專利名稱：脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于使體外培養(yǎng)的脂肪衍生的基質(zhì)細胞定向分化成軟骨細胞譜系的細胞的方法和組合物，且本發(fā)明特別涉及在將軟骨細胞譜系的細胞植入受體或宿主之前或同時這類定向譜系用于治療人體或其它物種中的疾病的誘導作用。
間充質(zhì)干細胞(MSCs)是在能夠分化成特異性類型的間充質(zhì)或結(jié)締組織包括脂肪、骨、軟骨、彈性結(jié)締組織、肌肉結(jié)締組織和纖維結(jié)締組織的骨髓、血液、真皮和骨外膜中發(fā)現(xiàn)的形成多能胚細胞或胚胎樣細胞。這些細胞進入的特異性分化途徑取決于來自機械性影響和/或由宿主組織確立的內(nèi)源性生物活性因子諸如生長因子、細胞因子和/或局部微環(huán)境條件的各種影響。
在出生前的生物體中，可以充分確定MSCs分化成特定的結(jié)締組織細胞；例如，胚胎雞、鼠或人肢芽間充質(zhì)細胞分化成軟骨、骨和其它結(jié)締組織(CaplanA I(1981):39th Annual Symposium of the Society for DevelopmentalBiology，由S.Subtelney和U.Abbott編輯，pp 3768,New York,Alan R LissInc.；Elmer等(1981)Teratology,24:215-223；Hauschka S.D.(1974)Developmental Biology(1974)37:345-368；Solursh等(1981)Developmental Biology,83:9-19；Swalla等(1986)DevelopmentalBiology,116:31-38)。此外，已經(jīng)證實克隆鼠胎顱蓋細胞系可分化成肌肉、脂肪、軟骨和骨(Goshima等(1991)Clin.Orthop.Rel.Res.269:274-283)。還沒有對出生后生物體中存在的MSCs進行目的在于證明胚后期細胞分化成幾種中胚層表型的廣泛研究。已經(jīng)進行的少數(shù)研究包括由骨髓細胞在其在擴散室中套裝(encasement)并在體內(nèi)移植后形成骨和軟骨(Ashton等(1980)Clin.Orthop.Rel.Res.151:294-307；Bruder等(1990)Bone Mineral,11:141-151,1990)。近來，已經(jīng)從雞骨外膜中分離出了細胞、將其平展在培養(yǎng)基中并且在體外高密度的條件下證實了它們可分化成軟骨和骨(Nakahara等(1991)Exp.Cell Res.,195:492-503)。已經(jīng)證實鼠骨髓衍生的間充質(zhì)細胞在植入體內(nèi)時具有分化成成骨細胞和軟骨細胞的能力(Dennis等(1991)Cell Transpl.,1:2332；Goshima等(1991)Clin.Orthop.Rel.Res.269:274-283)。由Johnstone等在美國專利5,908,784中所做的工作證實了來源于皮膚的間充質(zhì)細胞有分化成類似于軟骨細胞的生物化學和表型細胞的能力。
成年人骨髓微環(huán)境是這些假擬間充質(zhì)干細胞的潛在來源。自成年人骨髓分離的細胞有不同的名稱包括基質(zhì)細胞、基質(zhì)干細胞、間充質(zhì)干細胞(MSCs)、間充質(zhì)成纖維細胞、網(wǎng)狀-內(nèi)皮細胞和Westen-Bainton細胞(Gimble等(1996年11月)Bone 19(5):421-8)。體外研究已經(jīng)確定這些細胞可以沿多中胚層或間充質(zhì)譜系途徑分化。這些細胞包括但不限于脂肪細胞(Gimble等(1992)J.Cell Biochem.50:73-82)、軟骨細胞(Caplan等(1998)J.Bone JointSurg.Am.80(12):1745-57)、造血支持細胞(Gimble等(1992)J.CellBiochem.50:73-82)、肌細胞(Prockop等(1999)J.Cell Biochem.72(4):570-85)、肌細胞(Charbord等(1999)Exp.Hematol.27(12):1782-95)、和成骨細胞(Beresford等(1993)J.Cell Physiol.154:317-328)。已經(jīng)將骨髓用作再生骨、軟骨、肌肉、脂肪組織和其它間充質(zhì)衍生器官的基質(zhì)干細胞的來源。對這些細胞的用途的主要限制在于進行骨髓活檢過程時的困難和危險附屬物、并且來自這種來源的干細胞的產(chǎn)率低。
