專利名稱：HER－2/neu融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及HER-2/neu融合蛋白，編碼該蛋白質(zhì)的核酸分子，表達(dá)該蛋白質(zhì)的病毒載體，和包含該蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的核酸分子的藥物組合物(例如疫苗)。本發(fā)明還涉及通過激發(fā)或增強(qiáng)對HER-2/neu蛋白質(zhì)免疫應(yīng)答來治療或預(yù)防癌癥的方法，包括用于治療與HER-2/neu致癌基因相關(guān)的癌癥。
背景技術(shù)：
盡管投入了大量人力物力，癌癥仍然是主要死因之一。例如，癌癥是35-74歲婦女中的頭號死因。乳房癌是婦女中最常見的癌癥，而且其發(fā)病率正在上升。據(jù)估計(jì)，9名婦女中就有1名可能被診斷為乳房癌。乳房癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法主要圍繞手術(shù)、放射和化療相結(jié)合。這些療法對某些癌癥具有顯著療效。然而，如果診斷滯后，乳房癌將是最難治愈的。所以需要可早期診斷和治療的方法。
癌癥的共同特征之一是細(xì)胞不受控制的生長。癌細(xì)胞似乎發(fā)生了轉(zhuǎn)變，由其正常表型轉(zhuǎn)變?yōu)榭勺灾魃L的惡性表型。體細(xì)胞基因的擴(kuò)增和過度表達(dá)被認(rèn)為是引起細(xì)胞惡變共同的最初行為。由致癌基因編碼的惡性表型特征通過細(xì)胞分裂傳遞給惡變細(xì)胞的后代。
至今，已鑒定了至少40個(gè)在癌細(xì)胞中活動，并引起或參與惡變的致癌基因。已根據(jù)這些基因產(chǎn)物(例如致癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì))的推定功能或位置對這些致癌基因進(jìn)行了分類。
據(jù)信，在某些方面，致癌基因正常細(xì)胞生理學(xué)所必需的。例如，HER-2/neu致癌基因似乎是受體樣糖蛋白類酪氨酸激酶家族的一員，與表皮生長因子受體(EGFR)具有高度的相同性。據(jù)推測，HER-2/neu在細(xì)胞生長和/或分化中起著一定作用。似乎，HER-2/neu通過一種正?；虍a(chǎn)物的增加或下調(diào)所致的定量機(jī)制誘導(dǎo)了惡變。
p185糖蛋白是HER-2/neu致癌基因的產(chǎn)物。在乳房癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌等多種癌癥中，HER-2/neu基因發(fā)生擴(kuò)增，p185過度表達(dá)。p185與惡變相關(guān)，被發(fā)現(xiàn)存在于卵巢、前列腺、結(jié)腸和肺等部位發(fā)生的50-60％導(dǎo)管原位癌，20-40％侵襲性乳房癌和腺癌實(shí)質(zhì)性組分中。HER-2/neu表達(dá)不僅與惡性表型密切相關(guān)，而且與惡變發(fā)展相關(guān)。HER-2/neu的過度表達(dá)與乳房癌和卵巢癌的預(yù)后不良相關(guān)。
p185是一種跨膜蛋白質(zhì)，估計(jì)其分子量約185KD，長約1255個(gè)氨基酸。p185有一個(gè)645氨基酸的胞外域(ECD)，其氨基酸序列與EGFR具有至少40％相同性，一個(gè)高度疏水的跨膜域，和一個(gè)約580氨基酸的羧基末端胞內(nèi)域(ICD)，與EGFR具有至少80％相同性。
目前需要一種針對HER-2/neu相關(guān)惡變的抗癌疫苗，以及可激發(fā)或增強(qiáng)對HER-2/neu基因免疫應(yīng)答的組合物和方法。本發(fā)明就針對了這些及其它重要目的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了HER-2/neu p185融合蛋白，編碼該蛋白的核酸分子，包含該編碼聚核苷酸的病毒載體，用于免疫溫血?jiǎng)游飶亩挚笻ER-2/neu相關(guān)性惡變?？蓪⒈景l(fā)明的融合蛋白或核酸分子制成組合物，還包含藥學(xué)上認(rèn)可的的載體或稀釋劑，例如水包油乳液，還可含有一種或多種其它活性成分，例如免疫刺激物，例如SBAS-2，3D-MPL，QS21或3D-MPL聯(lián)合QS21。本發(fā)明的組合物可以是疫苗的形式，或以此形式使用。可將所述的融合蛋白、核酸分子、病毒載體、藥物組合物和/或疫苗一次性給予(例如，給予具有癌癥發(fā)生和復(fù)發(fā)高度危險(xiǎn)性的個(gè)體，或懷疑患有癌癥的人)，或定期給予(例如，給予具有癌癥發(fā)生和復(fù)發(fā)高度危險(xiǎn)性的個(gè)體，或懷疑患有癌癥的人)。本發(fā)明的化合物或組合物可用于包括人在內(nèi)的溫血?jiǎng)游?，用于治療一種或多種已經(jīng)存在的腫瘤，或預(yù)防腫瘤的發(fā)生或復(fù)發(fā)。
本發(fā)明還提供了一種通過激發(fā)或增強(qiáng)對HER-2/neu蛋白質(zhì)免疫應(yīng)答從而抑制或預(yù)防患者體內(nèi)癌癥發(fā)展的方法，包括給予患者以上所述的藥物組合物或疫苗。所述患者可以是，例如，乳房癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌或前列腺癌患者，本發(fā)明方法可用于治療這些患者，或者預(yù)防性治療具有以上癌癥危發(fā)性的患者。實(shí)施方式之一中，所述的給予藥物組合物或疫苗包括用本發(fā)明核酸分子體外轉(zhuǎn)染溫血?jiǎng)游锏募?xì)胞，或用含本發(fā)明核酸分子的病毒載體體外感染溫血?jiǎng)游锏募?xì)胞，然后將轉(zhuǎn)染或感染后的細(xì)胞回輸給患者。
本發(fā)明還提供了一種去除生物樣品中腫瘤細(xì)胞的方法，包括將生物樣品與HER-2/neu融合蛋白特異性T細(xì)胞接觸，所述接觸步驟的條件和時(shí)間足以消除樣品中表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞。在相關(guān)的內(nèi)容中，還提供了抑制患者體內(nèi)癌癥發(fā)展的方法，包括將如上處理的生物樣品給予患者。
另一實(shí)施方式中，提供了激發(fā)和/或擴(kuò)增HER-2/neu融合蛋白特異性T細(xì)胞的方法，包括將T細(xì)胞與一種或多種以下物質(zhì)接觸(i)上述融合蛋白；(ii)編碼該融合蛋白的聚核苷酸，和/或(iii)表達(dá)該融合蛋白的抗原呈遞細(xì)胞，接觸的條件和時(shí)間足以激發(fā)和/或擴(kuò)增T細(xì)胞。還提供了如上所述制備的分離的T細(xì)胞群。繼而，本發(fā)明還提供了將有效量如上所述制備的T細(xì)胞群給予患者來抑制其體內(nèi)癌癥發(fā)展的方法。
另一實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了抑制患者體內(nèi)癌癥發(fā)展的方法，其步驟包括(a)將分離自患者的CD4+/CD8+T細(xì)胞與一種或多種以下物質(zhì)共培養(yǎng)(i)HER-2/neu融合蛋白；(ii)編碼該融合蛋白的聚核苷酸；(iii)表達(dá)該融合蛋白的抗原呈遞細(xì)胞；和(b)給予患者有效量的增殖T細(xì)胞，由此抑制患者體內(nèi)癌癥的發(fā)展。在給予患者前，可以，但非必須，繼續(xù)增殖細(xì)胞的克隆。
最后，本發(fā)明還提供了制造HER-2/neu融合蛋白的方法，其步驟包括(a)在細(xì)胞內(nèi)引入表達(dá)載體，該載體包含編碼HER-2/neu融合蛋白的聚核苷酸，(b)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞；和(c)純化表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。另一優(yōu)選實(shí)施方式中，對所述細(xì)胞進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)。另一實(shí)施方式中，所表達(dá)的蛋白質(zhì)分兩步純化Q瓊脂糖高效柱上的離子交換層析，和苯基瓊脂糖6快速低取代柱上的疏水性層析。
通過以下詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的以上及其它內(nèi)容將是顯而易見的。本發(fā)明分別參考了在此引用的各參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容。
附圖簡述

圖1是pFLAGCMV-1/ICD表達(dá)質(zhì)粒的圖譜，其大小為6.7kb。
圖2是pFLAGCMV-1/KD表達(dá)質(zhì)粒的圖譜，其大小為5.7kb。
圖3是pFLAGCMV-1/PD表達(dá)質(zhì)粒的圖譜，其大小為5.7kb。
圖4顯示，HER-2/neu的磷酸化區(qū)分泌進(jìn)入培養(yǎng)基，HER-2/neu的胞內(nèi)域和激酶區(qū)不分泌進(jìn)入培養(yǎng)基，參見實(shí)施方式3。
圖5是表達(dá)載體pcDNA3.1/hygro/ECD-PD的圖譜，大小為8.3kb。
圖6顯示HEK-293和CHO細(xì)胞內(nèi)ECD-PD融合蛋白的表達(dá)結(jié)果，顯示融合蛋白分泌進(jìn)入培養(yǎng)基，參見實(shí)施方式4。
圖7顯示人HER-2/neu蛋白質(zhì)的全長氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
圖8顯示大鼠HER-2/neu蛋白質(zhì)的全長氨基酸序列(SEQ ID NO2)。激酶區(qū)是其中的氨基酸721-998。
圖9顯示HER-2/neu蛋白質(zhì)胞外域的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。
圖10顯示人HER-2/neu蛋白質(zhì)磷酸化區(qū)(PD)的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖11顯示人HER-2/neu蛋白質(zhì)磷酸化區(qū)中一優(yōu)選部分的氨基酸序列(ΔPD)(SEQ ID NO5)。
圖12顯示包含人HER-2/neu蛋白質(zhì)的胞外域(ECD)和磷酸化區(qū)(PD)的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
圖13顯示包含人HER-2/neu蛋白質(zhì)的胞外域(ECD)和磷酸化區(qū)中優(yōu)選部分(ΔPD)的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO7)。
圖14顯示大鼠HER-2/neu蛋白質(zhì)胞外域(ECD)的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。
圖15顯示編碼人HER-2/neu蛋白質(zhì)的DNA分子的全長核苷酸序列(SEQ IDNO9)。該全長核苷酸序列可參見WO96/30514，本發(fā)明全面參考了其內(nèi)容。
圖16顯示編碼大鼠HER-2/neu蛋白質(zhì)的DNA分子的全長核苷酸序列(SEQID NO10)。該全長核苷酸序列可參見Bargmann等(1986)，自然，319226-30，和GENBANK/X03362，本發(fā)明全面參考了其內(nèi)容。
圖17是ELISA試驗(yàn)結(jié)果半抗原與哺乳動物細(xì)胞或大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的不同ECD-PD融合蛋白結(jié)合。大腸桿菌產(chǎn)生的融合蛋白與C-或N-末端6×組氨酸尾(分別記為C-His尾和N-His尾)同框。
圖18是無血清條件下懸浮培養(yǎng)，CHO-K1細(xì)胞和畢赤氏酵母細(xì)胞內(nèi)HER-2/neu ECD-PD融合蛋白表達(dá)的比較。
圖19顯示小鼠HER-2/neu的核苷酸序列。
圖20顯示小鼠HER-2/neu的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式
的描述前言本發(fā)明涉及能夠調(diào)節(jié)(以激發(fā)或增強(qiáng)為佳)對HER-2/neu致癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫力，包括作用于溫血?jiǎng)游矬w內(nèi)的如下惡變，其中，擴(kuò)增的HER-2/neu基因及相關(guān)惡變不需要腫瘤上存在該基因的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物。例如，該基因的過度表達(dá)可能涉及腫瘤形成的引發(fā)和早期階段，但此后，該蛋白質(zhì)的表達(dá)減少或消失。本發(fā)明可用于激發(fā)或增強(qiáng)有效的免疫應(yīng)答，從而將HER-2/neu陽性腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)镠ER-2/neu陰性，避免HER-2/neu陽性腫瘤的形成，并引起已有HER-2/neu陽性腫瘤的消退。
以下是本發(fā)明中的縮寫“ECD”表示胞外域，“ICD”表示胞內(nèi)域，“PD”表示胞內(nèi)域中的磷酸化區(qū)(即，被磷酸化的區(qū)域)，“ΔPD”表示磷酸化區(qū)內(nèi)的一個(gè)片段，“KD”表示胞內(nèi)域中的激酶區(qū)。HER-2/neu基因表達(dá)的產(chǎn)物在此稱為“HER-2/neu蛋白質(zhì)”，又稱“p185”或“c-erbB2”。定義“HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白”，即“ECD-ICD”或“ECD-ICD融合蛋白”，指包含HER-2/neu蛋白質(zhì)胞外域(或其片段)和胞內(nèi)域(或其片段)的融合蛋白(或其片段)。在此，ECD-ICD融合蛋白不包括HER-2/neu跨膜域的實(shí)質(zhì)性部分，最好完全不包括HER-2/neu跨膜域。
“HER-2/neu ECD-PD融合蛋白”，即“ECD-PD”或“ECD-PD融合蛋白”，或“HER-2/neu ECD-ΔPD融合蛋白”，即“ECD-ΔPD”或“ECD-ΔPD融合蛋白”，指包含HER-2/neu蛋白質(zhì)胞外域(或其片段)和磷酸化區(qū)(或其片段，如ΔPD)的融合蛋白(或其片段)。ECD-PD和ECD-ΔPD不包括HER-2/neu跨膜域的實(shí)質(zhì)性部分，最好完全不包括HER-2/neu跨膜域。
“HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白”和“HER-2/neu ECD-PD融合蛋白”及相關(guān)的術(shù)語應(yīng)理解為包括其片段、類似物和功能相當(dāng)物(統(tǒng)稱為“變異體”)，例如有一處或多處氨基酸插入、缺失或取代的那些，在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式中，它們或者(i)比HER-2/neu蛋白質(zhì)更強(qiáng)地激發(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，或(ii)基本上不影響HER-2/neu蛋白質(zhì)激發(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答(例如，變異體激發(fā)輔助T細(xì)胞或細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答，或激發(fā)抗體的產(chǎn)生)。具體的非限定性變異體實(shí)例包括HER-2/neuECD-ICD融合蛋白和HER-2/neu ECD-PD融合蛋白的片段、類似物和功能相當(dāng)物。變異體可以“基本上相同”或“基本上相似”于含有天然多肽組分、并保留了激發(fā)免疫應(yīng)答的能力的融合蛋白。
“融合蛋白”指至少由兩段多肽共價(jià)連接而成的蛋白質(zhì)，其中，一段多肽來自一種蛋白質(zhì)序列或區(qū)域，另一段則來自另一蛋白質(zhì)序列或區(qū)域。這些多肽可以直接連接，也可以通過共價(jià)接頭(例如氨基酸接頭(如聚甘氨酸接頭)，化合物接頭(例如碳酸水合物接頭)，脂質(zhì)接頭，脂肪酸接頭，或聚醚接頭(例如PEG等)連接(參見Hermanson，生物偶聯(lián)技術(shù)(1996))。形成融合蛋白的多肽一般以C末端與N末端相連，但也可能C末端與C末端相連，N末端與N末端相連，或N末端與C末端相連。融合蛋白中多肽的順序可以任意?！叭诤系鞍住边€包括修飾變異體，多態(tài)變異體，等位基因變異體，突變體，構(gòu)成融合蛋白的多肽的亞序列和種間類似物。融合蛋白的制備可通過將一種蛋白質(zhì)序列的氨基酸鏈與另一蛋白質(zhì)序列的氨基酸鏈共價(jià)連接，例如通過制備連續(xù)編碼該融合蛋白的重組聚核苷酸。融合蛋白可包含來自相同或不同物種的2、3、4或更多種不同氨基酸鏈。一個(gè)融合蛋白內(nèi)的不同氨基酸鏈可以直接拼接在一起，也可以通過化學(xué)連接基團(tuán)或氨基酸連接基團(tuán)間接拼接在一起。融合蛋白還可以包含本發(fā)明所述的其它組分。
“蛋白質(zhì)”在此與“多肽”和“肽”同義。
“核酸”指脫氧核糖核酸或核糖核酸，以及它們聚合物的單鏈或雙鏈形式。它還包括如下含有已知核苷酸類似物或修飾骨架殘基和連鍵的核酸合成的，天然的，非天然的，與所參照的核酸具有相似結(jié)合特性的，與之具有相同代謝方式的。此類類似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯，磷酰胺，磷酸甲酯，手性磷酸甲酯，2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核酸(PNAs)。
除非另作說明，一段特定的核酸序列還暗含其保守性修飾的變異體(例如簡并性密碼子的取代)和互補(bǔ)序列，以及明確列出的序列。具體地說，獲得簡并密碼子取代可通過生成多段如下序列其中，用混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代一個(gè)或多個(gè)(或全部)選定密碼子的第三位(Batzer等(1991)，核酸研究，195081；Ohtsuka等(1985)，生物化學(xué)雜志，2602605-2608；Rossolini等(1994)，分子細(xì)胞探針，891-98)。在此，核酸與基因，cDNA，mRNA，寡核苷酸和聚核苷酸同義。
在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，含本發(fā)明融合蛋白的聚核苷酸序列可與編碼該融合蛋白中各多肽的核苷酸序列雜交。因此，編碼融合多肽內(nèi)各多肽的聚核苷酸序列包括保守性修飾的變異體，多態(tài)變異體，等位基因變異體，突變體，亞序列和種間類似物。
“序列相同性百分比”通過在一個(gè)比較窗內(nèi)比較最適排列的兩段序列來測定，其中，為了獲得兩序列的最適排列，聚核苷酸序列比較窗內(nèi)的部分與參比序列(沒有增加或缺失)對比時(shí)可以有增加或缺失(例如空格)。百分比的計(jì)算為確定兩序列中核酸堿基或氨基酸殘基相同的位置數(shù)，得出匹配位數(shù)，將其除以比較窗內(nèi)的總位數(shù)，再乘以100，得出序列相同性百分比。
聚核苷酸序列“基本相同”表示具有至少25％序列相同性。相同性百分比也可能在25-100％之間。較好的實(shí)施方式是，用本發(fā)明所述的方法，與參比序列相比的相同性為至少25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，或更高；較好的方法是后文所述采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，考慮密碼子簡并性，氨基酸相似性，讀碼框位置等因素，可對這些數(shù)值適當(dāng)調(diào)整，從而確定兩核苷酸序列所編碼蛋白質(zhì)的相同性。就此而言，氨基酸序列“基本相同”指序列相同性至少40％，以40-100％為佳，更好的是至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％?！盎鞠嗨啤钡亩嚯钠湫蛄泄餐匀缜八?，但不相同殘基的位置上可以是保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代指具有相似側(cè)鏈的殘基之間的可互換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸組是甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的氨基酸組是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸組是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸組是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸組是賴氨酸，精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的氨基酸組是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守性氨基酸取代是纈氨酸-賴氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸-賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，天冬氨酸-谷氨酸，天冬酰胺-谷氨酰胺。
對比序列的最適排列可按照Smith和Waterman(1981)，Add.APL.Math.2482所述的局部相同性算法，Needleman和Wunsch(1970)分子生物學(xué)雜志，48443所述的相同性排列算法，Pearson和lipman(1988)美國科學(xué)院院報(bào)852444所述的相似性研究方法，以及這些算法的計(jì)算機(jī)化形式(Wisconsin基因軟件包中的GAP，BESTFIT，BLAST，F(xiàn)ASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.Madison，WI)來進(jìn)行，或通過目測。
適合用于測定序列相同性或相似性的較好的算法例是BLAST和BLAST 2.0算法，分別參見Altschul等(1977)，核酸研究253389-3402和Alschul等(1990)，分子生物學(xué)雜志215403-410。采用本文所述的參數(shù)使用BLAST和BLAST2.0，測定本發(fā)明核酸和蛋白質(zhì)的序列相同性百分比。BLAST軟件通過國家生物技術(shù)信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)向公眾開放。用參數(shù)M(匹配殘基對的得分；總是＞0)和N(錯(cuò)配堿基對的罰分；總是＜0)計(jì)算核苷酸序列的累計(jì)分值。用計(jì)分矩陣來計(jì)算氨基酸序列的累計(jì)分值。在以下時(shí)刻終止各方向上的計(jì)分延續(xù)當(dāng)累計(jì)排列分值由所得最大值下降達(dá)X時(shí)；當(dāng)累計(jì)分值因一個(gè)或多個(gè)負(fù)分殘基排列累積而趨于0或0以下；當(dāng)達(dá)到其中之一序列的末端時(shí)。BLAST算法參數(shù)W，T和X決定排列對比的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用其默認(rèn)值字符長度(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，并對兩條鏈都進(jìn)行比較。對于氨基酸序列，采用BLASTP程序，采用其默認(rèn)值字符長度(W)3，期望值(E)10，以及BLOSUM62計(jì)分矩陣(參見Henikoff和Henikoff(1989)美國科學(xué)院院報(bào)8910915)排列(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，對兩條鏈都進(jìn)行比較。
如果在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下，最好是高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，兩分子能夠彼此雜交，或與第三種核酸雜交，也表明它們基本相同。嚴(yán)謹(jǐn)條件視序列而異，而且不同環(huán)境下也不同。序列越長，特異性雜交的溫度越高。有關(guān)核酸雜交的全面論述可參見Tiissen，“生物活性和分子生物學(xué)技術(shù)-與核酸探針的雜交”中“有關(guān)雜交原理和核酸試驗(yàn)策略的綜述”(1993)。通常，嚴(yán)謹(jǐn)條件的選擇應(yīng)是比特定序列在確定離子強(qiáng)度和pH下熔點(diǎn)Tm低約5-10℃。Tm即(確定離子強(qiáng)度和pH下)50％的靶序列與優(yōu)選匹配探針雜交的溫度。通常，嚴(yán)謹(jǐn)條件應(yīng)選擇pH7.0至8.3時(shí)，鹽濃度低于1.0M鈉離子(通常為0.01-1.0M鈉離子或其它鹽濃度)，短探針(例如10-50個(gè)核苷酸)的溫度約30℃，長探針(例如超過50個(gè)核苷酸)的溫度約60℃。也可以加入甲酰胺之類去穩(wěn)定劑來獲得嚴(yán)謹(jǐn)條件。對于選擇性或特異性雜交來說，陽性信號為背景雜交的2倍以上，是其10倍以上則更好。
嚴(yán)謹(jǐn)條件的例子如50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，42℃培養(yǎng)；或5×SSC，1％SDS，65℃培養(yǎng)，并以0.2×SSC和0.1％SDS在65℃洗滌。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，合適的“中等嚴(yán)謹(jǐn)條件”包括，例如在5×SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH8.0)溶液中預(yù)洗，在50-65℃，5×SSC中雜交過夜，然后用2×、0.5×和0.25×SSC(含0.1％SDS)65℃洗滌2次，每次20分鐘。這些雜交DNA序列也屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
“T細(xì)胞增殖”在此包括T細(xì)胞的繁殖，以及引起其繁殖的T細(xì)胞刺激，即，引起有絲分裂的事件和有絲分裂本身。檢測T細(xì)胞增殖的方法如后文所述。本發(fā)明的融合蛋白A.HER-2/neu蛋白質(zhì)的胞內(nèi)域和胞外域根據(jù)以上所述對HER-2/neu的研究結(jié)果，將HER-2/neu蛋白質(zhì)選作抗癌疫苗的目標(biāo)。該方法的主要困難之一在于難以分離到足量的HER-2/neu蛋白。解決該問題的一種代償是在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)分別表達(dá)ECD和ICD。ECD是高水平表達(dá)的分泌蛋白質(zhì)，從1L小鼠細(xì)胞培養(yǎng)物中可純化得到約20mg ECD蛋白。然而，ICD的表達(dá)水平很低，從1L HEK-293細(xì)胞僅可純化得到約0.2mg ICD蛋白。此外，所得的ICD蛋白在細(xì)胞裂解物中很不穩(wěn)定，會對純化造成許多預(yù)想不到的問題。
