專利名稱：用于保存感染性重組腺病毒的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及保存呈穩(wěn)定形式的可儲(chǔ)存腺病毒，以及用于這種保存的液體或凍凝組合物。
背景技術(shù)：
保存穩(wěn)定組合物中的腺病毒是一個(gè)已知的問題，該問題已成為許多研究工作的課題，直到現(xiàn)在還未得到真正令人滿意的結(jié)果。事實(shí)上，這些重組病毒只是在達(dá)到在未發(fā)生降解以及沒有失去其感染能力之時(shí)將它們儲(chǔ)存的條件下才是可使用的。
溶液中腺病毒顆粒的物理狀態(tài)隨時(shí)間流逝同時(shí)而快速地發(fā)生兩種變化一方面病毒顆粒聚集(凍凝)呈團(tuán)或絲狀，因?yàn)檫@種現(xiàn)象是不可逆的，所以是極嚴(yán)重的，而另一方面，衣殼本身的二十面體結(jié)構(gòu)分裂(通過衣殼溶胞作用，衣殼體釋放到介質(zhì)中)。
在國(guó)際申請(qǐng)WO 98/02522中，曾描述一種在含有蔗糖的水溶液中保存呈懸浮液形式的感染重組病毒的方法。推薦的組合物不含有甘油，按照優(yōu)選實(shí)施方式含有至少一種二價(jià)陽(yáng)離子鹽或一價(jià)堿金屬陽(yáng)離子鹽。
但是，可能表明蔗糖沒有系統(tǒng)地帶來在+4℃的穩(wěn)定作用，根據(jù)這種情況，在這個(gè)溫度下的穩(wěn)定作用從未超過2星期，或至多也短于2個(gè)月。
在《病毒學(xué)雜志》(J.Virology)，70(11)，7498-7509(1996)中，曾描述以三羥甲基氨基甲烷緩沖液和甘油為主要成分的緩沖液形式保存腺病毒，但該緩沖液系統(tǒng)地含有氯化鎂。這些制劑必需保存在非常低的溫度下，約-70℃，以免其感染能力降低。
在《人體基因治療》(Human Gene Therapy)，7，1693-99(1996)中，還使用一種以三羥甲基氨基甲烷緩沖液和甘油為主要成分的含有氯化鎂的儲(chǔ)存制劑。這個(gè)制劑保存在-80℃。
更一般地，直到今天在該文獻(xiàn)中描述的以三羥甲基氨基甲烷為主要成分的制劑系統(tǒng)地含有氯化鎂(一般1毫摩爾)或/和具有生理濃度的鹽(一般，150毫摩爾NaCl)。作為示例，例如可以列舉[《細(xì)胞》(Cell)，68，143-155(1992)；《自然遺傳學(xué)》(Nature Genetics)，3，229-234(1993)；《人體基因治療》，6，5-11(1955)；《人體基因治療》，6，145-153(1995)；《人體基因治療》，6，277-287(1995)；《人體基因治療》，6，643-666(1995)；《人體基因治療》，6，1039-1044(1995)；《人體基因治療》，6，1317-1322(1995)；《人體基因治療》，6，1587-1593(1995)；《人體基因治療》，7，2177-2184(1996)；《病毒學(xué)雜志》，73，1601-1608(1999)]。這些作者明確指出，病毒保存系統(tǒng)地在-70℃/-80℃下完成。
自此曾表明，病毒結(jié)構(gòu)的演變(聚積和溶解)是一個(gè)非常依賴于如某些添加到溶液中反陽(yáng)離子濃度因素，也非常依賴于如腺病毒濃度因素的現(xiàn)象。在約1E12pv/毫升濃度以上，根據(jù)使用的藥物組合物，在幾小時(shí)至幾天內(nèi)可觀察到衣殼聚積和分裂作用(因此喪失感染能力)，而在低濃度下，這些現(xiàn)象變得比較緩慢。因此，長(zhǎng)時(shí)間保存高度濃縮的病毒顆粒組合物是特別困難的。
于是，人們發(fā)現(xiàn)并且構(gòu)成本發(fā)明目的的是，在溫度+4至+20℃之間，能夠在緩沖溶液中呈懸浮液狀保存在含水介質(zhì)中的感染重組病毒，所述緩沖液能夠?qū)⒔橘|(zhì)的pH固定在弱堿性值，而緩沖液中被加入了甘油，但是未添加二價(jià)金屬陽(yáng)離子或堿金屬陽(yáng)離子。
更確切地，介質(zhì)的pH固定在8.0-9.6。