脂肪組織為作為多能基質(zhì)干細胞來源的骨髓提供了另一種選擇。脂肪組織使用方便且在許多個體中蘊含豐富。在美國肥胖屬于表皮部分的疾病，其中超過50％的成年人超過了根據(jù)其身高推薦的BMI。通過以門診病人為主進行脂肪抽吸來收集脂肪細胞。對于廣大患者來說，這是一種可接受的具有整容效果的相對非侵染性方法。已經(jīng)有足夠的資料證明脂肪細胞是一種可再充滿的細胞群體。甚至在使用脂肪抽吸和其它過程的外科手術(shù)去除后，通常仍然可以觀察到脂肪細胞在一段時間內(nèi)在個體中再生。這提示脂肪組織中含有能夠自我更新的基質(zhì)干細胞。
病理性證據(jù)提示脂肪衍生的基質(zhì)細胞能夠沿多間充質(zhì)譜系分化。大多數(shù)常見的軟組織瘤(脂質(zhì)肉瘤)是從脂肪細胞樣細胞發(fā)展而來?；旌蟻碓吹能浗M織瘤相對常見。它們可以包括脂肪組織、肌肉(平滑肌或骨骼肌)、軟骨和/或骨的成分。在骨髓內(nèi)僅作為骨成形細胞的細胞可以分化成脂肪細胞或脂肪的細胞，髓外脂肪細胞能夠形成成骨細胞(Halvorsen WO 99/28444)。
軟骨是一種多水結(jié)構(gòu)，它具有的水含量占其重量的70％-80％。剩余的20％-30％包括Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖。膠原蛋白通常占軟骨干重的70％(在“Pathology”(1988)中，Rubin和Farber編輯，J.B.Lippincott Company,PA.pp.1369-1371)。蛋白聚糖由從其中伸展多糖類長鏈的中央蛋白核心組成。這些稱作糖胺聚糖類的多糖類包括軟骨素-4-硫酸鹽、軟骨素-6-硫酸鹽和硫酸角質(zhì)素。軟骨具有特征性結(jié)構(gòu)組織，它由分散在內(nèi)源性產(chǎn)生和分泌的胞外基質(zhì)內(nèi)的軟骨形成細胞組成。含有軟骨細胞的基質(zhì)中的腔稱作軟骨腔隙。與骨不同，軟骨既不受神經(jīng)支配也不能被血管或淋巴系統(tǒng)透入(Clemente(1984)在“Gray’s Anatomy,30 sup.th Edit”中所述，Lea & Febiger)。
有三類軟骨存在于哺乳動物中，包括透明軟骨、纖維軟骨和彈性軟骨(Rubin和Farber，見上文)。透明軟骨由帶有堅固、彈性密度的軟骨團組成，它是半透明的且顯珠光藍色。透明軟骨主要在接合關(guān)節(jié)的接合表面上發(fā)現(xiàn)。在骺板、肋軟骨、氣管軟骨、支氣管軟骨和鼻軟骨中也可以發(fā)現(xiàn)它。纖維軟骨除含有可增加軟骨抗張強度的Ⅰ型膠原蛋白原纖維外，基本上與透明軟骨相同。膠原纖維呈束狀排列，在束間存在有軟骨細胞。通常在椎間盤的纖維環(huán)、腱和韌帶嵌入物、半月板、恥骨聯(lián)合和關(guān)節(jié)囊嵌入物中發(fā)現(xiàn)纖維軟骨。彈性軟骨除含有彈性蛋白纖維外也類似于透明軟骨。它比透明軟骨更不透明且更柔韌和更易彎曲。由軟骨基質(zhì)中包埋的彈性纖維來部分地確定這些特征。一般來說，在耳部的耳廓、會厭和喉中存在彈性軟骨。
哺乳動物關(guān)節(jié)中接合骨的表面被關(guān)節(jié)軟骨覆蓋。關(guān)節(jié)軟骨可防止相對骨表面的直接接觸并允許接合骨相互之間的接近無摩擦的運動(Clemente，上文)。通常在哺乳動物中觀察到兩類關(guān)節(jié)軟骨的缺損，它們包括全厚度和部分厚度的缺損。兩類缺損不僅在物理性損害的程度上而且在各類損害引起的修復反應的性質(zhì)上不同。
全厚度關(guān)節(jié)軟骨缺損包括對關(guān)節(jié)軟骨、潛在的軟骨下骨組織和位于關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨之間的軟骨鈣化層的損害。全厚度缺損通常在嚴重的關(guān)節(jié)外傷過程中或在變性關(guān)節(jié)疾病的晚期階段、例如骨關(guān)節(jié)炎過程中產(chǎn)生。由于軟骨下骨組織受神經(jīng)支配并血管化，所以對這種組織的損傷經(jīng)常發(fā)生疼痛。由對軟骨下骨損傷所誘發(fā)的修復反應通常導致在全厚度缺損部位處形成纖維軟骨。然而，纖維軟骨缺乏關(guān)節(jié)軟骨的生物機械特性且不能夠在關(guān)節(jié)中長時間持續(xù)存在。