如上所述，HER-2/neu是一種癌基因自身蛋白質(zhì)，對自身蛋白質(zhì)的免疫耐受性會抑制免疫應(yīng)答。對特定蛋白質(zhì)不同部分的免疫耐受性水平可能取決于所表達(dá)的蛋白質(zhì)部分是在細(xì)胞膜內(nèi)還是膜外。ECD在細(xì)胞表面，是分泌蛋白。相反，ICD及其部分位于細(xì)胞內(nèi)，不是分泌蛋白。ECD易與機(jī)體的免疫系統(tǒng)接觸，而ICD及其部分與機(jī)體的免疫系統(tǒng)則相對隔離。因此，對HER-2/neu蛋白ECD的免疫耐受性高于對ICD部分的耐受性。因此，對本發(fā)明的疫苗來說，與ECD蛋白和ECD肽相比，ICD蛋白和ICD肽，其變異體，包括PD部分和PD肽可誘導(dǎo)更高水平的免疫應(yīng)答。
雖然ICD及其變異體的免疫原性高于ECD及其變異體，但對ECD及其變異體的抗體仍是有益的，也可能是必要的。ECD位于細(xì)胞表面，而ICD及其部分不是分泌蛋白，隱蔽在細(xì)胞內(nèi)。因此，對ECD的抗體應(yīng)答具有更高的治療價(jià)值，因而為本發(fā)明所優(yōu)選。ECD本身的免疫原性不高。因?yàn)镮CD(包括PD和ΔPD)的免疫原性高于ECD，ECD-ICD融合蛋白和/或ECD-PD融合蛋白的免疫原性高于單獨(dú)的ECD。ECD-ICD融合蛋白和/或ECD-PD融合蛋白也許可比單獨(dú)ECD更有效地誘導(dǎo)抗ECD的抗體，因而為本發(fā)明所優(yōu)選。
本發(fā)明中，將ECD或其變異體與ICD或其變異體(以PD或其變異體為佳)組合、連接或融合(直接或通過接頭)。ECD提供的結(jié)構(gòu)構(gòu)型誘導(dǎo)能與細(xì)胞表面HER-2/neu蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體，ICD或PD則提高ECD的免疫原性。與單獨(dú)ECD相比，以上組合誘導(dǎo)對ECD免疫應(yīng)答的效率有出人意料的提高。
可將ECD或其部分與ICD或其變異體(包括ICD的部分或PD或其變異體(包括PD的部分，例如ΔPD))組合。本發(fā)明的ECD最好是人、大鼠或小鼠的ECD。人ECD參見圖9，SEQ ID NO3。大鼠ECD參見圖14，SEQ ID NO8。
本發(fā)明的ICD最好是人、大鼠或小鼠的ICD。人ECD參見圖7，SEQ ID NO1，包括其中Lys676-Val1255。大鼠ECD參見圖8，SEQ ID NO2，包括其中的Lys677至Val1256。
本發(fā)明的PD最好是人、大鼠或小鼠的PD。人PD參見圖10，SEQ ID NO4。人PD可以是人ΔPD，參見圖11，SEQ ID NO5。大鼠PD參見圖8，SEQ ID NO2，包括其中的Gln991至Val1256。大鼠PD可以是大鼠ΔPD，參見圖8，SEQ IDNO2，包括其中的Gln991至Arg1049。
實(shí)施方式之一中，人ECD可與以下所述之一融合(i)人ICD或大鼠ICD，或(ii)人PD或ΔPD，或大鼠PD或ΔPD。另一實(shí)施方式中，大鼠ECD可與以下所述之一融合(i)人ICD或大鼠ICD，或(ii)人PD或ΔPD，或大鼠PD或ΔPD。
HER-2/neu PD長268氨基酸，位于胞內(nèi)，可以被蛋白質(zhì)酪氨酸激酶磷酸化。該區(qū)域與其它酪氨酸激酶受體的相應(yīng)區(qū)域沒有相同性。因此，該區(qū)域的特異性和獨(dú)特性使其特別適合作為腫瘤疫苗。然而，該區(qū)域難以在細(xì)菌或哺乳動物相比內(nèi)單獨(dú)表達(dá)。例如，生成的PD很不穩(wěn)定，不適合大規(guī)模生成。實(shí)施方式之一中，本發(fā)明通過將該胞內(nèi)域全部或部分或其磷酸化區(qū)與HER-2/neu胞外域的全部或部分融合解決了該問題。本發(fā)明ECD-ICD融合蛋白和ECD-PD融合蛋白是可溶蛋白，分泌蛋白，可穩(wěn)定存在于培養(yǎng)基。該系統(tǒng)可提供大量的胞內(nèi)域或磷酸化區(qū)用于癌癥疫苗的開發(fā)，尤其是乳房癌疫苗的開發(fā)，可用于抵抗以HER-2/neu表達(dá)為特征的各種抗癌疫苗。除了可提高胞內(nèi)域或磷酸化區(qū)或其變異體的表達(dá)之外，作為與胞外域或其變異體所成的融合蛋白，ECD-ICD和ECD-PD融合蛋白提供了更好的疫苗制劑。
通過在PD的N末端引入一段分泌信號，可將PD改造成分泌蛋白質(zhì)，成為可溶性、分泌型重組蛋白。因?yàn)橹亟M蛋白可在培養(yǎng)基內(nèi)積累，所以最好有分泌過程。因?yàn)樵摰鞍踪|(zhì)不與胞內(nèi)蛋白質(zhì)偶聯(lián)，所以蛋白質(zhì)裂解有限。應(yīng)可更方便、更經(jīng)濟(jì)地純化該蛋白質(zhì)。
如實(shí)施方式3所述，用pFLAGCMV-1表達(dá)質(zhì)粒(Kodak)來確定HER-2/neu胞內(nèi)域的哪個(gè)區(qū)域可分泌。表達(dá)的蛋白質(zhì)是融合蛋白，在其N末端有一段前胰蛋白酶原(preprotrypsin)分泌信號和FLAG-標(biāo)簽。用這樣的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，用FLAG-標(biāo)簽M2抗體作為探針，通過Western印跡法檢測細(xì)胞和培養(yǎng)液中的FLAG-標(biāo)簽融合蛋白。圖4中的結(jié)果證明全長ICD或KD都不分泌，但PD是可溶性和分泌型的，可在培養(yǎng)液中檢測到。該結(jié)果表明，全長ICD或KD不分泌，即不能穿越細(xì)胞膜。
如實(shí)施方式4所述，ECD有一段分泌信號序列，可表達(dá)為分泌蛋白，可作為PD的融合伴侶。在HEK-293細(xì)胞內(nèi)表達(dá)ECD-PD融合蛋白。用HER-2/neu ECD特異性抗體通過ELISA試驗(yàn)，再用HEK-2/neu PD特異性抗體通過Western印跡檢測可溶性ECD-PD融合蛋白的分泌。如圖6所示，HEK-293表達(dá)可溶性的ECD-PD，并分泌進(jìn)入培養(yǎng)液。
B.本發(fā)明融合蛋白的免疫原性在優(yōu)選實(shí)施方式之一中，本發(fā)明涉及基于HER-2/neu基因蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物特定部分的融合蛋白(例如，HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白或HER-2/neu ECD-PD融合蛋白)，它能激發(fā)抗體應(yīng)答，并可被胸腺依賴性淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)識別。因此，可用自身的免疫T細(xì)胞應(yīng)答預(yù)防或治療HER-2/neu正在或已經(jīng)過度表達(dá)的癌癥。另一方面，本發(fā)明涉及指導(dǎo)ECD-ICD融合蛋白，或ECD-PD融合蛋白，或其變異體表達(dá)的核酸分子的免疫用途，其可單獨(dú)使用或在表達(dá)載體中使用。
通常，在被特定抗原激發(fā)時(shí)，CD4+T細(xì)胞群被認(rèn)為通過釋放淋巴因子起著輔助或誘導(dǎo)細(xì)胞的作用；然而，CD4+細(xì)胞的一個(gè)亞群具細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的作用(CTL)。類似的，CD8+T細(xì)胞的作用被認(rèn)為是裂解抗原靶細(xì)胞；然而，在許多場合，它們可以分泌淋巴因子，起到輔助細(xì)胞或DTH作用。盡管功能可能有所重疊，但表型CD4和CD8都與識別I類或II類MHC抗原相結(jié)合的肽相關(guān)。識別I類或II類MHC中的抗原使得CD4+和CD8+T細(xì)胞對不同條件下呈遞的不同抗原或相同抗原作出反應(yīng)。免疫原性肽與II類MHC抗原的結(jié)合最常發(fā)生于被抗原呈遞細(xì)胞所攝取的抗原。
如本發(fā)明所述，作為HER-2/neu致癌基因蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的ECD-ICD融合蛋白或ECD-PD融合蛋白可被T細(xì)胞識別。循環(huán)中的HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白或HER-2/neu ECD-PD融合蛋白被降解成肽片段。ECD-ICD融合蛋白或ECD-PD融合蛋白的肽片段可與主組織相容性復(fù)合物(MHC)抗原結(jié)合。通過在細(xì)胞表面展示與HMC抗原結(jié)合的肽，并由宿主的T細(xì)胞識別肽加自身MHC抗原，則HER-2/neu ECD-ICD或HER-2/neu ECD-PD融合蛋白(包括癌細(xì)胞上表達(dá)的那些)將對T細(xì)胞具有免疫原性。T細(xì)胞受體的精確特異性使得各T細(xì)胞能辨別相差僅一個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)片段。
在對ECD-ICD融合蛋白或ECD-PD融合蛋白的肽片段的免疫應(yīng)答中，所表達(dá)的T細(xì)胞受體與肽-MHC復(fù)合物具有高結(jié)合親和力的T細(xì)胞將與肽-MHC復(fù)合物結(jié)合，于是被激活、誘導(dǎo)而增殖。在首次遭遇某肽時(shí)，少量免疫T細(xì)胞會分泌淋巴因子，增殖，并分化為效應(yīng)和記憶T細(xì)胞。體內(nèi)將發(fā)生初次免疫應(yīng)答，但在體外難以檢測到。當(dāng)記憶T細(xì)胞再次遇上同一抗原時(shí)，就會引起更快、更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。第二次應(yīng)答在體內(nèi)和體外都會發(fā)生。通過以下測定即可測定體外反應(yīng)測定T細(xì)胞群再次接觸抗原時(shí)的增殖程度，細(xì)胞因子產(chǎn)生的程度，或溶胞活性。T細(xì)胞群在對特定抗原的應(yīng)答中顯著增殖，被認(rèn)為表明曾經(jīng)接觸過該抗原，或曾以該抗原初免疫過。
C.本發(fā)明的融合蛋白實(shí)施方式之一中，本發(fā)明的化合物包含HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白或其變異體，或編碼該ECD-ICD融合蛋白的聚核苷酸。較好的是，所述核酸分子是DNA分子。在本發(fā)明的HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白中，ECD和ICD多肽組分可直接融合，或通過接頭(例如氨基酸接頭或其它化學(xué)接頭)融合。一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的ECD-ICD融合蛋白包含完整或部分HER-2/neu ECD與完整或部分HER-2/neu ICD的融合。
另一實(shí)施方式中，可通過依次去除ECD羧基末端1-100氨基酸中任一區(qū)段來改變ECD-ICD融合蛋白中ECD的大小，最好是去除約100個(gè)氨基酸。類似的，可通過依次去除ICD的N末端和/或C末端1-100氨基酸中任一區(qū)段來改變ECD-ICD融合蛋白中ICD的大小。得到的變異體可用文獻(xiàn)或本發(fā)明所述的合適的篩選方法，根據(jù)它們的抗原性和/或免疫原性進(jìn)行篩選，然后用于本發(fā)明。
另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物包含HER-2/neu ECD-PD融合蛋白，或其變異體，或編碼該ECD-PD融合蛋白的核酸分子。實(shí)施方式之一中，HER-2/neuECD與HER-2/neu ΔPD融合。較好的是，該核酸分子是DNA分子。在本發(fā)明的HER-2/neu ECD-PD融合蛋白中，ECD，PD或ΔPD組分可直接融合，或通過接頭(例如氨基酸接頭或其它化學(xué)接頭)融合。優(yōu)選實(shí)施方式之一中，本發(fā)明的ECD-PD融合蛋白中的HER-2/neu ECD與HER-2/neu PD或ΔPD直接融合。本發(fā)明中，優(yōu)選的本發(fā)明融合蛋白是HER-2/neu PD融合蛋白。
另一實(shí)施方式中，可通過依次去除ECD羧基末端1-100氨基酸中任一區(qū)段來改變ECD-PD融合蛋白中ECD的大小，最好是去除約100個(gè)氨基酸。類似的，可通過依次去除PD的N末端和/或C末端1-100氨基酸中任一區(qū)段來改變ECD-PD融合蛋白中PD的大小。其它變異體可用文獻(xiàn)或本發(fā)明所述的合適的篩選方法，根據(jù)它們的抗原性和/或免疫原性進(jìn)行篩選，然后用于本發(fā)明。
表1顯示，去除ECD羧基末端的100個(gè)氨基酸對ECD-PD融合蛋白的表達(dá)水平和穩(wěn)定性沒有影響。
表1ECD截短—PD小結(jié)

ECD-ICD融合蛋白和ECD-PD融合蛋白的變異體還包括天然ECD-ICD融合蛋白和ECD-PD融合蛋白的各種結(jié)構(gòu)形式。因?yàn)榇嬖诳呻x子化的氨基和羧基，HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白可以是酸式鹽或堿式鹽的形式，或者是中性形式。各氨基酸殘基還可以通過氧化或還原來修飾。
本發(fā)明范圍內(nèi)的其它變異體包括如下ECD-ICD融合蛋白或ECD-PD融合蛋白其中天然HER-2/neu ECD-ICD或天然HER-2/neu ECD-PD蛋白質(zhì)的一級氨基酸結(jié)構(gòu)通過與其它肽或多肽或化學(xué)基團(tuán)(例如糖基，脂類，磷酸，乙?；?共價(jià)偶聯(lián)或聚集而被修飾。共價(jià)衍生物可以通過將特定官能團(tuán)與氨基酸側(cè)鏈或N末端或C末端連接來制備。
本發(fā)明還包括糖基化或沒有糖基化的HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白和HER-2/neu ECD-PD融合蛋白。酵母或哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的ECD-ID融合蛋白或ECD-PD融合蛋白，因?yàn)楸磉_(dá)系統(tǒng)的緣故，在分子量和糖基化方式上可能與天然分子相似或略有不同。編碼多肽的DNA在大腸桿菌等細(xì)菌內(nèi)表達(dá)通常得到非糖基化的分子。真核蛋白質(zhì)N糖基化位點(diǎn)的特征是三聯(lián)氨基酸Asn-A1-Z，其中A1可以是除Pro之外的任意氨基酸，Z是Ser或Thr。具有非活化N糖基化位點(diǎn)的HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白的變異體可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來制備，例如寡核苷酸合成和連接，或定點(diǎn)誘變技術(shù)，這些都屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)?；蛘撸部梢詫連接的糖基化位點(diǎn)加入HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白中。
本發(fā)明的ECD-ICD融合蛋白(包括其變異體)包括人和非人源多肽所有可能的組合。非人多肽包括來自各種動物的多肽，例如大鼠，小鼠，豚鼠，馬，牛，豬，羊，狗等。實(shí)施方式之一中，ECD-ICD融合蛋白包括(i)人ECD-人ICD融合蛋白，例如圖9(SEQ ID NO3)的人ECD與圖7(SEQID NO1)氨基酸序列(包括Lys676-Val1255)的人ICD直接或通過化學(xué)和/或氨基酸接頭連接而成的融合蛋白，或其變異體；(ii)大鼠ECD-大鼠ICD融合蛋白，例如圖14(SEQ ID NO8)的大鼠ECD與圖8(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列(包括Lys677-Val1256)的大鼠ICD直接或通過化學(xué)和/或氨基酸接頭連接而成的融合蛋白，或其變異體；(iii)人ECD-大鼠ICD融合蛋白，例如圖9(SEQ ID NO3)的人ECD與圖8(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列(包括Lys677-Val1256)的大鼠ICD直接或通過化學(xué)和/或氨基酸接頭連接而成的融合蛋白，或其變異體；(iv)大鼠ECD-人ICD融合蛋白，例如圖14(SEQ ID NO8)的大鼠ECD與圖7(SEQ ID NO1)所示氨基酸序列(包括Lys676-Val1255)的人ICD直接或通過化學(xué)和/或氨基酸接頭連接而成的融合蛋白，或其變異體。
本發(fā)明ECD-ICD融合蛋白的各種變異體都屬于本發(fā)明的實(shí)施方式。實(shí)施方式之一中，這樣的變異體與天然HER-2/neu ECD-ICD蛋白基本相同或基本相似，并保留了激發(fā)免疫應(yīng)答的能力。編碼ECD蛋白質(zhì)的人DNA序列可參見圖15(SEQID NO9)，包括核苷酸1-1959。編碼ICD蛋白的人DNA序列可參見圖15(SEQ IDNO9)，包括核苷酸2026-3765。不難測定各種序列修飾對于HER-2/neu ECD-ICD蛋白質(zhì)引起免疫應(yīng)答能力的影響，例如，可通過采用本文所述的方法分析突變HER-2/neu ECD-ICD蛋白質(zhì)誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的能力，或通過分析突變HER-2/neuECD-ICD蛋白質(zhì)產(chǎn)生抗體的能力。
本發(fā)明ECD-PD融合蛋白(包括變異體)包括人和非人源多肽所有可能的組合。非人多肽包括來自各種動物的多肽，例如大鼠，小鼠，豚鼠，馬，牛，豬，羊，狗等。實(shí)施方式之一中，ECD-PD融合蛋白包括(i)人ECD-人PD融合蛋白，如圖12(SEQ ID NO6)所示或其變異體，例如圖9(SEQ ID NO3)的人ECD與圖10(SEQ ID NO4)所示的人PD直接或通過化學(xué)和/或氨基酸接頭連接而成的融合蛋白，或其變異體；(ii)大鼠ECD-大鼠PD融合蛋白，例如圖14(SEQ ID NO8)的大鼠ECD與包括圖8(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列Gln 991-Val1256的大鼠PD直接或通過化學(xué)和/或氨基酸接頭連接而成的融合蛋白，或其變異體；(iii)人ECD-大鼠PD融合蛋白，例如圖9(SEQ ID NO3)的人ECD與圖8(SEQID NO2)所示氨基酸序列(包括Gln 991-Val1256)的大鼠PD直接或通過化學(xué)和/或氨基酸接頭連接而成的融合蛋白，或其變異體；(iv)大鼠ECD-人PD融合蛋白，例如圖14(SEQ ID NO8)的大鼠ECD與圖10(SEQ ID NO4)所示的人PD直接或通過化學(xué)和/或氨基酸接頭連接而成的融合蛋白，或其變異體。
本發(fā)明ECD-PD融合蛋白的各種變異體都屬于本發(fā)明的實(shí)施方式。實(shí)施方式之一中，這樣的變異體與天然HER-2/neu ECD-PD蛋白基本相同或基本相似，并保留了激發(fā)免疫應(yīng)答的能力。編碼ECD蛋白質(zhì)的人DNA序列可參見圖15(SEQ IDNO9)，包括核苷酸1-1959。編碼PD蛋白的人DNA序列可參見圖15(SEQ IDNO9)，包括核苷酸2986-3765。不難測定各種序列修飾對于HER-2/neu ECD-PD蛋白質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力的影響，例如，可通過采用本文所述的方法分析突變HER-2/neu ECD-PD蛋白質(zhì)誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的能力，或通過分析突變HER-2/neuECD-PD蛋白質(zhì)產(chǎn)生抗體的能力。
另一實(shí)施方式中，本發(fā)明ECD-PD融合蛋白是ECD-ΔPD融合蛋白(包括變異體)包括人和非人源多肽所有可能的組合。非人多肽包括來自各種動物的多肽，例如大鼠，小鼠，豚鼠，馬，牛，豬，羊，狗等。實(shí)施方式之一中，ECD-PD融合蛋白包括(i)人ECD-人ΔPD融合蛋白，如圖13(SEQ ID NO7)所示或其變異體，例如圖9(SEQ ID NO3)的人ECD與圖11(SEQ ID NO5)所示的人ΔPD直接或通過化學(xué)和/或氨基酸接頭連接而成的融合蛋白，或其變異體；(ii)大鼠ECD-大鼠ΔPD融合蛋白，例如圖14(SEQ ID NO8)的大鼠ECD與包括圖8(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列Gln991-Arg1049的大鼠PD直接或通過化學(xué)和/或氨基酸接頭連接而成的融合蛋白，或其變異體；(iii)人ECD-大鼠ΔPD融合蛋白，例如圖9(SEQ ID NO3)的人ECD與圖8(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列(包括Gln991-Arg1049)的大鼠ΔPD直接或通過化學(xué)和/或氨基酸接頭連接而成的融合蛋白，或其變異體；(iv)大鼠ECD-人ΔPD融合蛋白，例如圖14(SEQ ID NO8)的大鼠ECD與圖11(SEQ ID NO5)所示的人ΔPD直接或通過化學(xué)和/或氨基酸接頭連接而成的融合蛋白，或其變異體。
本發(fā)明ECD-ΔPD融合蛋白的各種變異體都屬于本發(fā)明的實(shí)施方式。實(shí)施方式之一中，這樣的變異體與天然HER-2/neu ECD-ΔPD蛋白基本相同或基本相似，并保留了激發(fā)免疫應(yīng)答的能力。編碼ECD蛋白質(zhì)的人DNA序列可參見圖15(SEQID NO9)，包括核苷酸1-1959。編碼ΔPD蛋白的人DNA序列可參見圖15(SEQ IDNO9)，包括核苷酸2968-3144。不難測定各種序列修飾對于HER-2/neu ECD-ΔPD蛋白質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力的影響，例如，可通過采用本文所述的方法分析突變HER-2/neu ECD-ΔPD蛋白質(zhì)誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的能力，或通過分析突變HER-2/neuECD-ΔPD蛋白質(zhì)產(chǎn)生抗體的能力。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的HER-2/neu ECD-PD融合蛋白是ECD-ΔPD蛋白。
在某
具體實(shí)施例方式
中，本發(fā)明的融合蛋白包含某種融合伴侶，例如免疫融合伴侶或表達(dá)增強(qiáng)者。例如，融合伴侶可協(xié)助提供T輔助細(xì)胞表位(免疫融合伴侶)，最好是人可識別的T輔助細(xì)胞表位，或者協(xié)助以高于重組融合蛋白的得率表達(dá)融合蛋白(表達(dá)增強(qiáng)者)。某些優(yōu)選的融合伴侶既是免疫融合伴侶，又是表達(dá)增強(qiáng)伴侶。也可選擇其它融合伴侶來提高融合蛋白的溶解度，或使得融合蛋白針對于特定的胞內(nèi)區(qū)室。還可以選擇具有親和尾的融合伴侶，用來協(xié)助融合蛋白的純化。
本發(fā)明還提供了包含本文所述融合多肽與一種不相關(guān)免疫原性蛋白共同構(gòu)成的融合蛋白。較好的是，所述的免疫原性蛋白能夠激發(fā)回憶反應(yīng)。此類蛋白質(zhì)包括破傷風(fēng)蛋白，結(jié)核蛋白和肝炎蛋白(參見Stoute等(1997)，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，33686-91)。
其它實(shí)施方式中，由蛋白質(zhì)D，一種革蘭氏陰性流感嗜血桿菌B(WO91/18926)的表面蛋白獲得了一種免疫融合伴侶。較好的是，蛋白質(zhì)D衍生物約包含該蛋白質(zhì)的前三分之一(例如，N末端的前100-110個(gè)氨基酸)，而且，蛋白質(zhì)D衍生物可以脂化。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在N末端連接脂蛋白D融合伴侶的前109個(gè)殘基，為融合蛋白增加例外的外源性T細(xì)胞表位，并提高其在大腸桿菌中的表達(dá)水平(因此作為表達(dá)增強(qiáng)者)。脂質(zhì)尾可優(yōu)化融合蛋白向抗原呈遞細(xì)胞的呈遞。其它融合伴侶包括流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1(血凝素)。通常采用N末端前81個(gè)氨基酸，但也可以使用包含T輔助細(xì)胞表位的其它片段。
在另一實(shí)施方式中，免疫融合伴侶是LYTA蛋白或其部分(以C末端部分為佳)。LYTA來自可合成N-乙?；?L-丙氨酸酰胺酶(又稱LYTA酰胺酶)(由LytA基因編碼)的肺炎鏈球菌(參見，基因43265-292，1986)。LYTA是一種自溶酶，特異性降解肽聚糖骨架中的某些鍵。LYTA的C末端區(qū)負(fù)責(zé)與膽堿或DEAE等膽堿類似物的親和力。這一特性已被用來開發(fā)用于表達(dá)融合蛋白的大腸桿菌C-LYTA表達(dá)質(zhì)粒(參見，生物技術(shù)10795-798，1992)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，可在融合蛋白內(nèi)加入一LYTA重復(fù)段。該重復(fù)段被發(fā)現(xiàn)位于C末端，從第178位殘基開始。一段特別好的重復(fù)段包含殘基188-305。
在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的融合蛋白還包含一個(gè)融合伴侶。優(yōu)選的融合伴侶包括但不限于Ra12或LeIF。特別是，本發(fā)明提供了用Ra12或LeIF序列作為融合伴侶提高重組融合多肽穩(wěn)定性和表達(dá)量，或者突破耐受性的材料和方法。
Ra12是結(jié)核分支桿菌MTB32A編碼序列的一段C末端14kD片段，它能夠高水平的自身表達(dá)，并在純化過程中保持可溶形式。LeIF是與真核核糖體蛋白質(zhì)eIF類似的利什曼原蟲抗原，它能夠激發(fā)Th1和/或CTL免疫應(yīng)答(參見，例如美國專利5,876,966，5,876,735，5,879,687)。本發(fā)明利用Ra12和LeIF多肽的這些特性提供了為了穩(wěn)定而高水平表達(dá)除HER-2/neu融合多肽之外還含Ra12和LeIF多肽的融合多肽的重組核酸分子，表達(dá)載體，宿主細(xì)胞和方法。編碼含Ra12和LeIF多肽的融合多肽的和有意義融合多肽的重組核酸分子可通過傳統(tǒng)基因工程技術(shù)來構(gòu)建。最好，構(gòu)建成的重組核酸分子中，融合伴侶聚核苷酸位于選定融合蛋白序列的5＇端?；蛘撸部蓪⑷诤习閭H聚核苷酸序列置于有意義融合蛋白聚核苷酸序列的3＇端，或者將融合蛋白的聚核苷酸插入融合伴侶聚核苷酸序列內(nèi)的某一位點(diǎn)。此外，本文所述的各種編碼融合伴侶或其部分或其變異體的合適的聚核苷酸都可用來構(gòu)建本發(fā)明的重組融合核酸。
本發(fā)明編碼融合伴侶多肽的核酸可以用各種本領(lǐng)域已知的方法來制備。這些方法例如合適序列的克隆和限制性酶切，或者用Narang等(1979)酶學(xué)方法6890-99所述的磷酸三酯法，Brown等(1979)酶學(xué)方法68109-151所述的磷酸二酯法；Beaucage等(1981)Tetra Lett.，221859-1862所述的二乙基亞磷酰胺法和美國專利4,458,066所述的固相支持法直接化學(xué)合成。
編碼包含融合伴侶多肽和選定融合蛋白的融合多肽的重組核酸可用各種本領(lǐng)域的已知方法來制備。如前所述，構(gòu)建而成的核酸分子中，融合伴侶聚核苷酸宜位于編碼有意義融合蛋白的聚核苷酸序列的5＇端。還可以對融合伴侶和融合蛋白聚核苷酸序列進(jìn)行修飾，促進(jìn)其融合和表達(dá)。
重組核酸分子還可以包含其它核苷酸序列，例如有助于純化的親和性尾的編碼序列。
D.本發(fā)明融合蛋白的變異體CD4+T細(xì)胞一般識別位于腫瘤細(xì)胞外的抗原。相反，在一般情況下，只有位于胞質(zhì)溶膠中并由靶分子自己合成的蛋白質(zhì)才會與I類MHC的結(jié)合，細(xì)胞外的蛋白質(zhì)不在此列。這種情況的例外是外源多肽與高濃度的位于胞外的一類特定I類結(jié)合基序結(jié)合。因此，CD4+和CD8+T細(xì)胞在功能上存在很大差異，各自識別不同的抗原，反映抗原通常所在的位置不同。
