專利名稱：具有佐劑作用的細(xì)菌膜組分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及革蘭氏陰性細(xì)菌尤其是肺炎克氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)的膜組分聯(lián)合抗原或半抗原，在制備旨在將免疫應(yīng)答引向Th1型和/或混合的Th1/Th2型應(yīng)答的藥物組合物中的用途，其中所述免疫應(yīng)答對(duì)抗所述抗原或半抗原。此外，本發(fā)明包括用于制備所述膜組分和含有所述膜組分的藥物組合物的方法，以及它們?cè)陬A(yù)防和治療感染性疾病(尤其是RSV等副粘病毒造成的感染)和癌癥(尤其是那些其腫瘤與腫瘤抗原相關(guān)的癌癥)中的用途。
接種疫苗是一種預(yù)防或降低尤其是感染的有效手段。接種運(yùn)動(dòng)在該領(lǐng)域的成功使疫苗的概念可以延伸到自身免疫病、癌癥和生殖領(lǐng)域。另一方面，單獨(dú)接種抗原并不總是能夠引起快速而持久的抗體應(yīng)答，這就需要佐劑，即幫助(來自拉丁文adjuvare幫助)這些抗原誘導(dǎo)該應(yīng)答的化合物的存在。
佐劑構(gòu)成一組結(jié)構(gòu)和來源均不同的化合物。因此，在該范疇中有尤其是油包水型(弗氏不完全佐劑)或水包油型乳劑、細(xì)菌來源的化合物例如來自革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖衍生物、和鋁鹽。目前，僅鋁鹽被作為佐劑在疫苗制品中應(yīng)用于人。
對(duì)抗抗原的抗體應(yīng)答的發(fā)生需要一系列的復(fù)雜事件。它涉及呈遞該抗原的細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Th，即T“輔助細(xì)胞”)、和產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞。兩種類型的Th淋巴細(xì)胞可以根據(jù)它們產(chǎn)生的細(xì)胞因子類型來區(qū)分1型Th淋巴細(xì)胞在小鼠中產(chǎn)生IFN-γ和IL-2，并促進(jìn)IgG2a的形成，而2型Th淋巴細(xì)胞在小鼠中產(chǎn)生II-4、IL-5和IL-10，并引起IgG1的形成(Mosman，T.R.和Sad S.當(dāng)代免疫學(xué)(Immunol.Today)1996，17138)。而且，已經(jīng)顯示，對(duì)于相同的給定抗原，正是佐劑在抗體應(yīng)答期間造成了占優(yōu)勢(shì)的同種型(Toellner K.-M.等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1998，1871193)。因此，已知鋁鹽例如鋁膠在小鼠中誘導(dǎo)基本上是Th2型的應(yīng)答，并促進(jìn)IgGl或甚至是IgE的形成(Allison A.C.疫苗設(shè)計(jì)-細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的角色(Vaccine design-The role of cytokine networks)第293卷，1-9，Plenum Press，1997)，這會(huì)給有過敏性體質(zhì)的患者造成問題。而且，根據(jù)所設(shè)想的治療目標(biāo)，可能期望Th1或混合(Th1/Th2)型應(yīng)答。
因此，目前需要獲得能夠誘導(dǎo)Th1或混合(Th1/Th2)型免疫應(yīng)答，優(yōu)選其中Th1應(yīng)答接近或高于Th2應(yīng)答的混合Th1/Th2型應(yīng)答的新佐劑。
令人驚奇的是，本發(fā)明的作者闡明了革蘭氏陰性細(xì)菌肺炎克氏桿菌的膜組分(又稱FMKp)，尤其是按以下實(shí)例中所描述的方法獲得的膜組分的特殊性質(zhì)。事實(shí)上，作者發(fā)現(xiàn)，所述膜組分FMKp聯(lián)合抗原不僅能夠增強(qiáng)對(duì)抗所述抗原的抗體應(yīng)答，而且能夠?qū)⒓?xì)胞因子應(yīng)答重新引向Th1/Th2型分布，因此與所尋求的特殊佐劑活性相符，而且這與所述膜組分的施用方式并不相關(guān)。
因此，本發(fā)明的主題是革蘭氏陰性細(xì)菌尤其是肺炎克氏桿菌的膜組分聯(lián)合抗原或半抗原，在將免疫應(yīng)答引向?qū)顾隹乖虬肟乖腡h1型和/或混合的Th1/Th2型應(yīng)答中的用途，或在制備旨在將免疫應(yīng)答引向?qū)顾隹乖虬肟乖腡h1型和/或混合的Th1/Th2型應(yīng)答的藥物組合物中的用途。
關(guān)于將免疫應(yīng)答引向Th1和/或混合Th1/Th2型應(yīng)答的問題，優(yōu)選尤其是相對(duì)于用明礬佐劑獲得的Th1/Th2應(yīng)答而言引向促進(jìn)誘導(dǎo)Th1應(yīng)答的免疫應(yīng)答。
關(guān)于將免疫應(yīng)答引向Th1和/或混合Th1/Th2型應(yīng)答的問題，尤其更優(yōu)選引向?qū)瓜嚓P(guān)抗原的IgG2a抗體的效價(jià)相對(duì)于用明礬佐劑獲得的IgG2a效價(jià)增加了至少10倍、優(yōu)選至少25倍、50倍和100倍的免疫應(yīng)答。