部分厚度的關(guān)節(jié)軟骨缺損受到軟骨組織自身的限制。這些缺損通常包括軟骨接合表面中的裂隙或裂口。部分厚度缺損由誘發(fā)關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨組織磨損的關(guān)節(jié)的機械性排列所導致。在沒有神經(jīng)支配和血管系統(tǒng)的情況下，部分厚度缺損不會引起修復反應且因此不會趨向于愈合。盡管沒有痛苦，但是部分厚度缺損經(jīng)常變性成全厚度缺損。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明者已經(jīng)觀察到當人脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞與三維形式相關(guān)時，如果它們與某種軟骨誘導劑或因子體外接觸，它們則可以用于沿軟骨形成途徑分化。三維形式對于本發(fā)明的體外軟骨形成來說是關(guān)鍵的，且細胞-優(yōu)選聚在一起的，例如是作為壓緊或沉淀的細胞團的形式或處于藻酸鹽基質(zhì)中。本發(fā)明提供了用于沿軟骨細胞譜系分離、分化和表征成年人胞外脂肪組織基質(zhì)細胞的方法和組合物的實例，及其用于治療大量人體疾患和疾病的用途的概要。認為這一體外過程再現(xiàn)了體內(nèi)發(fā)生的情況且可以將它用于促進哺乳動物體內(nèi)軟骨的修復。
本發(fā)明提供了用于將來源于皮下、乳房、生殖腺或網(wǎng)膜的脂肪組織的基質(zhì)細胞持續(xù)和定量誘導成全功能性軟骨細胞的方法和組合物。該方法包括下列步驟培養(yǎng)所分離的脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞、以500-20,000個細胞/cm2的密度在以化學方式確定的培養(yǎng)基中將其鋪平板，該培養(yǎng)基含有下列成分或用下列成分進行了補充(1)能夠激活可產(chǎn)生成熟軟骨細胞表型的任何細胞轉(zhuǎn)導途徑的軟骨誘導劑；(2)抗菌素；(3)營養(yǎng)補充劑諸如胎牛血清或馬血清；(4)抗壞血酸或相關(guān)的維生素C類似物以及(5)糖皮質(zhì)激素或能夠激活細胞糖皮質(zhì)激素受體的另一種化學劑。
本發(fā)明還提供了一種用于使脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞分化成軟骨細胞的方法，即通過在諸如DMEM或α-MEM或RPMI 1640這樣的培養(yǎng)基中沉淀基質(zhì)細胞、并用下列成分補充所述培養(yǎng)基(1)能夠激活可產(chǎn)生成熟軟骨細胞表型的任何細胞轉(zhuǎn)導途徑的軟骨誘導劑；(2)抗菌素；(3)營養(yǎng)補充劑諸如胎牛血清或馬血清；(4)抗壞血酸或相關(guān)的維生素C類似物以及(5)糖皮質(zhì)激素或能夠激活細胞糖皮質(zhì)激素受體的另一種化學劑。
本發(fā)明還提供了一種通過在海藻酸鈣或能夠以三維構(gòu)造支撐軟骨形成的其它生物相容性晶格或基質(zhì)中懸浮細胞而使脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞分化成軟骨細胞的方法。
本發(fā)明提供了用于測定這些培養(yǎng)條件和試劑對于脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞分化和功能的能力、用于將攜帶調(diào)節(jié)基因的病毒載體轉(zhuǎn)導入所述基質(zhì)細胞、用于將攜帶調(diào)節(jié)基因的病毒載體轉(zhuǎn)染入所述基質(zhì)細胞、用于追蹤和檢測由這些基因編碼的功能性蛋白、和用于開發(fā)重新將這些細胞引入生物有機體的生物機械性載體的方法。
本發(fā)明進一步提供了用于將這些軟骨細胞引入用于修復的軟骨缺損區(qū)域的方法。
本方法和組合物已經(jīng)用于與分化細胞相關(guān)疾病狀態(tài)和創(chuàng)傷損害有關(guān)的化合物和蛋白質(zhì)的藥物開發(fā)，所述的創(chuàng)傷損害包括但不限于前交叉韌帶撕裂、全厚度關(guān)節(jié)軟骨缺損、部分厚度關(guān)節(jié)軟骨缺損。