另一種進(jìn)行氨基酸取代來產(chǎn)生本發(fā)明變異體的方法是鑒定并替換T細(xì)胞基序中可能結(jié)合II類MHC分子(對CD4+T細(xì)胞應(yīng)答)或I類MHC分子(對CD8+T細(xì)胞應(yīng)答)的氨基酸。具有理論上可能結(jié)合II類分子的基序的(HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白的)肽節(jié)段可通過計(jì)算機(jī)分析來鑒定。例如，可用蛋白質(zhì)序列分析軟件包“T位點(diǎn)”，其中有數(shù)個(gè)設(shè)計(jì)用來鑒別可能性T細(xì)胞識別位點(diǎn)的計(jì)算機(jī)程序(Feller等(1991)，自然，349720-721)?？捎脙煞N檢索程序(1)Margalit所述的AMPHI程序(Feller等(1991)，自然，349720-721；Margalit等(1987)，免疫學(xué)雜志，1382213-2229)根據(jù)α螺旋周期和兩親性來鑒定表位基序；(2)Rothbard和Taylor程序根據(jù)電荷和極性來鑒定表位基序(Rotherbard等(1988)EMBO，793-100)。兼具兩種基序的節(jié)段最適合與II類MHC分子的結(jié)合。CD8+T細(xì)胞可識別與I類MHC分子結(jié)合的肽。Parker等(1994)免疫學(xué)雜志152163已認(rèn)定，結(jié)合特定MHC分子的肽具有共同的可識別的基序。通過對取自一種培養(yǎng)細(xì)胞系的HLA-A2.1分子的肽Edman降解，鑒定了一段結(jié)合HLA-A2.1槽區(qū)的肽基序(表2，摘自Falk等(1991)，自然，351290-296)。根據(jù)該方法的鑒定，HLA-A2.1結(jié)合性肽一般長9個(gè)氨基酸，優(yōu)勢錨殘基位于2位(L)和9位(V)。常見的強(qiáng)結(jié)合性殘基是2(M)，4(E，K)，6(V)和8(K)。鑒定到的該基序代表了許多結(jié)合肽的普遍基序。
表2HLA-A2.1限制性基序

目前鑒定的衍生肽基序并不特別嚴(yán)謹(jǐn)。有些HLA-A2.1結(jié)合性肽不兼具兩個(gè)優(yōu)勢錨殘基，而且優(yōu)勢錨殘基兩側(cè)的氨基酸對結(jié)合或不結(jié)合起著重要作用。并非所有具有所述基序的肽都能結(jié)合，有些沒有該基序的肽也能結(jié)合。然而，所述基序足可鑒定出能夠結(jié)合的肽。需要指出的是，所有MHC和各自的基序在2位和9位的兩個(gè)優(yōu)勢錨氨基酸之間有6個(gè)氨基酸。
在鑒定了HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白內(nèi)的肽基序后，就可進(jìn)行保守性或非保守性的氨基酸取代。后一種取代是為了產(chǎn)生更有效和/或交叉反應(yīng)性更廣泛的ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白或多肽。更有效蛋白質(zhì)或肽的一個(gè)例子是它能夠以更高的親和力與天然蛋白質(zhì)或多肽的同樣的MHC分子結(jié)合，但不影響T細(xì)胞對天然蛋白質(zhì)或多肽的特異性識別。交叉反應(yīng)性更廣泛的多肽的一個(gè)實(shí)例是它能夠比天然多肽誘導(dǎo)更廣泛的免疫交叉反應(yīng)(即結(jié)合更多種的MHC分子)。同理，位于肽的基序之間并具有間隔功能的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如與MHC分子或T細(xì)胞受體不反應(yīng))可以被保守性或非保守性取代。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，可用多種試驗(yàn)來測定含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的多肽是利于或不利的免疫應(yīng)答，從而鑒定其激發(fā)T細(xì)胞識別的能力。
本發(fā)明所述的變異體還可以包含其它修飾，包括氨基酸缺失或增加，如前所述，這些修飾對于所需的多肽的免疫特性的影響必須最小。知道，可以使用HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白非天然延伸形式或截短形式，只要所需的免疫特性與全長天然HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白基本相當(dāng)。為了避免在復(fù)性時(shí)形成不正確的分子間二硫鍵，可將半胱氨酸殘基去除或取代。其它誘變方法包括修飾相鄰堿性氨基酸殘基以增強(qiáng)其在酵母系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)，該系統(tǒng)中存在KEX2蛋白酶活性。本發(fā)明融合蛋白的制備A.編碼融合蛋白的聚核苷酸本發(fā)明涉及分離或純化的聚核苷酸，它編碼HER-2/neu融合蛋白。根據(jù)本發(fā)明，任何編碼融合蛋白氨基酸序列的核苷酸都可用來產(chǎn)生重組分子，指導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。
為了克隆全長編碼序列或類似變異體以產(chǎn)生HER-2/neu融合聚核苷酸，可用標(biāo)記DNA探針(根據(jù)HER-2/neu核酸或其互補(bǔ)序列的任一部分設(shè)計(jì)而成)篩選基因組或cDNA庫，鑒定出融合蛋白各組分的編碼序列。HER-2/neu核苷酸可以是任意合適的哺乳動物的，例如大鼠，小鼠，馬，牛，豬，羊，狗等。
實(shí)施方式之一中，HER-2/neu序列是人、大鼠或小鼠的序列。小鼠HER-2/neu序列可參見圖19(SEQ ID NO11)。可由小鼠的腦RNA擴(kuò)增得到小鼠HER-2/neu，所用的引物是5＇引物CCTAGGAGCTGGCGGCCTGGTGCCGTTG(SEQ IDNO12)和3＇引物GGCCTTCTGGTTCATACTGGCACATCCAGGC(SEQ IDNO13)。小鼠HER-2/neu氨基酸序列參見圖20(SEQ ID NO14)。小鼠HER-2/neu氨基酸序列的一種變異可參見Nagata等，免疫學(xué)雜志，1591336-1343(1997)。
可在合適的表達(dá)文庫中篩選表達(dá)全長HER-2/neu蛋白質(zhì)的克隆來分離這樣的克隆。文庫的建立和篩選可按照本領(lǐng)域的常用方法進(jìn)行，例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring HarborNY(1989)。簡而言之，將噬菌體表達(dá)庫接種在平板上，然后轉(zhuǎn)移到濾膜上。將濾膜與檢測劑共培養(yǎng)。本發(fā)明中，“檢測劑”即各種能與HER-2/neu蛋白結(jié)合，然后可用各種已知方法測定的化合物。典型的檢測劑具有與報(bào)道基團(tuán)偶聯(lián)的“結(jié)合劑”，例如A蛋白，G蛋白，IgG或凝集素。優(yōu)選的報(bào)道基團(tuán)包括酶，底物，輔因子，抑制劑，染料，放射性核素，發(fā)光基團(tuán)，熒光基團(tuán)和生物素。更好的報(bào)道基團(tuán)是辣根過氧化物酶，它可通過與底物，例如四甲基聯(lián)苯胺或2，2＇-偶氮-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸共培養(yǎng)來檢測。用已知技術(shù)分離出含表達(dá)HER-2/neu蛋白質(zhì)的基因組或cDNA序列的噬菌斑，并純化。合適的方法可參見Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring HarborNY(1989)。
也可以用兩段簡并性寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來分離編碼序列，所述引物的設(shè)計(jì)以本發(fā)明所述的編碼序列為基礎(chǔ)。也可以用其它已知的擴(kuò)增方法來克隆所需的核酸?？捎玫捏w外擴(kuò)增方法包括PCR，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，Qβ-復(fù)制酶擴(kuò)增及其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)，可參見Sambrook和Ausubel所述，以及美國專利4,683,202；PCR方法方法及應(yīng)用指南(Innis等編輯，1990)；Amheim&Levinson C&EN pp.36-47(1990年10月1日)；NIH研究雜志381-94(1991)；Kwoh等(1989)美國科學(xué)院院報(bào)861173；Guatelli等(1990)美國科學(xué)院院報(bào)871874；Lomell等(1989)臨床化學(xué)雜志351826；Landegren等(1988)科學(xué)2411077-1080；Van Brunt(1990)生物技術(shù)8291-294；Wu等(1989)基因4560；以及，Barringer等(1990)基因89117?？寺◇w外擴(kuò)增的核酸的改良方法參見Wallace等的美國專利5,426,039。適合用于擴(kuò)增本發(fā)明核酸的引物可根據(jù)本文所述的序列來設(shè)計(jì)。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的聚核苷酸編碼融合蛋白、其片段、或其功能相當(dāng)物，可用它來產(chǎn)生重組核酸分子，從而在合適宿主細(xì)胞內(nèi)引起融合蛋白、其片段、或其功能相當(dāng)物的表達(dá)?？赏ㄟ^對編碼序列的分子操作來改變聚核苷酸編碼的融合多肽產(chǎn)物。
由于密碼子固有的簡并性，也可用編碼級別相同或功能相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄械钠渌麯NA序列來實(shí)施本發(fā)明，以表達(dá)該融合多肽。這樣的DNA序列包括，能夠在中低或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與后文所述編碼序列或其互補(bǔ)序列雜交的那些。
可用于本發(fā)明的改變后的核苷酸序列含有不同核苷酸殘基的缺失、增加和取代，于是得到一段編碼相同或功能相當(dāng)基因產(chǎn)物的序列。該基因產(chǎn)物本身可以含有氨基酸殘基的缺失、增加或取代，引起沉默突變，從而得到功能相當(dāng)?shù)目乖员砦??？梢愿鶕?jù)有關(guān)殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、和/或兩親性特征的相似性來制造此類保守性氨基酸取代。例如，負(fù)電荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；正電荷氨基酸包括賴氨酸，組氨酸和精氨酸；具有無電荷極性頭部，且疏水性近似的氨基酸包括甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸；具有非極性頭部的氨基酸包括丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸和色氨酸。
為了不同的目的可通過基因工程改造本發(fā)明的核苷酸序列，從而改變?nèi)诤系鞍椎木幋a序列，所述的目的包括但不限于改善基因產(chǎn)物的加工和表達(dá)。例如，可用已知技術(shù)(例如引入或去除限制酶位點(diǎn))引入突變，從而改變糖基化方式，磷酸化作用，創(chuàng)建和/或破壞翻譯、啟動、和/或終止序列，或在編碼區(qū)內(nèi)制造變異，從而促進(jìn)此后的體外修飾。本領(lǐng)域有許多可在給定核酸構(gòu)建物內(nèi)進(jìn)行改變的方法。此類方法包括，例如，定點(diǎn)誘變，用簡并寡核苷酸進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，含核酸的細(xì)胞與誘變劑接觸或接受輻照，化學(xué)合成所需的寡核苷酸(例如，結(jié)合連接反應(yīng)和/或克隆，形成大核酸分子)，以及其它眾所周知的技術(shù)(參見Giliman等(1979)，基因881-97，Hutchinson等(1978)生物化學(xué)雜志2536551；Roberts等(1987)自然328731-734)。較好的是，所述的操作不破壞融合多肽的免疫原性。
本發(fā)明實(shí)施方式之一中，可用本領(lǐng)域熟知的方法全部或部分合成融合蛋白的編碼序列(參見，Caruthers等(1980)，核酸研究7215-233；Gre等(1980)核酸研究9(10)2331；Matteucci等(1980)，Tetrahedron Letter21719(1980)；和Chow等(1981)核酸研究9(12)2807-2817。
B.多肽的合成或者，可用化學(xué)合成完整或部分氨基酸序列的方法合成融合多肽本身。例如，可用固相技術(shù)合成肽，例如Merrifield固相合成法，其中，將氨基酸依次加到延伸鏈上(參見Merrifield(1963)美國化學(xué)協(xié)會雜志852149-2146)。已可購買到自動多肽合成設(shè)備，例如Perkin Elmer Biosystems，Inc.(Foster City，CA)的產(chǎn)品，一般按照制造者的說明進(jìn)行操作。然后可從樹脂上切下合成的肽，通過例如制備性高效液相層析進(jìn)行純化(參見，Greighton，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理，50-60(198))。合成融合多肽的組成可通過氨基酸分析或測序來檢驗(yàn)(例如，Edman降解法；參見Greighton，蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)和分子原理，pp.34-49(1983))。
此外，可在序列內(nèi)引入非經(jīng)典氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物作取代或增加。非經(jīng)典氨基酸包括但不限于，普通氨基酸的D異構(gòu)型，α-氨基異丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，γ-Abu，ε-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基異丁酸，3-氨基丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥基脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，半胱磺酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟氨基酸，β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸，Nα-甲基氨基酸等，以及其它氨基酸類似物。此外，氨基酸可以是D型(右旋)也可以是L型(左旋)。
C.連接基團(tuán)實(shí)施方式之一中，融合蛋白的多肽，例如ECD與ICD，或ECD與PD，通過連接基團(tuán)連接。連接基團(tuán)可以是化學(xué)交聯(lián)劑，包括例如琥珀酰亞氨基-(N-馬來酰亞氨基甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)。連接基團(tuán)還可以是附加的氨基酸序列，包括例如聚甘氨酸連接基團(tuán)。
在一種特殊的實(shí)施方式中，融合蛋白中各多肽的編碼序列可以按照任意順序，通過肽鍵直接在氨基或羧基末端相連。
也可以用一段氨基酸接頭序列將第一和第二多肽組分隔開足夠的距離，從而確保各自能夠折疊成各自的二級和三級結(jié)構(gòu)?？捎帽绢I(lǐng)域已熟知的方法將此類氨基酸接頭序列加入該融合蛋白?？筛鶕?jù)以下因素選擇合適的肽接頭序列(1)能夠形成柔性延展構(gòu)型；(2)其二級結(jié)構(gòu)不會與第一和第二多肽上的功能性表位相互作用；(3)沒有可能與多肽功能性表位相互作用的疏水性或帶電殘基。優(yōu)選的肽接頭序列含有Gly，Asn和Ser殘基。接頭序列中也可采用其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala?？捎米鹘宇^的氨基酸序列可參見，Maratea等(1986)基因4039-46；Murphy等(1986)美國科學(xué)院院報(bào)838258-8262；美國專利4,935,233和4,751,180。接頭序列一般長約1-50氨基酸。當(dāng)?shù)谝缓偷诙嚯木哂蟹潜仨歂末端氨基酸區(qū)時(shí)可以不用接頭序列，因?yàn)樵搮^(qū)可將功能性區(qū)域間隔開來，避免立體干擾。
其它化學(xué)接頭包括糖類接頭，脂類接頭，脂肪酸接頭，聚醚接頭，例如PEC等(參見，Hermanson，生物偶聯(lián)技術(shù)(1996))。
D.其它多肽如上所述，融合蛋白可以與一段或多段其它多肽連接。例如，融合多肽可以與該融合蛋白的一種或兩種多肽的一份或多份拷貝相連?；蛘撸蓪⑷诤系鞍着c一段異源多肽(例如前述Ra12或LeIF)相連。還可將該融合多肽與一段親和尾融合，從而簡便表達(dá)后的純化。例如，由此尾編碼的多組氨酸可允許用金屬螯合物親和層析法來純化融合多肽。其它親和尾分子的例子包括例如，Strep-尾，PinPoint，麥芽糖結(jié)合蛋白，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶等(參見，Glick&Pasternak，分子生物技術(shù)原理和重組DNA的應(yīng)用(第2版，1999))。
實(shí)施方式之一中，融合多肽還可以與一脂類部分相連，例如分枝菌酸，lipoaribdomanin(LAMs)或海藻糖衍生物。
如前所述，實(shí)施方式之一中，這樣的融合蛋白是通過編碼該融合蛋白的核酸分子重組表達(dá)產(chǎn)生的?？捎靡阎椒?，將編碼所需氨基酸序列的核酸序列彼此連接，置于正確的讀碼框內(nèi)，表達(dá)該產(chǎn)物，由此得到融合產(chǎn)物?；蛘?，可通過蛋白質(zhì)合成來制造這樣的產(chǎn)物，例如，用肽合成儀。還可以在該融合聚核苷酸中加入例如細(xì)胞因子或佐劑等其它分子的編碼序列。
E.序列的修飾可如下鑒定保留了激發(fā)免疫應(yīng)答能力的本發(fā)明融合蛋白的變異體按以上所述一項(xiàng)或多項(xiàng)內(nèi)容修飾該序列，然后測定所得融合蛋白激發(fā)免疫應(yīng)答(例如T細(xì)胞應(yīng)答或抗體應(yīng)答)的能力。例如，一般可如下進(jìn)行所述的試驗(yàn)將T細(xì)胞與修飾后的融合蛋白接觸，并分析應(yīng)答反應(yīng)。還可以分離構(gòu)成融合蛋白的各多肽的天然變異體例如，用編碼各多肽或其變異體的DNA序列篩選合適的cDNA或基因組庫。
引入上述序列修飾可采用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)或通過修飾融合蛋白的自動合成。例如，將突變引入特定基因座可通過合成一段含突變序列的寡核苷酸，其兩側(cè)為能將該區(qū)連入天然序列的限制酶位點(diǎn)。連接后，所得的構(gòu)建序列就編碼一個(gè)具有所需氨基酸插入、取代或缺失的類似物。
或者，還可用寡核苷酸指導(dǎo)的定點(diǎn)誘變來產(chǎn)生特定密碼子被取代、缺失或插入的基因。產(chǎn)生以上改變的方法可參見Walder等(1986)基因42133；Bauer等(1985)基因3773；Graik(1985)生物技術(shù)，一月12-19；Smith等，基因工程原理和方法，Plenum Press(1981)；和美國專利4,518,584和4,737,462。
當(dāng)然，為表達(dá)HER-2/neu蛋白質(zhì)而構(gòu)建的核苷酸序列內(nèi)的突變必須保持編碼序列的讀碼框，而且，不宜形成可雜交形成mRNA二級結(jié)構(gòu)(例如環(huán)區(qū)或發(fā)卡區(qū))的互補(bǔ)區(qū)，這些二級結(jié)構(gòu)會阻礙mRNA的翻譯。雖然突變的位點(diǎn)可以預(yù)定，但上述突變的性質(zhì)卻不一定能預(yù)計(jì)。例如，為了挑選一個(gè)給定位點(diǎn)上具有最佳特性的突變，可以對目標(biāo)密碼子進(jìn)行隨機(jī)誘變，對表達(dá)的突變HER-2/neu融合蛋白篩選所需活性。并非所有編碼HER-2/neu融合蛋白的核苷酸序列內(nèi)的突變都會表達(dá)在最終產(chǎn)物中。例如，可用核苷酸取代來增強(qiáng)表達(dá)，主要是避免轉(zhuǎn)錄mRNA內(nèi)二級環(huán)結(jié)構(gòu)的形成(參見，歐洲專利申請75,444A)，或者用來提供更可能被選定宿主翻譯的密碼子，例如用于大腸桿菌表達(dá)的常用大腸桿菌偏愛密碼子。
F.表達(dá)載體本發(fā)明HER-2/neu融合蛋白，其變異體宜通過重組DNA方法來產(chǎn)生。這樣的方法包括將編碼HER-2/neu融合蛋白的DNA序列插入重組表達(dá)載體，然后在有利表達(dá)的條件下，在重組的細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞，真菌或昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)該DNA序列，而且，最好分泌該融合蛋白。本發(fā)明編碼HER-2/neu融合蛋白的DNA序列可用cDNA片段與短寡核苷酸接頭拼接而成，或由一系列寡核苷酸拼接而成，從而得到能夠插入重組表達(dá)載體，并以一個(gè)重組轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)的合成基因。
重組表達(dá)載體中，編碼HER-2/neu融合蛋白的DNA序列與來自哺乳動物、真菌、細(xì)菌、病毒或昆蟲基因的合適轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件操作性連接。所述的調(diào)控元件包括轉(zhuǎn)錄啟動子，任選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱序列，編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列，和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。還可以含有復(fù)制起點(diǎn)和協(xié)助轉(zhuǎn)化子鑒別的選擇標(biāo)記。
當(dāng)DNA區(qū)域彼此功能性相關(guān)時(shí)，需將它們操作性連接。例如，如果需要表達(dá)參與多肽分泌的前導(dǎo)肽，則可將信號肽(分泌前導(dǎo)序列)的DNA與多肽的DNA操作性相連；如果一個(gè)啟動子可控制序列的轉(zhuǎn)錄，則可將其與編碼區(qū)操作性相連；如果一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)可促進(jìn)翻譯，則可將其與編碼序列操作性相連。“操作性相連”一般表示毗鄰相連，對分泌性前導(dǎo)序列而言還必需在讀碼框內(nèi)相連。用于微生物內(nèi)表達(dá)的編碼HER-2/neu融合蛋白的DNA序列最好不含內(nèi)含子，內(nèi)含子會提前終止DNA向mRNA的轉(zhuǎn)錄。
用于細(xì)菌的表達(dá)載體可含有市售質(zhì)粒的選擇標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，所述的市售質(zhì)粒含有熟知的克隆載體pBR322(ATCC37017)中的各種遺傳元件。這些市售質(zhì)粒例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，pGEM 1(PromegaBiotec，Madison，WI)，pET28b(Novagen)和pPDM(pET28b的修飾型，Corixa)。將這些pBR322“骨架”的組件與合適的啟動子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列組合。pBR322是一種來自大腸桿菌的質(zhì)粒(Bolivar等(1977)基因295)，常用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌。pBR322具有氨芐青霉素和鏈霉素抗性，因此可方便地鑒定出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。重組微生物表達(dá)載體的常用啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等(1978)，自然275615；和Goeddel等(1979)自然281544；色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddle等1980，核酸研究84057)和歐洲專利申請36,776)和tac啟動子(Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，Cold Spring Harbor laboratory，p.142(1982))。一種特別有用的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)采用噬菌體λPL啟動子和cI857ts熱敏阻抑蛋白?？上蛎绹湫团囵B(yǎng)物保藏中心獲取的含λPL啟動子的質(zhì)粒載體包括大腸桿菌JMB9(ATCC37092)內(nèi)的pHUB2，和大腸桿菌RR1(ATCC53082)內(nèi)的pPLc28。
適合酵母載體的合適啟動子包括醇氧化酶、金屬硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶的啟動子(Hitzeman等(1980)，生物化學(xué)雜志2552073)或其它糖酵解酶(Hess等(1968)，J.Adv.Enzyme Reg.7149；和Holland等(1978)生物化學(xué)，174900)，例如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，果糖磷酸激酶，葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸異構(gòu)酶，葡萄糖磷酸異構(gòu)酶和葡糖激酶。有關(guān)酵母表達(dá)的合適載體和啟動子可參見歐洲專利申請73,657。
可將用于在大腸桿菌內(nèi)選擇和復(fù)制的pBR322的DNA序列(Ampr基因和復(fù)制起點(diǎn))與包含葡萄糖可抑制性ADH2啟動子和α-因子分泌前導(dǎo)序列的酵母DNA序列組裝成適用的酵母載體。有關(guān)ADH2啟動子可參見Russel等(1982)，生物化學(xué)雜志2582674和Beier等(1982)自然300724。酵母α-因子前導(dǎo)序列引起異源蛋白質(zhì)的分泌，可將其插入啟動子與需表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因之間(參見Kurjan等(1982)，細(xì)胞30933；和Bitter等(1984)美國科學(xué)院院報(bào)815330)?？蓪υ撉皩?dǎo)序列進(jìn)行修飾，從而在3＇端包含一個(gè)或多個(gè)有用的限制酶位點(diǎn)，從而利于該前導(dǎo)序列與異源基因的融合。