以一種尤其優(yōu)選的方式，該免疫應(yīng)答被引向其中Th1應(yīng)答接近或高于Th2應(yīng)答的Th1和/或混合Th1/Th2型應(yīng)答。詞語“接近”應(yīng)理解為是指，當(dāng)以對(duì)抗相關(guān)抗原的IgG2a抗體的效價(jià)表示時(shí)，應(yīng)答是對(duì)抗所述抗原的IgG1抗體效價(jià)的至少0.5倍，優(yōu)選至少0.75倍，而且對(duì)抗該相關(guān)抗原的IgG抗體效價(jià)接近或高于用明礬或弗氏佐劑獲得的對(duì)抗該相關(guān)抗原的IgG抗體效價(jià)。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的用途，其特征在于該膜組分含有至少兩種不同細(xì)菌菌株的膜組分。
詞語細(xì)菌的膜組分在本發(fā)明中應(yīng)理解為是指從所述細(xì)菌的培養(yǎng)物獲得的并且其制備方法至少包含了如下步驟的任何純化或部分純化的膜組分或提取物，該步驟是裂解培養(yǎng)后獲得的該細(xì)菌，并通過尤其是離心或過濾，從該裂解步驟后獲得的總裂解物中分離含有所述細(xì)菌的膜的組分。
在本發(fā)明中，當(dāng)所述細(xì)菌是肺炎克氏桿菌時(shí)，詞語“細(xì)菌膜組分”還應(yīng)理解為是指具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的P40蛋白，即肺炎克氏桿菌膜組分中的一種活性組分，或其片段之一。
根據(jù)本發(fā)明，這些膜組分可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如Haeuw J.F等(歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)255，446-454，1998)所描述的方法。
根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的用途，其特征在于該膜組分是通過包含以下步驟的方法制備的a)在允許所述細(xì)菌生長的培養(yǎng)基中對(duì)所述細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，之后離心所述培養(yǎng)物；b)如果適當(dāng)?shù)脑?，失活步驟a)獲得的細(xì)菌沉淀中的分解酶，之后離心獲得的懸浮物；c)通過在抽提溶液中對(duì)步驟a)或b)中獲得的沉淀進(jìn)行至少一個(gè)循環(huán)的洗滌，從該沉淀中抽提和除去非膜蛋白質(zhì)和核酸；d)在存在蛋白水解酶的情況下消化步驟c)中獲得的膜沉淀，之后離心；e)在生理鹽水和/或蒸餾水中對(duì)步驟d)中獲得的沉淀進(jìn)行至少一個(gè)循環(huán)的洗滌；和f)超聲處理步驟e)中獲得的沉淀。
步驟b)，對(duì)步驟a)獲得的細(xì)菌沉淀中的分解酶的失活，可以通過任何已知的酶失活方法來實(shí)現(xiàn)，例如尤其是通過將該重新懸浮的細(xì)菌沉淀加熱至優(yōu)選近100℃的溫度，或通過加入這些酶的活性的抑制劑來實(shí)現(xiàn)。
步驟c)，從步驟a)或b)獲得的沉淀中抽提并除去非膜蛋白質(zhì)和核酸，可以通過例如在抽提溶液中對(duì)該沉淀進(jìn)行至少一個(gè)如下循環(huán)的洗滌來實(shí)現(xiàn)，即加入高滲溶液(抽提溶液)，優(yōu)選摩爾濃度接近1M的鹽溶液，在足以達(dá)到期望效果的接觸期之后，離心獲得的懸浮物，并除去在所述離心后獲得的上清液，可以重復(fù)幾次該洗滌循環(huán)。
步驟d)，消化步驟c)中獲得的膜沉淀，可以在存在蛋白水解酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或任何已知的具有蛋白水解活性的酶的溶液時(shí)進(jìn)行，其中反應(yīng)條件、溶液的pH、反應(yīng)溫度和持續(xù)時(shí)間均優(yōu)選調(diào)節(jié)至對(duì)于所選酶而言最佳的條件，并在反應(yīng)后進(jìn)行離心，該消化循環(huán)可以采用相同的酶、相同的酶組合、或針對(duì)進(jìn)行的每個(gè)消化循環(huán)而言采用不同的酶重復(fù)幾次。
步驟e)，洗滌步驟d)中獲得的沉淀，是通過將該沉淀放入生理鹽水或蒸餾水中，在足夠的接觸期后進(jìn)行離心來實(shí)現(xiàn)的，可以將該洗滌循環(huán)重復(fù)幾次。
最后步驟f)，沉淀的超聲處理，旨在尤其是分解和勻漿步驟e)結(jié)束時(shí)獲得的膜組分。該超聲條件(持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度)將由本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)例如待處理的膜組分的量來確定。
根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方案，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的用途，其特征在于該膜組分是通過包含以下步驟的方法制備的a)在允許所述細(xì)菌生長的培養(yǎng)基中對(duì)所述細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，之后，如果適當(dāng)?shù)脑?，進(jìn)行離心；b)冷凍步驟a)獲得的該培養(yǎng)基或沉淀，之后融化并干燥細(xì)胞；c)利用DNase從重新懸浮起來的步驟b)獲得的該干燥細(xì)胞中除去核酸；d)研磨步驟c)獲得的細(xì)胞，然后澄清獲得的懸浮物；e)在酸性介質(zhì)中沉淀步驟d)獲得的懸浮物，并除去沉淀；f)中和步驟e)獲得的含有膜懸浮物的上清液，之后透析并濃縮該膜懸浮物；和