在添加甘油的緩沖液中含有腺病毒顆粒的液體或凍凝組合物屬于本發(fā)明的范圍。這些組合物具有的突出優(yōu)點(diǎn)是良好的穩(wěn)定性，同時(shí)特別適合長(zhǎng)期保存高濃度病毒顆粒。
根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)⒔橘|(zhì)的pH固定在8.0-9.6的緩沖溶液，或者由含有Tris[三(羥甲基)氨基甲烷]或賴氨酸與選自強(qiáng)酸(例如鹽酸)或弱酸(例如馬來酸、蘋果酸或乙酸)的酸的酸/堿體系組成，或者由含有Hepes[2-(4-(2-羥基乙基哌嗪)-1-基)乙烷磺酸]和強(qiáng)堿(例如氫氧化鈉)的酸/堿體系組成。
優(yōu)選地，pH固定在8.4-8.8，更優(yōu)選地固定在8.4(在25℃測(cè)量值)。
以在對(duì)pH值不會(huì)產(chǎn)生不利影響的范圍或體積內(nèi)施加緩沖作用的方式確定緩沖液的濃度。酸+堿的摩爾濃度可以是10-500毫摩爾，優(yōu)選地是20-100毫摩爾，更優(yōu)選地是固定在20毫摩爾。在本發(fā)明的緩沖體系中，Tris/HCl緩沖溶液在濃度20毫摩爾可得到特別令人滿意的結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明，該組合物含有10-50％甘油，優(yōu)選地是20-25％(體積/體積)。
本發(fā)明的組合物還可以任選地含有其他添加劑。這些添加劑可以選自聚合物(聚乙二醇，例如PEG 400，PEG 8000)、特別是其量為約1-20％(重量)聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷共混物(例如Pluronic F68)，聚山梨酸酯(特別是吐溫20，例如0.01-1％(重量))，或選自糖，例如像蔗糖、甘露糖醇或葡萄糖(特別是約5-10％)，或選自1-10％(體積)醇(特別是乙醇)。
發(fā)明概述本發(fā)明的組合物特別適合于保存高濃度腺病毒制劑。事實(shí)上，如此穩(wěn)定化處理的組合物能夠使病毒顆粒保持呈含水液體懸浮液狀(特別是+4至+20℃)，同時(shí)保持其病毒感染能力，甚至在非常高的病毒濃度(從1E8pv/毫升值直到1E12pv/毫升或直到1E13pv/毫升，甚至可以直到5E13pv/毫升)也是如此。
根據(jù)本發(fā)明的另一種可供選擇方案，該病毒也可以在-20℃下凍凝，于是可保存幾個(gè)月或更長(zhǎng)的時(shí)間，然后該配方解凍，而不損害其結(jié)構(gòu)與感染能力。
根據(jù)本發(fā)明，通過將開始在水溶液中得到的然后純化的腺病毒顆粒懸浮于緩沖溶液中、接著加入甘油以及任選地加入如前述添加劑，可以制備這些組合物。
根據(jù)衣殼體包裹作用的反式互補(bǔ)(transcomplementante)細(xì)胞系，例如293細(xì)胞系或PER-C6細(xì)胞系通常的產(chǎn)生方法，可以得到感染性重組腺病毒。然后，這些病毒顆?？梢圆捎美缭凇镀胀ú《緦W(xué)雜志》(Journal of GeneralVirology)，34，19-35(1977))中描述的氯化銫梯度離心法進(jìn)行純化。更優(yōu)選地，采用陰離子交換與凝膠過濾方式、疏水方式的液相色譜法，或采用金屬螯合作用純化病毒顆粒。采用陰離子交換純化是特別有利的，因?yàn)檫@種純化通過僅一步色譜就能夠得到純的病毒制劑，脫去了蛋白，核酸和其他來自生產(chǎn)細(xì)胞的雜質(zhì)和代謝物，脫去了由培養(yǎng)基帶來的化合物。在國(guó)際申請(qǐng)WO 98/00524或如下面實(shí)施例中描述了優(yōu)選的色譜純化方式。然后，特別地使用滲析法、透濾法或凝膠過濾色譜法在選擇的保存緩沖液中配制腺病毒顆粒。
如此得到的組合物可以任選地凍凝并保存在所希望的儲(chǔ)存溫度下(例如-20℃)，但這種操作對(duì)于長(zhǎng)期保存不是必需的，這些組合物在液態(tài)下在+4℃至+20℃是穩(wěn)定的。
