的公用區(qū)。首先用Top10細(xì)菌按廠商說(shuō)明將BASB132的PCR產(chǎn)物引入到pCRIITOPO克隆載體中(Invitrogen)。這種中間構(gòu)建體有利于進(jìn)一步克隆到表達(dá)載體中。利用限制酶分析方法篩選出含有BASB132 DNA插入序列的轉(zhuǎn)化體。約取20μl消化后的反應(yīng)物試樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(Tris-醋酸鹽-EDTA(TAE)緩沖液中含有0.8％的瓊脂糖)。凝膠電泳結(jié)束后用溴化乙錠染色，然后用UV光顯示DNA片段。將DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(1Kb梯形分子量標(biāo)準(zhǔn)，Life Technologies)與測(cè)試樣品并行電泳，以估計(jì)DNA片段的大小。然后根據(jù)廠商建議，用BspHI與BstXI或BstXI與BglII限制酶(LifeTechnologies)依次完全消化從每次克隆的選定轉(zhuǎn)化體純化出的質(zhì)粒。消化的DNA片段用硅膠旋轉(zhuǎn)柱純化，然后與pQE60質(zhì)粒連接。
BPCR-陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體的表達(dá)分析為了制備用于連接的表達(dá)質(zhì)粒pQE60，用NcoI和BglII將其進(jìn)行類似的完全消化，然后按廠商說(shuō)明用牛小腸磷酸酶(CIP，～0.02單位/pmol5’末端，Life Technologies)進(jìn)行處理，以避免自身連接。連接反應(yīng)使用了約5倍摩爾數(shù)過(guò)量的消化片段來(lái)制備載體。用該領(lǐng)域熟知的方法以T4DNA連接酶(～2.0單位/反應(yīng)，Life Technologies)進(jìn)行～20μl的標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)(～16℃，～16小時(shí))。按該領(lǐng)域熟知的方法用連接反應(yīng)的試樣(～5μl)對(duì)電感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。再將轉(zhuǎn)化細(xì)胞置于～1.0ml LB培養(yǎng)基中37℃生長(zhǎng)～2-3小時(shí)，然后鋪在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上。添加的抗生素可用于篩選。將平板37℃過(guò)夜保溫～16小時(shí)。用無(wú)菌牙簽挑取ApR單菌落，并對(duì)新鮮LB ApR平板進(jìn)行“點(diǎn)狀”接種，同時(shí)對(duì)～1.0ml LB ApR液體培養(yǎng)基接種。在普通培養(yǎng)箱(用于平板)或振蕩水浴中將接種的平板和液體培養(yǎng)基37℃保溫過(guò)夜。然后進(jìn)行限制酶分析，以證實(shí)轉(zhuǎn)化體中含有BASB132 DNA插入序列。約取20μl消化后的反應(yīng)物試樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(Tris-醋酸鹽-EDTA(TAE)緩沖液中含有0.8％的瓊脂糖)。凝膠電泳結(jié)束后用溴化乙錠染色，然后用UV光顯示DNA片段。將DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(1Kb梯形分子量標(biāo)準(zhǔn)，LifeTechnologies)與測(cè)試樣品并行電泳，以估計(jì)DNA片段的大小。產(chǎn)生預(yù)期大小DNA片段的轉(zhuǎn)化體即為含有BASB132表達(dá)構(gòu)建體的菌株。然后對(duì)含有表達(dá)質(zhì)粒的菌株進(jìn)行重組BASB132的可誘導(dǎo)表達(dá)分析。
CPCR-陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體的表達(dá)分析然后用該領(lǐng)域熟知的方法將重組質(zhì)粒的DNA試樣(～1μl)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)M15(pREP4)細(xì)菌中。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞置于～1.0ml LB培養(yǎng)基中37℃生長(zhǎng)～2-3小時(shí)，然后鋪在含有氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(30μg/ml)的LB瓊脂平板上。添加的抗生素可用于篩選。將平板37℃過(guò)夜保溫～16小時(shí)。用無(wú)菌牙簽挑取ApR單菌落，并接種到～5.0ml的LB ApRKmR液體培養(yǎng)基中。將液體培養(yǎng)基37℃振蕩(～250rpm)保溫過(guò)夜。再把過(guò)夜的接種培養(yǎng)物的試樣(～1.0ml)接種到含有～25ml LB Ap培養(yǎng)基的125ml錐形瓶中，然后37℃振蕩(～250rpm)培養(yǎng)，直到培養(yǎng)物的混濁度達(dá)到O.D.600為～0.5，即對(duì)數(shù)中期(一般約為1.5-2.0小時(shí))。此時(shí)將大約一半的培養(yǎng)物(～12.5ml)轉(zhuǎn)到另一個(gè)125ml錐形瓶中，并通過(guò)添加終濃度為1.0mM的IPTG(在無(wú)菌水中配制的1.0M儲(chǔ)液，Sigma)來(lái)誘導(dǎo)重組BASB132蛋白的表達(dá)。將IPTG誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物都于37℃及振蕩條件下再保溫～4小時(shí)。誘導(dǎo)期結(jié)束后，從誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中取樣(～1.0ml)，并在微量離心機(jī)中室溫離心～3分鐘，以收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀分別懸浮在～50μl無(wú)菌水中，然后與等體積的含有2-巰基乙醇的2×Laemelli SDS-PAGE樣品緩沖液相混合，并在沸水浴中煮～3分鐘，以使蛋白變性。將IPTG誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的粗制細(xì)胞裂解物以相同的體積(～15μl)加樣到12％Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠上(1mm厚的Mini-gels，Novex)，一式兩份。在常規(guī)條件下用標(biāo)準(zhǔn)的SDS/Tris/甘氨酸電泳緩沖液(BioRad)將誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的裂解物樣品及預(yù)染的分子量標(biāo)準(zhǔn)(SeeBlue，Novex)一同進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，一塊膠用考馬斯亮藍(lán)R250(BioRad)染色，然后脫色，以顯示可由IPTG誘導(dǎo)而新產(chǎn)生的BASB132蛋白(圖3A)。另一塊膠則用BioRad Mini-Protean II印跡裝置和Towbin’s甲醇(20％)轉(zhuǎn)移緩沖液在PVDF膜(0.45微米孔徑，Novex)上4℃電印跡～2小時(shí)。膜的阻斷和抗體保溫是按該領(lǐng)域熟知的方法來(lái)進(jìn)行。利用抗RGS(His)3單克隆抗體和HRP偶聯(lián)的兔抗鼠二抗(QiaGen)來(lái)驗(yàn)證BASB132重組蛋白及其表達(dá)(圖3B)。用ABT不溶底物或Hyperfilm和Amersham ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)來(lái)顯示抗-His抗體的反應(yīng)模式。
