專利名稱：新的人類和哺乳動物細胞高效表達載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的人類和哺乳動物細胞表達載體，下文中稱為pBMP6.1，其具有人源性的啟動子及多聚腺苷酸加尾信號片段。本發(fā)明所述表達載體可在體外高效表達異源性目的基因并可應(yīng)用于基因治療。
基因治療作為一種富有前景的疾病治療手段，既往的研究已取得很大進展，且自90年代以來，逐漸開始用于臨床實踐。但其作為有效的臨床治療手段，遠未成熟。一個重要的問題就是尚無可靠的載體能安全用于人體，并且達到治療基因在體內(nèi)的高效表達。
目前哺乳動物細胞基因的表達載體所采用病毒性啟動子，如巨細胞病毒、腺病毒、SV40等啟動子，以及常用于將外源基因?qū)肴嘶蚪M內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等載體等都具有可能引起意外的遺傳性狀改變、產(chǎn)生比野生型病毒更加危險的新病毒、或潛在的致癌危險性等缺點。因此，構(gòu)建一種以人類基因為啟動子的安全、高效表達載體，必將為拓寬基因治療的安全度和使用范圍奠定基礎(chǔ)。
熱休克蛋白是一類進化上保守的蛋白質(zhì)，它們以分子伴侶的形式在細胞內(nèi)發(fā)揮其正常生理功能，并參與細胞應(yīng)激保護和應(yīng)答過程。本發(fā)明人在研究人類淋巴細胞hsp90β基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制時發(fā)現(xiàn)，hsp90β基因的5’上游區(qū)，第一外顯子和第一內(nèi)含子的片段(-1039/+1530)可以介導(dǎo)報告基因在T淋巴細胞中的高組成性表達及熱誘導(dǎo)表達(Shen YF等，F(xiàn)EBS Lett.(1997)44392-98)。經(jīng)過對該序列進行一系列優(yōu)化重組，篩選出具有介導(dǎo)目的基因在哺乳動物細胞內(nèi)高效表達活性的非病毒性啟動子B6.1。實驗表明，以B6.1為啟動子構(gòu)建的氯酶素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因表達質(zhì)粒pHSP90β6.1，在哺乳動物細胞內(nèi)產(chǎn)生的CAT活性高于受CMV、RSV-LTR及SV40啟動子介導(dǎo)的的CAT基因表達活性。啟動子B6.1及表達質(zhì)粒pHSP90β6.1的內(nèi)容見發(fā)明名稱為“用于人體細胞高效表達外源基因的人源性啟動子”的中國專利申請99125931.9(申請日1999年12月10日)。該文獻本文引入作參考。
鑒于上述表達質(zhì)粒pHSP90β6.1中還存在其它病毒性元件影響質(zhì)粒的安全性，必須以人源基因序列替代該元件，而且，擬以多克隆位點替代該質(zhì)粒中的CAT基因，因此，本發(fā)明人對pHSP90β6.1進行了多步驟改建，終于獲得了一種新的哺乳動物細胞高效表達載體，由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的在于提供一種哺乳動物細胞高效表達載體，該載體的啟動子及多聚腺核苷酸加尾信號序列均是人源的，克服了現(xiàn)有技術(shù)中病毒性元件的缺點。
本發(fā)明的另一目的在于所述的表達載體在基因治療中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種哺乳動物細胞高效表達的非病毒性載體，命名為pBMP6.1，其圖譜見圖6，其大小為5094bp，該載體中啟動子元件、多克隆位點及多聚腺核苷酸加尾信號片段的核苷酸序列如

圖12所示。
本發(fā)明的載體pBMP6.1的啟動子元件(-1044/+694bp)及含有多聚腺核苷酸(PolyA)加尾信號序列片段(+804/+1415bp)均來源于人hsp90β基因。啟動子元件保留了hsp90β基因從5′上游-1039bp至第一內(nèi)含子+531bp片段及第一內(nèi)含子3′端+1373/+1531bp。該啟動子除含有CAAT盒(-87/-84bp)、SP1結(jié)合位點(-51bp)、核心啟動子TATA盒(-27bp)、轉(zhuǎn)錄起始位點(+1bp)外，還含有本發(fā)明人首先發(fā)現(xiàn)的對hsp90β基因的高組成性及熱誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起協(xié)同作用的第一內(nèi)含子3′端的富含A/T區(qū)(+1373/+1531bp)，和其中的數(shù)個轉(zhuǎn)錄起始子元件。插入該載體的hsp90β基因3′端+6497至+7108 bp片段除含有(PolyA)加尾信號序列外，還保留了該基因的翻譯終止密碼子、3′非翻譯區(qū)及第12內(nèi)含子。