本發(fā)明的組合物是穩(wěn)定的，在+4℃在至少12個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，或在+20℃至少5個(gè)月的時(shí)間內(nèi)沒有顯著退化[物理和生物的穩(wěn)定性(感染能力)]。物理上穩(wěn)定的溶液，更特別地應(yīng)當(dāng)理解為在所考慮的保存期之后未出現(xiàn)顆粒凝結(jié)、沉積或沉淀物(通過目視估計(jì)，測(cè)量光密度、電子顯微鏡分析或顆粒大小分布分析)的溶液。
本發(fā)明更特別地涉及保存呈穩(wěn)定形式的感染性腺病毒，還涉及用于這種保存的液體或凍凝組合物。
本發(fā)明配方的優(yōu)點(diǎn)在于所制備的第一個(gè)組合物使得有可能在溫度+4℃至+20℃下保存呈液體形式的腺病毒，同時(shí)還具有達(dá)到高病毒濃度的可能性。本發(fā)明在其應(yīng)用于重組腺病毒方面是特別有意義的，而它可以一般地應(yīng)用于任何腺病毒(野生的或重組的)。
作為實(shí)例，特別可以列舉有利地在本發(fā)明組合物中保存的下述腺病毒所有人的野生腺病毒，它們屬于六個(gè)已知的被稱為A、B、C、D、E和F的亞組，更特別地組成這六個(gè)亞組的所有人的腺病毒的49種不同血清型。同樣地，本發(fā)明能夠應(yīng)用于猴、牛、馬、豬、羊或狗的野生病毒，它們屬于腺病毒科。此外，本發(fā)明能夠應(yīng)用來自屬于腺病毒科的野生病毒的突變病毒。
在本發(fā)明適用的重組腺病毒載體中，可以列舉在被稱作E1的基因組區(qū)域內(nèi)，或在E2區(qū)域內(nèi)，或在E3區(qū)域內(nèi)或在E4區(qū)域內(nèi)，所有具有一個(gè)或多個(gè)缺失的修飾的腺病毒，以及在上述區(qū)域中有多個(gè)組合缺失的重組病毒，以及本發(fā)明可以應(yīng)用于完全缺失的重組病毒(稱之gutless)[FASEB，11，615(1997)]。
同樣地，本發(fā)明也應(yīng)用于還含有所感興趣的核酸的重組腺病毒載體。所感興趣的核酸可以插入腺病毒基因組中的不同部位。有利地，它插入E1、E3和E4區(qū)域處。但是，很清楚的是可以使用其他位點(diǎn)。特別地，進(jìn)入基因組核苷酸序列能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員確定可插入所感興趣的核酸的區(qū)域。所感興趣的核酸可以是任何導(dǎo)入的DNA序列，特別是尋求在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)移和/或表達(dá)的任何序列。
特別地，它可以含有一個(gè)或多個(gè)治療基因和/或一個(gè)或多個(gè)編碼抗原蛋白的基因?？梢匀绱宿D(zhuǎn)移的治療基因是其在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和任選的翻譯產(chǎn)生具有治療作用產(chǎn)物的任何基因。在治療產(chǎn)物中，更具體地可以列舉酶、血衍生物、荷爾蒙、淋巴因子白細(xì)胞介素、干擾素、TNF等(WO 93/19191)，生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)或它們的前體或合成酶、營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等，載脂蛋白ApoAl、ApoIV、ApoE等(WO 94/25073)、肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白或微肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(minidystrophine)(WO 93/06223)、能夠控制restenose的基因GAX、NOS等，腫瘤抑制基因p53、Rb、Rap1A、DCC、k-rev等(WO94/24297)、凝結(jié)作用中所涉及因子的編碼基因因子VII、VIII、IX，自殺基因TK等，天然或人工免疫球蛋白Fab、ScFv(WO 94/29446)，抗編程性細(xì)胞死亡基因AKT等。