實(shí)施例3重組BASB132的產(chǎn)生菌株用含有粘膜炎莫拉氏菌BASB132編碼質(zhì)粒(pQE60)的大腸桿菌M15重組表達(dá)菌株(PREP4)來(lái)產(chǎn)生用于純化重組蛋白的細(xì)胞團(tuán)。在含有100μg/ml氨芐青霉素(“Ap”)和30μg/ml卡那霉素(“Km”)的LB瓊脂平板上培養(yǎng)表達(dá)菌株，以確保pQE60和pREP4得以維持。用于-80℃冷凍保存的菌株是在含有相同濃度抗生素的LB培養(yǎng)基中增殖，然后與等體積的含有30％(w/v)甘油的LB培養(yǎng)基相混合。
培養(yǎng)基用于產(chǎn)生重組蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基含有2×YT培養(yǎng)基(Difco)和100μg/ml Ap及30μg/ml Km。在發(fā)酵罐中使用的培養(yǎng)基添加了0.25ml/L消泡劑(Antifoam 204，Sigma)。在發(fā)酵罐中添加IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)(終濃度1mM)，以誘導(dǎo)BASB132重組蛋白的表達(dá)。
發(fā)酵用0.3ml快速融解的冷凍培養(yǎng)物，或選擇性瓊脂平板培養(yǎng)基上的數(shù)個(gè)菌落，對(duì)含有50ml工作容積的500-ml接種錐形瓶進(jìn)行接種，并在150rpm的振蕩平臺(tái)上(Innova2100，New Brunswick Scientific)于37±1℃保溫約12小時(shí)。然后用該接種培養(yǎng)物對(duì)含有2×YT培養(yǎng)基和Ap抗生素的工作容積為5-L的發(fā)酵罐進(jìn)行接種。發(fā)酵罐(Bioflo 3000，New BrunswickScientific)在37±1℃、曝氣速率0.2-0.4 VVM以及Rushton葉輪轉(zhuǎn)速250rpm的條件下運(yùn)轉(zhuǎn)。接種錐形瓶與發(fā)酵罐中的pH值均不做調(diào)整。發(fā)酵其間，發(fā)酵罐中的pH值為6.5-7.3。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到對(duì)數(shù)中期時(shí)(～0.7 O.D.600單位)，把IPTG(溶于無(wú)菌水的1.0M儲(chǔ)液)添加到發(fā)酵罐中。細(xì)胞誘導(dǎo)2-4小時(shí)，然后用28RS Heraeus(Sepatech)或RC5C超速離心機(jī)(SorvallInstruments)離心以收集細(xì)胞。細(xì)胞漿在處理前保存于-20℃。
化學(xué)劑與材料咪唑和Triton X-100購(gòu)于Merck公司。鹽酸胍購(gòu)于Fluka公司。抑肽酶來(lái)自Sigma化學(xué)制品公司。尿素和AEBSF來(lái)自ICN-Biochemicals公司。其他所有化學(xué)劑均為試劑純或更高程度。
Ni-NTA Superflow樹(shù)脂和不含BSA的Penta-His抗體購(gòu)于QiaGen公司。MicroBCA測(cè)定劑來(lái)自Pierce公司；Amicon 3濾膜來(lái)自Millipore公司。透析膜(MWCO12-14000)購(gòu)于MFPI，USA。分子量標(biāo)準(zhǔn)(梯形標(biāo)準(zhǔn))購(gòu)于Life-technologies。
實(shí)施例4由大腸桿菌純化重組BASB132提取-純化把2750ml IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)物(～4小時(shí)，OD620＝0.5)獲得的細(xì)胞漿重懸在110ml含有6M鹽酸胍的100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，pH8緩沖液中(緩沖液A)，室溫放置1小時(shí)，然后10,000g離心20分鐘。將上清液加到用緩沖液A平衡的Ni-NTA Superflow樹(shù)脂上，立即收集。用含有8M尿素的100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，pH6.3緩沖液(緩沖液C)將樹(shù)脂清洗兩次。洗脫是用4×1.5ml含有8M尿素的100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，pH5.9緩沖液(緩沖液D)，然后用4×1.5ml含有8M尿素的100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，pH4.5緩沖液(緩沖液E)。洗脫組分用25％體積pH7.5的200mM磷酸緩沖液中和。將含有BASB132蛋白的組分合并，并對(duì)含有8M尿素的100mMNaH2PO4，pH7.4緩沖液透析，然后對(duì)含有4M尿素的該緩沖液透析，再對(duì)含有2M尿素的該緩沖液透析，最后對(duì)含有0.1％Triton-X100的pH7.4的PBS緩沖液透析三次。
由于在透析過(guò)程中產(chǎn)生沉淀，所以溶液呈混濁狀(溶液A)。離心(3000rpm，10分鐘)兩次后，溶液變得澄清(溶液B)。利用MicroBCA測(cè)定劑對(duì)溶液A和溶液B的純化BASB132蛋白進(jìn)行定量。溶液A的結(jié)果為170μg/ml。獲得的純化澄清蛋白(溶液B)為1.65mg，終濃度為75μg/ml。如圖4-A所示，純化的BASB132蛋白在SDS-PAGE分析中顯示為一條遷移率約100kDa(估計(jì)的相對(duì)分子量)的主帶。純度估計(jì)在70％以上。BASB132蛋白與一種針對(duì)6-組氨酸基元誘發(fā)的小鼠單克隆抗體具有反應(yīng)活性(圖4-B)。
實(shí)施例5產(chǎn)生抗重組BASB132的抗血清用純化的重組BASB132蛋白對(duì)兔子接種可產(chǎn)生抗BASB132蛋白的多價(jià)抗血清。
用純化的重組BASB132蛋白對(duì)小鼠接種也可產(chǎn)生抗BASB132蛋白的多價(jià)抗血清。
在首次免疫前(免疫前血)和最后一次免疫后取動(dòng)物血。
通過(guò)ELISA方法用純化的重組BASB132蛋白測(cè)定抗BASB132蛋白的效價(jià)。該效價(jià)的定義是用XL Fit軟件由4-參數(shù)邏輯模型計(jì)算出的中點(diǎn)效價(jià)。
另外還按下文實(shí)施例7所述，用蛋白印跡方法以抗血清為一抗對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定。蛋白印跡的結(jié)果顯示，在免疫動(dòng)物的血清內(nèi)存在抗BASB132抗體。
實(shí)施例6免疫學(xué)鑒定BASB132的表面暴露情況利用被福爾馬林殺死的粘膜炎莫拉氏菌全細(xì)胞以ELISA方法測(cè)定抗BASB132蛋白的效價(jià)。該效價(jià)的定義是用XL Fit軟件由4-參數(shù)邏輯模型計(jì)算出的中點(diǎn)效價(jià)。
實(shí)施例7免疫學(xué)鑒定蛋白質(zhì)印跡分析在Muller Hinton瓊脂平板上將包括ATCC43617菌株在內(nèi)的幾種粘膜炎莫拉氏菌菌株以及來(lái)自不同地理區(qū)的臨床分離物于36℃培育24小時(shí)。用幾個(gè)菌落來(lái)接種培養(yǎng)基。培養(yǎng)物生長(zhǎng)到A620約為0.6時(shí)，離心收集細(xì)胞。然后將細(xì)胞濃縮并溶解在PAGE樣品緩沖液中。然后在4-20％聚丙烯酰胺凝膠上對(duì)溶解的細(xì)胞進(jìn)行解析，并將分離的蛋白電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后用飽和緩沖液對(duì)PVDF膜進(jìn)行預(yù)處理。隨后的所有保溫步驟都使用這種預(yù)處理緩沖液。
用免疫前血清或兔或鼠的免疫血清與PVDF膜保溫。然后清洗PVDF膜。