正如在下述實施例中所詳細描述的，為獲得本發(fā)明的載體，本發(fā)明人一方面通過PCR技術(shù)從Jurkat細胞基因組DNA中擴增了hsp90β基因3′端+6497至+7108 bp片段；另一方面利用基因重組技術(shù)刪除質(zhì)粒pHSP90β6.1中用于檢測啟動子活性的CAT報告基因及含有SV40基因PolyA加尾信號序列片段，代之以上述PCR擴增片段，再插入多克隆位點，最終構(gòu)建成一種人源化的哺乳動物細胞高效表達載體pBMP6.1(見實施例1)。
為鑒定本發(fā)明載體在人類細胞中表達外源基因的水平，本發(fā)明人將人抑癌基因產(chǎn)物p53 cDNA插入載體pBMP6.1，獲得重組質(zhì)粒pBMP6.1-p53，然后，應(yīng)用Western印跡技術(shù)對分別轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pBMP6.1-p53及分別以CMV及B6.1為啟動子、均含有兔珠蛋白基因PolyA加尾信號序列的pCMV-Neo-BAM-p53及pB6.1-Neo-BAM-p53的Jurkat細胞中p53基因的表達水平進行了比較，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pBMP6.1-p53的Jurkat細胞中p53的水平明顯高于其它兩種質(zhì)粒(見實施例2)。
因此，由于本發(fā)明的哺乳動物細胞高效表達載體的啟動子及PolyA加尾信號序列是人源性的，具有安全的優(yōu)點。另外，本發(fā)明的載體能介導(dǎo)p53基因在人類細胞中高水平表達，其強度超過所檢測過的哺乳動物細胞表達載體。
由此，本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的載體作為基因治療載體的應(yīng)用。
以下將參照附圖和實施例更詳細地描述本發(fā)明。其中圖1為質(zhì)粒pHSP90β6.1結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為質(zhì)粒T-PolyA的構(gòu)建流程圖。
圖3為質(zhì)粒SK-500的構(gòu)建流程圖。
圖4為質(zhì)粒pB6.1的構(gòu)建流程圖。
圖5為質(zhì)粒pBM6.1的構(gòu)建流程圖。
圖6為質(zhì)粒pBMP6.1的構(gòu)建流程圖。
圖7為質(zhì)粒pBMP6.1的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖8為質(zhì)粒pCMV-Neo-BAM-p53結(jié)構(gòu)示意圖。
圖9為質(zhì)粒pBMP6.1-p53的構(gòu)建流程圖。
圖10為質(zhì)粒pB6.1-Neo-BAM-p53結(jié)構(gòu)示意圖。
圖11為pBMP6.1與pB6.1-Neo-BAM-p53和pCMV-Neo-BAM-p53中p53在Jurkat細胞中的表達水平的比較。
圖12為載體pBMP6.1中啟動子元件、多克隆位點及多聚腺核苷酸加尾信號片段的核苷酸序列。
實施例1 哺乳動物細胞高效表達載體pBMP6.1的構(gòu)建1.含有hsp90β基因PolyA加尾信號序列的質(zhì)粒T-PolyA的構(gòu)建1.1 hsp90β基因3′端+6497至+7108 bp片段的擴增根據(jù)文獻(Rebbe，NF等，J.Biol.Chem.(1989)264，15006-15011)發(fā)表的人hsp90β基因的序列，設(shè)計并合成了能擴增含有hsp90β基因PolyA加尾信號序列的翻譯終止密碼子、3′非翻譯區(qū)及第12內(nèi)含子的一對引物P1和P2，所述引物序列如下P15’CGAGATC+6497TAGGTTAGGAGTTCATAGTTGG+65183’(下劃線為BglII位點)P25’CG+7108GGATCCCTAGGCTCTGTTCCAT+70873’ (下劃線為BamHI位點)應(yīng)用此對引物，從Jurkat細胞(得自ATCC)基因組DNA中經(jīng)PCR擴增出與預(yù)期一致的612bp的DNA片段。