治療基因還可以是一種基因或一種反義(antisen)序列，它們?cè)诎屑?xì)胞中表達(dá)能夠控制基因表達(dá)或細(xì)胞信使RNA轉(zhuǎn)錄。根據(jù)在專利申請(qǐng)EP 140 308中描述的技術(shù)，這樣一些序列例如可以在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成細(xì)胞信使RNA的互補(bǔ)RNA，于是阻斷它們翻譯成蛋白。
同樣地，本發(fā)明應(yīng)用于能夠產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的重組腺病毒載體[TumorTargetting，3，59(1998)]，還應(yīng)用于在一個(gè)或多個(gè)病毒衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白中含有一個(gè)或多個(gè)修飾的腺病毒，特別是纖維(蛋白IV)和六鄰體腺病毒蛋白(蛋白II)，或應(yīng)用于無纖維的腺病毒[《病毒學(xué)雜志》，73，1601(1999)]，加入每個(gè)修飾的目的在于改變腺病毒的自然向性[Current Opinion in Biotechnology，8，583(1997)]。
另外，由于本發(fā)明的組合物可以用于制備用來通過基因療法進(jìn)行治療或預(yù)防治療的藥物，所以它們是特別有意義的。
感染性病毒有許多應(yīng)用，其中可以列舉它們?cè)诎惴N疫苗方面和基因治療方面的應(yīng)用。在這些應(yīng)用中，在將它們的基因物質(zhì)(RNA或DNA)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞之后，這些病毒利用感染細(xì)胞的細(xì)胞器實(shí)現(xiàn)其固有的基因組編碼的蛋白的合成，因此誘導(dǎo)出所要求的特異生物效應(yīng)。在基因治療的應(yīng)用中，帶有治療意義基因的感染重組病毒被用來將這種基因轉(zhuǎn)移到待治療病人器官的特定細(xì)胞中。多種治療方案得到描述并且目前處于用于借助病毒載體轉(zhuǎn)移和表達(dá)治療基因的臨床評(píng)價(jià)過程中。在這些載體中，近年來為轉(zhuǎn)移治療蛋白的編碼基因，曾廣泛地研制非復(fù)制腺病毒載體。在這些基因中，可以列舉在控制細(xì)胞繁殖時(shí)涉及的腫瘤抑制基因p53。在抗腫瘤適應(yīng)癥方面，目前已研制各種在人體中使用腺病毒轉(zhuǎn)移p53基因的臨床試驗(yàn)方案。在其他研制應(yīng)用中，可以列舉治療粘液粘稠癥。
使用腺病毒載體作為治療劑只是在掌握了能夠在足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保存和儲(chǔ)存這些制劑而又不嚴(yán)重喪失上述病毒的感染能力的方法的條件下才能夠?qū)崿F(xiàn)。因此，本發(fā)明是特別有意義的。
非限制性地給出的下述實(shí)施例表明本發(fā)明的實(shí)施方法以及組合物的穩(wěn)定性和如此配制的顆粒的感染能力。
實(shí)施例1本發(fā)明組合物的制備按照下述方式制備病毒懸浮液在CellCube(Costar)中，在補(bǔ)充10％胎牛血清的DMEM介質(zhì)中培養(yǎng)細(xì)胞293。它們匯合時(shí)，用一等份表達(dá)p53基因的腺病毒工作庫(kù)試樣以感染復(fù)數(shù)2感染這些細(xì)胞。感染五天之后，采用排水法收集產(chǎn)生的上清液，再通過流經(jīng)一組孔隙度逐漸降低(10/1/0.8-0.2微米)的過濾器澄清。這種上清液然后采用在截留閾為300kDa的Millipore膜上的切向超濾濃縮達(dá)20倍體積。然后用平衡的Source 15Q柱色譜純化病毒，用在20毫摩爾Tris/HCl，pH8.0緩沖液中氯化鈉溶液梯度洗脫。