用生物素標(biāo)記的綿羊抗兔或抗鼠Ig與PVDF膜保溫，再與抗生蛋白鏈菌素-過(guò)氧化物酶保溫。然后用清洗緩沖液將PVDF膜清洗3次，再用4-氯-1-萘酚顯色。
實(shí)施例8免疫學(xué)鑒定殺菌活性檢測(cè)抗-BASB132抗體的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，以確定按上文所述制備的BASB132蛋白抗血清的疫苗效力。檢測(cè)免疫前血清與抗-BASB132抗血清的補(bǔ)體介導(dǎo)的殺粘膜炎莫拉氏菌活性。在平板上培育粘膜炎莫拉氏菌菌株。將幾個(gè)菌落接種到液體培養(yǎng)基中。使培養(yǎng)物增殖，并在A620約為0.4時(shí)收集細(xì)胞。清洗一次，然后將沉淀懸浮并稀釋。
96孔板的第一個(gè)孔中附著免疫前血清和抗-BASB132血清，同一行的其他孔中附著一系列稀釋度的血清。然后添加稀釋的活體粘膜炎莫拉氏菌，并將混合物保溫。按照在毒性測(cè)定試驗(yàn)中預(yù)先確定的有效稀釋度將補(bǔ)體添加到每個(gè)孔中。
每次測(cè)試都包括補(bǔ)體對(duì)照(不含血清但含有活性或滅活補(bǔ)體源的孔)、陽(yáng)性對(duì)照(含有血清和已知效價(jià)的殺菌性抗體的孔)、培養(yǎng)物對(duì)照(不含血清和補(bǔ)體的孔)和血清對(duì)照(不含補(bǔ)體的孔)。
測(cè)量兔或鼠抗血清的殺菌活性(殺死50％的同源菌株)。
實(shí)施例9抗BASB132抗體在人類恢復(fù)期血清中的存在情況除一抗采用來(lái)源于被粘膜炎莫拉氏菌感染的兒童的人類血清之外，按上文實(shí)施例7所述對(duì)純化的重組BASB132進(jìn)行蛋白印跡分析。
實(shí)施例10BASB132疫苗的效力提高小鼠肺部的粘膜炎莫拉氏菌清除率該小鼠模型的依據(jù)是對(duì)接種小鼠進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的鼻內(nèi)誘發(fā)，然后分析粘膜炎莫拉氏菌對(duì)肺的侵襲。
用BASB132疫苗對(duì)成組小鼠進(jìn)行免疫。在促升接種后，將細(xì)菌懸浮液滴注到麻醉狀態(tài)的小鼠的鼻孔內(nèi)，以此來(lái)激發(fā)小鼠。在激發(fā)后30分鐘到24小時(shí)之間處死小鼠，在無(wú)菌條件下取出肺臟并分別勻漿。把勻漿的稀釋物鋪在瓊脂平板上，然后計(jì)算生長(zhǎng)的菌落，并由此確定CFU/肺的log10加權(quán)平均數(shù)。計(jì)算各組CFU/肺的log10加權(quán)平均數(shù)的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。
該實(shí)驗(yàn)中的各組小鼠是用BASB132或死亡的粘膜炎莫拉氏菌全細(xì)胞制劑(kwc)進(jìn)行免疫或進(jìn)行假免疫。
實(shí)施例11抗BASB132抗血清對(duì)粘膜炎莫拉氏菌粘附于細(xì)胞的抑制該試驗(yàn)可測(cè)量抗BASB132血清對(duì)莫拉氏菌粘附于上皮細(xì)胞的抑制能力。該活性可阻礙莫拉氏菌在鼻咽部建群。
將1體積細(xì)菌與1體積免疫前血清或抗BASB132免疫血清的稀釋物置于冰上保溫。然后把該混合物添加到含有為去除痕量抗生素而用培養(yǎng)基清洗一次的鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)物的24孔板中。將板離心并保溫。然后溫和清洗每個(gè)孔。清洗完后，在孔中加入甘膽酸鈉。將板保溫，然后刮出細(xì)胞層并勻漿。把勻漿的稀釋物鋪在瓊脂平板上并保溫。對(duì)每個(gè)平板的菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算出每個(gè)孔中存在的細(xì)菌數(shù)。
保藏材料含有粘膜炎莫拉氏菌Catlin菌株的保藏物已于1997年6月21日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(文中稱為“ATCC”)，保藏號(hào)為43617。被描述成粘膜炎布蘭漢氏球菌(Frosch and Kolle)的該保藏物是一種由粘膜炎莫拉氏菌分離物構(gòu)建的凍干形式的1.5-2.9kb插入序列庫(kù)，其中的粘膜炎莫拉氏菌分離物是從患有慢性支氣管炎的一名煤礦工人的穿氣管吸出物中獲得。該保藏物在Antimicrob.Agents Chemother.21506-598(1982)中有所描述。
該粘膜炎莫拉氏菌菌株保藏物在文中稱為“保藏菌株”或“保藏菌株的DNA”。
該保藏菌株含有全長(zhǎng)BASB132基因。
含有插入到pQE30中的粘膜炎莫拉氏菌DNA的pMC-D15載體保藏物已于1999年2月12日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號(hào)為207105。
該保藏菌株/克隆中包含的多核苷酸序列及其編碼的所有多肽的氨基酸序列如果與文中關(guān)于序列的任何描述有任何沖突，則以前者為準(zhǔn)。
該保藏菌株的保藏符合“國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約”的規(guī)定。本申請(qǐng)獲得專利權(quán)時(shí)，該保藏菌株即可以不可撤消的方式不受限制地或無(wú)條件地向公眾發(fā)放。提供該保藏菌株只是為該領(lǐng)域的技術(shù)人員提供方便，而不是認(rèn)為保藏是申請(qǐng)專利的必需條件，例如35 U.S.C.§112即要求該條件。
序列信息BASB132的多核苷酸及多肽序列序列編號(hào)1來(lái)源于ATCC43617菌株的粘膜炎莫拉氏菌BASB132多核苷酸序列ATGACTCATCAGGATAATTCAAAAAACTCGTCATCGGCAGAAAATGGGGTTTCTGCTGGCGTTGCTGCACCGACTAAAACTCAGCCCAAACCACCAAACCCACCCAAACCACAATGGCTAATCTATTTAATTCGCTTAATTGTCGGAGCAATTATTGCCGCTTTATTGTTGTTGGCGGTGTTATTTGCCATGACCAACAGCGAGTCAGGTTCAAAGTTTTTAATCGAAAAAATTGCGTTAGAAACTGGCACTAAGCTTAAGTACAGCGAAGGCTCAATTCGCCATGGAGTTTGGGTGCAAGATGTCAAAATCGCTCAAAGTGAAGATATTACCATCACCATTAATCGTGCCTATGTACAGCTTGGGTGGCGAGCCTTGTTTGCTCGCCAAGTGCATTTGGTCAATCCTAAGATTGATAAAGTTTATGTGACAAACACCAAGCCATCAACAGGCGAACCCTTTGATTATGCGACCATCAACCTACCAGTGACGCTTAAGCTTGAAAATGCCAAAGTCAATGAAATTATCTATGACCAAGTGGATTCTGAGCCTGTCGTACTGCATCATATCGCATTTGATCACGCATCATGGGCAGATTCAACAGTTAAAATTGATAACGCCATGCTAAGCTATGGTGATGATATTAATATCAGCCATGCCACTGGTGGAATTGATTTAACAGGTCATTATCCGCTGTCGTTGTCGGCAGATGTGCATATTTTGGCACTTGATGATGCGTATTTTGATACTTTGTCGGTGAAAGCAGGCGGTAGCCTTAAGCGTACCGTTGGTACACTCACTGGCAAATATAATCAGCATCATGTGACAGGCAGCTTTATCGCTCAAGGGTTGGATAAAAACTCACCTTTTAGCGCACGCCTTGATTTTGATGAAGTACGATTGCCTTATGCTGACAGTCAAAATATTTTACTAAAAAATGGCTCTATCATCGCTGATGGCGTCATCTCAAATATCGAGCTACGCATTAACACTGAGTTATCCGCCAAAGATATTCCTGATGGGCATTATCAGGGTCGTGGAATTATTCGTGGCAGTACCATGCAAATCCCATATTTGCAGGCTGATACTGCCAATGGTACTTTGGTGGCAACGGGTGATATGACTTGGGAAGATGGCTATGAGCTTGATGCCACCATTACAGCAGACGGCTATCGTATCCGTGAAGAGATGCCAAGTGATTATCATGAATATAGAGCCTATCTACCTAAGGTTTTGACAGGCTCACTTGGGGTTAAGTATACGCTATTAGACAAAGCCAGTCATGATACTCGGTTTGAGTTTGATCTGAATCAAAAAGACGGTGAACGCATTCAAGCGACGCTGGCTCAAAATCAACAGAGTGATCATGAGCCTTGGCGTATTGATGCGACTTGGGCAAATCTAATCCGCCATGATATTCCACAAATTGGCGAGATTCATAGCCGCTCAGGTCAGGCATCAGTTCGTTTGGAGAACGGACATACCTATATTAACGCCTCTGCTGACATTGTTAAACTTAATGCCGTCCCAAGCGGATCATATCATGTGCAAGCAAATATTGAGCAAAATCAGCACTTGCACTTGACAGATTTTAACTATCAAGGTGTGATGGGCGAGTTGACAGGTACTGGCAGGGTTGATTTTGCGACTGCCCAAAGACCGCTTGAGTGGCAGCTTGATGTCACTGCCAATCCAGTCAAACCCAATGCGTATTTTCAAACACCCAATCAAACACCGTTTGAGCAAATTTCAGGCAGAATAATTGCTTCAGGGCGTCTGCGTGAGATAGATGGTGTGTCAATTCATGACATTAAAGTGGATGACAGTGATTTAACCGCTTTATTAAATGACGGCAAGCAAGTACATCTGATGGGTCAAGGCGTCAGCAAGATTAGGCTACAAGATGGACAAATTAGCCATCTTAAGGCAAATTTTGATGGCAAGCTTGCTCAAGATATCTTACCGCAGGTAGCTGACTCAAGCATTGGATTGGATATTGAAGGTGATTTGAATGATTTGACCATCACACGGGCAGTCATGATGAATGACTCAGGCAAAGTATCGCTTGCAGGTCGTCTTGGATTAAATGACGGTATTCATTGGCAAATTCAAGGGCGATTAGATGAGGTGGATACCGCCGCTTTTGTTGATGATGACAATTTAGTTGCGATCATCACAGGCGATCTTGCCACATCAGGCAGATATCGTGATGGCGTGATGGATGATATCGCACTCACTTTTGATGGTCAAGTGATTAACAATTCAATCCCAAATGGTCATCTAAGTATTGATGCGACAGGTTCTGGCAATCGCTTTATGGTCAATCATCTAAGACATGATGGCACAGCAGGCACGCTGAATGCGACAGGCTGGGTAGATATTAGCCAAGGTGCTGCATGGCAGCTAGAGGCTGATATGAATTCATTGAATTTGGGTGCATTTATCCAGTCGCTAGATACTGACTTAAACGGTACAATTCAGCTTGCAGGCAACTGGCAAGAGTCTCATCAAGTCATTGATATCAGTAATTTGGATATTACAGGTAGCTACAATAATCAGCCACTTATCGCCACAGGCAGCTTATATGCCAAGCTTTCCCTACCTAAAGATTTGGCTGGGTATATCCAAAGTATCAAGCAAGCAAGCCGCCCACCGACTTCGTCTGATGATTTATTGGCACTAAAAAATCGTATTGATAACAACGCACGCCAAACCCAAAATATCGTTCATAAACTCAATGCTGATAATCTACAAGTCCGCATTGGCAATAATCATTTGGCCATATCAGGCGATGAAAGACAGTTGACCGCCAGTGTGAATGTGATTGATCTTGGGCAGCTGATTGATACCGCAAGTGGTGCGATTCAAGGCGGTGTGATTGTCGTCAATGATCATCACGCTTTGCCAACTTTATATATTGATGCCAGTGTCTCATCACTCAGATTTGCCAATATCACCATCCAAAACGCCCAAGCTATCGGTAAAATTGTCAATCTGGGTAATAGCGAAAGCCAGCTGTTGGTTCAGGGTGATGATATTATCGTGATGGGACGCACCATTAAATCTGCTCGGATGGATTTTAGTGGCACAGAAGCCGATCATATCTTATCAATTTCAACCAAAAGCGGTGATATCGAAGCATCTATGCATATTGATGGGGCATTTAATCGCAACAATATGCGATATCATGGTGTTTTGTCTGATGGTTTTGTCAAGAGTGGATTTGGCAAAATGTCACAGCGTCAGCCGACCGAGTTTAGCTATGGATTGGATGATAATAGCTTACAAATTGCAGCGCATTGTTGGCAATCGGCACAT
ATCCAAGGCGATGGCGTGGGTGCGATTTGTTTACAAGATACATTAAGTTATACACCGCAATCAGGGAATGTCAATCTTATTATCCAAAATCTTGATACTCAAGTACTATTGGCGGCTCTACCCAGTGATATTCATTGGAAATCCATGCTCAATGGTCGCATTAAGGCAATGTGGCAGGCAGGTCAATCACCTTTGGTTGATGCTGTACTGTATTCTGATGATGGTACAATTGGCTTAACTCAAGAAGAGACAGGTTATATTGAGATGCCATATCAGCGTGCGTCTGTGATTGCCAAAAGTGTTGATAATGGCTTAAAGGTAAGAACCGATATCTTGGGTACGGCAGGTCGTGGTTATGCCGATGTAATCATCAACCCCAAGCAAACAGACAAGCCCATTTCTGGTGCGCTTGTTATGAATGATCTTAATTTGGCGGTATTGCGACCATTTTTCCCGAGCATTCAAACATTGAGCGGTAAAGTCAGCTTGGCAGGTGGCTTAGGTGGTACATTATCCAAACCATTGTTTTATGGTAATGCCAATTTAAAGAATGGTGCATTAGCGATTGTTGGCGTACCAATGCCCATTTCTGATGTTGATGCCACGGTGAACATACGAGGTACTAAAGCACGCTTAGACGGTAGATTTATGGGTGGTGAGGGTCATGGTGTGCTTTATGGTGAAATGGATTGGGCAGAAGAGCTGTATGCTCGCCTTGGCGTATTTGGTGAAAATCTGACCGTCAGCCAGCCACCGCTTGTGACGGCACAAATCAGCCCTGAGCTGGAAGTGATTATCAGACCTTTCCAAAAATTTGTAGATGTTCAAGGCGTTGTTAGTATCCCATCAGCAACCATTCGTCCGCCAGAGGCAACCGCAGATATCGTAACCGAATCCCCAGATGTATCAGTCATTGACCGCCGTATCACAGGTAATATTGACCAGATTTTAAGTAGAGCGAAACCTTGGGATATTAATGCAAATATCGGTGTTGATTTGGGTAATGAGATTGAATTTCGTGGATTTGGGGCGGTATTACCATTGGCAGGCGCGATACATTTGACTCAGTCAGGACAAGGTGCAATGCAAGCTCTTGGCGTGGTTCAGGTTTCTAAACGCACAAAAATCGATGTCATCGGTCAAAATTTGGATTTAAATTATGCCCAAATTCGTTTTGATGGCGACATGCTTAATCCACGCTTATCTATTGAGGGTGAAAAACAAATTGAAGGGCAAACGGTGGGCGTTCGCATTCGTGGAACGGCATCAAATCCAAACATTACCGTATTTAATGATGCAGGTTTGGATGAATACCAAGCAATGAATGCACTGGTGACAGGACGCATTAGCGAATCAAGTGATTTGGGTATCACAGAGCAGGGTTTTCGCTCACAAGTAACCAATCACCTTGCTGCTGCTGGCTTAAGCTTAGGTTTGTCAGGAACCAGAGATTTAACCAACCAAATTGGTCACGCATTTGGTTTTCAGAGTTTGACCATTGATGCCTCGGGCAGCTCAGATGATACCAATGTTAATGTTACAGGCTATATTACACCAGATTTGTATTTGCGTTATGGCGTGGGTGTGTTTAATGCTGAATCAACCTTATCCATGCGTTATCAATTGACACGCCGTGTTTATATTGAAGCAACCAGTGCCGCTGAAAATATGGTTGATGTGATTTATCGTTGGAAGTTTTAG序列編號(hào)2由序列編號(hào)1的多核苷酸序列推導(dǎo)出的粘膜炎莫拉氏菌BASB132多肽序列MTHQDNSKNSSSAENGVSAGVAAPTKTQPKPPNPPKPQWLIYLIRLIVGAIIAALLLLAVLFAMTNSESGSKFLIEKIALETGTKLKYSEGSIRHGVWVQDVKIAQSEDITITINRAYVQLGWRALFARQVHLVNPKIDKVYVTNTKPSTGEPFDYATINLPVTLKLENAKVNEIIYDQVDSEPVVLHHIAFDHASWADSTVKIDNAMLSYGDDINISHATGGIDLTGHYPLSLSADVHILALDDAYFDTLSVKAGGSLKRTVGTLTGKYNQHHVTGSFIAQGLDKNSPFSARLDFDEVRLPYADSQNILLKNGSIIADGVISNIELRINTELSAKDIPDGHYHGRGIIRGSTMQIPYLQADTANGTLVATGDMTWEDGYELDATITADGYRIREEMPSDYHEYRAYLPKVLTGSLGVKYTLLDKASHDTRFEFDLNQKDGERIQATLAQNQQSDHEPWRIDATWANLIRHDIPQIGEIHSRSGQASVRLENGHTYINASADIVKLNAVPSGSYHVQANIEQNQHLHLTDFNYQGVMGELTGTGRVDFATAQRPLEWQLDVTANPVKPNAYFQTPNQTPFEQISGRIIASGRLREIDGVSIHDIKVDDSDLTALLNDGKQVHLMGQGVSKIRLQDGQISHLKANFDGKLAQDILPQVADSSIGLDIEGDLNDLTITRAVMMNDSGKVSLAGRLGLNDGIHWQIQGRLDEVDTAAFVDDDNLVAIITGDLATSGRYRDGVMDDIALTFDGQVINNSIPNGHLSIDATGSGNRFMVNHLRHDGTAGTLNATGWVDISQGAAWQLEADMNSLNLGAFIQSLDTDLNGTIQLAGNWQESHQVIDISNLDITGSYNNQPLIATGSLYAKLSLPKDLAGYIQSIKQASRPPTSSDDLLALKNRIDNNARQTQNIVHKLNADNLQVRIGNNHLAISGDERQLTASVNVIDLGQLIDTASGAIQGGVIVVNDHHALPTLYIDASVSSLRFANITIQNAQAIGKIVNLGNSESQLLVQGDDIIVMGRTIKSARMDFSGTEADHILSISTKSGDIEASMHIDGAFNRNNMRYHGVLSDGFVKSGFGKMSQRQPTEFSYGLDDNSLQIAAHCWQSAHIQGDGVGAICLQDTLSYTPQSGNVNLIIQNLDTQVLLAALPSDIHWKSMLNGRIKAMWQAGQSPLVDAVLYSDDGTIGLTQEETGYIEMPYQRASVIAKSVDNGLKVRTDILGTAGRGYADVIINPKQTDKPISGALVMNDLNLAVLRPFFPSIQTLSGKVSLAGGLGGTLSKPLFYGNANLKNGALAIVGVPMPISDVDATVNIRGTKARLDGRFMGGEGHGVLYGEMDWAEELYARLGVFGENLTVSQPPLYTAQISPELEVIIRPFQKFVDVQGVVSIPSATIRPPEATADIVTESPDVSVIDRRITGNIDQILSRAKPWDINANIGVDLGNEIEFRGFGAVLPLAGAIHLTQSGQGAMQALGVVQVSKRTKIDVIGQNLDLNYAQIRPDGDMLNPRLSIEGEKQIEGQTVGVRIRGTASNPNITVFNDAGLDEYQAMNALVTGRISESSDLGITEQGFRSQVTNHLAAAGLSLGLSGTRDLTNQIGHAFGFQSLTIDASGSSDDTNVNVTGYITPDLYLRYGVGVFNAESTLSMRYQLTRRVYIEATSAAENMVDVIYRWKF
序列編號(hào)3來(lái)源于ATCC43617菌株的粘膜炎莫拉氏菌BASB132多核苷酸序列ATGAATGACTCAGGCAAAGTATCGCTTGCAGGTCGTCTTGGATTAAATGACGGTATTCATTGGCAAATTCAAGGGCGATTAGATGAGGTGGATACCGCCGCTTTTGTTGATGATGACAATTTAGTTGCGATCATCACAGGCGATCTTGCCACATCAGGCAGATATCGTGATGGCGTGATGGATGATATCGCACTCACTTTTGATGGTCAAGTGATTAACAATTCAATCCCAAATGGTCATCTAAGTATTGATGCGACAGGTTCTGGCAATCGCTTTATGGTCAATCATCTAAGACATGATGGCACAGCAGGCACGCTGAATGCGACAGGCTGGGTAGATATTAGCCAAGGTGCTGCATGGCAGCTAGAGGCTGATATGAATTCATTGAATTTGGGTGCATTTATCCAGTCGCTAGATACTGACTTAARCGGTACAATTCAGCTTGCAGGCAACTGGCAAGAGTCTCATCAAGTCATTGATATCAGTAATTTGGATATTACAGGTAGCTACAATAATCAGCCACTTATCGCCACAGGCAGCTTATATGCCAAGCTTTCCCTACCTAAAGATTTGGCTGGGTATATCCAAAGTATCAAGCAAGCAAGCCGCCCACCGACTTCGTCTGATGATTTATTGGCACTAAAAAATCGTATTGATAACAACGCACGCCAAACCCAAAATATCGTTCATAAACTCAATGCTGATAATCTACAAGTCCGCATTGGCAATAATCATTTGGCCATATCAGGCGATGAAAGACAGTTGACCGCCAGTGTGAATGTGATTGATCTTGGGCAGCTGATTGATACCGCAAGTGGTGCGATTCAAGGCGGTGTGATTGTCGTCAATGATCATCACGCTTTGCCAACTTTATATATTGATGCCAGTGTCTCATCACTCAGATTTGCCAATATCACCATCCAAAACGCCCAAGCTATCGGTAAAATTGTCAATCTGGGTAATAGCGAAAGCCAGCTGTTGGTTCAGGGTGATGATATTATCGTGATGGGACGCACCATTAAATCTGCTCGGATGGATTTTAGTGGCACAGAAGCCGATCATATCTTATCAATTTCAACCAAAAGCGGTGATATCGAAGCATCTATGCATATTGATGGGGCATTTAATCGCAACAATATGCGATATCATGGTGTTTTGTCTGATGGTTTTGTCAAGAGTGGATTTGGCAAAATGTCACAGCGTCAGCCGACCGAGTTTAGCTATGGATTGGATGATAATAGCTTACAAATTGCAGCGCATTGTTGGCAATCGGCACATATCCAAGGCGATGGCGTGGGTGCGATTTGTTTACAAGATACATTAAGTTATACACCGCAATCAGGGAATGTCAATCTTATTATCCAAAATCTTGATACTCAAGTACTATTGGCGGCTCTACCCAGTGATATTCATTGGAAATCCATGCTCAATGGTCGCATTAAGGCAATGTGGCAGGCAGGTCAATCACCTTTGGTTGATGCTGTACTGTATTCTGATGATGGTACAATTGGCTTAACTCAAGAAGAGACAGGTTATATTGAGATGCCATATCAGCGTGCGTCTGTGATTGCCAAAAGTGTTGATAATGGCTTAAAGGTAAGAACCGATATCTTGGGTACGGCAGGTCGTGGTTATGCCGATGTAATCATCAACCCCAAGCAAACAGACAAGCCCATTTCTGGTGCGCTTGTTATGAATGATCTTAATTTGGCGGTATTGCGACCATTTTTCCCGAGCATTCAAACATTGAGCGGTAAAGTCAGCTTGGCAGGTGGCTTAGGTGGTACATTATCCAAACCATTGTTTTATGGTAATGCCAATTTAAAGAATGGTGCATTAGCGATTGTTGGCGTACCAATGCCCATTTCTGATGTTGATGCCACGGTGAACATACGAGGTACTAAAGCACGCTTAGACGGTAGATTTATGGGTGGTGAGGGTCATGGTGTGCTTTATGGTGAAATGGATTGGGCAGAAGAGCTGTATGCTCGCCTTGGCGTATTTGGTGAAAATCTGACCGTCAGCCAGCCACCGCTTGTGACGGCACAAATCAGCCCTGAGCTGGAAGTGATTATCAGACCTTTCCAAAAATTTGTAGATGTTCAAGGCGTTGTTAGTATCCCATCAGCAACCATTCGTCCGCCAGAGGCAACCGCAGATATCGTAACCGAATCCCCAGATGTATCAGTCATTGACCGCCGTATCACAGGTAATATTGACCAGATTTTAAGTAGAGCGAAACCTTGGGATATTAATGCAAATATCGGTGTTGATTTGGGTAATGAGATTGAATTTCGTGGATTTGGGGCGGTATTACCATTGGCAGGCGCGATACATTTGACTCAGTCAGGACAAGGTGCAATGCAAGCTCTTGGCGTGGTTCAGGTTTCTAAACGCACAAAAATCGATGTCATCGGTCAAAATTTGGATTTAAATTATGCCCAAATTCGTTTTGATGGCGACATGCTTAATCCACGCTTATCTATTGAGGGTGAAAAACAAATTGAAGGGCAAACGGTGGGCGTTCGCATTCGTGGAACGGCATCAAATCCAAACATTACCGTATTTAATGATGCAGGTTTGGATGAATACCAAGCAATGAATGCACTGGTGACAGGACGCATTAGCGAATCAAGTGATTTGGGTATCACAGAGCAGGGTTTTCGCTCACAAGTAACCAATCACCTTGCTGCTGCTGGCTTAAGCTTAGGTTTGTCAGGAACCAGAGATTTAACCAACCAAATTGGTCACGCATTTGGTTTTCAGAGTTTGACCATTGATGCCTCGGGCAGCTCAGATGATACCAATGTTAATGTTACAGGCTATATTACACCAGATTTGTATTTGCGTTATGGCGTGGGTGTGTTTAATGCTGAATCAACCTTATCCATGCGTTATCAATTGACACGCCGTGTTTATATTGAAGCAACCAGTGCCGCTGAAAATATGGTTGATGTGATTTATCGTTGGAAGTTTTAG序列編號(hào)4由序列編號(hào)3的多核苷酸序列推導(dǎo)出的粘膜炎莫拉氏菌BASB132多肽序列MNDSGKVSLAGRLGLNDGIHWQIQGRLDEVDTAAFVDDDNLVAIITGDLATSGRYRDGVMDDIALTFDGQVINNSIPNGHLSIDATGSGNRFMVNHLRHDGTAGTLNATGWVDISQGAAWQLEADMNSLNLGAFIQSLDTDLNGTIQLAGNWQESHQVID
ISNLDITGSYNNQPLIATGSLYAKLSLPKDLAGYIQSIKQASRPPTSSDDLLALKNRIDNNARQTQNIVHKLNADNLQVRIGNNHLAISGDERQLTASVNVIDLGQLIDTASGAIQGGVIVVNDHHALPTLYIDASVSSLRFANITIQNAQAIGKIVNLGNSESQLLVQGDDIIVMGRTIKSARMDFSGTEADHILSISTKSGDIFASMHIDGAFNRNNMRYHGVLSDGFVKSGFGKMSQRQPTETSYGLDDNSLQIAAHCWQSAHIQGDGVGAICLQDTLSYTPQSGNVNLIIQNLDTQVLLAALPSDIHWKSMLNGRIKAMWQAGQSPLVDAVLYSDDGTIGLTQEETGYIEMPYQRASVIAKSVDNGLKVRTDILGTAGRGYADVIINPKQTDKPISGALVMNDLNLAVLRPFFPSIQTLSGKVSLAGGLGGTLSKPLFYGNANLKNGALAIVGVPMPISDVDATVNIRGTKARLDGRFMGGEGHGVLYGEMDWAEELYARLGVFGENLTVSQPPLVTAQISPELEVIIRPFQKFVDVQGVVSIPSATIRPPEATADIVTESPDVSVIDRRITGNIDQILSRAKPWDINANIGVDLGNEIEFRGFGAVLPLAGAIHLTQSGQGAMQALGVVQVSKRTKIDVIGQNLDLNYAQIRFDGDMLNPRLSIEGEKQIEGQTVGVRIRGTASNPNITVFNDAGLDEYQAMNALVTGRISESSDLGITEQGFRSQVTNHLAAAGLSLGLSGTRDLTNQIGHAFGFQSLTIDASGSSDDTNVNVTGYITPDLYLRYGVGVFNAESTLSMRYQLTRRVYIEATSAAENMVDVIYRWKF序列編號(hào)5CCC ACC GTT TGC CCT TCA AT序列編號(hào)6CAT TTT TCC CGA GCA TTC AAA C序列編號(hào)7AAT CAG CCA CTT ATC GCC AC序列編號(hào)8GTA AAA CGA CGG CCA GT序列編號(hào)9CAG GAA ACA GCT ATG AC序列編號(hào)10TCA TGA ATG ACT CAG GCA AAG序列編號(hào)11AGA TCT AAA CTT CCA ACG ATA AAT C序列編號(hào)12AAA CAA ATC GCA CCC ACG CC
序列編號(hào)13ACA AAT TGC AGC GCA TTG TTG G序列表序列表<110>史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司(Smithkline Beecham Biologicals S.A.)<120>來(lái)源于粘膜炎莫拉氏菌的免疫原性多肽及其應(yīng)用<130>BM45417<160>13<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>5019<212>DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)<400>1atgactcatc aggataattc aaaaaactcg tcatcggcag aaaatggggt ttctgctggc 60gttgctgcac cgactaaaac tcagcccaaa ccaccaaacc cacccaaacc acaatggcta 120atctatttaa ttcgcttaat tgtcggagca attattgccg ctttattgtt gttggcggtg 180ttatttgcca tgaccaacag cgagtcaggt tcaaagtttt taatcgaaaa aattgcgtta 240gaaactggca ctaagcttaa gtacagcgaa ggctcaattc gccatggagt ttgggtgcaa 300gatgtcaaaa tcgctcaaag tgaagatatt accatcacca ttaatcgtgc ctatgtacag 360cttgggtggc gagccttgtt tgctcgccaa gtgcatttgg tcaatcctaa gattgataaa 420gtttatgtga caaacaccaa gccatcaaca ggcgaaccct ttgattatgc gaccatcaac 480ctaccagtga cgcttaagct tgaaaatgcc aaagtcaatg aaattatcta tgaccaagtg 540gattctgagc ctgtcgtact gcatcatatc gcatttgatc