附

圖1表示來自單層培養(yǎng)物的人體脂基持細胞中Ⅱ型膠原蛋白的免疫檢測。在上部一組實驗對象中使用相差顯微鏡；在下部一組實驗對象中使用免疫熒光。
附圖2表示來自沉淀培養(yǎng)物的人體脂肪基質(zhì)細胞中Ⅱ型膠原蛋白的免疫檢測。在上部一組實驗對象中使用相差顯微鏡；在下部一組實驗對象中使用免疫熒光。
附圖3表示來自藻酸鹽培養(yǎng)物的人體脂肪基質(zhì)細胞中Ⅱ型膠原蛋白的免疫檢測。在上部一組實驗對象中使用相差顯微鏡；在下部一組實驗對象中使用免疫熒光。
附圖4表示在不含β-TGF(對照)和含有β-TGF的藻酸鹽基質(zhì)中培養(yǎng)細胞2周時的Ⅵ型膠原蛋白的表達情況。
附圖5表示當細胞作為單層或在藻酸鹽懸浮液中生長時用于表達不同蛋白質(zhì)包括Ⅵ型膠原蛋白、連接物、聚集蛋白聚糖、Ⅰ型膠原蛋白和肌動蛋白的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。
本發(fā)明提供了用于將脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞分化和培養(yǎng)成軟骨細胞的方法和組合物。由本發(fā)明方法生產(chǎn)的細胞用于提供治療人體疾病和創(chuàng)傷損害修復的組織工程產(chǎn)品的研究、移植和開發(fā)的完全分化和功能性細胞的來源。因此，一方面，本發(fā)明提供了用于使脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞分化成軟骨細胞的方法，該方法包括在含有能夠支持基質(zhì)細胞生長并分化成功能性軟骨細胞的培養(yǎng)基的組合物中培養(yǎng)基質(zhì)細胞的步驟。本發(fā)明進一步提供了用于將這些軟骨細胞引入進行修復的軟骨缺損區(qū)域的方法。
“脂肪基質(zhì)細胞”指的是來源于脂肪組織的基質(zhì)細胞。所謂“脂肪”指的是任何脂肪組織。脂肪組織可以是棕色或白色的脂肪組織，它來源于皮下、網(wǎng)膜/內(nèi)臟、乳房、生殖腺或其它脂肪組織部位。優(yōu)選的情況是，所述的脂肪組織是皮下白色脂肪組織。這類細胞可以含有原代細胞培養(yǎng)物或無限增殖化細胞系。所述的脂肪組織可以來自具有脂肪組織的任何生物體。優(yōu)選的情況是，所述的脂肪組織是哺乳動物的脂肪組織；最優(yōu)選的情況是，所述的脂肪組織是人體脂肪組織。脂肪組織的方便的來源是來自脂肪抽吸手術(shù)，然而，脂肪組織的來源或分離脂肪組織的方法對于本發(fā)明來說并不關(guān)鍵。如果需要基質(zhì)細胞自身植入受試者，那么將從該受試者中分離脂肪組織。
“軟骨細胞”(軟骨的細胞)指的是能夠表達軟骨細胞的特征生物化學標記的細胞，其包括但不限于Ⅱ型膠原蛋白、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和平滑肌的特征形態(tài)標記，這些細胞包括但不限于培養(yǎng)物中觀察到的圓形形態(tài)的細胞；“軟骨細胞”還指能夠分泌Ⅱ型膠原蛋白的細胞，包括但不限于生成具有體外軟骨的血液動力特性的組織或基質(zhì)的細胞。
可以使用在組織培養(yǎng)物中能夠支持基質(zhì)細胞的任意培養(yǎng)基。支持成纖維細胞生長的培養(yǎng)基配方包括但不限于Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、α改進的極限必需培養(yǎng)基(αMEM)或Roswell Park Memorial Institute培養(yǎng)基1640(RPMI培養(yǎng)基1640)等。一般來說，將0-20％的胎牛血清(FBS)或1-20％的馬血清加入到上述培養(yǎng)基中以便支持基質(zhì)細胞和/或軟骨細胞的生長。然而，如果鑒定用于基質(zhì)細胞和軟骨細胞的FBS中的必需生長因子、細胞因子和激素并在生長培養(yǎng)基中提供合適的濃度，那么可以使用所定義的培養(yǎng)基。用于本發(fā)明方法中的培養(yǎng)基可以含有一種或多種有意義的化合物，但不限于用于基質(zhì)細胞的抗菌素、促有絲分裂或分化的化合物。使所述的細胞在31℃-37℃下在一種加濕培養(yǎng)箱中生長。將二氧化碳的含量維持在2％-20％的范圍并將氧氣含量維持在1％-22％的范圍。細胞將在該環(huán)境中保持達4周的期限。