PCR條件為20微升反應(yīng)體系中含有基因組DNA(75ng/μl)1微升，5′及3′引物(10pmol/μl)各1微升，10×PCR緩沖液2.5微升，4×dNTP(各2.5mM)2微升。加20微升石蠟油后，94℃變性5分鐘后，加入1微升Taq DNA聚合酶(0.6U/μl)，然后94℃變性1分鐘，57℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，循環(huán)1次；再94℃變性1分鐘，63℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，循環(huán)29次，之后72℃繼續(xù)延伸10分鐘。1.2 hsp90β基因3’下游片段(+6497/+7108bp)的克隆回收所獲得的612bp PCR擴增片段，用T4 DNA連接酶將該片段與pGEM-T Easy載體(Promega公司)連接。連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1blue菌株(Stratagene)，挑取陽性克隆，制備質(zhì)粒。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶譜分析證實人hsp90β基因+6497/+7108bp片段已被克隆，該重組質(zhì)粒被命名為T-PolyA。該質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖2所示。2.含有hsp90β基因B6.1啟動子的高效表達載體pBMP6.1的構(gòu)建2.1質(zhì)粒SK-500的構(gòu)建先用EcoRI酶切pHSP90β6.1(圖1，中國專利申請99125931.9)，棄去含有CAT及SV40 PolyA加尾信號序列的1.4Kb片段，回收含有B 6.1啟動子的4.5Kb片段，經(jīng)Klenow酶補平后，再用XbaI酶切，獲得700bp和3.8Kb兩片段，其中3.8kb片段置-20℃保存，以作為進一步克隆時的載體。PEG法回收700bp片段，經(jīng)XhoI酶切后得到500bp和200bp片段，回收500bp片段并克隆到質(zhì)粒pBS-SK(Stratagene公司)中，構(gòu)建成質(zhì)粒SK-500。該質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖3所示。2.2質(zhì)粒pB6.1的構(gòu)建質(zhì)粒SK-500以Asp718酶切為線性片段，Klenow酶補平，再以XbaI酶切，回收516bp片段，然后用T4連接酶將該片段與步驟2.1中所得3.8Kb片段進行連接，獲得質(zhì)粒pB6.1。該質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖4所示。2.3人工接入多克隆位點先用KpnI與SacI酶切質(zhì)粒pBS-SK，回收含有多克隆位點的103bp片段，再用T4DNA聚合酶削平兩端3’突出；同時，用ApaI酶切步驟2.2中所得質(zhì)粒pB6.1，得到線性DNA，依次用T4 DNA聚合酶削平3’突出及小牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)去磷酸化后與103bp片段連接，構(gòu)建成質(zhì)粒pBM6.1。經(jīng)核苷酸序列測定、分析，質(zhì)粒pBM6.1中的多克隆位點依次為SacII，SpeI，EcoRI，EcoRV，ClaI及SalI。該質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖5所示。2.4質(zhì)粒pBMP6.1的構(gòu)建依次用BglII和SpeI酶切步驟2.1中所得質(zhì)粒質(zhì)粒T-PolyA，回收hsp90β基因終止密碼子及其3’下游含有PolyA加尾信號序列的612bp片段，Klenow酶補平，同時，用ApaI酶切步驟2.3所得過渡質(zhì)粒pBM6.1，經(jīng)T4 DNA聚合酶削平3’突出及CIAP去磷酸化后與612bp片段連接，構(gòu)建成載體pBMP6.1(圖7)。該質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖6所示。