g)對(duì)步驟f)獲得的濃縮膜懸浮物進(jìn)行滅菌。
該方法步驟b)中的融化條件當(dāng)然應(yīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)待處理的沉淀的初始量來確定，優(yōu)選對(duì)于1kg干細(xì)胞的等同物在4℃進(jìn)行至少48個(gè)小時(shí)。
步驟c)中，核酸的去除通過例如向濃度等同于5％干細(xì)胞的細(xì)胞懸浮物中加入DNase至終濃度5mg/ml來實(shí)現(xiàn)。
對(duì)步驟c)獲得的細(xì)胞的研磨可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于研磨細(xì)胞的任何系統(tǒng)或裝置，例如壓機(jī)或優(yōu)選例如在Manton Gaulinet loop中研磨30分鐘，來進(jìn)行。
研磨后獲得的懸浮物的澄清可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于澄清細(xì)菌細(xì)胞研磨產(chǎn)物的任何系統(tǒng)或裝置，例如Sharpless系統(tǒng)來進(jìn)行。
步驟e)，在酸性介質(zhì)中沉淀步驟d)獲得的懸浮物，可以用例如乙酸來實(shí)現(xiàn)。該沉淀之后通過Sharpless類系統(tǒng)除去沉淀，并回收上清液。
步驟f)包括對(duì)在酸性介質(zhì)中沉淀后獲得的上清液進(jìn)行中和、稀釋、透析和濃縮。
最后，最后步驟包括通過例如于121℃加熱約35分鐘，對(duì)前面步驟獲得的膜組分濃縮物滅菌。
本發(fā)明尤其是涉及根據(jù)本發(fā)明的用途，其特征在于該膜組分是具有SEQ ID NO.2序列的肺炎克氏桿菌P40蛋白，或其一個(gè)片段。
詞語“P40蛋白片段”應(yīng)理解為尤其是指具有能夠增加非特異性免疫應(yīng)答和/或能夠誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的P40蛋白氨基酸序列中所包含的氨基酸序列的任一個(gè)片段，且所述片段含有至少5個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少10個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少15個(gè)氨基酸。
當(dāng)然，所述P40蛋白，或其片段，可以通過化學(xué)合成或以重組肽的形式獲得。
本發(fā)明尤其涉及根據(jù)本發(fā)明的用途，其特征在于所述抗原或半抗原選自感染劑例如病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲所特異的抗原或半抗原，或與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的抗原。
根據(jù)本發(fā)明，所述抗原或半抗原優(yōu)選選自肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂質(zhì)、或任何能夠特異將免疫應(yīng)答指向?qū)垢腥緞┧禺惖目乖虬肟乖幕驅(qū)鼓[瘤細(xì)胞相關(guān)抗原的Th1型和/或混合的Th1/Th2型應(yīng)答的化合物。
當(dāng)然，當(dāng)所述抗原或半抗原的性質(zhì)是多肽時(shí)，可以通過化學(xué)合成或重組合成來獲得。
現(xiàn)在，制備重組肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，因此不在本發(fā)明說明書中作詳細(xì)描述。在可以用于產(chǎn)生這些重組肽的細(xì)胞中，當(dāng)然可以提及細(xì)菌細(xì)胞(Olins P.O.和Lee S.C.，1993，大腸桿菌中異源基因表達(dá)的最新進(jìn)展(Recent advances in heterologous gene expression in E.coli)，Curr.Op.Biotechnology 4520-525)，和酵母細(xì)胞(Buckholz R.G.，1993，用于異源基因產(chǎn)物表達(dá)的酵母系統(tǒng)(Yeast Systems for theExpression of Heterologous Gene Products)，Curr.Op.Biotechnology4538-542)，以及動(dòng)物細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物(Edwards C.P.和Aruffo A.，1993，基于COS細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的當(dāng)前應(yīng)用(Currentapplications of COS cell based transient expression systems)，Curr.Op.Biotechnology 4558-563)，和其中可以采用涉及例如桿狀病毒的方法的昆蟲細(xì)胞(Luckow V.A.，1993，用于人類基因產(chǎn)物表達(dá)的桿狀病毒系統(tǒng)(Baculovirus systems for the expression of human geneproducts)，Curr.Op.Biotechnology 4564-572)。