acgcatcatg ggcagattca 600acagttaaaa ttgataacgc catgctaagc tatggtgatg atattaatat cagccatgcc 660actggtggaa ttgatttaac aggtcattat ccgctgtcgt tgtcggcaga tgtgcatatt 720ttggcacttg atgatgcgta ttttgatact ttgtcggtga aagcaggcgg tagccttaag 780cgtaccgttg gtacactcac tggcaaatat aatcagcatc atgtgacagg cagctttatc 840gctcaagggt tggataaaaa ctcacctttt agcgcacgcc ttgattttga tgaagtacga 900ttgccttatg ctgacagtca aaatatttta ctaaaaaatg gctctatcat cgctgatggc 960gtcatctcaa atatcgagct acgcattaac actgagttat ccgccaaaga tattcctgat 1020gggcattatc acggtcgtgg aattattcgt ggcagtacca tgcaaatccc atatttgcag 1080gctgatactg ccaatggtac tttggtggca acgggtgata tgacttggga agatggctat 1140gagcttgatg ccaccattac agcagacggc tatcgtatcc gtgaagagat gccaagtgat 1200tatcatgaat atagagccta tctacctaag gttttgacag gctcacttgg ggttaagtat 1260acgctattag acaaagccag tcatgatact cggtttgagt ttgatctgaa tcaaaaagac 1320ggtgaacgca ttcaagcgac gctggctcaa aatcaacaga gtgatcatga gccttggcgt 1380attgatgcga cttgggcaaa tctaatccgc catgatattc cacaaattgg cgagattcat 1440agccgctcag gtcaggcatc agttcgtttg gagaacggac atacctatat taacgcctct 1500gctgacattg ttaaacttaa tgccgtccca agcggatcat atcatgtgca agcaaatatt 1560gagcaaaatc agcacttgca cttgacagat tttaactatc aaggtgtgat gggcgagttg 1620acaggtactg gcagggttga ttttgcgact gcccaaagac cgcttgagtg gcagcttgat 1680gtcactgcca atccagtcaa acccaatgcg tattttcaaa cacccaatca aacaccgttt 1740gagcaaattt caggcagaat aattgcttca gggcgtctgc gtgagataga tggtgtgtca 1800attcatgaca ttaaagtgga tgacagtgat ttaaccgctt tattaaatga cggcaagcaa 1860gtacatctga tgggtcaagg cgtcagcaag attaggctac aagatggaca aattagccat 1920cttaaggcaa attttgatgg caagcttgct caagatatct taccgcaggt agctgactca 1980agcattggat tggatattga aggtgatttg aatgatttga ccatcacacg ggcagtcatg 2040atgaatgact caggcaaagt atcgcttgca ggtcgtcttg gattaaatga cggtattcat 2100tggcaaattc aagggcgatt agatgaggtg gataccgccg cttttgttga tgatgacaat 2160ttagttgcga tcatcacagg cgatcttgcc acatcaggca gatatcgtga tggcgtgatg 2220gatgatatcg cactcacttt tgatggtcaa gtgattaaca attcaatccc aaatggtcat 2280ctaagtattg atgcgacagg ttctggcaat cgctttatgg tcaatcatct aagacatgat 2340ggcacagcag gcacgctgaa tgcgacaggc tgggtagata ttagccaagg tgctgcatgg 2400cagctagagg ctgatatgaa ttcattgaat ttgggtgcat ttatccagtc gctagatact 2460gacttaaacg gtacaattca gcttgcaggc aactggcaag agtctcatca agtcattgat 2520atcagtaatt tggatattac aggtagctac aataatcagc cacttatcgc cacaggcagc 2580ttatatgcca agctttccct acctaaagat ttggctgggt atatccaaag tatcaagcaa 2640gcaagccgcc caccgacttc gtctgatgat ttattggcac taaaaaatcg tattgataac 2700aacgcacgcc aaacccaaaa tatcgttcat aaactcaatg ctgataatct acaagtccgc 2760attggcaata atcatttggc catatcaggc gatgaaagac agttgaccgc cagtgtgaat 2820gtgattgatc ttgggcagct gattgatacc gcaagtggtg cgattcaagg cggtgtgatt 2880gtcgtcaatg atcatcacgc tttgccaact ttatatattg atgccagtgt ctcatcactc 2940agatttgcca atatcaccat ccaaaacgcc caagctatcg gtaaaattgt caatctgggt 3000aatagcgaaa gccagctgtt ggttcagggt gatgatatta tcgtgatggg acgcaccatt 3060aaatctgctc ggatggattt tagtggcaca gaagccgatc atatcttatc aatttcaacc 3120aaaagcggtg atatcgaagc atctatgcat attgatgggg catttaatcg caacaatatg 3180cgatatcatg gtgttttgtc 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1500ggtacaattg gcttaactca agaagagaca ggttatattg agatgccata tcagcgtgcg 1560tctgtgattg ccaaaagtgt tgataatggc ttaaaggtaa gaaccgatat cttgggtacg 1620gcaggtcgtg gttatgccga tgtaatcatc aaccccaagc aaacagacaa gcccatttct 1680ggtgcgcttg ttatgaatga tcttaatttg gcggtattgc gaccattttt cccgagcatt 1740caaacattga gcggtaaagt cagcttggca ggtggcttag gtggtacatt atccaaacca 1800ttgttttatg gtaatgccaa tttaaagaat ggtgcattag cgattgttgg cgtaccaatg 1860cccatttctg atgttgatgc cacggtgaac atacgaggta ctaaagcacg cttagacggt 1920agatttatgg gtggtgaggg tcatggtgtg ctttatggtg aaatggattg ggcagaagag 1980ctgtatgctc