可以補充入所述培養(yǎng)基的抗菌素包括但不限于青霉素和鏈霉素。在以化學方式確定的培養(yǎng)基中青霉素的濃度約為10-約200單位/ml。以化學方式確定的培養(yǎng)基中鏈霉素的濃度約為10-約200μg/ml。
可以用于本發(fā)明的糖皮質(zhì)激素包括但不限于氫化可的松和地塞米松。培養(yǎng)基中地塞米松的濃度約為1-約100nM。培養(yǎng)基中氫化可的松的濃度約為1-約100nM。
本文所用的術(shù)語“軟骨誘導劑”或“軟骨誘導因子”指的是天然或合成的有機或無機化學或生物化學化合物或化合物的組合物或混合物，或可施用于人體脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞以便使其在體外產(chǎn)生軟骨形成誘導作用或產(chǎn)生軟骨細胞的任何機械或其它物理的裝置、容器、影響或力量。該軟骨誘導劑優(yōu)選分別或以混合方式選自下列物質(zhì)組成的組(ⅰ)糖皮質(zhì)激素諸如地塞米松；(ⅱ)β-轉(zhuǎn)化生長因子超家族中的一個成分諸如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(優(yōu)選BMP-2或BMP-4)、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、胰島素樣生長因子(IGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFBF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFBF)、肝細胞生長因子(HGF)、角膜細胞生長因子(KGF)、成骨蛋白(OP-1、OP-2、和OP-3)、抑制素A和軟骨形成刺激活性因子(CSA)；(ⅲ)膠原胞外基質(zhì)的成分諸如膠原蛋白Ⅰ(特別是凝膠形式)；和(ⅵ)維生素A類似物諸如視黃酸；以及(ⅴ)抗壞血酸或其它相關(guān)維生素C類似物。
β-轉(zhuǎn)化生長因子的濃度約為1-約100ng/ml。視黃酸的濃度約為0.1-約1μg/ml。
屬于基質(zhì)細胞促細胞分裂劑化合物的實例包括但不限于β-轉(zhuǎn)化生長因子；成纖維細胞生長因子；骨形態(tài)發(fā)生蛋白和基質(zhì)細胞分化因子包括但不限于地塞米松、氫化可的松、β-轉(zhuǎn)化生長因子、成纖維細胞生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白等。
優(yōu)選的情況是，從引入最終分化細胞的受試者的脂肪組織中分離脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞。然而，也可以從作為受試者的相同或不同物種的任何生物體中分離所述的基質(zhì)細胞。具有脂肪組織的任何生物體可以是潛在的候選者。優(yōu)選的情況是，所述的生物體是哺乳動物，最優(yōu)選所述的生物體是人。
本發(fā)明還提供了一種用于通過在能夠以三維構(gòu)造支撐軟骨形成的海藻酸鈣或另一種生物相容性晶格或基質(zhì)中懸浮細胞而使脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞分化成軟骨細胞的方法。晶格物質(zhì)的實例包括(1)海藻酸鈣、它是一種交聯(lián)的L-葡糖醛酸和D-甘露糖醛酸的多糖、濃度為1％-4％；(2)纖維蛋白；(3)Ⅱ型膠原蛋白；或(4)瓊脂糖凝膠。將含有細胞的晶格或基質(zhì)轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，所述的培養(yǎng)皿中含有(1)可以激活產(chǎn)生成熟軟骨細胞表型的任何細胞轉(zhuǎn)導途徑的軟骨誘導劑；(2)抗菌素；(3)營養(yǎng)補充劑諸如胎牛血清或馬血清；(4)抗壞血酸或相關(guān)維生素C類似物；和(5)糖皮質(zhì)激素或能夠激活細胞糖皮質(zhì)激素受體的另一種化學劑。
可以使用質(zhì)粒、病毒或可選擇戴體的策略，用一種有意義的核酸穩(wěn)定或暫時性地轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞。有意義的核酸包括但不限于那些促進軟骨中發(fā)現(xiàn)的胞外基質(zhì)成分產(chǎn)生的編碼基因產(chǎn)物；實例包括β-轉(zhuǎn)化生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、活化素和胰島素樣生長因子。