此外，本發(fā)明還包含根據(jù)本發(fā)明的用途，其特征在于所述抗原或半抗原與所述膜組分偶聯(lián)或混合，尤其是與該膜組分中所包含的至少一種化合物共價(jià)偶聯(lián)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含根據(jù)本發(fā)明的用途，其特征在于所述抗原或半抗原與支持肽(supporting peptide)共價(jià)偶聯(lián)，形成能夠與哺乳動(dòng)物血清白蛋白特異結(jié)合的復(fù)合物，優(yōu)選地所述支持肽是來源于鏈球菌G蛋白的肽片段，尤其是稱作BB的C端片段。
當(dāng)然，所述復(fù)合物可以通過遺傳重組制備。
可以利用重組DNA技術(shù)通過將編碼蛋白質(zhì)性質(zhì)的所述抗原或半抗原的序列插入或添加在編碼所述鏈球菌G蛋白肽片段的DNA序列上，制備所述嵌合或雜合復(fù)合物。
用于合成雜合分子的方法包括在遺傳工程中用于構(gòu)建編碼期望多肽序列的雜合多核苷酸的方法?？梢杂欣貐⒖祭鏒.V.Goeddel等(基因表達(dá)技術(shù)(Gene expression technology)，酶學(xué)方法(Methods inEnzymology)，第185卷，3-187，1990)所描述的用于制備編碼融合蛋白的基因的技術(shù)。
根據(jù)本發(fā)明，該共價(jià)偶聯(lián)可以通過化學(xué)合成實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以將一或多個(gè)連接元件引入該膜組分所包含的至少一種化合物中和/或引入所述抗原或半抗原中，以利于該化學(xué)偶聯(lián)。
優(yōu)選地，引入的所述連接元件是氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明，可以引入一或多個(gè)連接元件，尤其是氨基酸，以便于該膜組分的化合物與所述抗原或半抗原之間的偶聯(lián)反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明所述該膜組分的化合物與所述抗原或半抗原之間的共價(jià)偶聯(lián)可以發(fā)生在該膜組分的化合物的N-或C-末端或所述抗原或半抗原的N-或C-末端，如果后者的性質(zhì)是例如肽的話。允許該偶聯(lián)的雙功能試劑將根據(jù)選擇用于該偶聯(lián)的末端，和待偶聯(lián)的所述抗原或半抗原的性質(zhì)來決定。
本發(fā)明還包含根據(jù)本發(fā)明的用途，其特征在于當(dāng)抗原、半抗原或復(fù)合物和膜化合物的性質(zhì)是肽時(shí)，所述抗原、半抗原或復(fù)合物與膜組分所包含的至少一種化合物之間的偶聯(lián)是通過遺傳重組實(shí)現(xiàn)的。
實(shí)際上確實(shí)可以通過遺傳重組實(shí)現(xiàn)所述抗原、半抗原或復(fù)合物與膜組分所包含的至少一種化合物之間的偶聯(lián)。例如，可以在提取所述革蘭氏陰性細(xì)菌的膜組分之前，預(yù)先用含有編碼目的抗原或所述復(fù)合物的核酸結(jié)構(gòu)的載體轉(zhuǎn)化該細(xì)菌，以便由此轉(zhuǎn)化的該細(xì)菌表達(dá)與所述細(xì)菌的膜結(jié)合或錨定在其中的該目的抗原或所述復(fù)合物。用于表達(dá)與膜結(jié)合的重組蛋白質(zhì)的方法是熟知的，并且需要例如存在特異的調(diào)節(jié)序列，例如信號(hào)肽類序列。
本發(fā)明的主題還是根據(jù)本發(fā)明的用途，其特征在于該藥物組合物還含有使得可以以能增加其穩(wěn)定性和/或其免疫原性的形式運(yùn)載與所述抗原、半抗原或復(fù)合物相聯(lián)的所述膜組分的藥劑，這些形式例如水包油或油包水型乳劑的形式，脂質(zhì)體、微球體或納球體(nanosphere)類顆粒的形式，或允許與所述抗原、半抗原或復(fù)合物相聯(lián)的所述膜組分以顆粒形式封裝和呈遞的任何類型結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的用途，其特征在于所述藥劑選自鋁鹽，鈣鹽，植物來源的化合物例如Quil A或皂苷，或細(xì)菌來源的化合物例如霍亂、百日咳或破傷風(fēng)類毒素的衍生物，或大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素的衍生物。
本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的用途，其特征在于該藥物組合物還含有可以調(diào)節(jié)所述膜組分聯(lián)合所述抗原、半抗原或復(fù)合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的藥劑。
在所述調(diào)節(jié)藥劑中，尤其優(yōu)選細(xì)胞因子、生長因子、激素、或細(xì)胞成分例如核酸、熱休克蛋白家族中的蛋白質(zhì)或核糖體。
本發(fā)明的主題還有在制備旨在預(yù)防或治療病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲來源的感染性疾病，或旨在預(yù)防或治療癌癥(尤其是其中腫瘤與腫瘤抗原相關(guān)的癌癥)的藥物組合物中的根據(jù)本發(fā)明的用途。