收集病毒峰，并采用在截留閾為300kDa的Millipore膜上的切向超濾濃縮該病毒。如此得到病毒制劑的純度非常高，含有＜50納克牛血清白蛋白和＜10納克1E12病毒顆粒的宿主細(xì)胞的DNA。該病毒再配制在各種選擇的緩沖液中。為了進(jìn)行這種操作，對(duì)裝有按照供應(yīng)商說明書選擇的緩沖液洗脫和平衡的Sephadex G-25的PD-10(Amersham-Pharmacia Biotech)柱通過色譜法進(jìn)行緩沖液更換。在用色譜測(cè)定之后，如果必要，可通過稀釋在選擇的制劑緩沖液中，將病毒濃度調(diào)節(jié)到目標(biāo)值。對(duì)于每種選擇的配方，在研究的溫度(-20℃，+4℃或+20℃)下，在聚丙烯管中放入2毫升病毒懸浮液，研究在各種配方中的病毒穩(wěn)定性。然后，在這個(gè)溫度下，在確定的時(shí)間內(nèi)保存上述每個(gè)試驗(yàn)的樣品(參見下面實(shí)施例)。
通過將待分析溶液放在碳化格柵上，然后用1.5％醋酸鈾酰進(jìn)行負(fù)染色處理，進(jìn)行電子顯微鏡分析。這些分析使用的設(shè)備是Jeol 1010電子顯微鏡，操作電壓為50-100千伏。
借助Coulter N4+裝置(Coultronic)，采用光子相關(guān)光譜法(PCS)進(jìn)行病毒顆粒的大小分布分析。
能夠定量病毒顆粒的HPLC(高效液相色譜)分析按照如下所述進(jìn)行在HR5/5型柱(Amersham-Pharmacia Biotech)中制備裝填約1毫升QSepharoseXL(45-165微米；Amersham-Pharmacia Biotech)的色譜柱。這種柱子安裝在配置UV/可見光探測(cè)系統(tǒng)的HPLC體系上，該探測(cè)系統(tǒng)在吸收范圍為200-300nm下操作，該柱用來分離與定量測(cè)定病毒顆粒。在每次分析之前，該柱于30℃以流速1.5毫升/分鐘用20毫摩爾Tris/HCl，pH7.5緩沖液進(jìn)行平衡。含病毒顆粒的待分析樣品注入柱上。在注入之后，該柱用5個(gè)體積的同樣緩沖液進(jìn)行沖洗，再用30個(gè)柱體積線性梯度為0-1M的氯化鈉在20毫摩爾Tris/HCl，pH7.5緩沖液中的溶液洗脫固定的物種。在梯度變化結(jié)尾，在進(jìn)行再平衡之前，用2個(gè)柱體積的0.5N氫氧化鈉溶液洗滌柱子，以便下面的分析。
用色譜純化的腺病毒顆粒制劑在260nm構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過使用在260nm每單位吸收率為1×1010顆粒的轉(zhuǎn)化系數(shù)，借助在0.1％SDS溶液中于260nm處的吸收率預(yù)先測(cè)定這種標(biāo)準(zhǔn)制劑，結(jié)果以顆粒數(shù)表示。這些樣品在用色譜分析之前經(jīng)過濾器(0.22微米)過濾。
F.L.Graham等人在《分子生物技術(shù)》(Molecular Biotechnology)，3，207(1995)中描述了腺病毒滴定技術(shù)。在Boyle等人在《第五次病毒載體和疫苗年會(huì)(1998)》上發(fā)表的“使用免疫滴定法測(cè)量腺病毒載體活性”中描述了采用免疫滴定測(cè)量五鄰體腺病毒蛋白表達(dá)，接著采用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)定量測(cè)量的技術(shù)。
實(shí)施例2在+4℃下保存本發(fā)明的組合物；病毒顆粒的物理穩(wěn)定性下面的表表明隨緩沖溶液性質(zhì)變化所得到的結(jié)果，以及采用色譜分析這些制劑所測(cè)定的病毒顆粒的物理穩(wěn)定性

*Tris/HCl20毫摩爾；pH＝8.4，％甘油體積/體積，％蔗糖體積/體積實(shí)施例3在+4℃保存本發(fā)明的組合物；甘油濃度的影響下面表表明隨配方中甘油濃度變化所得到的結(jié)果，以及通過制劑的色譜分析所測(cè)定的病毒顆粒的物理穩(wěn)定性