gccttggcgt atttggtgaa aatctgaccg tcagccagcc accgcttgtg 2040acggcacaaa tcagccctga gctggaagtg attatcagac ctttccaaaa atttgtagat 2100gttcaaggcg ttgttagtat cccatcagca accattcgtc cgccagaggc aaccgcagat 2160atcgtaaccg aatccccaga tgtatcagtc attgaccgcc gtatcacagg taatattgac 2220cagattttaa gtagagcgaa accttgggat attaatgcaa atatcggtgt tgatttgggt 2280aatgagattg aatttcgtgg atttggggcg gtattaccat tggcaggcgc gatacatttg 2340actcagtcag 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<223>引物<400>12aaacaaatcg cacccacgcc 20<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13acaaattgca gcgcattgtt gg 22
134表
關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明(細(xì)則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，該多肽含有一段氨基酸序列，該氨基酸序列與選自序列編號(hào)2和序列編號(hào)4的全長(zhǎng)氨基酸序列分別具有至少85％的同一性。
2.權(quán)利要求1的一種分離的多肽，其中的氨基酸序列與選自序列編號(hào)2和序列編號(hào)4的全長(zhǎng)氨基酸序列分別具有至少95％的同一性。
3.權(quán)利要求1的多肽，該多肽包含一段選自序列編號(hào)2和序列編號(hào)4的氨基酸序列。
4.序列編號(hào)2或序列編號(hào)4的一種分離的多肽。
5.權(quán)利要求1-4之一的多肽的一種免疫原性片段，其中該免疫原性片段的免疫原性與序列編號(hào)2或序列編號(hào)4的多肽基本相同。
6.權(quán)利要求1-5之一的一種多肽，其中該多肽是一種較大的融合蛋白的一部分。
7.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸可編碼權(quán)利要求1-6之一的一種多肽。
8.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有一段可編碼一種多肽的核苷酸序列，該多肽與序列編號(hào)2或4的全長(zhǎng)氨基酸序列分別具有至少85％的同一性；或與這種分離的多核苷酸互補(bǔ)的一種核苷酸序列。
9.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有一段核苷酸序列，該序列與編碼序列編號(hào)2或4的全部編碼區(qū)的一種核苷酸序列具有至少85％的同一性；或與這種分離的多核苷酸互補(bǔ)的一種核苷酸序列。
10.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有一段核苷酸序列，該序列與序列編號(hào)1或3的全長(zhǎng)核苷酸序列分別具有至少85％的同一性；或與這種分離的多核苷酸互補(bǔ)的一種核苷酸序列。
11.權(quán)利要求7-10之一的一種分離的多核苷酸，其中與序列編號(hào)1或3的同一性至少為95％。
12.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有一段核苷酸序列，該序列可編碼序列編號(hào)2或序列編號(hào)4的多肽。
13.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有序列編號(hào)1或序列編號(hào)3的多核苷酸。
14.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有一段核苷酸序列，該序列可編碼序列編號(hào)2、序列編號(hào)4的多肽，獲得該多核苷酸的方法可以是，在嚴(yán)格雜交條件下用一種具有序列編號(hào)1或序列編號(hào)3所述序列的標(biāo)記探針或其片段對(duì)適當(dāng)?shù)膸?kù)進(jìn)行篩選。
15.一種表達(dá)載體或一種活體重組微生物，該載體或該活體重組微生物含有權(quán)利要求7-14之一的一種分離的多核苷酸。
16.含有權(quán)利要求15的表達(dá)載體的一種宿主細(xì)胞，或該宿主細(xì)胞的一種亞細(xì)胞組分或膜，該宿主細(xì)胞或其亞細(xì)胞組分或膜能夠表達(dá)一種分離的多肽，該多肽含有一段氨基酸序列，該序列與選自序列編號(hào)2和序列編號(hào)4的氨基酸序列具有至少85％的同一性。
17.一種方法，用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-6的一種多肽，該方法包括，在足以產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求16的一種宿主細(xì)胞，以及從培養(yǎng)基中回收這種多肽。
18.一種方法，用于表達(dá)權(quán)利要求7-14之一的一種多核苷酸，該方法包括，用至少含有一種所述多核苷酸的表達(dá)載體對(duì)一種宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以及在足以表達(dá)任何一種所述多核苷酸的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。
19.一種疫苗組合物，該組合物含有有效劑量的權(quán)利要求1-6之一的一種多肽和一種藥學(xué)容許的載體。
20.一種疫苗組合物，該組合物含有有效劑量的權(quán)利要求7-14之一的一種多核苷酸和一種有效的藥用載體。
21.權(quán)利要求19或20之一的一種疫苗組合物，其中該組合物至少含有粘膜炎莫拉氏菌以外的一種抗原。
22.一種抗體，該抗體對(duì)權(quán)利要求1-6之一的多肽或免疫原性片段具有免疫特異性。
23.一種診斷粘膜炎莫拉氏菌感染的方法，該方法包括，確定權(quán)利要求1-6之一的一種多肽或?qū)υ摱嚯木哂忻庖咛禺愋缘囊环N抗體在懷疑患有這種感染的動(dòng)物的生物學(xué)樣品中的存在情況。
24.一種組合物在一種藥劑的制備中的應(yīng)用，該組合物含有免疫學(xué)有效劑量的權(quán)利要求1-6之一的一種多肽，該藥劑用于在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
25.一種組合物在一種藥劑的制備中的應(yīng)用，該組合物含有免疫學(xué)有效劑量的權(quán)利要求7-14之一的一種多核苷酸，該藥劑用于在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
26.一種治療組合物，可用于對(duì)患有粘膜炎莫拉氏菌性疾病的人進(jìn)行治療，該組合物至少含有一種針對(duì)權(quán)利要求1-6之一的多肽的抗體，以及一種適當(dāng)?shù)乃幱幂d體。
全文摘要
本發(fā)明提供BASB132多肽和編碼BASB132多肽的多核苷酸，以及由重組技術(shù)產(chǎn)生這些多肽的方法。另外還提供診斷、預(yù)防及治療性應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1402785SQ00816501
公開(kāi)日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2000年9月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月30日
發(fā)明者J·通納德 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司