在所述病毒來源的感染性疾病中，尤其優(yōu)選由副粘病毒，尤其是由副流感病毒，更優(yōu)選由呼吸道合胞病毒(RSV)引起的感染性疾病。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的用途的特征在于與該膜組分相聯(lián)的所述抗原含有G2Na肽，即具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的病毒G蛋白片段；與序列SEQ ID NO.4比對(duì)后其序列表現(xiàn)出至少80％、優(yōu)選至少90％、95％和99％一致性的G2Na的同源肽；或與鏈球菌G蛋白的C端片段(BB)，即描述于Power等的文獻(xiàn)(1997，病毒學(xué)(Virology)230，155-166)和WO 96/14416中的肽BB，共價(jià)偶聯(lián)形成能夠與哺乳動(dòng)物血清白蛋白結(jié)合的復(fù)合物的G2Na肽或其同系物之一。
為了本發(fā)明的目的，詞語兩個(gè)核酸或氨基酸序列之間的“一致性百分?jǐn)?shù)、程度或水平”應(yīng)理解為是指在最佳比對(duì)后獲得的待比較的兩個(gè)序列之間一致的核苷酸或氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)，該百分?jǐn)?shù)是純粹的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，而且這兩個(gè)序列之間的差異隨機(jī)地分布在它們的全長范圍內(nèi)。傳統(tǒng)上兩個(gè)核酸或氨基酸序列之間的序列比較是在以最佳方式比對(duì)這些序列之后通過比較這些序列進(jìn)行的，而所述比較是通過片段或“比較窗”鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性來進(jìn)行的。用于比較的最佳序列比對(duì)可以通過手工完成，或利用Smith和Waterman(1981)(Ad.App.Math.2482)的局部同源性算法、Neddleman和Wunsch(1970)(分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48443)的局部同源性算法、Pearson和Lipman(1988)(美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444)的相似性搜索方法、或應(yīng)用這些算法的計(jì)算機(jī)軟件(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin遺傳學(xué)軟件包，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，WI；或比較軟件包BLAST N或BLAST P)來完成。
兩個(gè)核酸或氨基酸序列之間的一致性百分?jǐn)?shù)通過計(jì)數(shù)比較窗中最佳比對(duì)的這兩個(gè)序列來確定，對(duì)于這兩個(gè)序列之間的最佳比對(duì)而言，在所述比較窗中待比較的核酸或氨基酸序列區(qū)域相對(duì)于參考序列可以含有添加或缺失。該一致性百分?jǐn)?shù)通過以下方式計(jì)算確定這兩個(gè)序列之間核苷酸或氨基酸殘基一致的一致位置的數(shù)目，用該一致位置數(shù)目除以比較窗中位置的總數(shù)，然后將所獲結(jié)果乘以100，以獲得這兩個(gè)序列之間的一致性百分?jǐn)?shù)。
例如，可以采用在網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html上可獲得的BLAST程序，“BLAST 2序列”，和給出的默認(rèn)參數(shù)(尤其是參數(shù)“開始空缺罰分”5，和“延伸空缺罰分”2；所選模板是例如由該程序提議的模板“BLOSUM 62”)，然后通過該程序直接計(jì)算待比較的兩個(gè)序列之間的一致性百分?jǐn)?shù)。
另一方面，本發(fā)明涉及制備革蘭氏陰性細(xì)菌，尤其是肺炎克氏桿菌的膜組分的方法，其特征在于該方法含有以下步驟a)在允許所述細(xì)菌生長的培養(yǎng)基中對(duì)所述細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，然后離心所述培養(yǎng)物；b)如果適當(dāng)?shù)脑?，失活步驟a)獲得的細(xì)菌沉淀中的分解酶，之后離心獲得的懸浮物；c)通過在抽提溶液中對(duì)步驟a)或b)獲得的沉淀進(jìn)行至少一個(gè)循環(huán)的洗滌，從該沉淀中抽提并除去非膜蛋白質(zhì)和核酸；
d)在存在蛋白酶時(shí)消化步驟c)獲得的膜沉淀，然后離心；e)在生理鹽水和/或蒸餾水中對(duì)步驟d)獲得的沉淀進(jìn)行至少一個(gè)循環(huán)的洗滌；和f)超聲處理步驟e)獲得的沉淀。
本發(fā)明還包括制備革蘭氏陰性細(xì)菌，尤其是肺炎克氏桿菌的膜組分的方法，其特征在于它含有如下步驟a)在允許所述細(xì)菌生長的培養(yǎng)基中對(duì)所述細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，之后，如果適當(dāng)?shù)脑?，進(jìn)行離心；b)冷凍步驟a)獲得的該培養(yǎng)基或沉淀，之后融化并干燥這些細(xì)胞；c)利用DNase從重新懸浮起來的步驟b)獲得的干燥細(xì)胞中除去核酸；d)研磨步驟c)獲得的細(xì)胞，然后澄清獲得的懸浮物；e)在酸性介質(zhì)中沉淀步驟d)獲得的懸浮物，并除去沉淀；f)中和步驟e)獲得的含有膜懸浮物的上清液，之后透析并濃縮該膜懸浮物；和g)對(duì)步驟f)獲得的濃縮膜懸浮物進(jìn)行滅菌。
能夠通過所述這些方法獲得的膜組分事實(shí)上構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。