可以用由氯化銫顯帶法或其它按10∶1-2000∶1多重性感染(病毒單位細胞)的方法純化的病毒載體(腺病毒、反錄病毒、與腺相關(guān)的病毒或其它載體)來進行將攜帶調(diào)節(jié)基因的病毒載體轉(zhuǎn)導入所述基質(zhì)細胞的過程。使細胞在沒有或有陽離子去污劑諸如聚乙烯亞胺或LipofectamineTM存在的情況下、在不含血清或含有血清的培養(yǎng)基中與病毒接觸1小時至24小時的期限(Byk等(1998)Human Gene Therapy 9:2493-2502；Sommer B.等(1999)Calcif.Tissue Int.64:45-49)。
通過使用磷酸鈣DNA沉淀法或陽離子去污劑法(LipofectamineTM,DOTAP)可以將攜帶調(diào)節(jié)基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入單層培養(yǎng)物中的細胞或通過直接將質(zhì)粒DNA載體加入生物相容性聚合物中而將攜帶調(diào)節(jié)基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入三維培養(yǎng)物中(Bonadio J.等(1999)Nat.Med.5:753-759)。
為了追蹤和檢測由這些基因編碼的功能性蛋白質(zhì)，病毒或質(zhì)粒DNA載體將含有易于檢測的標記基因諸如綠色熒光蛋白或β-半乳糖苷酶，兩者均可以用組織化學方法追蹤。
對于開發(fā)用于將基質(zhì)細胞重新引入生物體的生物機械性載體來說，所述的載體包括但不限于海藻酸鈣、瓊脂糖、Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型或其它膠原蛋白同種型、纖維蛋白、聚-乳酸/聚-乙醇酸、透明質(zhì)酸鹽衍生物或其它物質(zhì)(Perka C.等(2000)J.Biomed.Mater.Res.49:305-311；Sechriest VF.等(2000)J.Biomed.Mater.Res.49:534-541；Chu CR.等(1995)J.Biomed.Mater.Res.29:1147-1154；Hendrickson DA.等(1994)Orthop.Res.12:485-497)。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于鑒定和研究可促進脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞分化成軟骨細胞的化合物。促進分化的化合物在治療部分或完全軟骨缺損、骨關(guān)節(jié)炎、外傷性軟骨、包括腭裂或隔膜偏離在內(nèi)的先天性缺損的整容手術(shù)中是有價值的。方法包括但不限于開發(fā)體外三維培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物可維持脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞作為軟骨細胞，這些細胞隨后可與有價值的新型化合物接觸。
可以檢測任意化合物的影響脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞分化成軟骨細胞的能力。與所試驗化合物相容的合適載體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的且可以在最新版本的《Remington’s藥物科學》(Remington’s PharmaceuticalSciences)(1995,Mack Publishing Co.,Easton,PA)中找到，將該文獻的內(nèi)容引入本文作為參考。
參照下列實施例可以更清楚地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點，這些實施例不用來限定本發(fā)明。實驗部分脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞分化成軟骨細胞實施例1使用地塞米松的體外軟骨形成按照于1999年1月29日提交的順序號為09/240,029號申請“人體前脂肪細胞分化成軟骨細胞的方法和組合物”中所述的方法從人體皮下脂肪組織中分離基質(zhì)細胞。以500-20,000個細胞/cm2的密度將這些細胞鋪平板。本發(fā)明關(guān)注的是體外生成的前軟骨凝聚作用促進了來源于人體脂肪組織的間充質(zhì)遠祖細胞內(nèi)的軟骨形成。通過下列方法來完成上述過程，所述的方法包括但不限于(1)使用開發(fā)的含有分離的生長平板細胞的沉淀培養(yǎng)物系統(tǒng)，(Kato等(1988)PNAS 85:9552-9556；Ballock & Reddi,J.Cell Biol.(1994)126(5):1311-1318)且已經(jīng)將該系統(tǒng)用于維持放入培養(yǎng)物中的軟骨細胞的軟骨表型的表達(Solursh(1999)J.Cell Biochem.45:258-260)。
(2)藻酸鹽懸浮法，其中將細胞維持在海藻酸鈣懸浮液中以便防止細胞-細胞接觸并維持圓形形態(tài)特征，從而促進軟骨細胞表型的維護和獲取。
如上所述分離人體脂肪組織衍生的細胞。對于沉淀培養(yǎng)物來說，將等份的200,000個細胞在無菌的15ml圓錐形聚丙烯試管內(nèi)的DMEM中以500g離心10分鐘，所述的DMEM中含有10％胎牛血清、50ng/ml的抗壞血酸-2-磷酸、100nM地塞米松(DEX)；然后在37℃下和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)達3周。對于藻酸鹽培養(yǎng)物來說，以每ml 1百萬個細胞的密度將細胞懸浮在1.2％海藻酸鈣中并維持在含有10％胎牛血清、50ng/ml的抗壞血酸-2-磷酸、100nM地塞米松(DEX)的DMEM中，然后在37℃下和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)達3周。2-4周后，將細胞分離、固定并通過免疫組織化學法使用合適的抗體試劑或通過用甲苯胺藍染色以檢測胞外基質(zhì)中存在的硫酸化蛋白聚糖來分析軟骨細胞譜系的標記。
使用檢測有代表性的軟骨細胞標記蛋白(膠原蛋白Ⅱ)的抗體獲得的結(jié)果如附圖1-3中所示。維持在沉淀培養(yǎng)物(附圖2)或海藻酸鈣(附圖3)中的細胞經(jīng)胞內(nèi)存在的膠原蛋白Ⅱ蛋白質(zhì)的免疫熒光染色為陽性。這些結(jié)果與對在附圖1中所示單層培養(yǎng)物中維持3周的脂肪組織衍生的細胞的相同分析相反；此處，無論如何也沒有觀察到染色。使用檢測軟骨細胞標記蛋白(膠原蛋白Ⅵ)的抗體試劑的免疫組織化學結(jié)果如附圖4中所示。將脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞維持在1.2％海藻酸鈣中，并在沒有或有β-轉(zhuǎn)化生長因子(10ng/ml)存在的情況下維持在含有10％胎牛血清、50ng/ml的抗壞血酸-2-磷酸、100nM地塞米松(DEX)的DMEM中，然后在37℃下和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)達2周。免疫組織化學揭示了在有(而不是沒有)β-轉(zhuǎn)化生長因子存在的情況下維持的那些細胞周圍的膠原蛋白Ⅵ蛋白質(zhì)的沉積密度。
檢測有代表性的與軟骨形成相關(guān)的基因標記的聚合酶鏈反應結(jié)果如附圖5中所示。將脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞維持在1.2％海藻酸鈣(Alg)中或單層(Mono)培養(yǎng)物中、并在沒有(TGFβ-)或有(TGFβ+)β-轉(zhuǎn)化生長因子(10ng/ml)存在的情況下維持在含有10％胎牛血清、50ng/ml的抗壞血酸-2-磷酸、100nM地塞米松(DEX)的DMEM中達4周的期限。從各個培養(yǎng)物中分離出總RNA并用于采用對Ⅰ或Ⅵ型膠原蛋白、蛋白聚糖連接(連接物)蛋白、聚集蛋白聚糖或肌動蛋白有特異性的引物的聚合酶鏈反應。在所有生長條件下檢測膠原蛋白標記和肌動蛋白。然而，在藻酸鹽懸浮條件下連接物mRNAs最為豐富、且在有TGFβ存在的情況下在藻酸鹽條件下僅存在聚集蛋白聚糖。