可在表達(dá)載體中使用病毒來源的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列來轉(zhuǎn)化脊椎動物細(xì)胞。例如，常用的是多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40(SV40)和人巨細(xì)胞病毒的啟動子和增強(qiáng)子?？捎肧V40病毒基因組的DNA序列，例如SV40復(fù)制起點(diǎn)，早期和晚期啟動子，增強(qiáng)子，剪接和聚腺苷酸化位點(diǎn)提供表達(dá)異源DNA序列所需的其它遺傳元件。特別有用的是早期和晚期啟動子，因?yàn)?，兩者都很容易從病毒中得到，其形式為另含SV40復(fù)制起點(diǎn)的片段(Fiers等(1978)自然273113)。也可以使用更大或更小的SV40片段，只要含有病毒復(fù)制起點(diǎn)中從Hind III到BglII之間的約250bp序列。此外，凡與所選的宿主細(xì)胞相容的病毒基因組啟動子，調(diào)控和/或信號序列均可使用?？砂凑誒kayama等(1983)分子細(xì)胞生物學(xué)3280所述構(gòu)建此類載體。
可按照Cosman等(1986)分子免疫學(xué)23935所述，構(gòu)建在C127小鼠乳房上皮細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定高水平表達(dá)哺乳動物受體cDNA的系統(tǒng)。適合表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的一種真核載體是pCD406(McMahan等(1991)，EMBO雜志102821，其中有SV40，人免疫缺陷病毒(HIV)和埃博病毒(EBV)的調(diào)控序列)。載體還包括pDC409和pDC410，它們都來自pDC406。pDC410以編碼SV40大型T抗原的序列取代了pDC406中的EBV復(fù)制起點(diǎn)。pCD409與pDC406的區(qū)別在于缺失多克隆位點(diǎn)外的BglII位點(diǎn)，使得多克隆位點(diǎn)內(nèi)的BglII位點(diǎn)成為唯一。任意其它啟動子，只要能夠在CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒啟動子、Rous肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子或其它已知可用于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)的啟動子調(diào)控下表達(dá)蛋白質(zhì)，均可使用。
除了轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列之外，有些表達(dá)系統(tǒng)還含有證明基因擴(kuò)增的標(biāo)記，例如新霉素、胸腺嘧啶激酶、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶和二氫葉酸還原酶。
可使表達(dá)載體(例如pDC406和pDC409，都含有EBV的復(fù)制起點(diǎn))游離型復(fù)制的細(xì)胞系是CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)。CV-1/EBNA細(xì)胞系是用編碼EBV核抗原-I(EBNA-I)的基因轉(zhuǎn)染CV-1細(xì)胞系而得到的，它可在人CMV立即早期增強(qiáng)子/啟動子驅(qū)動下組成型地表達(dá)EBNA-I。
在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的優(yōu)選載體包括pFLAGCMV-1(Kodak)，pcDNA3.1/hyg(Invitrogen)和pEE14-GS(CellTech)。
G.宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞即如下宿主細(xì)胞它們被重組DNA技術(shù)所構(gòu)建的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，因而含有編碼本發(fā)明HER-2/neu融合蛋白的序列。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可表達(dá)所選的HER-2/neu融合蛋白，但用于克隆或擴(kuò)增HER-2/neu DNA的宿主細(xì)胞不需要表達(dá)HER-2/neu融合蛋白。最好能使表達(dá)的HER-2/neu融合蛋白分泌到培養(yǎng)液或上清液中，這取決于所選的DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，如果HER-2/neu融合蛋白分泌進(jìn)入培養(yǎng)上清液，則它們也是可溶于培養(yǎng)上清液的。
任何熟知的用于將異源核苷酸序列引入宿主細(xì)胞的方法都可用于表達(dá)載體的引入。這些方法包括，使用Superfect(Qiagen)，脂質(zhì)體，磷酸鈣轉(zhuǎn)染等試劑，Polvbrene，原生質(zhì)體融合，電穿孔，顯微注射，質(zhì)粒載體，病毒載體，生物粒子加速(基因槍)，或其它用于將克隆基因組DNA，cDNA，合成DNA或其它異源遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞的方法(參見Sambrook等，同上)。
適合表達(dá)重組蛋白的宿主細(xì)胞包括受合適啟動子調(diào)控的原核細(xì)胞、酵母或高等真核細(xì)胞。原核細(xì)胞包括革蘭氏陰性和陽性微生物，例如大腸桿菌或芽孢桿菌。高等真核細(xì)胞包括后文所述的已建立的昆蟲或哺乳動物細(xì)胞系。也可使用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，用DNA構(gòu)建物的RNA來生產(chǎn)HER-2/neu融合蛋白。適合用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞宿主的克隆和表達(dá)載體如前文所述，例如，參見Pouwels等的“克隆載體實(shí)驗(yàn)室手冊”，Elsevier，NewYork(1985)。
可以用原核表達(dá)宿主來表達(dá)不需要廣泛蛋白酶解和二硫鍵加工的HER-2/neu融合蛋白。原核表達(dá)載體一般含有一個(gè)或一個(gè)以上表型性選擇標(biāo)記，例如編碼抗生素抗性蛋白的基因或滿足某種營養(yǎng)需要的基因，還有一個(gè)可被宿主識別的復(fù)制起點(diǎn)，從而確?？稍谒拗鲀?nèi)擴(kuò)增。適用于轉(zhuǎn)化的原核宿主包括大腸桿菌(例如BL21(DE3)，CodonePlus大腸桿菌)，枯草芽孢桿菌，以及鼠傷寒沙門氏菌和假單胞桿菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各菌種，但也可以使用其它宿主。
還可以在例如P.pastoris的酵母宿主中表達(dá)重組HER-2/neu融合蛋白。也可使用釀酒酵母、裂殖酵母、或克魯維酵母等其它屬的酵母。將待表達(dá)基因與細(xì)菌穿梭質(zhì)粒(例如Invitrogen Co.的pPICZ系列)連接，然后用該載體轉(zhuǎn)化酵母，并經(jīng)染色體整合插入酵母基因組的醇氧化酶(AOX)基因座，則可實(shí)現(xiàn)在畢赤氏酵母中的表達(dá)。然后，用例如Zeocin(Invitrogen)選出重組酵母，在培養(yǎng)液中加入甲醇誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)(參見Higgin等，“畢赤氏酵母法”，分子生物學(xué)方法，第103卷，Humana Press(1988))。適用于蛋白質(zhì)表達(dá)的畢赤氏酵母菌株包括，例如，SMD1168畢赤氏酵母菌種。還可以采用基于其它方法的表達(dá)系統(tǒng)，例如ESP系統(tǒng)(Stratagene)。
合適的酵母轉(zhuǎn)化方法是已知的。例如Hind等，美國科學(xué)院院報(bào)751929(1978)所述，包括，在選擇培養(yǎng)液(0.67％酵母氮基本培養(yǎng)液，0.5％酪蛋白氨基酸，2％葡萄糖，10mg/ml腺嘌呤和20mg/ml尿嘧啶)中選擇Trp+轉(zhuǎn)化子。在營養(yǎng)培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％葡萄糖，80mg/ml腺嘌呤和80mg/ml尿嘧啶)中培養(yǎng)用載體轉(zhuǎn)化的宿主菌種，所述載體含有ADH2啟動子。當(dāng)培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗殆盡則發(fā)生ADH2啟動子抑制。過濾收集粗制酵母上清液，保存于4℃，以備進(jìn)一步純化。
可用各種哺乳動物或昆蟲(例如灰翅夜蛾(Spodoptera)或毛翅夜蛾(Trichoplusia))細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)重組多肽。用桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異源多肽可參見例如Luckow等(1988)生物技術(shù)647。合適的宿主細(xì)胞系包括猴腎細(xì)胞COS-7細(xì)胞系，參見Gluzman(1981)細(xì)胞23175，以及其它能夠表達(dá)合適的載體的細(xì)胞系，例如CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)，L細(xì)胞，C127，3T3，中國倉鼠卵巢(CHO)，COS，NS-1，Hela，人胎腎成纖維細(xì)胞(HEK293)和BHK細(xì)胞系。哺乳動物表達(dá)載體可能含有非轉(zhuǎn)錄元件(例如復(fù)制起點(diǎn)，與待表達(dá)基因相連的合適啟動子和/或增強(qiáng)子，或其它5＇或3＇非轉(zhuǎn)錄序列)，以及5＇或3＇非翻譯序列(例如必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，聚腺苷酸化位點(diǎn)，剪接的提供和接受位點(diǎn)，以及轉(zhuǎn)錄終止序列)。優(yōu)選的哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)之一是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。
H.本發(fā)明融合蛋白的純化培養(yǎng)適合表達(dá)本發(fā)明DNA的重組翻譯產(chǎn)物的宿主/載體系統(tǒng)，然后由培養(yǎng)液或細(xì)胞提取物中提純可制得純化的HER-2/neu融合蛋白。例如，若是向培養(yǎng)液中分泌重組多肽的系統(tǒng)，則可先用市售蛋白質(zhì)濃縮濾膜對該系統(tǒng)的上清液進(jìn)行濃縮，所述濾膜例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元。濃縮后，將濃縮液上樣到合適的純化基質(zhì)上。例如，合適的親和基質(zhì)可以是相對結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(即，HER-2/neu融合蛋白基于結(jié)構(gòu)通過特異性結(jié)合與之作用的蛋白質(zhì))或凝集素或抗體分子結(jié)合于合適的支持物上。
或者，可以使用陰離子交換樹脂，例如，具有二乙基氨基乙基(DEAE)側(cè)鏈的基質(zhì)。該基質(zhì)可以是丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、聚乙烯、瓊脂糖凝膠(Sepharose)或其它蛋白質(zhì)純化中常用的類型。也可采用陽離子交換。合適的陽離子交換劑包括各種含有磺丙基或羧甲基的不溶性基質(zhì)，其中以磺丙基為佳。凝膠過濾層析也是HER-2/neu融合蛋白純化的手段之一。較好的是，通過陰離子交換層析，例如用monoQ柱或Q瓊脂糖凝膠高效層析法來純化本發(fā)明的融合蛋白。
親和力層析是純化HER-2/neu融合蛋白的另一種優(yōu)選方法。例如，可按已知方法，用抗HER-2/neu融合蛋白的單克隆抗體進(jìn)行親和力層析純化。
最后，可通過一步或多步使用疏水性RP-HPLC介質(zhì)(例如具有甲基或其它脂肪族基團(tuán)側(cè)鏈的硅膠)的反相高效液相層析(RP-HPLC)來進(jìn)一步純化HER-2/neu融合蛋白組合物。也可以將上述純化步驟中的某些或全部進(jìn)行各種組合，用來制備勻質(zhì)的重組蛋白或多肽。
對于細(xì)菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組HER-2/neu融合蛋白，可先從細(xì)胞沉淀中進(jìn)行萃取，然后進(jìn)行一步或多步濃縮，鹽析，水性離子交換或大小排阻層析。可用高效液相層析(HPLC)作為最終純化步驟。用于表達(dá)重組HER-2/neu融合蛋白的細(xì)胞可用各種常規(guī)方法來裂解，例如凍融循環(huán)，超聲波處理，機(jī)械破壞，或用細(xì)胞裂解劑。
若用表達(dá)分泌型HER-2/neu融合蛋白的酵母進(jìn)行發(fā)酵，可大大簡化純化過程。可用類似Urdal等(1984)層析雜志296171所述的方法純化大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)生的分泌型重組蛋白質(zhì)。該文獻(xiàn)描述的是在制備級HPLC柱上，通過兩步連續(xù)的反相HPLC，純化重組的人GM-CSF。
在重組培養(yǎng)物中合成的HER-2/neu融合蛋白制品可能含有從培養(yǎng)物中回收HER-2/neu融合蛋白時(shí)的非HER-2/neu細(xì)胞組分(包括蛋白質(zhì))，它們的含量和特征取決于所采用的純化步驟。這些組分一般來自酵母，原核細(xì)胞或非人真核細(xì)胞。這樣的制品一般不含天然狀態(tài)下與HER-2/neu蛋白結(jié)合的其它蛋白質(zhì)。
自動合成是制備本發(fā)明蛋白質(zhì)和多肽的另一種方法。例如，任何市售的固相技術(shù)都可采用，例如，Merrifield固相合成法，該方法將氨基酸依次加到一氨基酸延伸鏈上(參見Merrifield(1963)，美國化學(xué)協(xié)會雜志852149-2146)。自動合成多肽的設(shè)備有市售的，例如AppliedBiosystems Inc.(Foster城，CA)的產(chǎn)品，一般可按照制造商的說明進(jìn)行操作。
總而言之，本文所述的多肽(包括融合蛋白)和聚核苷酸都是分離的?！胺蛛x”的多肽或聚核苷酸表示脫離了其原來的環(huán)境。例如，天然蛋白質(zhì)如果與天然系統(tǒng)中與之共存的其它物質(zhì)相分離，則認(rèn)為其是分離的。較好的是，所述多肽的純度至少90％，更好的是95％，最好至少99％。例如，如果一段聚核苷酸被克隆到一個(gè)載體內(nèi)，而該載體并非其天然環(huán)境的一部分，則認(rèn)為其是分離的。
結(jié)合劑本發(fā)明還提供了一些試劑，例如抗體及其抗原結(jié)合性片段，它們特異性結(jié)合本發(fā)明的HER-2/neu融合蛋白。在此，如果抗體或其抗原結(jié)合性片段以高于背景信號至少2倍的可測知的水平與HER-2/neu融合蛋白反應(yīng)(例如在ELISA中)，而且在類似條件下與非相關(guān)蛋白質(zhì)的反應(yīng)則檢測不到，則認(rèn)為其“特異性結(jié)合”HER-2/neu融合蛋白。在此，“結(jié)合”表示兩分子之間通過非共價(jià)鍵形成復(fù)合物。結(jié)合能力可通過測定形成復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)來確定。結(jié)合常數(shù)即復(fù)合物濃度除以各組分濃度之積所得的數(shù)值。通常，在本文中，當(dāng)形成復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)高于1031/ml時(shí)，則稱兩化合物“結(jié)合”。結(jié)合常數(shù)可用已知方法測定。
采用本發(fā)明的代表性試驗(yàn)，結(jié)合劑也許還能分辨癌癥和非癌癥患者，所述癌癥例如乳房癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌或前列腺癌。換言之，與HER-2/neu融合蛋白結(jié)合的其它抗體或結(jié)合劑可產(chǎn)生某種信號，表明至少20％的患者存在癌癥，或產(chǎn)生一個(gè)陰性信號，表明至少90％的個(gè)體沒有癌癥。為了確定某一結(jié)合劑是否滿足這一要求，可按本文所述分析癌癥和非癌癥患者(由標(biāo)準(zhǔn)臨床檢測確定)的生物樣品(例如血液，血清，血漿，尿液和/或腫瘤活檢)，檢測是否存在與結(jié)合劑相結(jié)合的多肽。顯然，必需對具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義數(shù)量的樣品進(jìn)行分析。各結(jié)合劑都必需符合上述標(biāo)準(zhǔn)；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可以將多種結(jié)合劑組合使用，以提高靈敏度。
能滿足上述要求的試劑都可以是結(jié)合劑。例如，結(jié)合劑可以是含或不含肽的核糖體，RNA或多肽分子。優(yōu)選實(shí)施例之一中，結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合性片段?？捎酶鞣N已知技術(shù)制備抗體，參見Harlow和Lane，“抗體實(shí)驗(yàn)室手冊”，Cold Spring Habor Laboratory，1988。通常，可用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)抗體，包括如本文所述的單克隆抗體生產(chǎn)，或通過將抗體基于轉(zhuǎn)入合適的細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞宿主來生產(chǎn)重組抗體。技術(shù)之一中，先給哺乳動物(可在小鼠、大鼠、兔子、綿羊或山羊等多種中任選)注射免疫原(包含，例如融合多肽，或有意義融合蛋白內(nèi)各多肽彼此間接頭的對應(yīng)序列(即連接區(qū)))。在這一步中，本發(fā)明的融合蛋白或其連接區(qū)起著非修飾免疫原的作用?；蛘?，對較短的序列來說，可將該序列與某種載體蛋白，例如牛血清白蛋白或匙孔血藍(lán)蛋白相連，從而激發(fā)理想的免疫應(yīng)答。較好的是，按照一個(gè)預(yù)定的計(jì)劃給動物宿主注射免疫原，該計(jì)劃應(yīng)包括一次或多次加強(qiáng)免疫，并且，可定期抽取動物的血樣。然后，例如，可通過親和層析，即使用偶聯(lián)于合適的固相支持物上的融合多肽，由抗血清純化融合多肽的特異性多克隆抗體。
可從用本發(fā)明融合蛋白產(chǎn)生的多克隆抗體中挑選出僅與本發(fā)明融合蛋白發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，而不與構(gòu)成融合蛋白的各單獨(dú)多肽反應(yīng)的多克隆抗體。這樣的挑選可以通過扣除與本發(fā)明融合蛋白各單獨(dú)多肽組分交叉反應(yīng)的抗體來進(jìn)行。
或者，本發(fā)明可采用能識別構(gòu)成融合蛋白的各多肽組分中單個(gè)或全部的抗體。
可用Kohler和Milstein(1976)歐洲免疫學(xué)雜志6511-519所述的方法，以及本文的改進(jìn)，制備對本發(fā)明免疫原性融合多肽具有特異性的單克隆抗體。簡而言之，這些方法包括制備能夠產(chǎn)生具有所需特異性(即，與有意義融合多肽的反應(yīng)性)的抗體的無限繁殖細(xì)胞系?？扇缜八觯擅庖邉游铽@得脾細(xì)胞。然后將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(最好與免疫動物同品系)融合，得到無限繁殖細(xì)胞系。融合可采用多種方法。例如，可將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞與非離子除垢劑接觸數(shù)分鐘，然后低密度地接種在支持雜交細(xì)胞生長而不支持骨髓瘤細(xì)胞生長的選擇培養(yǎng)基上。優(yōu)選選擇方法之一是使用HAT(次黃嘌呤，氨基蝶啉，胸腺嘧啶)選擇法。足夠的時(shí)間，一般為1-2周后，可看到雜交集落。選出單個(gè)集落，檢測其培養(yǎng)上清液與融合多肽的結(jié)合活性。優(yōu)選具有高度反應(yīng)性兼特異性的雜交瘤。
可從生長中的雜交瘤集落上清液中分離出單克隆抗體。此外，可用各種技術(shù)來提高得率，例如，將雜交瘤細(xì)胞系注射入合適的脊椎動物宿主，例如小鼠的腹腔。然后，由腹水或血液收獲單克隆抗體。污染物可用常規(guī)技術(shù)去除，例如層析，凝膠過濾，沉淀和抽提?？捎帽景l(fā)明的融合多肽于進(jìn)行純化，例如用于其中的親合層析步驟。
某些實(shí)施方式中以使用抗體的抗原結(jié)合性片段為佳。這些片段包括用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備的Fab片段。簡而言之，通過A蛋白珠層析柱上的親合層析，從兔血清純化免疫球蛋白(Harlow和Lane，“抗體實(shí)驗(yàn)室手冊”，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，然后用木瓜蛋白酶消化，制得Fab和Fc片段。可通過A蛋白珠層析柱親合層析純化這些Fab和Fc片段。
可將本發(fā)明的單克隆抗體與一種或多種治療劑偶聯(lián)。合適的治療劑包括放射性核素，分化誘導(dǎo)劑，藥物，毒素，以及它們的衍生物。優(yōu)選的放射性核素包括90Y，123I，125I，131I，186Re，188Re，211At和212Bi。優(yōu)選的藥物有氨甲蝶啉，以及吡啶、嘌呤類似物。優(yōu)選的分化誘導(dǎo)劑包括佛波酯和丁酸。優(yōu)選的毒素包括蓖麻毒蛋白，相思豆毒蛋白，白喉毒素，霍亂毒素，gelonin，假單胞菌外毒素，志賀氏菌毒素和商陸抗病毒蛋白。
可將治療劑與合適的單克隆抗體直接(例如通過共價(jià)鍵)或間接(例如通過接頭基團(tuán))偶聯(lián)。如果藥物和抗體都具有能夠彼此反應(yīng)的基團(tuán)，則兩者可能發(fā)生直接反應(yīng)。例如，其中之一上的親核基團(tuán)，諸如氨基或巰基，可與另一個(gè)上的含羰基基團(tuán)，例如酸酐或酰鹵，或含有優(yōu)良離去基團(tuán)(例如鹵素)的烷基反應(yīng)。
或者，也可以將治療劑與抗體通過接頭基團(tuán)相連。接頭基團(tuán)可以起將抗體與藥物分開的間隔基的作用，從而避免對結(jié)合能力的影響。接頭基團(tuán)還能夠提高藥物或抗體上取代基的化學(xué)反應(yīng)活性，從而提高偶聯(lián)效率?；瘜W(xué)反應(yīng)性的提高還有利于藥物或藥物上的官能團(tuán)發(fā)揮某些原本不可能的作用。
顯然，許多雙官能或多官能，均官能或異官能(例如Pierce Chemical Co.，Rockford，IL的目錄中的那些)的反應(yīng)試劑可用作接頭基團(tuán)。偶聯(lián)可以發(fā)生在氨基、羧基、巰基或氧化羰基上。許多參考文獻(xiàn)中描述了此類方法，例如美國專利4,671,958。
如果某治療劑不與本發(fā)明免疫偶聯(lián)物中的抗體部分相連時(shí)更有效，則可使用在被細(xì)胞內(nèi)化時(shí)或內(nèi)化后可切斷的接頭基團(tuán)。已知許多此類基團(tuán)。藥物與這些接頭基團(tuán)胞內(nèi)分離的機(jī)制包括因二硫鍵還原而切斷(例如美國專利4,489,710)，通過對光敏感鍵的輻照(例如美國專利4,625,014)，通過水解衍生的氨基酸鏈(例如美國專利4,638,045)，通過血清補(bǔ)體介導(dǎo)的水解(例如美國專利4,671,958)，和酸催化的水解(例如美國專利4,569,789)。
可能需要將一種以上藥物與一個(gè)抗體相連。實(shí)施方式之一中，一種藥物的多個(gè)分子與同一個(gè)抗體偶聯(lián)。另一實(shí)施方式中，一種以上藥物與一個(gè)抗體偶聯(lián)。不論哪一種實(shí)施方式，都可用多種方法制得含有一種以上藥物的免疫偶聯(lián)物。例如，可將一種以上藥物直接與一抗體分子相連，或與提供多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的接頭相連。或者，也可以用載體。
載體可以多種方式攜帶藥物，例如直接或通過接頭共價(jià)結(jié)合。合適的載體包括蛋白質(zhì)，例如白蛋白(美國專利4,507,234)，肽和多糖，例如氨基葡聚糖(美國專利4,699,784)。載體還可以通過非共價(jià)結(jié)合或通過包裹(例如包裹在脂質(zhì)體囊泡中(美國專利4,429,008和4,873,088))來攜帶藥物。專用于放射性核素類藥物的載體包括放射性鹵化小分子和螯合化合物。例如，美國專利4,735,792描述了代表性的放射性鹵化小分子及它們的合成?？捎沈匣衔镏苽浞派湫院怂仳衔铮@些化合物包括可結(jié)合金屬或金屬氧化物、放射性核素的氮或硫原子作為供電子原子。例如，美國專利4,673,562描述了代表性的螯合化合物及它們的合成。
可采用多種途徑給予抗體和免疫偶聯(lián)物。通常，可通過靜脈、肌內(nèi)、皮下或已切除腫瘤的癌床內(nèi)給藥。顯然，抗體/免疫偶聯(lián)物的確切劑量取決于所用的抗體，腫瘤上的抗原密度，和抗體的清除速度。
適用于本發(fā)明融合蛋白的抗體包括但不限于8029K兔多克隆抗體，小鼠單克隆c-neu-3抗體(Calbiochem)，和小鼠單克隆Herceptin抗體(美國專利5,677,171)。單克隆抗體c-neu-3可識別PD區(qū)的一連續(xù)性表位，該表位沒有ECD-ΔPD構(gòu)建物中的1242-1255aa。Herceptin抗體則與ECD區(qū)的一個(gè)構(gòu)象性表位結(jié)合。
T細(xì)胞免疫治療組合物還可以或也可以包含本發(fā)明融合蛋白的特異性T細(xì)胞。可用標(biāo)準(zhǔn)方法在體外或體內(nèi)制備這樣的細(xì)胞。例如，可從患者的骨髓、外周血或其組分中，用市售的細(xì)胞分離系統(tǒng)分離T細(xì)胞(參見美國專利5,240,856和5,215,926；WO89/06280；WO91/16116和WO92/07243)?；蛘?，也可以從相關(guān)或不相關(guān)的人、非人哺乳動物的細(xì)胞系或培養(yǎng)物中制備T細(xì)胞。
可用HER-2/neu融合多肽，編碼HER-2/neu融合蛋白的聚核苷酸和/或表達(dá)融合多肽的抗原呈遞細(xì)胞(APC)激發(fā)T細(xì)胞。所述激發(fā)的條件和時(shí)間應(yīng)足以產(chǎn)生對所述融合多肽具有特異性的T細(xì)胞。較好的是，將HER-2/neu融合多肽或聚核苷酸包含于一傳遞載體(例如微球體)中，從而促進(jìn)特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生。