當(dāng)用半乳糖總含量和蛋白質(zhì)總含量表示時(shí)，能夠通過所述方法獲得的膜組分的蛋白聚糖含量，即活性成分FMKp的含量，優(yōu)選在如下數(shù)值之間-對(duì)于半乳糖1.2g/l-3.4g/l；-對(duì)于蛋白質(zhì)7.5g/l-14.9g/l。
更優(yōu)選地，該含量為-對(duì)于半乳糖1.6g/l-2.6g/l；-對(duì)于蛋白質(zhì)9.3g/l-11.7g/l。
此外，本發(fā)明還涉及含有通過根據(jù)本發(fā)明的這些方法能夠獲得的膜組分的藥物組合物，優(yōu)選地，所述藥物組合物還含有與所述膜組分相聯(lián)的上文所定義的抗原、半抗原或復(fù)合物，例如尤其是副粘病毒特異的病毒抗原或復(fù)合物，或與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的抗原。
當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明的所述藥物組合物可以還含有諸如上面所定義的載體和調(diào)節(jié)劑等藥劑。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的特征在于與該膜組分相聯(lián)的所述抗原包括具有序列SEQ ID NO.4的呼吸道合胞病毒G2Na肽、上面所定義的它的同系物之一、與鏈球菌G蛋白C端片段(BB)共價(jià)偶聯(lián)形成能夠結(jié)合哺乳動(dòng)物血清白蛋白的復(fù)合物的所述G2Na肽或其同系物之一。
以下


和實(shí)施例旨在舉例說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制其范圍。

圖1FMKp輔助的BBG2Na-劑量-反應(yīng)研究(血清抗G2Na IgG效價(jià))。
*p＜0.05(與PBS組比較)。
圖2FMKp輔助的BBG2Na-抗G2Na的IgG1和IgG2a的效價(jià)。
圖3FMKp輔助的BBG2Na-保護(hù)研究。
圖4FMKp對(duì)Immugrip(流感疫苗)的佐劑作用。
*p＜0.05在樣品收集的同一天與未有佐劑的組(“0”)進(jìn)行比較。
實(shí)施例1肺炎克氏桿菌膜組分(FMKp)的制備方法1優(yōu)選在從離心沉淀中抽提肺炎克氏桿菌I145的膜之前加上如下步驟在任選地重新溶解在溶液中之后，例如通過100℃加熱沉淀，破壞沉淀中獲得的細(xì)胞成分的分解酶。
從該離心沉淀中將膜實(shí)際提取出來優(yōu)選通過以下方式來進(jìn)行在任選破壞分解酶后，用鹽水溶液例如1M氯化鈉處理沉淀的細(xì)胞成分一或多次，之后優(yōu)選以20,000g離心獲得的懸浮物，從該離心獲得的上清液含有蛋白質(zhì)和核酸等非膜雜質(zhì)，將其除去，而沉淀含有所述膜。
與含有這些雜質(zhì)的鹽溶液分離后，在有蛋白水解酶，優(yōu)選胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶時(shí)，于pH8的溶液中37℃消化該膜4小時(shí)。
消化后，通過超聲勻漿該溶液。由此獲得的產(chǎn)物構(gòu)成稱作FMKp的膜組分。
獲得的上清再次在相同條件下，優(yōu)選在140,000g離心。制備膜糖肽通過40,000g離心20分鐘，從所獲得的沉淀中制備該組分。將所述沉淀重新懸浮在生理鹽水中，然后在沸水浴上100℃加熱該懸浮物10分鐘，以失活分解酶。冷卻后，20,000g離心該介質(zhì)30分鐘。獲得的沉淀用1M NaCl抽提兩次，以除去蛋白質(zhì)和核酸。通過20,000g離心30分鐘回收該膜。
然后37℃在pH 8時(shí)用胰蛋白酶消化它們4小時(shí)，之后在相同條件下用胰凝乳蛋白酶消化。
然后通過2000g離心30分鐘回收這些膜，用生理鹽水，之后用蒸餾水洗滌，并通過超聲15分鐘進(jìn)行破碎。方法2在+4℃融化最少48小時(shí)之后，將1kg肺炎克氏桿菌干細(xì)胞以5％干細(xì)胞的濃度重新懸浮在溶液中。加入DNase至5mg/l。然后在Manton Gaulinloop中研磨30分鐘，接著在SHARPLES中以50l/h澄清，之后在pH＝4.2+0.1下用乙酸沉淀30分鐘。除去沉淀(SHARPLES，25l/h)并中和上清液，然后用滲透水(osmosed water)將其稀釋至初體積的兩倍。然后在PUF100上以高達(dá)800Ωcm進(jìn)行恒定體積透析，之后將由此獲得的膜懸浮物(NS)濃縮至11l/kg干細(xì)胞。然后在+121℃35分鐘滅菌該MS，并于+4℃保存6個(gè)星期。FMKp的特性蛋白聚糖的量，即活性成分FMKp的量定義為半乳糖的總量和蛋白質(zhì)的總量。
-半乳糖平均2.2g/l
-蛋白質(zhì)平均10.5g/l。實(shí)施例2FMKp對(duì)重組蛋白質(zhì)BBG2Na的佐劑作用BBG2Na是在大腸桿菌中制備的重組蛋白質(zhì)。其由具有序列SEQ ID NO.4的G2Na肽，即A型呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白的第130位殘基至第230位殘基片段，和BB，即能夠結(jié)合血清白蛋白的鏈球菌G蛋白片段，融合在一起構(gòu)成的。BBG2Na是一種抗RSV疫苗(Power U.病毒學(xué)，1997，230155-166)。
BALB/C小鼠接受2次20μg BBG2Na和不同量FMKp的皮下注射。在第28天(D28)收集血液樣品，以G2Na處于固相通過ELISA測(cè)定血清抗體的效價(jià)。獲得的結(jié)果顯示在圖1中。令人驚奇的是，它們顯示，F(xiàn)MKp顯著增強(qiáng)了抗G2Na的IgG應(yīng)答；所達(dá)到的抗G2Na的IgG效價(jià)與用明礬或弗氏佐劑誘導(dǎo)的相似。該作用是劑量依賴性的從5μg FMKp時(shí)可以觀察到，自50ug FMKp時(shí)達(dá)到最大，100μg FMKp時(shí)保持不變。因此，對(duì)于BBG2Na，F(xiàn)MKp是一種潛在的佐劑。