實施例2人抑癌基因p53 cDNA在新建載體pBMP6.1中的表達1.質(zhì)粒pBMP6.1-p53的構(gòu)建先用BamHI酶切含有p53 cDNA片段的質(zhì)粒pCMV-Neo-BAM(Johns Hopkins大學(xué)B.Volgestein教授贈給)(圖8)，回收1.8Kb p53cDNA片段；同時，用SpeI酶切新建載體pBMP6.1，得到5.3Kb線性DNA，依次經(jīng)Klenow酶補平及CIAP去磷酸化后與p53 cDNA片段連接，構(gòu)建成質(zhì)粒pBMP6.1-p53。該質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖9所示。2.質(zhì)粒pBMP6.1-p53組成性表達水平的檢測A.方法1、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染基本按照應(yīng)用LipofectamineTM轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的說明書(Gibco公司)進行。室溫1700rpm離心5分鐘收集Jurkat細胞，以PBS洗細胞兩次，然后懸浮于適量Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)中，計算細胞數(shù)。取超螺旋質(zhì)粒pBMP6.1-p53、pB6.1-Neo-BAM-p53(本發(fā)明人構(gòu)建，圖10)及pCMV-Neo-BAM-p53各2μg，分別加入100μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，再取10μl Lipofectamin加入90μl Opti-MEM中，將兩者混勻，室溫放置15-40分鐘。取107個細胞懸浮于800μl Opti-MEM培養(yǎng)基中并置于6孔板上，加入質(zhì)粒DNA和Lipofectamin混合液200μl，輕輕混勻后在37℃，5％CO2培養(yǎng)5小時，加入9ml含11％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、6、12、18、24、36、48、60、72小時收集細胞。2、全細胞抽提物(WCE)的提取和蛋白濃度測定基本按文獻(Xiao L等Cancer Res，(2000)60400-408)的方法進行。簡要地說，室溫1,500rpm離心5分鐘收集轉(zhuǎn)染后各時間點的Jurkart細胞，用冷PBS洗滌2次后，轉(zhuǎn)入1.5ml Eppendorf管中，加入200μl冰冷的RIPA緩沖液(0.05 mol/L HEPES，pH7.5、0.15 mol/L NaCl、0.002mol/L EDTA、0.002 mol/L EGTA、1％Triton X-100、0.05 mol/L氟化鈉、0.005mol/L焦磷酸鈉、0.05 mol/L β-甘油磷酸鈉、0.001 mol/L原釩酸鈉、0.001 mol/L DTT、0.001 mol/L PMSF、10μg/ml亮抑蛋白酶肽、10μg/ml抑蛋白酶肽)，充分混勻，置于4℃輕輕搖晃1小時后，于4℃13,000rpm離心20分鐘，吸取上清于Eppendorf管中，用BCA蛋白分析試劑盒(Pierce公司)測定上清中的總蛋白濃度。3.Western印跡-ECL分析將轉(zhuǎn)染后各時間點的Jurkart細胞WCE各50μg經(jīng)10％SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用含有5％脫脂奶粉的TBST(0.02mol/L Tris-HCl，pH7.5、0.5 mol/L NaCl、0.05％Tween 20)在室溫下將硝酸纖維素膜封閉60分鐘后，TBST洗滌1次，繼之與1∶2000稀釋的小鼠抗人p53單克隆抗體DO-1(Santa Cruze公司)室溫孵育60分鐘，再用TBST洗滌3次，每次5分鐘，然后再與1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IgG(北京中山生物技術(shù)公司)室溫孵育60分鐘，經(jīng)TBST洗滌3次，每次5分鐘，再與增強型化學(xué)發(fā)光試劑ECL(Amersham公司)進行反應(yīng)，然后在X光片上曝光30秒～5分鐘后顯影，定影，比較3組轉(zhuǎn)染細胞各時間點的WCE中p53的表達水平。