如果T細(xì)胞能夠殺死外有融合多肽或表達(dá)編碼融合多肽的聚核苷酸的細(xì)胞，則認(rèn)為該T細(xì)胞具有對HER-2/neu融合多肽的特異性。可用多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來測定T細(xì)胞的特異性。例如，在鉻釋放試驗(yàn)或增殖試驗(yàn)中，如果裂解作用和/或增殖作用的激發(fā)指數(shù)比陰性對照高2倍以上，則說明T細(xì)胞具有特異性。進(jìn)行這樣的試驗(yàn)可參照例如Chen等(1994)癌癥研究541065-1070所述?；蛘撸捎枚喾N已知方法檢測T細(xì)胞是否增殖。例如，測定DNA的合成速度可測知T細(xì)胞的增殖(例如，通過用氚化胸腺嘧啶脈沖標(biāo)記T細(xì)胞培養(yǎng)物，然后測定摻入DNA的氚化胸腺嘧啶)。與HER-2/neu融合多肽(100ng/ml一100μg/ml，以200ng/ml-25μg/ml為佳)接觸3-7天，應(yīng)能使T細(xì)胞增殖提高至少2倍。如上所述接觸2-3小時(shí)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子試驗(yàn)，應(yīng)能激活T細(xì)胞，在所述試驗(yàn)中，細(xì)胞因子(TNF或IFN-γ)釋放水平提高2倍則說明T細(xì)胞被激活(參見Coligan等，現(xiàn)代免疫學(xué)方法，第1卷，Wiley Interscience(Green 1989))。被HER-2/neu融合多肽，聚核苷酸或表達(dá)融合多肽的APC激活的T細(xì)胞可能是CD4+和/或CD8+?？捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)擴(kuò)增HER-2/neu融合蛋白特異性T細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述T細(xì)胞來自患者，或相關(guān)或非相關(guān)提供者，并在激發(fā)和擴(kuò)增后給予患者。
出于治療目的，可體外或體內(nèi)擴(kuò)增對HER-2/neu融合多肽、聚核苷酸或APC應(yīng)答而增殖的CD4+和/或CD8+T細(xì)胞。此類T細(xì)胞的體外擴(kuò)增有多種途徑。例如，可在加或不加T細(xì)胞生長因子(例如白介素-2)的條件下，讓T細(xì)胞與HER-2/neu融合多肽再次接觸，和/或與能合成HER-2/neu融合多肽的激發(fā)者細(xì)胞解除?；蛘?，可通過克隆來擴(kuò)增對HER-2/neu融合蛋白應(yīng)答而增殖的T細(xì)胞。擴(kuò)增后，可如Chang等(1996)Crit.Rev.Oncol.Hematol.22213所述，將細(xì)胞回輸給患者。包含本發(fā)明融合蛋白的藥物組合物和疫苗另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含HER-2/neu融合蛋白或其變異體，以及HER-2/neu ICD蛋白或其變異體的組合物。所述的融合蛋白以本發(fā)明所詳細(xì)描述的ECD-ICD融合蛋白，ECD-PD融合蛋白，或它們的變異體為佳。所述的ICD蛋白以人ICD蛋白為佳，它包括圖7(SEQ ID NO1)中的Lys676-Val1255區(qū)域，或大鼠ICD蛋白，即圖8(SEQ ID NO2)中的Lys677-Val1256區(qū)域?；蛘?，HER-2/neu ICD蛋白也可以是具有免疫原性或可提高組合物的免疫原性的ICD的各種變異體或其部分。例如，ICD蛋白的部分可以是前述HER-2/neu PD蛋白，HER-2/neuΔPD蛋白，HER-2/neuKD蛋白，或N或C末端1-100氨基酸內(nèi)任一處缺失的HER-2/neu ICD蛋白。此外，可通過多種途徑進(jìn)行氨基酸取代，從而得到本發(fā)明的變異體實(shí)施方式。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，進(jìn)行了前文所述的保守性氨基酸取代。
在某些內(nèi)容中，可將本發(fā)明所述的多肽、聚核苷酸、T細(xì)胞和/或結(jié)合劑加入藥物組合物或免疫原性組合物(及疫苗)。藥物組合物包含一種或多種以上化合物和生理學(xué)上認(rèn)可的載體。疫苗可包含一種或多種上述化合物和非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑。非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑可以是任何能夠增強(qiáng)對異源抗原免疫應(yīng)答的物質(zhì)。非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑的例子包括佐劑，可生物降解的微球體(例如聚乳糖半乳糖苷(polylactic galactide))和脂質(zhì)體(可包裹化合物，參見美國專利4,235,877)。有關(guān)疫苗制劑，可參見Powell和Newman編輯的“疫苗設(shè)計(jì)”(亞基和佐劑方法)，Plunum Press(NY 1995)。可以設(shè)計(jì)可產(chǎn)生抗體免疫和/或CTL或CD4+引起的細(xì)胞免疫的疫苗。
本發(fā)明的藥物組合物和疫苗還可以包含其它生物活性或非生物活性的化合物。例如，組合物或疫苗中可含有一種或多種其它腫瘤抗原的免疫原性部分，可以將它們結(jié)合在融合多肽內(nèi)，或作為獨(dú)立的化合物。多肽可以，但非必要，與例如美國專利4,372,945所述的其它大分子偶聯(lián)。藥物組合物和疫苗可用于預(yù)防和治療。
藥物組合物或疫苗可含有編碼一種或多種前述Her-2/neu融合蛋白、Her-2/neu ECD-ICD和/或Her-2/neu ECD-PD的聚核苷酸，這樣，就可以原位產(chǎn)生融合蛋白。這樣的聚核苷酸可以是DNA、RNA、修飾核酸或DNA/RAN雜交鏈。如上所述，聚核苷酸可包含在各種已知的傳遞系統(tǒng)中，這些系統(tǒng)包括核酸表達(dá)系統(tǒng)，細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。已知有多種基因傳遞技術(shù)，例如Rolland(1998)Crit.Rev.Therap.藥物載體系統(tǒng)15143-198所述。合適的核酸表達(dá)系統(tǒng)含有在患者體內(nèi)表達(dá)所必需的DNA序列(例如合適的啟動子和終止信號)。細(xì)菌傳遞系統(tǒng)包括給予這樣的細(xì)菌(例如芽孢桿菌Calmette-Guerin)它可在其細(xì)胞表面表達(dá)融合蛋白的免疫原性部分，或分泌該表位。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，可用病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如牛痘、天花病毒、逆病毒或腺病毒)引入DNA，這包括使用非病原性(缺陷型)可復(fù)制病毒。合適的系統(tǒng)可參見Fisher-Hoch等(1989)美國科學(xué)院院報(bào)86317-321；Flexner等(1989)紐約學(xué)術(shù)協(xié)會年報(bào)56986-103；Flexner等(1990)疫苗817-21；美國專利4,603,112，4,769,330，4,777,127和5,017,487；WO89/01973；GB2,200,651；EP0,345,242；WO91/02805；Berkner(1988)生物技術(shù)6616-627；Rosenfeld等(1991)科學(xué)252431-434；Kolls等(1994)美國科學(xué)院院報(bào)91215-219；Kass-Eisler等(1993)美國科學(xué)院院報(bào)9011498-11502；Guzman等(1993)循環(huán)882838-2848；和Guzman等(1993)循環(huán)系統(tǒng)研究731202-1207。將DNA引入所述表達(dá)系統(tǒng)的方法是已知的。也可以用“裸露”DNA，例如Ulmer等(1993)科學(xué)2591745-1749所述，Cohen(1993)科學(xué)2591691-1692所述。將裸露DNA包在可生物降解的微珠上可提高其被攝取率從而有效轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞。顯然，疫苗可以既包含聚核苷酸又包含多肽。這樣的疫苗可提供更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
顯然，疫苗可含有藥學(xué)上認(rèn)可的本發(fā)明聚核苷酸和融合多肽的鹽。這樣的鹽可用藥學(xué)上認(rèn)可的無毒堿，包括有機(jī)堿(例如伯胺、仲胺和叔胺，以及堿性氨基酸的鹽)和無機(jī)堿(例如鈉、鉀、鋰、銨、鈣和鎂鹽)來制備。
雖然各種合適的已知載體都可用于本發(fā)明的藥物組合物，但載體的類型根據(jù)給藥方式不同而不同?？筛鶕?jù)各種適合的給藥方式來配制本發(fā)明組合物，包括例如局部，口服，鼻內(nèi)，靜脈，顱內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下或肌內(nèi)給藥。對諸如皮下注射等非腸胃給藥而而言，較好的載體是水、鹽水、醇、脂類、蠟或緩沖液。對于口服來說，任何上述載體或固體載體均可使用，例如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石粉，纖維素，葡萄糖，蔗糖和碳酸鎂。可生物降解的微球(例如聚乳酸酯聚甘醇酸酯)也可用作本發(fā)明藥物組合物的載體。合適的可生物降解的微球可參見美國專利4,897,268，5,075,109，5,928,647，5,811,128，5,820,883，可將5，8-2/neu融合蛋白包裹在可生物降解的微球中，或結(jié)合于其表面。實(shí)施方式之一中，將本發(fā)明的ECD-ICD融合蛋白包在可生物降解的微球中。也可以或還可以將本發(fā)明的ECD-PD融合蛋白包在可生物降解的微球中。所述的微球體可以既包含ECD-ICD融合蛋白又包含ECD-PD融合蛋白。較好的是，微球體小于25μm，以1-10μm為佳。有關(guān)脂質(zhì)體膠囊化可參見例如美國專利4,235,877。
所述的組合物還可以包含緩沖液(中性緩沖鹽溶液，或磷酸鹽緩沖液)，糖(例如葡萄糖，甘露糖，蔗糖或葡聚糖)，甘露醇，蛋白質(zhì)，多肽或甘氨酸等氨基酸，抗氧化劑，抑菌劑，EDTA或谷胱甘肽等螯合劑，佐劑(例如氫氧化鋁)，使制劑與受血者的血液達(dá)到等滲、低滲或略為高滲的溶劑，懸浮劑，增稠劑和或防腐劑?；蛘撸蓪⒈景l(fā)明的組合物制成凍干劑?？捎檬熘募夹g(shù)將化合物包在脂質(zhì)體內(nèi)。
本發(fā)明疫苗可包含各種免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑或免疫刺激物。例如，可包含佐劑。大多數(shù)佐劑含有可保護(hù)抗原不被迅速代謝的物質(zhì)，例如氫氧化鋁或礦物油，以及免疫應(yīng)答刺激物，例如脂類A，百日咳桿菌或結(jié)核分支桿菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。合適的佐劑有市售的，例如Freund不完全佐劑和完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Merck佐劑65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKlineBeecham)；鋁鹽，例如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁；鈣、鐵或鋅鹽；?；野彼岬牟蝗苄詰腋∫?；?；牵魂栯x子或陰離子衍生的多肽；聚磷腈；可生物降解的微球體；單磷酰脂類A和quil A。也可用細(xì)胞因子，例如GM-CSF或白介素-2、-7或-12作為佐劑。
本發(fā)明疫苗中的佐劑組合物最好設(shè)計(jì)成可誘導(dǎo)以Th1型為主的免疫應(yīng)答。對于給予的抗原，高水平的Th1型細(xì)胞因子(例如IFN-γ，TNF-α，IL-2和IL-12)傾向于誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。相反，高水平的Th2型細(xì)胞因子(例如IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)則傾向于誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。給予本發(fā)明的疫苗后，患者將發(fā)生既包括Th1型又包括Th2型的免疫應(yīng)答。在優(yōu)選實(shí)施方式中，即以Th1型為主的免疫應(yīng)答中，Th1型細(xì)胞因子的水平被提高，超過Th2型細(xì)胞因子。用標(biāo)準(zhǔn)方法即可測得上述細(xì)胞因子的水平。有關(guān)細(xì)胞因子，可參見Mosmann和Coffman(1989)Ann.Rev.Immunol.7145-173。
用于激發(fā)Th1型為主免疫應(yīng)答的優(yōu)選佐劑包括，例如，單磷酰脂類A(優(yōu)選3-脫氧?；瘑瘟柞Ｖ怉(3D-MPL))與鋁鹽的組合。MPL佐劑可購自CorixaCorporation(Hamilton，MT；參見美國專利4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含CpG的寡核苷酸(其中，CpG二核苷酸沒有甲基化)也能誘導(dǎo)Th1型為主的免疫應(yīng)答。此類寡核苷酸是業(yè)內(nèi)熟知的，例如可參見WO96/02555和WP99/33488。有關(guān)免疫激發(fā)性DNA序列還可參見Sato等(1996)科學(xué)273352。另一種優(yōu)選佐劑是皂苷，以QS21(Aquila，United States)為佳，它可以單用，也可以與其它佐劑聯(lián)用。例如，一種增強(qiáng)系統(tǒng)包含單磷酰脂類A和皂苷的組合物，例如WO94/00153中的QS21與3D-MPL聯(lián)運(yùn)，或者，含一種反應(yīng)原性較低的組合物，其中，QS21被膽固醇所淬息，參見WO96/33739。其它優(yōu)選制劑包括水包油乳液和生育酚。一種特別有效的佐劑中含有QS21，3D-MPL，和含于水包油乳液中的生育酚，參見WO95/17210。有關(guān)QS21和3D-MPL，還可參見EP671 948B1。
其它優(yōu)選佐劑有Montanide ISA 720(Seppic，F(xiàn)rance)，SAF(Chiron，California，United States)，ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron)，SBAS佐劑系列(例如，SBAS-2或SBAS-4，可購自SmithKline Beecham，Rixensart，Belgium)，Detox(CorixaCorporation，Hamilton，MT)，RC-529(Corixa，USA)和氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGPs)。
優(yōu)選實(shí)施例之一中，佐劑是SBAS-2(參見，EP735898B1)。
本發(fā)明的各種疫苗都可用已知方法制備，從而得到包含抗原、免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑，合適的載體或賦形劑的組合物。所述的組合物可作為緩釋制劑(即膠囊或海綿制劑，可在給予后緩慢地發(fā)揮作用)的一部分給予患者。此類制劑一般可用已知方法(參見，Coombes等(1996)疫苗141429-1438)來制備，并通過口服、直腸或皮下植入，或目標(biāo)位置植入來給予。緩釋制劑可以將多肽、聚核苷酸或抗體分散在載體基質(zhì)中，和/或?qū)⑵浒趦Υ骟w中，并外被以控釋膜。
此類制劑所用的載體須生物相容，也可以是可生物降解的；較好的是，此類制劑可以相對恒定的水平釋放出活性成分。所述載體包括聚(交酯共乙醇酸酯)，以及聚丙烯酸酯，膠乳，淀粉，纖維素和葡聚糖制成的微粒。其它緩釋載體還包括超分子生物載體，它們具有一個(gè)非液態(tài)的親水核(例如交聯(lián)多糖或寡糖)，以及可選的兩性化合物(例如磷脂)外層(參見美國專利5,151,254和PCT申請WO94/20078，WO94/23701和WO96/06638)。緩釋制劑中活性化合物的含量取決于有待植入的部位，釋放速度，預(yù)期釋放時(shí)間，以及有待治療和預(yù)防的疾病的性質(zhì)。
可在藥物組合物和疫苗中使用多種傳遞載體，以促進(jìn)針對腫瘤的抗原特異性免疫應(yīng)答。所述傳遞載體包括抗原呈遞細(xì)胞(APC)，例如樹狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞，單核細(xì)胞以及其它經(jīng)基因工程改造后成為有效APC的細(xì)胞。可以但非必須對此類細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，以提高其呈遞抗原的能力，從而加強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答的活化和/或持續(xù)，獲得其自身的抗腫瘤效果和/或與受主免疫相容(即HLA單倍體相匹配)。APC可分離自各種生物液和器官，包括腫瘤和腫瘤周組織，并可以是自身、同種異體、同系或異種細(xì)胞。
本發(fā)明部分優(yōu)選實(shí)施方式使用樹狀細(xì)胞或祖細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞。樹狀細(xì)胞是很強(qiáng)的APC(Banchereau等(1998)自然392245-251)，并已被證明是有效的生理佐劑，可激發(fā)預(yù)防或治療性的抗腫瘤免疫力(參見，Timmerman等(1999)醫(yī)學(xué)評論年報(bào)50507-529)。通常，可根據(jù)其典型的形狀(原位呈星形，體外可觀察到明顯的胞質(zhì)突出(樹突))，其高效加工和提呈抗原的能力，及其激活原初T細(xì)胞應(yīng)答的能力來鑒別樹狀細(xì)胞。當(dāng)然，可對樹狀細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，使其在體內(nèi)或體外表達(dá)樹狀細(xì)胞原來沒有的特定細(xì)胞表面受體或配體，本發(fā)明包括此類修飾過的樹狀細(xì)胞?；蛘?，疫苗中也可以使用分泌型囊泡抗原攜帶樹狀細(xì)胞(又稱外來體(exosome))(參見Zitvogel等(1998)自然醫(yī)學(xué)4594-600)。
樹狀細(xì)胞和祖細(xì)胞可從外周血、骨髓、腫瘤浸潤細(xì)胞、腫瘤周邊組織-浸潤細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾臟、皮膚、臍帶血或其它合適的組織或液體獲得。例如，可從外周血獲得單核細(xì)胞，體外培養(yǎng)，向該培養(yǎng)物中加入GM-CSF、IL-4，IL-3和/或TNFα等細(xì)胞因子的組合物，促使樹狀細(xì)胞的體外分化?；蛘?，從外周血、臍帶血或骨髓獲得CD34陽性細(xì)胞，向培養(yǎng)基中加入可誘導(dǎo)樹狀細(xì)胞成熟和增殖的GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配體、LPS、flt3配體和/或其它化合物的組合物，使得它們分化為樹狀細(xì)胞。
一般將樹狀細(xì)胞分為“不成熟”細(xì)胞和“成熟”細(xì)胞，從而簡單區(qū)分兩種極具特征的表型。然而，不應(yīng)將這種命名理解為排除所有可能的分化中間狀態(tài)。不成熟樹狀細(xì)胞的特征在于，它是抗原攝取和加工能力很高的APC，這與Fcγ受體和甘露醇受體的高表達(dá)相關(guān)。成熟表型的特征在于這些標(biāo)記的表達(dá)水平較低，但與T細(xì)胞活化有關(guān)的細(xì)胞表面分子表達(dá)水平較高，例如I類和II類MHC分子、粘附分子(例如CD54和CD11)和協(xié)同刺激分子(例如CD40，CD80，和4-1BB)。
可用編碼本發(fā)明融合蛋白(或其變異體)的聚核苷酸轉(zhuǎn)染APC，這樣，該融合蛋白或其變異體可表達(dá)于該細(xì)胞表面。所述的轉(zhuǎn)染可體外進(jìn)行，然后，可將含有此類轉(zhuǎn)染細(xì)胞的組合物或疫苗用于治療?；蛘?，可將定向于樹狀細(xì)胞或其它抗原呈遞細(xì)胞的基因傳遞載體給予患者，從而進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染。體內(nèi)和體外樹狀細(xì)胞轉(zhuǎn)染可用已知方法進(jìn)行，例如WO97/24447所述的方法，或Mahvi等(1997)免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)75456-460所述的基因槍法。樹狀細(xì)胞上的抗原加載可通過將樹狀細(xì)胞或祖細(xì)胞與有意義的融合蛋白、DNA(裸露或含于質(zhì)粒載體內(nèi))或RNA或表達(dá)融合蛋白的重組細(xì)菌或病毒(例如牛痘、禽痘病毒、腺病毒或慢病毒載體)共培養(yǎng)進(jìn)行。或者，可分別，或在融合蛋白存在下，用非偶聯(lián)免疫伴侶對樹狀細(xì)胞進(jìn)行脈沖處理。
疫苗和藥物組合物可以呈單位劑量或多劑量的包裝形式，例如密封的安瓿瓶或小管。此類容器在使用前應(yīng)是密封的，以防細(xì)菌污染。通常，制劑可以油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳液的形式儲存?；蛘?，可將疫苗或藥物組合物保存在冷凍干燥條件下，使用前，只需加入無菌液體載體即可。
顯而易見的是，用于疫苗的HER-2/neu融合蛋白或核酸可以合成，也可以通過自然衍生得到。對本發(fā)明融合蛋白的免疫應(yīng)答A.對本發(fā)明融合蛋白的免疫應(yīng)答的檢測本發(fā)明內(nèi)容之一中，HER-2/neu融合蛋白(或其編碼聚核苷酸)可用于產(chǎn)生對HER-2/neu蛋白(包括HER-2/neu致癌基因相關(guān)惡性腫瘤上表達(dá)的那些)的免疫應(yīng)答。所述惡性腫瘤例如乳房癌，卵巢癌，結(jié)腸癌，肺癌和前列腺癌。HER-2/neu融合蛋白誘導(dǎo)的對HER-2/neu蛋白的免疫應(yīng)答一旦產(chǎn)生可以長期持續(xù)，在免疫后較長時(shí)間后仍可檢測到，與檢測時(shí)體內(nèi)是否存在該蛋白質(zhì)無關(guān)。因與HER-2/neu融合蛋白反應(yīng)而產(chǎn)生的抗HER-2/neu蛋白免疫應(yīng)答可通過檢測CD4+或CD8+T細(xì)胞活化是否發(fā)生或增強(qiáng)，或檢測有否抗體來檢測。例如，用常規(guī)方法(例如，外周血淋巴細(xì)胞Ficoll/Hypaque密度梯度離心)分離出免疫個(gè)體的T細(xì)胞，將其與HER-2/neu融合蛋白共培養(yǎng)。例如，可將T細(xì)胞與HER-2/neu融合蛋白(一般為5μg/ml全蛋白，或相當(dāng)數(shù)量的合成HER-2/neu蛋白質(zhì)的細(xì)胞)37℃體外共培養(yǎng)2-9天(一般為4天)?？赡苄枰獙⒘硪环軹細(xì)胞樣品培養(yǎng)在無HER-2/neu融合蛋白條件下以作為對照。
有多種方法可檢測CD4+或CD8+T細(xì)胞的特異性活化。檢測特異性T細(xì)胞活化的方法包括檢測T細(xì)胞的增殖，細(xì)胞因子(例如淋巴因子)的產(chǎn)生，或溶胞活性(即，HER-2/neu融合蛋白特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞的產(chǎn)生)。對CD4+T細(xì)胞而言，檢測特異性T細(xì)胞活化的較好方法是檢測T細(xì)胞的增殖。對CD8+T細(xì)胞而言，較好的方法是檢測溶胞活性。
有多種已知方法可檢測T細(xì)胞增殖。例如，可檢測DNA合成速度。受刺激而增殖的T細(xì)胞會表現(xiàn)出DNA合成速度提高。測定DNA合成速度的經(jīng)典方法是，例如，用氚化胸腺嘧啶脈沖標(biāo)記T細(xì)胞培養(yǎng)物，這種核苷前體會摻入新合成的DNA中?？捎靡合嚅W爍分光光度計(jì)測定摻入的氚化胸腺嘧啶。檢測T細(xì)胞增殖的其它方法包括檢測白介素-2(IL-2)生成，Ca2+通量或染料(例如3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑)的攝取。或者，可以檢測淋巴因子(例如γ干擾素)的合成，或測定可對完整p185HER-2/neu蛋白產(chǎn)生反應(yīng)的T細(xì)胞的相對數(shù)量。
B.對本發(fā)明融合蛋白應(yīng)答而產(chǎn)生的抗體的檢測本發(fā)明還涉及檢測這樣的HER-2/neu融合蛋白，它不僅具有對T細(xì)胞的免疫原性，而且可刺激B細(xì)胞產(chǎn)生可識別HER-2/neu融合蛋白的抗體。檢測這樣的抗體為診斷HER-2/neu致癌基因相關(guān)惡性腫瘤提供了另一種方法。HER-2/neu融合蛋白特異性抗體(即結(jié)合親和力約為107L/摩爾或更高)存在于包括血清和腹水等多種體液中。簡而言之，分離獲取需要檢測是否存在該融合蛋白特異性抗體的人等溫血?jiǎng)游锏捏w液。將該體液與HER-2/neu融合蛋白共培養(yǎng)，培養(yǎng)條件和時(shí)間應(yīng)足以允許HER-2/neu融合蛋白與其特異性抗體形成免疫復(fù)合物。例如，可將體液與HER-2/neu融合蛋白46℃共培養(yǎng)24-48小時(shí)。然后，檢測反應(yīng)混合物中有否免疫復(fù)合物?？捎枚喾N已知方法檢測HER-2/neu融合蛋白與其特異性抗體之間形成的一種或多種免疫復(fù)合物，例如放射性免疫試驗(yàn)(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。
合適的免疫試驗(yàn)包括David等(美國專利4,376,110)所述的單克隆抗體夾心免疫試驗(yàn)；單克隆-多克隆抗體夾心試驗(yàn)(Wide等，Kirkham和Hunter編輯的放射性免疫試驗(yàn)方法，E.和S.Livingstone，Edinburgh(1970))；Gordon等的“Western印跡”法(美國專利4,452,901)；標(biāo)記配體免疫沉淀(Brown等(1980)生物化學(xué)雜志2554980-4983)；Raines等(1982)生物化學(xué)雜志2575154-5160所述的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，包括使用熒光染料(Brooks等(1980)臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)39477)；和活性中和反應(yīng)(Bowen-Pope等(1984)美國科學(xué)院院報(bào)812396-2400)，本文參考了以上各篇文獻(xiàn)。除上述免疫試驗(yàn)之外，本發(fā)明還參考了許多其它免疫試驗(yàn)，包括美國專利3,817,827；3,850,752；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876。
用于檢測時(shí)，HER-2/neu融合蛋白(即抗原)可以標(biāo)記也可以不標(biāo)記。不標(biāo)記時(shí)，融合蛋白可用于凝集試驗(yàn)。此外，不標(biāo)記的融合蛋白還可以與對免疫復(fù)合物具有反應(yīng)性的的標(biāo)記分子聯(lián)用，或與標(biāo)記抗體(第二抗體)聯(lián)用，該第二抗體具有對抗HER-2/neu融合蛋白抗體的反應(yīng)性，例如免疫球蛋白的抗體?；蛘?，可直接標(biāo)記所述融合蛋白。當(dāng)標(biāo)記時(shí)，報(bào)道基團(tuán)可以是放射性同位素，熒光團(tuán)，酶，發(fā)光團(tuán)，染料粒子等。以上及其它標(biāo)記是業(yè)內(nèi)熟知的，可參見例如美國專利3,766,162；3,791,932；3,817,837；3,996,345；和4,233,402。