就Th1/Th2應(yīng)答而言，為了了解FMKp對(duì)免疫應(yīng)答取向的影響，在按以上詳述獲得的血清上測(cè)定抗G2Na的IgG1和IgG2a效價(jià)。這些結(jié)果(圖2)顯示，令人驚奇的是，與用明礬所觀察到的不同(占優(yōu)勢(shì)的同種型是IgG1)，F(xiàn)MKp能夠改變抗G2Na IgG1/IgG2a的比例。該分布與弗氏佐劑所誘導(dǎo)的接近。這說明，F(xiàn)MKp可以用作免疫佐劑誘導(dǎo)混合(Th1/Th2)型應(yīng)答。
按上述方法免疫的動(dòng)物經(jīng)鼻腔途徑接受105TCID50的RSV-A的病毒攻擊。這是在最后的免疫之后三周進(jìn)行的。病毒攻擊后5天，處死動(dòng)物并取肺以測(cè)定RSV-A的滴度。結(jié)果(圖3)顯示，接受FMKp輔助的BBG2Na的動(dòng)物受到保護(hù)不被RSV-A攻擊。
總之，F(xiàn)MKp使得可以使抗體應(yīng)答重新取向，而又不影響保護(hù)小鼠不受到RSV-A攻擊的能力。實(shí)施例3FMKp對(duì)失活病毒(流感疫苗)的佐劑作用給BALB/C小鼠單次注射0.01μg ImmugripTM(購自INAVA實(shí)驗(yàn)室的流感疫苗)和不同量的FMKp。這些產(chǎn)品是一起施用的。該注射是在第0天經(jīng)皮下進(jìn)行的。在第7、14和21天，收集血液樣品。采用固相上2μg/mlImmugrip通過ELISA測(cè)定抗Immugrip的血清IgG抗體效價(jià)。所獲結(jié)果(圖4)顯示，F(xiàn)MKp顯著增加抗Immugrip的抗體效價(jià)，這從最低劑量的FMKp，即0.1μg，就出現(xiàn)了。該佐劑作用是劑量依賴性的。有趣的是，觀察到與未接受輔助的Immugrip對(duì)照比較，F(xiàn)MKp的存在誘導(dǎo)從第7天較早地出現(xiàn)了抗體應(yīng)答。采用參考佐劑，弗氏完全佐劑(CFA)，未獲得該效果。
權(quán)利要求
1.肺炎克氏桿菌膜組分聯(lián)合抗原或半抗原在制備旨在將免疫應(yīng)答引向?qū)顾隹乖虬肟乖腡h1型和/或混合Th1/Th2型應(yīng)答的藥物組合物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其特征在于該膜組分含有至少兩種不同細(xì)菌菌株的膜組分。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于該膜組分是通過含有以下步驟的方法制備的a)在允許所述細(xì)菌生長的培養(yǎng)基中對(duì)所述細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，然后離心所述培養(yǎng)物；b)如果適當(dāng)?shù)脑?，失活步驟a)獲得的細(xì)菌沉淀中的分解酶，之后離心獲得的懸浮物；c)通過在抽提溶液中對(duì)步驟a)或b)獲得的沉淀進(jìn)行至少一個(gè)循環(huán)的洗滌，從該沉淀中抽提并除去非膜蛋白質(zhì)和核酸；d)在存在蛋白酶時(shí)消化步驟c)獲得的膜沉淀，然后離心；e)在生理鹽水和/或蒸餾水中對(duì)步驟d)獲得的沉淀進(jìn)行至少一個(gè)循環(huán)的洗滌；和f)超聲處理步驟e)獲得的沉淀。
4.權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于該膜組分是通過含有以下步驟的方法制備的a)在允許所述細(xì)菌生長的培養(yǎng)基中對(duì)所述細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，之后，如果適當(dāng)?shù)脑挘M(jìn)行離心；b)冷凍步驟a)獲得的該培養(yǎng)基或沉淀，之后融化并干燥這些細(xì)胞；c)利用DNase從重新懸浮起來的步驟b)獲得的干燥細(xì)胞中除去核酸；d)研磨步驟c)獲得的細(xì)胞，然后澄清獲得的懸浮物；e)在酸性介質(zhì)中沉淀步驟d)獲得的懸浮物，并除去沉淀；f)中和步驟e)獲得的含有膜懸浮物的上清液，之后透析并濃縮該膜懸浮物；和g)對(duì)步驟f)獲得的濃縮膜懸浮物進(jìn)行滅菌。
5.權(quán)利要求1-4之一的用途，其特征在于所述抗原或半抗原選自感染劑所特異的抗原或半抗原，或與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的抗原。
6.權(quán)利要求5的用途，其特征在于所述抗原或半抗原選自肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂質(zhì)、或任何能夠特異指向?qū)垢腥緞┨禺惖目乖虬肟乖驅(qū)鼓[瘤細(xì)胞相關(guān)抗原的Th1型和/或混合Th1/Th2型免疫應(yīng)答的化合物。
7.權(quán)利要求1-6之一的用途，其特征在于所述抗原或半抗原與所述膜組分偶聯(lián)或混合。
8.權(quán)利要求1-7之一的用途，其特征在于所述抗原或半抗原與支持肽共價(jià)偶聯(lián)，形成能夠特異結(jié)合哺乳動(dòng)物血清白蛋白的復(fù)合物。
9.權(quán)利要求8的用途，其特征在于所述支持肽是來源于鏈球菌G蛋白的肽片段。