*Tris/HCl20mM，pH＝8.4上表中列出的結(jié)果清楚地證實(shí)，10％(體積/體積)含量對(duì)于長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月期間內(nèi)病毒顆粒的物理穩(wěn)定化是有效的。對(duì)于包括10％以上甘油的配方，這一有效性在至少1年期間內(nèi)得到證實(shí)。任何已知配方在如此長(zhǎng)的期間內(nèi)都沒有帶來穩(wěn)定作用特別是含有10mM Tris/HCl+1mM MgCl2+1M蔗糖的配方被證實(shí)不適合于穩(wěn)定高濃度(6.9×1012pv/ml)腺病毒顆粒，病毒濃度從第2個(gè)月開始快速降低。
實(shí)施例4在+4℃或+20℃，根據(jù)本發(fā)明保存的腺病毒的感染能力通過用于表達(dá)病毒顆粒含有的轉(zhuǎn)基因以及導(dǎo)致相應(yīng)蛋白表達(dá)的病毒顆粒的容量測(cè)量了病毒顆粒的感染能力。這里所述蛋白是通過使用抗體(抗五鄰體)標(biāo)記法完成的免疫滴定法、接著通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析檢測(cè)的五鄰體腺病毒蛋白(蛋白III)。得到的結(jié)果用每毫升溶液感染單位(UI/ml)表示。計(jì)算pv/IU比是表達(dá)感染效價(jià)隨時(shí)間推移而變化的第二種方式。在使用的試驗(yàn)條件下，對(duì)于在保存之前新得到的病毒制劑，這個(gè)比值是約20±10。
下表表明，在+4℃保存6個(gè)月或12個(gè)月后，或在+4℃保存1個(gè)月、然后在+20℃保存3.5個(gè)月之后，用甘油或蔗糖配制的病毒顆粒的感染能力。

*Tris/HCl20mM，pH＝8.4
該研究表明，對(duì)于所有甘油濃度等于或高于10％，更特別地對(duì)于所有甘油濃度等于或高于15％，在+4℃特別好地保存病毒活性。同樣地，在+4℃保存1個(gè)月、然后在+20℃保存3.5個(gè)月的含有至少10％甘油的制劑保存其感染能力。首次證明了在室溫下長(zhǎng)期保存非常濃的腺病毒制劑的可能性。含有蔗糖和氯化鎂的對(duì)比配方無論在+4℃還是在+20℃都不能保存濃病毒(6.9×1012v/ml)。低濃度(0.36×1012pv/ml)配方在+4℃保存一個(gè)月、然后在+20℃保存3.5個(gè)月之后其效價(jià)降低。含有蔗糖的配方在增加其濃度時(shí)是完全不適合的。
在保存三個(gè)月之后，采用電子顯微鏡分析了不同的制劑，這些分析表明在20％甘油濃度下，這些顆粒呈現(xiàn)為天然的、實(shí)心的、完整的和對(duì)稱的顆粒。實(shí)際上在介質(zhì)中未檢測(cè)到任何自由的亞單位。與此相反，在高病毒濃度的對(duì)比配方中，這些病毒顆粒大部分聚結(jié)成含有約50個(gè)顆粒的塊狀，或者聚結(jié)成絲結(jié)構(gòu)狀。某些顆粒失去一部分其衣殼體，具有比較圓的或橢圓形結(jié)構(gòu)。這些衣殼體和游離纖維在介質(zhì)中仍完全分散，因此是非常易于觀察的。在+4℃與+20℃同樣好地觀察它們。
在+4℃12個(gè)月之后，在20％甘油中保存的病毒顆粒未出現(xiàn)變化(實(shí)心的、完整的和對(duì)稱的)。
實(shí)施例5于-20℃保存的在Tris/HCl+甘油中配制的腺病毒制劑的感染能力在這個(gè)實(shí)施例中，采用以pfu/ml表示的滴定法測(cè)定了病毒顆粒感染能力。pfu(“蝕斑形成單位”)這一表達(dá)方式相應(yīng)于腺病毒溶液感染能力的量度。通過感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)液，并一般地在培養(yǎng)15天后測(cè)量感染細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)進(jìn)行這種測(cè)定。這些劑量基于生物學(xué)方法，并且得到的值在某種測(cè)量中是采用的操作條件的函數(shù)[J.Virol.，70，7498(1996)]。