一般在ELISA試驗(yàn)中，有意義的融合蛋白吸附于微滴板的孔表面。然后用合適的試劑(例如牛血清白蛋白(BSA)，熱滅活的普通山羊血清(NGS)，或BLOTTO(脫脂乳的緩沖溶液，另含防腐劑、鹽和消泡劑)封閉表面上其余可結(jié)合蛋白質(zhì)的位點(diǎn)。然后，這些孔與懷疑有特異性抗體的樣品共保溫?？杉尤朐稑悠罚ǔＳ镁彌_液進(jìn)行稀釋，緩沖液中含少量(0.1-5.0重量％)蛋白質(zhì)(例如BSA，NGS或BLOTTO)。保溫時(shí)間足以發(fā)生特異性結(jié)合后，洗去孔中未結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后再與以報(bào)道基團(tuán)標(biāo)記的種特異性免疫球蛋白共同保溫。所述報(bào)道基團(tuán)可選自多種酶，例如辣根過氧化物酶，β-半乳糖苷酶，堿性磷酸酯酶和葡萄糖氧化酶。保溫時(shí)間應(yīng)足以發(fā)生特異性結(jié)合，然后再次洗去未結(jié)合的偶聯(lián)物，加入酶的底物。令其顯色，通過目測或用儀器測定孔中物質(zhì)的光密度。
這方面的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，將一種報(bào)道基團(tuán)與有意義的HER-2/neu融合蛋白結(jié)合。檢測免疫復(fù)合物的步驟包括去除幾乎所有未結(jié)合的HER-2/neu融合蛋白，然后檢測是否存在該報(bào)道基團(tuán)。
另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，將報(bào)道基團(tuán)與可結(jié)合HER-2/neu融合蛋白特異性抗體的第二抗體偶聯(lián)。檢測免疫復(fù)合物的步驟包括(a)去除幾乎所有未結(jié)合的抗體；(b)加入第二抗體，(c)去除幾乎所有未結(jié)合的第二抗體，然后(d)檢測是否存在報(bào)道基團(tuán)。其中的HER-2/neu融合蛋白特異性抗體來自人，其中的第二抗體是抗人抗體的抗體。
檢測免疫復(fù)合物的第三種優(yōu)選實(shí)施方式中，報(bào)道基團(tuán)與一種可結(jié)合免疫復(fù)合物的分子結(jié)合。檢測步驟包括(a)加入該分子，(b)去除幾乎所有未結(jié)合的分子，然后(c)檢測檢測是否存在報(bào)道基團(tuán)。所述能結(jié)合免疫復(fù)合物的分子的一個(gè)例子是A蛋白。
顯而易見的是，有多種檢測免疫復(fù)合物的方法可用于本發(fā)明。這些方法中合適的報(bào)道基團(tuán)包括，例如，放射性同位素，熒光團(tuán)，酶，發(fā)光團(tuán)和染料粒子。
在本發(fā)明與此相關(guān)的內(nèi)容中，對HER-2/neu融合蛋白與體液內(nèi)該融合蛋白特異性抗體間所形成免疫復(fù)合物的檢測可用來反映HER-2/neu致癌基因相關(guān)性癌癥的治療方法的效果，所述療法用到HER-2/neu融合蛋白。可用上述方法，對治療開始前后分別采集的體液樣品進(jìn)行分析。簡而言之，即比較兩份樣品中測得的免疫復(fù)合物數(shù)量。若第二份樣品(治療開始后)中的免疫復(fù)合物數(shù)量與第一份樣品(治療前)相比有顯著改變，則說明治療是成功的。
在本發(fā)明的另一方面內(nèi)容中，本發(fā)明的組合物被用于乳房癌、卵巢癌、結(jié)腸、肺和前列腺癌等癌癥的免疫治療。在這類方法中，通常將組合物和疫苗給予患者?！盎颊摺痹诖酥父鞣N溫血?jiǎng)游?，以人為佳。所述的患者可能患有癌癥，也可能沒有癌癥。所以，上述藥物組合物和疫苗或可用于預(yù)防癌癥，或可用于治療已經(jīng)患有癌癥的患者。癌癥的診斷可采用用業(yè)內(nèi)已普遍認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)，包括是否存在惡性腫瘤。藥物組合物和疫苗可在手術(shù)去除原發(fā)腫瘤和/或放射或常規(guī)化學(xué)治療之前或之后使用。給藥可采用各種合適的方法，包括靜脈、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、肛門、陰道、局部、舌下和口服等途徑。
某些實(shí)施方式中，所述免疫療法是主動免疫療法，其中的治療主要依賴于通過給予免疫應(yīng)答修飾劑(例如本發(fā)明的融合多肽和聚核苷酸)激發(fā)宿主內(nèi)源性免疫系統(tǒng)對抗腫瘤。
另一些實(shí)施方式中，所述的免疫療法是被動免疫療法，其中的治療包括給予已經(jīng)具備了腫瘤-免疫應(yīng)答性的物質(zhì)(例如效應(yīng)細(xì)胞或抗體)，這些物質(zhì)能夠直接或間接介導(dǎo)抗腫瘤效果，不一定依賴于健全的宿主免疫系統(tǒng)。效應(yīng)細(xì)胞的例子包括前文所述的T細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞(例如CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和腫瘤浸潤性CD4+T輔助淋巴細(xì)胞)，殺傷細(xì)胞(例如天然殺傷細(xì)胞和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞)，表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的B細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(例如樹狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。可將本發(fā)明融合多肽特異性的T細(xì)胞的受體和抗體的受體克隆，表達(dá)，然后轉(zhuǎn)移到其它載體或效應(yīng)細(xì)胞中，用于過繼免疫療法。本發(fā)明的融合多肽還可用于產(chǎn)生抗體或抗獨(dú)特型抗體(參見前文所述和美國專利4,918,164)，用于被動免疫療法。
通常，通過如本發(fā)明所述的體外培養(yǎng)可以獲得足夠數(shù)量用于過繼免疫療法的效應(yīng)細(xì)胞。將單抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞擴(kuò)增至數(shù)十億，同時(shí)保持其體內(nèi)識別抗原的能力，這樣的培養(yǎng)條件是業(yè)內(nèi)熟知的。這樣的體外培養(yǎng)條件一般采用在細(xì)胞因子(例如IL-2)和非分裂飼養(yǎng)細(xì)胞存在下用抗原進(jìn)行間歇性刺激。如前所述，本發(fā)明的免疫應(yīng)答性融合多肽可用于迅速擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞，從而產(chǎn)生足量用于免疫療法的細(xì)胞。具體地說，可用免疫應(yīng)答性融合多肽脈沖處理樹狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或B細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞，或通過標(biāo)準(zhǔn)方法用一種或多種聚核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)染。例如，可用含于重組病毒或其它表達(dá)載體內(nèi)的一段聚核苷酸轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞，該聚核苷酸含有適合增強(qiáng)表達(dá)的啟動子。用于治療的培養(yǎng)后效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)能廣泛生長和分布，并能在體內(nèi)長期存活。研究發(fā)現(xiàn)，用抗原加IL-2反復(fù)刺激，可誘導(dǎo)培養(yǎng)的效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)大量生長并長期存活(參見，例如，Cheever等(1997)免疫學(xué)評論157177)。
或者，可將表達(dá)本發(fā)明融合多肽的載體導(dǎo)入取自患者的抗原呈遞細(xì)胞，并在體外克隆擴(kuò)增，然后回輸給該患者。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞回輸給患者可采用各種業(yè)內(nèi)已知的方法，較好的是無菌條件下的靜脈、腔內(nèi)、腹膜內(nèi)或腫瘤內(nèi)給予。
給予本發(fā)明治療組合物的途徑和頻率以及劑量因人而異，但可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來確定。通常，藥物組合物和疫苗的給予可通過注射(皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈和皮下)，鼻內(nèi)(吸入)或口服。較好的是，在52周內(nèi)進(jìn)行1-10次給藥。較好的是，一個(gè)月間期給藥6次，然后定期加強(qiáng)免疫。對不同患者有不同的適宜方法。在如上所述給藥時(shí)，適宜的劑量應(yīng)能夠促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答，并高于基線(及未處理)水平至少10-15％。這樣的反應(yīng)可通過測定患者體內(nèi)的抗腫瘤抗體或疫苗依賴性細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞(能殺死患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞)的產(chǎn)生來監(jiān)測。這樣的疫苗還應(yīng)該能夠在接受免疫的患者中引起相比未接受免疫患者的臨床效果改善(例如，更頻繁的緩解期，完全或部分無疾病或更長的存活期)的免疫應(yīng)答。通常，對于含有一種或多種聚核苷酸的藥物組合物和疫苗來說，每一劑中，各融合蛋白的含量約為每kg宿主體重1μg-5mg，以100μg-5mg為佳，5μg-250μg最好。合適的劑量因患者體型大小而異，一般在約0.1-5ml之間。
較好的是，初次免疫用含有ECD和/或ICD或PD至少其一的HER-2/neu融合蛋白進(jìn)行，此后免疫或加強(qiáng)免疫則可用含有ECD和/或ICD或PD至少其一的HER-2/neu融合蛋白進(jìn)行。優(yōu)選用于免疫的ECD-ICD和/或ECD-PD融合蛋白即本文所述的那些。知道，本發(fā)明既考慮到使用一段完好的HER-2/neu融合蛋白，也考慮到將HER-2/neu融合蛋白分成多個(gè)肽。具有完整HER-2/neu ECD區(qū)域氨基酸序列的完整p185HER-2/neu蛋白或肽都不單獨(dú)用于免疫。
通常，適當(dāng)?shù)膭┝亢椭委煱l(fā)案需要足量的活性化合物，從而提供治療和/或預(yù)防效果。根據(jù)接受治療的患者優(yōu)于非治療患者的臨床效果(例如，更頻繁的緩解期，完全或部分無疾病或更長的存活期)，可對這樣的反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測。原有抗HER-2/neu蛋白或融合蛋白免疫應(yīng)答的增強(qiáng)通常與臨床效果改善相關(guān)聯(lián)。所述的免疫應(yīng)答可用標(biāo)準(zhǔn)的增殖、細(xì)胞毒或細(xì)胞因子試驗(yàn)來評價(jià)，這些試驗(yàn)可用治療之之前或之后的患者樣品進(jìn)行。監(jiān)測癌癥A.監(jiān)測癌癥的方法可根據(jù)取自患者的生物樣品(例如全血，血清，血漿，尿液和/或腫瘤活檢)中是否存在HER-2/neu蛋白和/或其編碼聚核苷酸來檢測癌癥。換言之，所述的蛋白質(zhì)可用作標(biāo)記來指示是否存在乳房癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌等癌癥。通?？捎帽景l(fā)明所述的結(jié)合劑檢測生物樣品中可與其結(jié)合的HER-2/neu蛋白的水平?？捎镁酆塑账嵋锖吞结榿頇z測編碼HER-2/neu腫瘤蛋白的mRNA水平，這一水平也可指示是否存在癌癥。通常，腫瘤組織內(nèi)的HER-2/neu腫瘤序列水平比正常組織內(nèi)高至少3倍。
有多種已知試驗(yàn)可用結(jié)合劑來檢測樣品中的多肽。參見，例如，Hawlow和Lane，“抗體實(shí)驗(yàn)室手冊”，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。通常，患者是否患有腫瘤可如下測定(a)將取自患者的生物樣品與結(jié)合劑接觸；(b)檢測樣品中與結(jié)合劑結(jié)合的多肽的水平；(c)將該多肽水平與預(yù)定的取舍值比較。
優(yōu)選實(shí)施方式之一中，所述試驗(yàn)包括用固定于固相支持物上的結(jié)合劑結(jié)合本發(fā)明多肽并去除剩余樣品中的多肽。然后用檢測劑檢測結(jié)合的多肽，該檢測劑含有特異性結(jié)合此結(jié)合劑/多肽復(fù)合物的報(bào)道基團(tuán)。這樣的檢測劑可包含，例如，特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的結(jié)合劑或抗體，或特異性結(jié)合該結(jié)合劑的其它物質(zhì)，例如抗免疫球蛋白，G蛋白，A蛋白或凝集素?；蛘撸刹捎酶偁幵囼?yàn)，其中，用報(bào)道基團(tuán)標(biāo)記多肽，經(jīng)結(jié)合劑與樣品共培養(yǎng)讓其與固定化的結(jié)合劑結(jié)合。樣品與固定化結(jié)合劑的反應(yīng)活性可體現(xiàn)樣品中成分抑制標(biāo)記多肽與結(jié)合劑結(jié)合的程度。適用于此類試驗(yàn)的合適多肽包括全長HER-2/neu腫瘤蛋白及其中可與結(jié)合劑結(jié)合的部分，HER-2/neu融合蛋白及其中可與結(jié)合劑結(jié)合的部分。
固相支持物可以是業(yè)內(nèi)已知的各種材料，只要腫瘤蛋白能夠附著。例如，固相支持物可以是微滴板的測試孔，或是硝酸纖維素或其它合適材料的膜?；蛘?，所述支持物可以是玻璃、玻璃纖維、乳膠或聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料的微珠或薄片。所述支持物還可以是磁性顆粒或光纖傳感器，參見美國專利5,359,681。結(jié)合劑可用多種已知技術(shù)固定在固相支持物上，專利及科技文獻(xiàn)中對此有充分的記述。在本發(fā)明中，“固定化”包括吸附等非共價(jià)結(jié)合和共價(jià)結(jié)合(可以是結(jié)合劑與支持物上官能團(tuán)直接連接，也可以通過交聯(lián)劑連接)。優(yōu)選吸附于微滴板的測試孔或膜上的固定化。此時(shí)，吸附可通過在合適緩沖液中使結(jié)合劑與固相支持物接觸足夠的時(shí)間來進(jìn)行。接觸時(shí)間因溫度而異，但一般在1小時(shí)至1天之間。通常，一個(gè)(聚苯乙烯或聚氯乙烯)微滴板的測試孔與約10ng-10μg結(jié)合劑接觸，更好的是100ng-1μg，就足以固定足量的結(jié)合劑。
結(jié)合劑與固相支持物的共價(jià)結(jié)合一般可先讓支持物與雙官能試劑反應(yīng)，該試劑既可與支持物反應(yīng)，又可與結(jié)合劑上的羥基或氨基等官能團(tuán)反應(yīng)。例如，可用苯醌將結(jié)合劑共價(jià)結(jié)合在具有相應(yīng)聚合物包被層的支持物上，或通過支持物上的醛基與結(jié)合劑上的氨基或活潑氫之間的縮合(參見，例如，PierceImmunotechnology Catalog and handbook，1991，A12-13)。
某些實(shí)施方式中，所述的試驗(yàn)是雙抗體夾心試驗(yàn)。該試驗(yàn)先將固定于固相支持物(一般為微滴板的測試孔)上的一種抗體與樣品接觸，使得其中的多肽與固定化抗體結(jié)合。然后去除未結(jié)合的樣品，留下固定化的多肽-抗體復(fù)合物，然后加入含報(bào)道基團(tuán)的檢測劑(以能夠結(jié)合多肽上其它位點(diǎn)的第二抗體為佳)。然后根據(jù)具體的報(bào)道基團(tuán)，用合適的方法檢測仍固定于固相支持物上的檢測劑的量。
更具體地說，在抗體如上所述固定于支持物上后，通常將支持物上的剩余蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)封閉。各種合適的已知封閉劑均可使用，例如牛血清白蛋白或Tween20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。固定化的抗體然后與樣品共培養(yǎng)，讓多肽與抗體結(jié)合。在孵育前，可用合適的稀釋劑，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋樣品。通常，適當(dāng)?shù)慕佑|時(shí)間(即孵育時(shí)間)應(yīng)該足以檢測到乳房癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌或前列腺癌患者樣品中存在的多肽。較好的是，接觸時(shí)間應(yīng)足以使結(jié)合水平達(dá)到結(jié)合與非結(jié)合多肽平衡時(shí)結(jié)合水平的至少95％。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，達(dá)到平衡所需的時(shí)間不難通過測定一段時(shí)間內(nèi)的結(jié)合水平來確定。室溫下，通常孵育約30分鐘為足夠。
然后，用合適的緩沖液，例如含0.1％Tween20的PBS洗滌固相支持物，從而洗去未結(jié)合的樣品。然后在固相支持物上加入含報(bào)道基團(tuán)的第二抗體。優(yōu)選的報(bào)道基團(tuán)可參見前文。
然后，將檢測劑與固定化的抗體-多肽復(fù)合物共孵育足夠的時(shí)間，以檢測結(jié)合的多肽。合適的時(shí)間長短可通過測定一段時(shí)間內(nèi)的結(jié)合水平來確定。然后去除未結(jié)合的檢測劑，并利用報(bào)道基團(tuán)檢測結(jié)合的檢測劑。用來檢測報(bào)道基團(tuán)的方法取決于報(bào)道基團(tuán)的性質(zhì)。對放射性基團(tuán)來說，一般宜采用閃爍計(jì)數(shù)或放射自顯影。分光法可用于檢測染料、發(fā)光基團(tuán)和熒光團(tuán)。生物素可用與其它報(bào)道基團(tuán)(一般為放射性或熒光基團(tuán)或酶)偶聯(lián)的親和素來檢測。酶報(bào)道基團(tuán)一般通過加入底物來檢測(一般需經(jīng)一段特定時(shí)間的反應(yīng))，然后用分光法或其它方法分析反應(yīng)產(chǎn)物。
為了測定是否存在乳房癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌或前列腺癌等癌癥，將仍結(jié)合于固相支持物上的報(bào)道基團(tuán)發(fā)出的信號與相應(yīng)的預(yù)定取舍值比較。優(yōu)選實(shí)施方式之一中，該檢測癌癥的取舍值是將固定化抗體與非癌癥患者的樣品共培養(yǎng)所得信號的平均值。通常，如果樣品產(chǎn)生的信號高于預(yù)定取舍值3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，則認(rèn)為是癌癥陽性。另一優(yōu)選實(shí)施方式中，取舍值用接受者操作者曲線(ReceiverOpertor Curve)，按照Sackett等“臨床流行病學(xué)臨床醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)科學(xué)”，LittleBrown and Co.，1985，p.106-7所述的方法測定。簡而言之，該實(shí)施方式中，將對應(yīng)于診斷結(jié)果各個(gè)可能的取舍值的真陽性率(即靈敏度)和假陽性率(100％特異性)繪制成圖，從該圖測定取舍值。圖中最靠近左上角的取舍值(即包圍面積最大的值)是最準(zhǔn)確的取舍值，如果樣品產(chǎn)生的信號高于該取舍值，則可認(rèn)定為陽性?；蛘撸粢M可能降低假陽性率，可將取舍值沿曲線向左移動，要盡可能降低假陰性率，則可向右移動。通常，如果樣品產(chǎn)生的信號高于如此測得的取舍值，則可認(rèn)定為癌癥陽性。
在一相關(guān)的實(shí)施方式中，所述試驗(yàn)以流過或剝離方式進(jìn)行，其中，將結(jié)合劑固定在硝基纖維素等膜上。在流過式試驗(yàn)中，當(dāng)樣品流過膜時(shí)，樣品中的多肽與固定化的結(jié)合劑結(jié)合。然后，當(dāng)含有第二結(jié)合劑的溶液流過膜時(shí)，其中的經(jīng)標(biāo)記結(jié)合劑與結(jié)合劑-多肽復(fù)合物結(jié)合。然后可如前所述檢測結(jié)合的第二結(jié)合劑。在剝離方式中，將結(jié)合有結(jié)合劑的膜的一端浸在含樣品的溶液中。樣品沿膜遷移，通過含第二結(jié)合劑的區(qū)域，到達(dá)固定化結(jié)合劑所在區(qū)域。根據(jù)固定化抗體所在區(qū)的第二結(jié)合劑濃集確定是否有癌癥。通常，所在處第二結(jié)合劑的濃集會產(chǎn)生目測不難發(fā)現(xiàn)的一定模式，例如一條帶。沒有這樣的模式，即為陰性結(jié)果。通常，膜上固定化結(jié)合劑量的選擇應(yīng)該是當(dāng)生物樣品所含多肽的水平足以在雙抗體夾心試驗(yàn)中產(chǎn)生陽性信號時(shí)，所選的量能夠產(chǎn)生上述可目測分辨的模式。此類試驗(yàn)中較好的結(jié)合劑是抗體及其抗原結(jié)合性片段。較好的是，固定于膜上抗體量在約25ng-1μg，約50ng-500ng為佳。此類試驗(yàn)一般用極少量的生物樣品進(jìn)行。
當(dāng)然，還有許多其它試驗(yàn)方法適用本發(fā)明腫瘤蛋白或本發(fā)明的結(jié)合劑進(jìn)行。以上描述只是舉例。例如，顯而易見的是，上述方法可改用HER-2/neu多肽來檢測生物樣品中可與之結(jié)合的抗體?？蓪⒋祟怘ER-2/neu蛋白質(zhì)特異性抗體的檢測與是否有癌癥相關(guān)聯(lián)。
也可以根據(jù)生物樣品中有否能與HER-2/neu融合蛋白特異性T細(xì)胞來檢測癌癥。在某些方法中，將取自患者的含有CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的生物樣品與HER-2/neu融合多肽，編碼該融合蛋白的聚核苷酸和/或至少表達(dá)該融合多肽的APC共孵育，然后檢測T細(xì)胞是否被特異性地激活。合適的生物樣品包括但不限于分離的T細(xì)胞。例如，可用常規(guī)技術(shù)(例如Ficoll/Hypaque密度梯度離心外周血淋巴細(xì)胞)分離出患者的T細(xì)胞?？蓪細(xì)胞與HER-2/neu融合多肽(例如5-25μg/ml)37℃體外孵育2-9天(一般為4天)。也許需要將另一份T細(xì)胞樣品在無HER-2/neu融合多肽的條件下孵育，作為對照。對CD4+細(xì)胞而言，宜通過評價(jià)T細(xì)胞的增殖來檢測活化現(xiàn)象。對CD8+細(xì)胞而言，宜通過評價(jià)溶胞活性來檢測活化現(xiàn)象。如果與無疾病患者相比，增殖水平高至少2被，和/或溶胞活性高至少20％，則指示患者患有癌癥。
如上所述，還可以根據(jù)生物樣品中編碼HER-2/neu蛋白質(zhì)的mRNA水平檢測癌癥。例如，在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試驗(yàn)中，用至少2個(gè)寡核苷酸引物擴(kuò)增自生物樣品得到的HER-2/neu cDNA的一部分，其中，至少寡核苷酸引物之一對編碼HER-2/neu蛋白質(zhì)的聚核苷酸具有特異性(即可與之雜交)。然后，分離出擴(kuò)增所得cDNA，并用已知方法(例如凝膠電泳)檢測。與此類似，可在雜交試驗(yàn)中使用與編碼HER-2/neu蛋白或融合蛋白的聚核苷酸特異性雜交的寡核苷酸探針，檢測生物樣品中有否編碼HER-2/neu蛋白的聚核苷酸。
為了能在試驗(yàn)條件下雜交，寡核苷酸引物和探針應(yīng)含有一段至少60％，75％，更好的是90％與編碼HER-2/neu蛋白或融合蛋白的聚核苷酸的一部分相同的寡核苷酸序列，并且，長至少10個(gè)核苷酸，至少20個(gè)核苷酸更好。較好的是，寡核苷酸引物和/或探針在前述中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼HER-2/neu蛋白或融合蛋白的聚核苷酸雜交。適用于本發(fā)明診斷方法的寡核苷酸引物和/或探針以長10-40個(gè)核苷酸為佳。優(yōu)選實(shí)施方式之一中的寡核苷酸長至少10個(gè)毗連核苷酸，至少15個(gè)毗連核苷酸更好，具有SEQ ID NO6或7序列的DNA分子。PCR和雜交試驗(yàn)技術(shù)都是業(yè)內(nèi)已知的(參見，Mullis等(1987)冷泉港定量生物學(xué)學(xué)會，51263；Erlich編輯，PCR技術(shù)，Stockton Press，NY，1989)。
優(yōu)選試驗(yàn)之一使用RT-PCR，即與逆轉(zhuǎn)錄相結(jié)合的PCR。通常，從生物樣品，例如活檢組織中抽提RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分子。使用至少一種特異性引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一種cDNA分子，并通過例如凝膠電泳使之分離和展現(xiàn)?？梢詫Υ郎y患者或非癌癥個(gè)體的生物樣品進(jìn)行擴(kuò)增?？蓪缭?個(gè)數(shù)量級的數(shù)個(gè)稀釋度的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。如果待測患者樣品的幾個(gè)稀釋度的擴(kuò)增都比同一稀釋度的非癌癥樣品高2倍以上，則認(rèn)定為陽性。
另一實(shí)施方式中，HER-2/neu蛋白或融合蛋白及其編碼聚核苷酸被用作標(biāo)記，以監(jiān)測癌癥的發(fā)展。這種實(shí)施方式中，可在一段時(shí)間內(nèi)多次進(jìn)行上述癌癥診斷，然后評價(jià)反應(yīng)性多肽水平的變化。例如，可以在6個(gè)月至1年的時(shí)間內(nèi)，每隔24-72小時(shí)進(jìn)行一次試驗(yàn)，然后根據(jù)需要進(jìn)行試驗(yàn)。通常，如果用結(jié)合劑測得，患者體內(nèi)的多肽水平隨時(shí)間升高，說明該患者體內(nèi)的癌癥在發(fā)展。相反，如果反應(yīng)性多肽的水平維持恒定或隨時(shí)間下降，則表示癌癥沒有發(fā)展。
癌癥的體內(nèi)診斷試驗(yàn)可直接對腫瘤進(jìn)行。此類試驗(yàn)包括將腫瘤細(xì)胞與結(jié)合劑接觸，然后直接檢測被結(jié)合的結(jié)合劑，或通過報(bào)道基團(tuán)進(jìn)行檢測。此類結(jié)合劑還可用于組織學(xué)方法。或者，可將聚核苷酸探針用于此類方法。
如上所述，要提高靈敏度，可對給定樣品中的多種HER-2/neu融合蛋白標(biāo)記進(jìn)行分析。顯然，可將本發(fā)明所述的不同蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合劑聯(lián)合用于同一試驗(yàn)。而且，可同時(shí)使用多種引物或探針?？筛鶕?jù)常規(guī)實(shí)驗(yàn)選擇腫瘤蛋白標(biāo)記，以確定最佳靈敏度的引物或探針的組合。此外，針對本發(fā)明腫瘤蛋白的試驗(yàn)還可以與用于其它已知腫瘤抗原的試驗(yàn)聯(lián)用。
B.診斷試劑盒本發(fā)明還提供了一種用于上述診斷方法的試劑盒。這樣的試劑盒一般包括進(jìn)行診斷試驗(yàn)所必需的兩個(gè)或更多個(gè)組件。所述組件可以是化合物、反應(yīng)試劑、容器和/或儀器。例如，試劑盒中的一個(gè)容器內(nèi)含有特異性結(jié)合HER-2/neu融合蛋白的單克隆抗體或其片段。所述的抗體或其片段可以已經(jīng)(如前所述)結(jié)合于支持物上。另外的一個(gè)或多個(gè)容器可含有試驗(yàn)需用的試劑或緩沖液等?；蛘?，這樣的試劑盒還含有如前所述的檢測劑，該檢測劑具有適合直接或間接檢測抗體結(jié)合現(xiàn)象的報(bào)道基團(tuán)。