10.權(quán)利要求8或9的用途，其特征在于所述復(fù)合物是通過遺傳重組制備的。
11.權(quán)利要求7-10之一的用途，其特征在于所述抗原、半抗原或復(fù)合物與該膜組分中包含的至少一種化合物共價(jià)偶聯(lián)。
12.權(quán)利要求11的用途，其特征在于該共價(jià)偶聯(lián)是通過化學(xué)合成實(shí)現(xiàn)的偶聯(lián)。
13.權(quán)利要求12的用途，其特征在于有一或多個(gè)連接元件被引入該膜組分所包含的至少一種化合物中，和/或被引入所述抗原、半抗原或復(fù)合物中，以便于該化學(xué)偶聯(lián)。
14.權(quán)利要求13的用途，其特征在于引入的所述連接元件是氨基酸。
15.權(quán)利要求11的用途，其特征在于當(dāng)所述抗原、半抗原或復(fù)合物和所述膜化合物的性質(zhì)是肽時(shí)，所述抗原、半抗原或復(fù)合物與該膜組分所包含的至少一種化合物之間的偶聯(lián)是通過遺傳重組來進(jìn)行的。
16.權(quán)利要求1-15之一的用途，其特征在于該藥物組合物還含有使得可以以能增強(qiáng)其穩(wěn)定性和/或其免疫原性的形式運(yùn)載與所述抗原、半抗原或復(fù)合物相聯(lián)的所述膜組分的藥劑。
17.權(quán)利要求16的用途，其特征在于所述藥劑是水包油型或油包水型乳劑。
18.權(quán)利要求16的用途，其特征在于所述藥劑是脂質(zhì)體、微球體或納球體類顆粒，或允許與所述抗原、半抗原或復(fù)合物相聯(lián)的所述膜組分以顆粒形式封裝和呈遞的任何類型結(jié)構(gòu)。
19.權(quán)利要求16的用途，其特征在于所述藥劑選自鋁鹽、鈣鹽、植物來源的化合物例如Quil A或皂苷、或細(xì)菌來源的化合物例如霍亂、百日咳或破傷風(fēng)類毒素或大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素。
20.權(quán)利要求1-19的用途，其特征在于該藥物組合物還含有使得可以調(diào)節(jié)由與所述抗原、半抗原或復(fù)合物相聯(lián)的所述膜組分所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的藥劑。
21.權(quán)利要求20的用途，其特征在于所述調(diào)節(jié)藥劑選自細(xì)胞因子、生長因子、激素、或細(xì)胞成分如核酸、熱休克蛋白家族的蛋白質(zhì)或核糖體。
22.權(quán)利要求1-21之一的用途，用于制備旨在預(yù)防或治療感染性疾病或癌癥的藥物組合物。
23.權(quán)利要求22的用途，其特征在于該感染性疾病是病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲來源的。
24.權(quán)利要求23的用途，用于制備旨在預(yù)防或治療副粘病毒感染的藥物組合物。
25.權(quán)利要求24的用途，其特征在于該副粘病毒是呼吸道合胞病毒。
26.權(quán)利要求25的用途，其特征在于與該膜組分相聯(lián)的所述抗原含有具有序列SEQ ID NO.4的G2Na肽，或其序列表現(xiàn)出與序列SEQ ID NO.4有至少80％一致程度的該G2Na肽的同系物之一。
27.權(quán)利要求26的用途，其特征在于所述G2Na肽或其同系物之一與鏈球菌G蛋白的C端片段(BB)共價(jià)偶聯(lián)，形成能夠與哺乳動(dòng)物血清白蛋白結(jié)合的復(fù)合物。
28.權(quán)利要求24的用途，其特征在于該副粘病毒是副流感病毒。
29.藥物組合物，其特征在于它含有通過權(quán)利要求3或4所定義的方法制備的膜組分，以及與所述膜組分相聯(lián)的抗原或半抗原。
30.權(quán)利要求29的藥物組合物，其特征在于所述抗原選自副粘病毒的肽片段。
31.權(quán)利要求30的藥物組合物，其特征在于該副粘病毒是呼吸道合胞病毒或副流感病毒。
32.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中與該膜組分相聯(lián)的所述抗原含有具有序列SEQ ID NO.4的呼吸道合胞病毒G2Na肽，或其序列表現(xiàn)出與序列SEQ ID NO.4有至少80％一致性程度的肽。
33.權(quán)利要求32的藥物組合物，其特征在于所述G2Na肽或其同系物之一與鏈球菌G蛋白的C端片段(BB)共價(jià)偶聯(lián)，形成能夠與哺乳動(dòng)物血清白蛋白結(jié)合的復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及革蘭氏陰性菌尤其是肺炎克氏桿菌的膜組分聯(lián)合抗原或半抗原在制備設(shè)計(jì)用于將免疫應(yīng)答引向?qū)顾隹乖虬肟乖腡h1和/或混合的Th1/Th2型應(yīng)答的藥物組合物中的用途。本發(fā)明還涉及制備所述膜組分和含有它們的藥物組合物的方法,以及它們?cè)陬A(yù)防和治療感染性疾病,尤其是那些涉及副粘病毒例如VRS的感染性疾病和癌癥,尤其是那些帶有腫瘤相關(guān)抗原的癌癥中的用途。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1343124SQ0080504
公開日2002年4月3日 申請(qǐng)日期2000年3月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月15日
發(fā)明者C·里博, N·科瓦雅, T·N·恩格耶, A·貝克, J－Y·博奈弗伊 申請(qǐng)人:皮埃爾法博赫藥品公司