下表表明在pfu試驗(yàn)中測(cè)量的在-20℃保存2個(gè)月病毒制劑的感染效價(jià)。

感染效價(jià)的測(cè)量值，更特別地pv/pfu比表明，無論是通過凍凝/解凍凝步驟還是通過在-20℃保存2個(gè)月都不會(huì)改變病毒顆粒。(初始病毒制劑的這個(gè)比值是20-30左右)。
實(shí)施例6在+4℃保存本發(fā)明的組合物；病毒顆粒的物理穩(wěn)定性下表表明隨緩沖液性質(zhì)而變化所得到的結(jié)果以及采用色譜分析制劑測(cè)定的病毒顆粒的物理穩(wěn)定性

實(shí)施例7在+4℃保存本發(fā)明的組合物；緩沖液pH的影響下表表明緩沖液的pH/值對(duì)在20mM Tris與10％甘油中配制的病毒顆粒在保存3個(gè)月后感染能力的影響

該研究表明，在含有10％甘油的20mM Tris/HCl配方中在pH為8.0-9.5的條件下在+4℃下病毒活性保存得特別好。
在pH小于8.0時(shí)，在+4℃其穩(wěn)定性無法繼續(xù)得到保證。
權(quán)利要求
1.含有腺病毒顆粒的液體或凍凝組合物，其特征在于它含有能夠?qū)⒔橘|(zhì)的pH固定在8.0-9.6的緩沖液，該緩沖液中添加了甘油，但是未添加二價(jià)金屬陽(yáng)離子或堿金屬陽(yáng)離子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的液體或凍凝組合物，其特征在于該緩沖液是能夠?qū)⒔橘|(zhì)的pH固定在8.4-8.8的溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的液體或凍凝組合物，其特征在于該緩沖液是能夠?qū)⒔橘|(zhì)的pH固定在8.4的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的液體或凍凝組合物，其特征在于所述緩沖液是由含有Tris或賴氨酸和選自強(qiáng)酸或弱酸的酸的酸/堿體系組成或由含有Hepes和強(qiáng)堿的酸/堿體系組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的液體或凍凝組合物，其特征在于所述緩沖液由選自體系Tris/HCl、賴氨酸/HCl、Tris/馬來酸、Tris/蘋果酸、Tris/乙酸和Hepes/氫氧化鈉的酸/堿體系組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的液體或凍凝組合物，其特征在于它還含有選自聚合物、糖或醇的添加劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的液體或凍凝組合物，其特征在于所述聚合物選自聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷聚環(huán)氧丙烷共混物或聚山梨酸酯，所述糖選自蔗糖、葡萄糖或甘露糖醇，所述醇是乙醇。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的組合物在腺病毒保存中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的腺病毒顆粒組合物在制備用于基因治療的藥物中的治療或預(yù)防性應(yīng)用。
全文摘要
含有腺病毒顆粒的液體或凍凝組合物,它含有能夠?qū)⒔橘|(zhì)的pH固定在弱堿性值的緩沖液,該緩沖液中添加了甘油,但是未添加二價(jià)金屬陽(yáng)離子或堿金屬陽(yáng)離子。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1347450SQ00806090
公開日2002年5月1日 申請(qǐng)日期2000年4月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月9日
發(fā)明者F·布蘭奇, 施香君 申請(qǐng)人:阿文蒂斯藥物股份有限公司