或者，可將試劑盒設(shè)計(jì)成可檢測生物樣品中編碼HER-2/neu蛋白質(zhì)的mRNA水平。這樣的試劑盒一般包括至少一種前述核苷酸探針或引物，它們可與編碼HER-2/neu蛋白或融合蛋白的聚核苷酸雜交。例如，可將這樣的寡核苷酸用于PCR或雜交試驗(yàn)。此類試劑盒中的其它組件可以包括協(xié)助檢測編碼HER-2/neu蛋白的聚核苷酸的第二種寡核苷酸和/或診斷試劑或容器。
本發(fā)明分別并全面地參考了本說明書中提及的各篇出版物和專利。
雖然，為了清楚的理解本發(fā)明，通過說明和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了較為詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員不難看出，根據(jù)本文所述，在后文權(quán)利要求書的精神和范圍中，可以進(jìn)行某些修改。
實(shí)施例以下實(shí)施例以說明為目的，并非限定，本發(fā)明的范圍僅由后文權(quán)利要求書限定。
在實(shí)施例中，普通分子生物學(xué)試劑，例如寡核苷酸引物、Lipofectamine和限制性核酸內(nèi)切酶，主要購自Gibco/BRL(Grand Island，NY)。限制性核酸內(nèi)切酶AatII和PflM-1購自New England Biolabs(Beverly，MA)。HER-2/neu ELISA試驗(yàn)試劑盒和HER-2/neu特異性單克隆抗體Ab-3購自O(shè)ncogene Science(Manhasset，NY)。pFLAGCMV-1表達(dá)載體和FLAG-Tag M2抗體購自Kodak(Rochester，NY)。Pfu聚合酶購自Strategene(La Jolla，CA)。pcDNA3.1/hyg表達(dá)載體購自Invitrogen(Carlsbad，CA)。
實(shí)施例1HER-2/neu ICD、KD和PD片段進(jìn)入pFLAGCMV-1表達(dá)載體的克隆用聚合酶鏈反應(yīng)分別制備編碼胞內(nèi)域(ICD)、激酶區(qū)(KD)和磷酸化區(qū)(PD)的HER-2/neu DNA片段。分別在它們的5＇和3＇末端引入限制性消化位點(diǎn)HindIII和XhoI。這樣的設(shè)計(jì)可將這些DNA片段克隆入pFLAGCMV-1表達(dá)載體(Kodak)，并與它們N末端的前胰蛋白酶原前導(dǎo)序列和FLAG-尾同框。凝膠純化PCR產(chǎn)物，將其克隆到pFLAGCMV-1的HindIII和XhoI位點(diǎn)。所得的表達(dá)質(zhì)粒稱為pFLAGCMV-1/ICD(圖1)，pFLAGCMV-1/KD(圖2)和pFLAGCMV-1/PD(圖3)。
實(shí)施例2ECD-PD融合蛋白進(jìn)入pcDNA3.1/hyg表達(dá)載體的克隆用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增編碼HER-2/neu PD的DNA片段。凝膠純化后，將其克隆到pT7-HER-2/neu質(zhì)粒中的AatII和XhoI位點(diǎn)。由此得到一個(gè)新的克隆載體，pT7/ECD-PD，它將ECD與PD連接在一起(包括跨膜域的一個(gè)Ser)。pT7/ECD-PD質(zhì)粒用HindIII和XhoI在37℃消化1小時(shí)。凝膠純化編碼ECD-PD融合蛋白的2.7kb DNA片段，并亞克隆到pcDNA3.1/hyg(Invitrogen)的HindIII和XhoI位點(diǎn)。所得的表達(dá)載體稱為pcDNA3.1/hyg/ECD-PD(圖5)。
實(shí)施例3
HER2/neu ICD、KD和PD片段在HEK-293細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)用pFLAGCMV-1表達(dá)載體(Kodak)確定HER-2/neu胞內(nèi)域中哪一段可分泌到培養(yǎng)液中。所表達(dá)的蛋白是N末端帶有前胰蛋白酶原分泌信號和FLAG-尾的融合蛋白，參見實(shí)施例1。
如下轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)表達(dá)ICD、KD和PD的細(xì)胞系將人胎腎成纖維細(xì)胞(HEK-293)培養(yǎng)在Dulbecco改良的Eagle＇s培養(yǎng)液中，其中含10％胎牛血清。轉(zhuǎn)染前1天，在6孔板的每孔中接種1.5×105個(gè)細(xì)胞。在無血清培養(yǎng)基中，用1μg質(zhì)粒DNA，通過lipofectamine(Gibeo/BRL)法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。72小時(shí)后收獲培養(yǎng)液和細(xì)胞。為了選出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)在含200μg/ml潮霉素的培養(yǎng)基中。
如下所述，通過Western印跡法檢測細(xì)胞和培養(yǎng)基中有否FLAG-尾融合蛋白在7.5％SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞的培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解物。將蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯(PVDF)濾膜上。該P(yáng)VDF膜先在5％牛血清白蛋白的TBST(20mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，0.01％Tween 20)溶液中孵育1小時(shí)，然后與第一抗體一起孵育1小時(shí)，最后與過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體孵育1小時(shí)。免疫斑點(diǎn)用ECL系統(tǒng)(AmershamCorp.)顯影。用小鼠單克隆抗體c-neuAb-3(“Ab-3”)(Oncogene Science)檢測HER-2/neu蛋白。Ab-3識別人HER-2/neu蛋白的羧基末端。為了檢測FLAG-尾融合蛋白，用M2單克隆抗體(Kodak)作為第一抗體進(jìn)行分析。
圖4所示的結(jié)果顯示，全長的ICD和KD都不分泌，但PD被分泌到培養(yǎng)液中。該結(jié)果表明，KD的結(jié)構(gòu)使得蛋白質(zhì)無法通過細(xì)胞膜。
實(shí)施例4用pcDNA3.1/hyg表達(dá)載體在HEK-293和CHO細(xì)胞中表達(dá)ECD-PD融合蛋白如實(shí)施例2所述構(gòu)建N末端帶有前胰蛋白酶原分泌信號和FLAG-尾的ECD-PD融合蛋白。
如下轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)表達(dá)ECD-PD的細(xì)胞系將HEK-293細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)培養(yǎng)在Dulbecco改良的Eagle＇s培養(yǎng)液中，其中含10％胎牛血清。轉(zhuǎn)染前1天，在6孔板的每孔中接種1.5×105個(gè)細(xì)胞。在無血清培養(yǎng)基中，用1μg質(zhì)粒DNA，通過lipofectamine(Gibco/BRL)法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。72小時(shí)后收獲培養(yǎng)液和細(xì)胞。為了選出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)在含200μg/ml潮霉素的培養(yǎng)基中。
如下所述，用HER-2/neu ECD特異性抗體，通過ELISA試驗(yàn)檢測可溶性ECD-PD融合蛋白的分泌先用能捕獲樣品中的HER-2/neu蛋白的HER-2/neu特異性小鼠抗體(Oncogene Science)覆蓋微滴板。待測樣品與檢測抗體在微滴板中室溫孵育1小時(shí)，然后再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體孵育1小時(shí)。加入過氧化物酶的底物鄰苯二胺后，可形成有顏色的產(chǎn)物。通過比色法定量檢測有色產(chǎn)物。以490nm處的吸光度代表樣品中neu蛋白的量。
然后，如下所述，用HER-2/neu PD特異性抗體，通過Western印跡法測定可溶性ECD-PD融合蛋白的分泌在7.5％SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞的培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解物。將蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯(PVDF)濾膜上。該P(yáng)VDF膜先在5％牛血清白蛋白的TBST(20mM Tris，pH7.5，150mMNaCl，0.01％Tween 20)溶液中孵育1小時(shí)，然后與第一抗體一起孵育1小時(shí)，最后與過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體孵育1小時(shí)。免疫斑點(diǎn)用ECL系統(tǒng)(Amersham Corp.)顯影。用小鼠Ab-3單克隆抗體(Oncogene Science)檢測HER-2/neu蛋白。Ab-3識別人HER-2/neu蛋白的羧基末端。為了檢測FLAG-尾融合蛋白，用M2單克隆抗體(Kodak)作為第一抗體進(jìn)行分析。結(jié)果見圖6。
實(shí)施例5用以下引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備圖13(SEQ ID NO17)所示的人ECD-ΔPD融合蛋白PDM-2515＇-cctgaatcgcgaacccaagtgtgcaccggcac-3＇(SEQ ID NO15)，Tm69℃PDM-2795＇-ctggactcgagtcattagcggtgcctgtggtgg-3＇(SEQ ID NO16)，Tm69℃聚合酶鏈反應(yīng)條件如下10μl 10×Pfu緩沖液(Stratagen)，1μl 10Mm dNTPs，10μM寡核苷酸各2μl，83μl無菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶，和50ng模板，96℃，2分鐘，1輪；(96℃20秒，69℃15秒，72℃5分鐘)×40輪；72℃5分鐘，1輪。PCR產(chǎn)物用NruI和XhoI消化，克隆到pPDM His載體中(改造的pET28載體，具有與鈍端限制性酶切點(diǎn)Eco72I同框的His尾，用Eco72I和XhoI剪切。驗(yàn)證序列，然后將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到用于大腸桿菌表達(dá)的BL21 pLys s中。然后用BamHI和XhoI消化該質(zhì)粒構(gòu)建物，克隆到pcDNA3.1/hyg/ECD-PD中，并用同樣的限制性酶剪切。
實(shí)施例6人ECD-PD-CT-His尾融合蛋白在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)如實(shí)施例2所述，將人ECD-PD融合蛋白克隆到pcDNA3.1/hyg載體中，以此作為模板構(gòu)建與C末端6His尾同框的hECD-PD。用以下引物通過PCR擴(kuò)增hECD-PDAWO28 hECD-PD有義引物，帶有NcoI位點(diǎn)5＇-GGGccatggggAGCACCCAAGTGTGCACCGGC-3＇(SEQ ID NO17)AWO29 hECD-PD反義引物，帶有XhoI位點(diǎn)，無中止子5＇-GGGctcgagCACTGGCACGTCCAGACCCAGG-3＇(SEQ ID NO18)用NcoI和XhoI限制酶剪切PCR產(chǎn)物，純化，連接到已用上述兩種酶線性化的pET28B表達(dá)載體中。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化NovaBlue細(xì)胞，挑選幾個(gè)集落進(jìn)行篩選。其中，通過DNA測序檢驗(yàn)出hECD-PD.CTHis克隆，用于此后的蛋白質(zhì)表達(dá)。
為了表達(dá)蛋白質(zhì)，將hECD-PD.CTHis克隆轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)CodonPlus-RIU大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。用轉(zhuǎn)化形成的克隆進(jìn)行一次標(biāo)準(zhǔn)的小量表達(dá)篩選，以測定誘導(dǎo)得率。將細(xì)胞培養(yǎng)在TB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)2小時(shí)，可獲得最佳結(jié)果。
然后用monoQ柱純化大腸桿菌生成的hECD-PD.CTHis，在20mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液中恢復(fù)折疊。通過Western印跡法和ELISA檢驗(yàn)折疊后蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)為Herceptin結(jié)合陽性(圖17)。然而，Herceptin結(jié)合活性隨后會喪失，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)發(fā)生了變性。
實(shí)施例7人NT-His尾-ECD-PD融金蛋白在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)將人ECD-PD融合蛋白克隆在5＇有NdeI位點(diǎn)，3＇端有XhoI位點(diǎn)的pPDM表達(dá)載體中。ECD-PD插入片段與N末端的6His尾同框融合。
為了表達(dá)蛋白質(zhì)，將含有NT-his-ECD-PD融合蛋白的pPDM載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)CodonPlus-RIU大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。用轉(zhuǎn)化形成的克隆進(jìn)行一次標(biāo)準(zhǔn)的小量表達(dá)篩選，以測定誘導(dǎo)得率。將細(xì)胞培養(yǎng)在TB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)2小時(shí)，可獲得最佳結(jié)果。
大腸桿菌產(chǎn)生的未純化NT-his-ECD-PD融合蛋白可被小鼠c-neu-3抗體和兔-抗ECD抗體識別。純化后，在Western印跡和ELISA中，大腸桿菌產(chǎn)生的NT-his-ECD-PD都可被Herceptin識別(圖17)。
實(shí)施例8小鼠ECD-PD-CT-His尾融合蛋白在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)參照實(shí)施例2中人ECD-PD融合蛋白的克隆，將小鼠ECD-PD融合蛋白克隆在poDNA3.1載體中。然后以該構(gòu)建物為模板構(gòu)建與C末端6His尾同框的mECD-PD，6His尾后為中止密碼子。用以下引物對mECD-PD/pcDNA3.1構(gòu)建物內(nèi)部的NcoI位點(diǎn)(ORF第1932位堿基對)進(jìn)行定點(diǎn)沉默誘變AWO038引物5＇-GGCCCCTCCAGCCCGATGGACAGCACCTTCTACCG-3＇(SEQ ID NO19)AWO039引物5＇-CGGTAGAAGGTGCTGTCCATCGGGCTGGAGGGGCC-3＇(SEQ IDNO20)檢驗(yàn)序列后，用以下引物PCR擴(kuò)增mECD-PD融合構(gòu)建物AWO036引物，含NcoI限制酶位點(diǎn)5＇-GGGccatggGTACCCAAGTGTGTACCGG-3＇(SEQ ID NO21)AWO037引物，含XhoI限制酶位點(diǎn)5＇-GGGctcgagTCAATGGTGATGGTGATGGTGTCATGGCACATCCAGGCCTAGGTACTCAGGG-3＇(SEQ ID NO22)然后，用NcoI和XhoI限制酶剪切PCR產(chǎn)物，純化，連接到已用上述兩種限制酶線性化的pET28b表達(dá)載體中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到NovaBlue中，產(chǎn)生多個(gè)克隆，挑選4個(gè)克隆進(jìn)行測序。其中，選出序列正確的mECD-PD.CThis克隆，將其轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)CodonPlus-RIU大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。用轉(zhuǎn)化形成的克隆進(jìn)行一次標(biāo)準(zhǔn)的小量表達(dá)篩選，以測定誘導(dǎo)得率。將細(xì)胞培養(yǎng)在2xYT培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)3小時(shí)，可獲得最佳結(jié)果。
實(shí)施例9Ra12-mECD-PD-CT-His尾融合蛋白在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)如實(shí)施例8所述，將小鼠ECD-PD融合蛋白克隆到pET28b表達(dá)載體中。用5＇端和3＇端加有NcoI位點(diǎn)的以下PCR片段擴(kuò)增Ra12序列Ra12.JC055＇-CCGccatggGCACGGCCGCGTCCGATAACTTCC-3＇(SEQ IDNO23)Ra12.JC065＇-GCGccatggCGGCCGGGGGTCCCTCGGCC-3＇(SEQ ID NO24)為了獲得與mECD-PD融合的Ra12佐劑，用NcoI限制酶消化Ra12的PCR產(chǎn)物，連接到經(jīng)NcoI消化和CIAP處理的pET28b-mECD-PD載體中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到NovaBlue細(xì)胞中，得到多個(gè)克隆。由于是非方向特異性連接，挑選雙倍克隆進(jìn)行質(zhì)粒的小量制備。通過AfiIII限制酶消化來篩選插入方向正確的克隆。對少量方向正確的克隆進(jìn)行分析。將序列正確的克隆轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)CodonPlus-RIU大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。用轉(zhuǎn)化形成的克隆進(jìn)行一次標(biāo)準(zhǔn)的小量表達(dá)篩選，以測定誘導(dǎo)得率。將細(xì)胞培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)3小時(shí)，可獲得最佳結(jié)果。
實(shí)施例10LeIF.mECD-PD-CT-His尾融合蛋白在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)如實(shí)施例8所述，將小鼠ECD-PD融合蛋白克隆到pET28b表達(dá)載體中。用5＇端和3＇端加有NcoI位點(diǎn)的以下PCR片段擴(kuò)增LeIF序列LeIF.JC035＇-CGCccatggCGCAGAATGATAAGATCGCCC-3＇(SEQ IDNO25)LeIF.JC045＇-GCCccatggCGTCGCGCATGAACTTCTTCGTC-3＇(SEQ IDNO26)為了獲得與mECD-PD融合的LeIF佐劑，用NcoI限制酶消化LeIF PCR產(chǎn)物，將其連接到經(jīng)NcoI消化和CIAP處理的pET28b-mECD-PD載體中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到NovaBlue細(xì)胞中，得到多個(gè)克隆。由于是非方向特異性連接，挑選雙倍克隆進(jìn)行質(zhì)粒的小量制備。通過KpnI限制酶消化來篩選插入方向正確的克隆。對少量方向正確的克隆進(jìn)行分析。將序列正確的克隆轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)CodonPlus-RIU大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。用轉(zhuǎn)化形成的克隆進(jìn)行一次標(biāo)準(zhǔn)的小量表達(dá)篩選，以測定誘導(dǎo)得率。將細(xì)胞培養(yǎng)在2xYT培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)3小時(shí)，可獲得最佳結(jié)果。
實(shí)施例11ECD-PD融合蛋白在畢赤氏酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)設(shè)計(jì)用于在畢赤氏酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的ECD-PD重組蛋白與用于CHO表達(dá)的相同，但有兩處改動(i)HER-2/neu基因的天然分泌信號序列被釀酒酵母的αpre-pro信號序列取代；(ii)在重組蛋白的C末端增加一個(gè)甘氨酸和6個(gè)組氨酸。
用Spheroplast法，將ECD-PD融合蛋白表達(dá)盒整合到SMD1168畢赤氏酵母細(xì)胞株中。通過定量斑點(diǎn)印跡分析，從250個(gè)克隆中挑選出6個(gè)多拷貝整合克隆。選出的克隆在緩沖甲醇—復(fù)合培養(yǎng)基(BMMY-1％甲醇)中振蕩誘導(dǎo)72小時(shí)。6個(gè)候選克隆在無細(xì)胞上清液和全細(xì)胞提取物中的表達(dá)情況相同。
在無細(xì)胞上清液中，全長ECD-PD重組蛋白的分泌很弱，只能在Western印跡中用c-neu-3小鼠抗體(Calbiochem)檢測到。在銀染色SDS-PAGE上可看到一種+70kDa蛋白質(zhì)的分泌和累積(72小時(shí)后達(dá)到最大)，這也可以用Herceptin小鼠抗體在非還原條件下進(jìn)行Western印跡檢測到。該蛋白質(zhì)無法用小鼠c-neu-3抗體或小鼠抗組氨酸抗體(QIAGEN)檢測。
在細(xì)胞總抽提物中，用DAIICHI染色試劑盒進(jìn)行的銀染色SDS-PAGE上，沒有發(fā)現(xiàn)特定條帶。在用小鼠c-neu-3抗體或小鼠抗組氨酸抗體進(jìn)行的Western印跡上檢測到2條帶。其中一條的分子量與CHO細(xì)胞表達(dá)并分泌的ECD-PD產(chǎn)物相同。另一條看似“污點(diǎn)”，約100-120kDa。這兩個(gè)信號反映保留在E.R.內(nèi)的重組蛋白，表明有多種不同的糖基化形式。
實(shí)施例12ECD-PD和ECD-ΔPD融合蛋白在CHOK1細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)用XbaI限制酶消化pcDNA3.1/hyg/ECD-PD和pcDNA3.1/hyg/ECD-ΔPD質(zhì)粒，凝膠純化含ECD-PD和ECD-ΔPD的DNA片段，分別得到2783bp和2166bp的XbaI片段。將片段各自轉(zhuǎn)染到已用XbaI(CMV立即早期啟動子下游的克隆位點(diǎn))線性化的pEE14-GS載體(CellTech)。連接后，將其轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。用限制酶消化分析了16個(gè)集落，其中2個(gè)為ECD-PD陽性，1個(gè)為ECD-ΔPD陽性。大規(guī)模制備所得的質(zhì)粒，用雙CsCl-EtBr梯度離心純化。對質(zhì)粒進(jìn)行限制酶消化分析，以及插入片段和載體間5＇和3＇端連接序列的測序，沒有發(fā)現(xiàn)異常。
通過經(jīng)典DNA磷酸鈣共沉淀技術(shù)，用pEE14-ECD-PD和pEE14-ECD-ΔPD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染來自Master Cell Bank MCB CHO-K1 028W 1996/2 SHF P31的CHO-K1細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)于無血清條件下。計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)移到96孔板上，每孔5000個(gè)細(xì)胞。按照Grockett等(1990)生物技術(shù)8662所述的谷氨酰胺合成酶(GS)表達(dá)系統(tǒng)方法挑選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在30μM甲硫氨酸亞硫酰亞胺(methionine sulphoximine)(MSX)存在下，在無谷氨酰胺而加有添加劑(甘氨酸/天冬酰胺/核苷酸)和5％經(jīng)透析胎牛血清(FBS)的GMEM培養(yǎng)基中擴(kuò)增。轉(zhuǎn)染后的第一周，細(xì)胞洗滌3次，第二周洗滌2次。第三次洗滌時(shí)，加入20％條件培養(yǎng)基。為了提高選擇水平，經(jīng)5次洗滌后，將MSX濃縮提高到50μM。
轉(zhuǎn)染3-5周后，將MSX轉(zhuǎn)染子克隆轉(zhuǎn)移到24孔板上，收獲培養(yǎng)物上清液。通過Hercptin抗體非還原條件下的Westone印跡分析檢測ECD-PD或ECD-ΔPD融合蛋白的表達(dá)。被測52個(gè)克隆中的18個(gè)可檢測到ECD-PD融合蛋白表達(dá)，被測47個(gè)克隆中的13個(gè)為ECD-ΔPD表達(dá)陽性。挑選出表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞，重新進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)。根據(jù)表達(dá)水平、生長情況和細(xì)胞活力，進(jìn)一步對5個(gè)帶有ECD-PD構(gòu)建物的克隆和3個(gè)帶有ECD-ΔPD構(gòu)建物的克隆進(jìn)行了評價(jià)和鑒定。就ECD-PD而言，克隆560F3的表達(dá)水平最高。
在33℃，丁酸鈉(2mM)和DMSO(2％)存在和不存在的條件下，評價(jià)表達(dá)水平。部分克隆可用NaB或DMSO誘導(dǎo)。ECD-PD和ECD-ΔPD在CHO-K1細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分析為進(jìn)行Western印跡和銀染色或考馬斯染色的SDS-PAGE。Western印跡分析使用Herceptin和c-neu-3小鼠單克隆抗體，以及8029K兔多克隆抗體。對ECD-PD和ECD-ΔPD克隆培養(yǎng)上清液的分析在銀染色或考馬斯染色凝膠上顯示各自150kDa和98kDa的條帶。用Hercptin和8029K多克隆抗血清以及只具有ECD-PD特異性的c-neu-3抗體也發(fā)現(xiàn)同樣的條帶(圖18)。CHO表達(dá)的HER-2/neu融合蛋白可被Herceptin抗體識別(圖18)。