B.結(jié)果1.本發(fā)明表達載體pBMP6.1與其它兩種表達載體對p53 cDNA的表達效率比較質(zhì)粒pB6.1-Neo-BAM-p53與質(zhì)粒pCMV-Neo-BAM-p53相比，兩者的啟動子分別來自人hsp90β基因及病毒CMV，Western印跡顯示兩者在Jurkat細胞中p53的表達水平存在差異，pB6.1-Neo-BAM-p53在轉(zhuǎn)染Jurkat細胞后36小時p53表達達到峰值，表達水平高于pCMV-Neo-BAM-p53。質(zhì)粒pBMP6.1-p53和pB6.1-Neo-BAM-p53中僅Poly(A)加尾信號片段來源不同，分別來自人hsp90β基因和兔β珠蛋白基因，實驗結(jié)果顯示，pBMP6.1-p53轉(zhuǎn)染后48小時p53表達達到峰值，其表達水平明顯高于pB6.1-Neo-BAM-p53(見圖11及表1)。表1.三種質(zhì)粒中p53在Jurkat細胞中的表達動力學(xué)的差異
以上研究結(jié)果證實，本發(fā)明創(chuàng)建的真核表達載體pBMP6.1具有高效表達人類基因的特點。
權(quán)利要求
1.一種可在體外高效表達重組蛋白質(zhì)的人類和哺乳動物細胞表達載體，命名為pBMP6.1，其特征在于具有人源性的啟動子及多聚腺苷酸信號，該載體中啟動子元件(-1044/+695bp)、多克隆位點(+696/+803bp)及多聚腺苷酸信號(+804bp/+1415bp)的核苷酸序列如下所示-1044 CTGCAGGAGC GAAGTGGGCG GAAAAAAAGC GAACCAGCTT GAGAAAGGGC-994 TTGACGTGCC TGCGTAGGGA GGGCGCATGT CCCCGTGCTC CGTGTACGTG-944 GCGGCCGCAG GGGCTAGAGG GGGGTCCCCC CCGCAGGTAC TCCACTCTCA-894 GTCTGCAAAA GTGTACGCCC GCAGAGCCGC CCCAGGTGCC TGGGTGTTGT-844 GTGATTGACG CGGGGAAGGA GGGGTCAGCC GATCCCTCCC CAACCCTCCA-794 TCCCATCCCT GAGGATTGGG CTGGTACCCG CGTCTCTCGG ACAGGTCAGA-744 GCGGGTCGCC GGGTGGGGTC GCTGCAAAAA CCCTGCCCCG GCCGCAGCCG-694 AGAGGCGGAC GTCGCGGGGA GGGGGCGGGA CCGCCGAGAC AGGCCTGGAA-644 ACTGCTGGAA ATGCCGCAGT GCCGCCGCCG CCCCTTCCGC CGCATGTCGG-594 CAAAGAGTCC CCGCCAGCCC CGGCCGGCGC CCTCCCCCTA CGCTGAGCTG-544 CCCCTCAGCG CGAACCCTCC GCCCTTCCTC TACTCTTGCG AGAGTCGGGA-494 TCTGGGGCTA CCCAAGGTTG GGTCCCGAAT GCCAGTCCCT CTGTCGGGAC-444 GCGAGATGTG TAGGGCAGAT GCTAGGAAGA AGATTGGGTC TGGGAGCGGT-394 GGTCCGCGTG GTTAGCTGCC TCCGCTCTTT TTCGGTGTCC CCCCCAGTCC-344 CGCCCTTGGG TGTGGGGACG CCTGCCCCAC AAGTGTTTAG GGAGGTCAGT-294 GGGTTCCTCG CCCGTAGAGA CACCGTTTAT GCCAAATGAG CACTCCTCAT-244 CCCCGCTCTT GATGGAGTCA TGTCCTAGAC GTGAAACTAT GGGGCTGTGA-194 TCACAAGCAA ATGTGTGGGC GGATCCGTTG CTTGGGTTCT TCCCCGCCCC-144 CTCCTTTTTT CGGACCATGA CGTCAAGGTG GGCTGGTGGC GGCAGGTGCG-94GGGTTGACAA TCATACTCCT TTAAGGCGGA GGGATCTACA GGAGGGCGGC(+1)-44TGTACTGTGC TTCGCCTTAT ATAGGGCGAC TTGGGGCACG CAGTAGCTCT+7CTCGAGTCAC TCCGGCGCAG TGTTGGGACT GTCTGGGTAT CGGAAAGCAA+57GCCTACGTTG CTCACTATTA CGTATAATCC TTTTCTTTTC AAGGTAAGGC+107TGAGATCTCC GCTAGCCTTC TTTCCCTTTA GTGCTGTATT CGTGTTGTTT+157TTGTTTTTTT CTGTCCTTTA GGGAGCCTTA GTCTAGATGT CGGGGTGGCT+207TGTGGATAAC GCTCTGGATT TTTATAGGGT GAGGGTAGTG GTGGGTGAGG+257TTTTTTGAGT CCTCCTCGGT TTTCTCTAGT GTGTTTGGGG GGTGGGGCTT+307TCTCTCGGCG CCTGCTGGCC GTAGCGAGGT GGGCTGTGGG GTTGGGGCAG+357TGGGCGGCTG GCAGCTGCAC GTGGTGGCCG CGCGGCCCGG GACGCTGCCA+407TTTTTGCCCC TCCACTTCCG GACGCGGCTA CGGGGCGTCG GAGGGGGACC+457GCAGGGTGGC GGGGGTGCCC GCTGGGGTGA CTCAGCACGG CCTTGTGGGA+507CTGGCTTTGT CACCTCTCTT ATCGGACGCG GATCTTTAAG AGAATGCATT+557TTTAGTCTTG GGAAGGGATA GTACTCCGGT TAAACCAGTC TGAACTCACT+607GTCTAAGGTC CTAACAAATG ATATGACCTT TAGGATTTTT AAACATGGGG+657CCTTAGTGTT CTTTTGTAAT TAATGAGATT TTTATTTTGA CCTCGAGGGG+707GCCACCGCGG TGGCGGCCGC TCTAGAACTA GTGGATCCCC CGGGCTGCAG+757GAATTCGATA TCAAGCTTAT CGATACCGTC GACCTCGAGG GGGGATCTAG+807GTTAGGAGTT CATAGTTGGA AAACTTGTGC CCTTGTATAG TGTCCCCATG+857 GGCTCCCACT GCAGCCTCGA GTGCCCCTGT CCCACCTGGC TCCCCCTGCT+907 GGTGTCTAGT GTTTTTTTCC CTCTCCTGTC CTTGTGTTGA AGGCAGTAAA+957 CTAAGGGTGT CAAGCCCCAT TCCCTCTCTA CTCTTGACAG CAGGATTGGA+1007 TGTTGTGTAT TGTGGTTTAT TTTATTTTCT TCATTTTGTT CTGAAATTAA+1057 AGTATGCAAA ATAAAGAATA TGCCGTTTTT ATACAGTTCT GCTTTCCCTT+1107 GTGAAGTGGA TGTTATCCTT CCCTAGCTTC TTCATCCCTC CAGCTCTTGC+1157 TGTTTTCATG AGCACAGCAA GTTGAGCTGG TTTTGTAGTG AAAATAACAG+1207 AATACCAGTG AGTCTTAAGA GTTCACACAC TGAAGCTAAA GGCAGTTTGG+1257 AAAAACTACC ATATAATAAT GCCCTTTCAG TCAACCAAAA CACAGGACCA+1307 AGTCCACTGC AGTAATTTAA TTTAATAAAA TAAAATTATA AGAGCAAAAA+1357 GTTACATTTC TAAAGTACCA AAACCTGCAA CAGGCTCATG GAACAGAGCC+1407 TAGGGATCCC GAATCACTAG CGCGGTAC
2.權(quán)利要求1的表達載體作為基因治療載體的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的人類和哺乳動物細胞表達載體,稱為pBMP6.1,其具有人源性的啟動子及多聚腺苷酸信號。本發(fā)明還涉及所述表達載體在基因治療中的應(yīng)用。
文檔編號A61K48/00GK1360053SQ0013581
公開日2002年7月24日 申請日期2000年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月21日
發(fā)明者沈珝琲, 程小款, 王曉蓉, 王曉哲, 劉巨洪 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所