還就不同細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性對融合蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了跟蹤。對5個(gè)ECD-PD克隆和2個(gè)ECD-ΔPD克隆進(jìn)行了傳代跟蹤，用Western印跡分析表達(dá)穩(wěn)定性。被測的7個(gè)克隆中，4個(gè)在傳代32次后仍然穩(wěn)定，但其中之一的死亡率很高，另一個(gè)則產(chǎn)生大細(xì)胞。
用最佳的2個(gè)ECD-PD和ECD-ΔPD克隆進(jìn)行小規(guī)模生產(chǎn)。將細(xì)胞于33℃懸浮培養(yǎng)于存在2mM丁酸鈉的無血清條件下，120小時(shí)。用Herceptin抗體進(jìn)行Western印跡和用Daiichi試劑盒進(jìn)行銀染色的SDS-PAGE，如此評價(jià)兩種融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種融合蛋白的表達(dá)都在+/-100μg/ml水平。
實(shí)施例13CHO細(xì)胞表達(dá)的ECD-PD和ECD-ΔPD融合蛋白的純化經(jīng)CHO細(xì)胞表達(dá)并分泌后，通過Q瓊脂糖高效柱上的陰離子交換層析純化ECD-PD和ECD-ΔPD融合蛋白。上清液上柱前，用1N HCl將pH調(diào)至6.5。用1ml的Q瓊脂糖高效樹脂(Pharmacia)充填C10/10柱(Pharmacia)，用于層析。
層析柱先平衡10倍柱體積的H2O，流速4ml/min，然后是1倍柱體積的0.5MNaCl，流速4ml/min，和10倍柱體積的緩沖液A(20mM Bis-Tris丙烷pH6.5-50mMNaCl)，流速4ml/min。然后上樣，以1ml/min流速通過。然后用緩沖液A以1ml/min流速洗柱，直至280nm的OD降至0.1，接著進(jìn)行20倍柱體積的洗滌。洗脫前，逆向流動，并進(jìn)行一步3倍柱體積的洗滌。
用1ml/min的流速洗脫，先用緩沖液B(20mM Bis-Tris丙烷pH6.5-250mMNaCl)，然后用緩沖液C(20mM Bis-Tris丙烷pH6.5-1mM NaCl)。有意義的融合蛋白由緩沖液B洗出。
接著，通過苯基瓊脂糖6快速低取代疏水層析進(jìn)一步純化融合蛋白。在含有ECD-PD和ECD-ΔPD融合蛋白的洗脫液(緩沖液B洗脫液)中加入固體硫酸銨(AMS)(140g/L溶液)，使得AMS濃度為1M。將該溶液的pH校正至7.0。
層析用0.5ml苯基瓊脂糖6快速低取代(Pharmacia)和C10/10柱(Pharmacia)進(jìn)行。然后，進(jìn)行柱平衡10倍柱體積的H2O，流速4ml/min，1倍柱體積的0.5MNaOH，流速4ml/min，和10倍柱體積的緩沖液D(1mM PO4pH7.0-1mM AMS)，流速4ml/min。然后上樣，以0.5ml/min流速通過。然后用緩沖液D以1ml/min流速洗柱，直至280nm的OD降至基線，接著進(jìn)行10倍柱體積1ml/min流速的洗滌。洗脫前，逆向流動，并進(jìn)行一步3倍柱體積的洗滌。用緩沖液E(1mM PO4pH7.0)洗脫，1ml/min。
進(jìn)行SDS-PAGE，然后用Daiichi試劑盒銀染色，并用8029K兔多克隆抗體或小鼠Herceptin抗體進(jìn)行Western印跡，如此分析經(jīng)純化的融合蛋白。分析顯示，根據(jù)光密度(Bioard GS-700造影光密度計(jì))，兩步純化后的純度水平約+/-90％。Western印跡分析顯示，純化過程中，單體始終是主帶，氧化水平?jīng)]有升高，而且，根據(jù)Herceptin抗體分析顯示，純化條件沒有改變有義表位的檢測結(jié)果。用蛋白質(zhì)比色試驗(yàn)(DOC TCA BCA)測定回收所得各融合蛋白的總量。該試驗(yàn)估計(jì)，從75ml培養(yǎng)物可分別純化得到2mg ECD-PD融合蛋白和4mg ECD-ΔPD融合蛋白，純度為+/-90％。
權(quán)利要求
1.一種分離的蛋白質(zhì)，其中，HER-2/neu胞外域與HER-2/neu磷酸化區(qū)融合，該蛋白質(zhì)能夠在溫血?jiǎng)游镏幸鹈庖邞?yīng)答。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的序列至少80％與SEQ IDNO6相同，或者，該蛋白質(zhì)中一段至少80％與SEQ ID NO3相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO4相同的序列融合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中，一段至少80％與SEQ ID NO3相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO2中Gln991-Val1256相同的氨基酸序列直接融合，或者，其中，一段至少80％與SEQ ID NO3相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO2中Gln991-Val1256相同的氨基酸序列融合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中，一段至少80％與SEQ ID NO8相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO4相同的序列直接融合，或者，其中，一段至少80％與SEQ ID NO8相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO4相同的序列融合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中，一段至少80％與SEQ ID NO8相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO2中Gln991-Val1256相同的氨基酸序列直接融合，或者，其中，一段至少80％與SEQ ID NO8相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO2中Gln991-Val1256相同的氨基酸序列融合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中HER-2/neu的胞外域與HER-2/neu磷酸化區(qū)通過化學(xué)接頭融合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)，其中的化學(xué)接頭是氨基酸接頭。
8.一種編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子。
9.一種病毒載體，含有編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的聚核苷酸序列。
10.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)和藥學(xué)上認(rèn)可的載體或稀釋劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，該組合物是疫苗。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，還包含免疫刺激物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中的蛋白質(zhì)包含在水包油乳液中。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中所含免疫刺激物是SBAS2，3D-MPL，QS21，或3D-MPL與QS21相組合。
15.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求8所述的核酸分子，和藥學(xué)上認(rèn)可的載體或稀釋劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物組合物，該組合物是疫苗。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物組合物，還包含免疫刺激物。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物組合物，所述的核酸分子是DNA分子。
19.一種激發(fā)或增強(qiáng)對HER-2/neu蛋白質(zhì)免疫應(yīng)答的方法，包括給予溫血?jiǎng)游锛ぐl(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答有效量的權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，所述蛋白質(zhì)以疫苗的形式給藥。
21.一種激發(fā)或增強(qiáng)對HER-2/neu蛋白質(zhì)免疫應(yīng)答的方法，包括給予溫血?jiǎng)游锛ぐl(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答有效量的權(quán)利要求8所述核酸分子。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，所述核酸分子以疫苗的形式給藥。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，所述給予步驟包括先用所述核酸分子體外轉(zhuǎn)染溫血?jiǎng)游锏募?xì)胞，然后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞回輸給溫血?jiǎng)游铩?br> 24.一種激發(fā)或增強(qiáng)對HER-2/neu蛋白質(zhì)免疫應(yīng)答的方法，包括予溫血?jiǎng)游锛ぐl(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答有效量的權(quán)利要求9所述病毒載體。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中的給予步驟包括用所述病毒載體體外轉(zhuǎn)染溫血?jiǎng)游锏募?xì)胞，然后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞回輸給溫血?jiǎng)游铩?br> 26.一種分離的蛋白質(zhì)，其中HER-2/neu的胞外域與HER-2/neu磷酸化區(qū)的片段融合，該蛋白質(zhì)能夠在溫血?jiǎng)游镏幸鹈庖邞?yīng)答。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有一段至少80％與SEQ IDNO7相同的序列，或者該蛋白質(zhì)中一段至少80％與SEQ ID NO3相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO5相同的序列融合。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的蛋白質(zhì)，其中一段至少80％與SEQ ID NO3相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO2中Gln991-Arg1049相同的序列直接融合，或者，其中一段至少80％與SEQ ID NO3相同的序列與一段至少80％與SEQID NO2中Gln991-Arg1049相同的序列融合。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的蛋白質(zhì)，其中一段至少80％與SEQ ID NO8相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO5相同的序列直接融合，或者，其中一段至少80％與SEQ ID NO8相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO5相同的序列融合。
30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的蛋白質(zhì)，其中一段至少80％與SEQ ID NO8相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO2中Gln991-Arg1049相同的序列直接融合，或者，其中一段至少80％與SEQ ID NO8相同的序列與一段至少80％與SEQID NO2中Gln991-Arg1049相同的序列融合。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的蛋白質(zhì)，其中HER-2/neu的胞外域與HER-2/neu磷酸化區(qū)通過化學(xué)接頭融合。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的蛋白質(zhì)，其中的化學(xué)接頭是氨基酸接頭。
33.一種編碼權(quán)利要求26所述蛋白質(zhì)的核酸分子。
34.一種病毒載體，含有編碼權(quán)利要求26所述蛋白質(zhì)的聚核苷酸序列。
35.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求26所述蛋白質(zhì)和藥學(xué)上認(rèn)可的載體或稀釋劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的藥物組合物，該組合物是疫苗。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的藥物組合物，還包含免疫刺激物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的藥物組合物，其中的蛋白質(zhì)包含在水包油乳液中。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的藥物組合物，其中所含免疫刺激物是SBAS2，3D-MPL，QS21，或3D-MPL與QS21相組合物。
40.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求8所述的核酸分子，和藥學(xué)上認(rèn)可的載體或稀釋劑。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的藥物組合物，該組合物是疫苗。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的藥物組合物，還包含免疫刺激物。
43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的藥物組合物，所述的核酸分子是DNA分子。
44.一種激發(fā)或增強(qiáng)對HER-2/neu蛋白質(zhì)免疫應(yīng)答的方法，包括給予溫血?jiǎng)游锛ぐl(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答有效量的權(quán)利要求26所述蛋白質(zhì)。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，所述蛋白質(zhì)以疫苗的形式給藥。
46.一種激發(fā)或增強(qiáng)對HER-2/neu蛋白質(zhì)免疫應(yīng)答的方法，包括給予溫血?jiǎng)游锛ぐl(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答有效量的權(quán)利要求33所述核酸分子。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，所述核酸分子以疫苗的形式給藥。
48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，所述的給予步驟包括先用所述核酸分子體外轉(zhuǎn)染溫血?jiǎng)游锏募?xì)胞，然后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞回輸給溫血?jiǎng)游铩?br> 49.一種激發(fā)或增強(qiáng)對HER-2/neu蛋白質(zhì)免疫應(yīng)答的方法，包括予溫血?jiǎng)游锛ぐl(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答有效量的權(quán)利要求34所述病毒載體。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中的給予步驟包括用所述病毒載體體外轉(zhuǎn)染溫血?jiǎng)游锏募?xì)胞，然后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞回輸給溫血?jiǎng)游铩?br> 51.一種分離的蛋白質(zhì)，其中，HER-2/neu胞外域與HER-2/neu胞內(nèi)域融合，該蛋白質(zhì)能夠在溫血?jiǎng)游镏幸鹈庖邞?yīng)答。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)中，一段至少80％與SEQ IDNO3的序列與一段至少80％與SEQ ID NO1中Lys676-Val1255相同的序列直接融合，或者，其中，一段至少80％與SEQ ID NO3的序列與一段至少80％與SEQ ID NO1中Lys676-Val1255相同的序列通過至少一個(gè)化學(xué)或氨基酸接頭融合。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)中，一段至少80％與SEQ IDNO3的序列與一段至少80％與SEQ ID NO2中Lys677-Val1256相同的序列直接融合，或者，其中，一段至少80％與SEQ ID NO3的序列與一段至少80％與SEQ ID NO2中Lys677-Val1256相同的序列通過至少一個(gè)化學(xué)或氨基酸接頭融合。
54.根據(jù)權(quán)利要求51所述的蛋白質(zhì)，其中，一段至少80％與SEQ ID NO8相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO1中Lys676-Val1255相同的序列直接融合，或者，其中，一段至少80％與SEQ ID NO8相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO1中Lys676-Val1255相同的序列通過至少一個(gè)化學(xué)或氨基酸接頭融合。
55.根據(jù)權(quán)利要求51所述的蛋白質(zhì)，其中，一段至少80％與SEQ ID NO8相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO2中Lys677-Val1256相同的序列直接融合，或者，其中，一段至少80％與SEQ ID NO8相同的序列與一段至少80％與SEQ ID NO2中Lys677-Val1256相同的序列通過至少一個(gè)化學(xué)或氨基酸接頭融合。
56.根據(jù)權(quán)利要求51所述的蛋白質(zhì)，其中HER-2/neu的胞外域與HER-2/neu胞內(nèi)域通過化學(xué)接頭融合。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的蛋白質(zhì)，其中的化學(xué)接頭是氨基酸接頭。
58.一種編碼權(quán)利要求51所述蛋白質(zhì)的核酸分子。
59.一種病毒載體，含有編碼權(quán)利要求51所述蛋白質(zhì)的聚核苷酸序列。
60.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求51所述蛋白質(zhì)和藥學(xué)上認(rèn)可的載體或稀釋劑。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的藥物組合物，該組合物是疫苗。
62.根據(jù)權(quán)利要求60所述的藥物組合物，還包含免疫刺激物。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的藥物組合物，其中的蛋白質(zhì)包含在水包油乳液中。
64.根據(jù)權(quán)利要求62所述的藥物組合物，其中所含免疫刺激物是SBAS2，3D-MPL，QS21，或3D-MPL與QS21相組合。
65.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求58所述的核酸分子，和藥學(xué)上認(rèn)可的載體或稀釋劑。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的藥物組合物，該組合物是疫苗。
67.根據(jù)權(quán)利要求65所述的藥物組合物，還包含免疫刺激物。
68.根據(jù)權(quán)利要求65所述的藥物組合物，所述的核酸分子是DNA分子。
69.一種激發(fā)或增強(qiáng)對HER-2/neu蛋白質(zhì)免疫應(yīng)答的方法，包括給予溫血?jiǎng)游锛ぐl(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答有效量的權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，所述蛋白質(zhì)以疫苗的形式給藥。
71.一種激發(fā)或增強(qiáng)對HER-2/neu蛋白質(zhì)免疫應(yīng)答的方法，包括給予溫血?jiǎng)游锛ぐl(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答有效量的權(quán)利要求58所述核酸分子。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，所述核酸分子以疫苗的形式給藥。
73.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，所述的給予步驟包括先用核酸分子體外轉(zhuǎn)染溫血?jiǎng)游锏募?xì)胞，然后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞回輸給溫血?jiǎng)游铩?br> 74.一種激發(fā)或增強(qiáng)對HER-2/neu蛋白質(zhì)免疫應(yīng)答的方法，包括予溫血?jiǎng)游锛ぐl(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答有效量的權(quán)利要求59所述病毒載體。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中的給予步驟包括用病毒載體體外轉(zhuǎn)染溫血?jiǎng)游锏募?xì)胞，然后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞回輸給溫血?jiǎng)游铩?br> 76.一種抑制患者體內(nèi)癌癥發(fā)展的方法，包括給予患者有效量的 1，26或51所述的融合多肽，從而抑制患者體內(nèi)癌癥的發(fā)展。
77.一種抑制患者體內(nèi)癌癥發(fā)展的方法，包括給予患者有效量的 8，33或58所述的聚核苷酸，從而抑制患者體內(nèi)癌癥的發(fā)展。
78.一種抑制患者體內(nèi)癌癥發(fā)展的方法，包括給予患者有效量的抗原呈遞細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)權(quán)利要求1，26或51所述的融合多肽，從而抑制患者體內(nèi)癌癥的發(fā)展。
79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中的抗原呈遞細(xì)胞是樹狀細(xì)胞。
80.根據(jù)權(quán)利要求76-79中任一項(xiàng)所述的方法，其中的癌癥是乳房癌，卵巢癌，結(jié)腸癌，肺癌或前列腺癌。
81.一種去除生物樣品中腫瘤細(xì)胞的方法，包括讓生物樣品與HER-2/neu融合蛋白特異性T細(xì)胞接觸，所述融合蛋白的氨基酸序列由以下聚核苷酸之一編碼(i)聚核苷酸SEQ ID NO8，33或58；和(ii)上述聚核苷酸的互補(bǔ)序列；所述接觸步驟的條件和時(shí)間足以去除樣品中表達(dá)所述抗原的細(xì)胞。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中的生物樣品是血液或其組分。
83.一種抑制患者體內(nèi)癌癥發(fā)展的方法，包括將經(jīng)過權(quán)利要求81所述方法處理的生物樣品給予患者。
84.一種刺激和/或擴(kuò)增HER-2/neu融合蛋白特異性T細(xì)胞的方法，該方法包括將T細(xì)胞與以下物質(zhì)中一種或多種接觸(i)權(quán)利要求1，26或51所述的融合蛋白；(ii)編碼該融合蛋白的聚核苷酸；或(iii)表達(dá)該融合蛋白的抗原呈遞細(xì)胞；接觸的條件和時(shí)間應(yīng)足以刺激和/或擴(kuò)增T細(xì)胞。
85.一種分離的T細(xì)胞群，包含按照權(quán)利要求84制得的T細(xì)胞。
86.一種抑制患者體內(nèi)癌癥發(fā)展的方法，包括將有效量的經(jīng)過權(quán)利要求85所述方法處理的T細(xì)胞群給予患者。
87.一種抑制患者體內(nèi)癌癥發(fā)展的方法，包括(a)將分離自患者的CD4+和/或CD8+T細(xì)胞與至少一種以下物質(zhì)共孵育(i)權(quán)利要求1，26或51所述的融合蛋白；(ii)編碼該融合蛋白的聚核苷酸；或(iii)表達(dá)該融合蛋白的抗原呈遞細(xì)胞；引起T細(xì)胞增殖；并(b)將有效量的增殖T細(xì)胞給予患者，從而抑制其體內(nèi)癌癥的發(fā)展。
88.一種抑制患者體內(nèi)癌癥發(fā)展的方法，包括(a)將分離自患者的CD4+和/或CD8+T細(xì)胞與至少一種以下物質(zhì)共孵育(i)權(quán)利要求1，26或51所述的融合蛋白；(ii)編碼該融合蛋白的聚核苷酸；或(iii)表達(dá)該融合蛋白的抗原呈遞細(xì)胞；引起T細(xì)胞增殖；并(b)用至少一個(gè)增殖T細(xì)胞克?。?c)將有效量的克隆T細(xì)胞給予患者，從而抑制其體內(nèi)癌癥的發(fā)展。
89.一種制備權(quán)利要求1，26或51所述融合蛋白的方法，包括(a)在細(xì)胞內(nèi)引入含有權(quán)利要求8，33或58所述聚核苷酸的表達(dá)載體；(b)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(c)純化表達(dá)的蛋白質(zhì)。
90.根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其中的細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
91.根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其中的細(xì)胞在無血清條件下懸浮培養(yǎng)。
92.根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其中純化表所達(dá)蛋白質(zhì)分兩步(a)Q瓊脂糖高效柱上進(jìn)行陰離子交換層析；(b)苯基瓊脂糖6快速低取代柱上進(jìn)行疏水性層析。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及HER－2/neu融合蛋白,編碼該融合蛋白的核酸分子,表達(dá)該融合蛋白的病毒載體,包含該融合蛋白和/或編碼該融合蛋白的核酸分子的藥物組合物(例如疫苗)。本發(fā)明還涉及通過激發(fā)或增強(qiáng)對HER－2/neu融合蛋白的免疫應(yīng)答來治療或預(yù)防癌癥的方法,包括用于治療與HER－2/neu致癌基因相關(guān)的癌癥。
文檔編號A61K48/00GK1345374SQ00805752
公開日2002年4月17日 申請日期2000年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月29日
發(fā)明者M·A·奇弗, D·加森 申請人:考麗克薩有限公司, 史密斯克蘭·比徹姆公共有限公司