這些結(jié)果證明通過將生成體外細胞聚集體和加入合適的允許因子結(jié)合起來，我們能夠表達符合來自皮下脂肪組織細胞中軟骨形成的軟骨細胞標記。實施例2合成軟骨膜片的制備在增殖后，可以以一種不依賴貼壁方式即在帶有細胞接觸的孔(細胞粘附表面)中培養(yǎng)仍具有軟骨形成潛能的軟骨形成細胞以便刺激軟骨特異性胞外基質(zhì)成分的分泌。
迄今為止，已經(jīng)觀察到以依賴貼壁方式增殖擴增的軟骨形成細胞通常分化并失去其分泌軟骨特異性Ⅱ型膠原蛋白和硫酸化蛋白聚糖的能力(Mayne等(1984)Exp.Cell.Res.151(1):171-82；Mayne等(1976)PNAS 73(5):1674-8；Okayama等(1976)PNAS 73(9):3224-8；Pacifici等(1981)J.Biol.Chem.256(2):1029-37；Pacifici等(1980)Cancer Res.40(7):2461-4；Pacifici等(1977)Cell 4:891-9；von der Mark等(1977)Nature 267(5611):531-2；West等(1979)Cell 17(3):491-501；Oegama等(1981)J.Biol.Chem.256(2):1015-22；Benya等(1982)Cell 30(1):215-24)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當將未分化軟骨形成細胞接種入具有阻礙細胞粘附于細胞接觸表面的細胞接觸表面的孔中并在其中培養(yǎng)時，所述的細胞重新分化并開始分泌軟骨特異性膠原蛋白和硫酸化蛋白聚糖，由此形成體外合成軟骨膜片(美國專利5,902,741和5,723,331)。
此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在預定形狀的孔中培養(yǎng)細胞能夠?qū)⑵渲瞥深A定厚度和體積的合成軟骨膜片。然而，發(fā)現(xiàn)所得軟骨膜片的體積不僅取決于孔的體積而且取決于接種入孔的軟骨形成細胞的數(shù)量。通過經(jīng)改變上述參數(shù)之一或上述兩種參數(shù)的常規(guī)實驗可以制備最佳預定體積的軟骨。A．預定形狀孔的制備。
可得到幾種手段來制備具有細胞接觸、細胞粘附表面的預定形狀的孔。
可以用阻礙軟骨形成細胞粘附于細胞接觸表面的分子包覆細胞接觸表面。優(yōu)選的包被試劑包括基于硅的試劑即二氯二甲基甲硅烷或基于聚四氟乙烯的試劑即Teflon.RTM。用基于硅的試劑特別是二氯二甲基甲硅烷包被材料的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。參見，例如，Sambrook等(1989)“分子克隆實驗室手冊”，冷泉港實驗室出版，將該文獻的公開內(nèi)容引入本文作為參考。發(fā)現(xiàn)可以將可防止細胞與孔表面附著的其它生物相容性試劑用于實施本發(fā)明。
另一方面，可以由自身不允許細胞附著的柔韌或可模塑的生物相容性材料來模塑成孔?？煞乐惯@種細胞附著的優(yōu)選的材料包括但不限于瓊脂糖、玻璃、未處理的細胞培養(yǎng)物塑料和聚四氟乙烯即Teflon.RTM。未處理的細胞培養(yǎng)物塑料即未用帶有靜電電荷的物質(zhì)處理的塑料或由這類物質(zhì)構(gòu)成的塑料，它們從市售可得且可以商購自例如Falcon Labware,Becton-Dickinson,LincolnPark,N.J.。然而，并不意味著上述材料是限定性的。應理解為可以將本來就阻礙軟骨形成細胞附著的任何其它柔韌或可模塑性生物相容性材料用于實施本發(fā)明。
根據(jù)所修復的關(guān)節(jié)軟骨缺損的大小和形狀可以確定孔的大小和形狀。例如，要求孔可以具有25cm2的截面表面積。這是成年人股骨軟骨截面表面積的平均值。因此，預計按照本發(fā)明可以制成單片合成軟骨以便重修完整的股骨軟骨表面?？椎纳疃葍?yōu)選大于約0.3cm且優(yōu)選約0.6cm的深度。成年人接合關(guān)節(jié)中天然關(guān)節(jié)軟骨的厚度通常約為0.3cm。因此，孔的深度應足夠大以便使得約0.3cm的軟骨膜片形成。然而，孔也應足夠深以便其中含有覆蓋軟骨膜片的生長培養(yǎng)基。
還希望可以將按照本發(fā)明制備的大片軟骨“修整”成外科醫(yī)師能夠進行外科手術(shù)修復受損害軟骨的預選的大小和形狀。借助于鋒利的切割器具即手術(shù)刀、剪刀或裝有切割邊的關(guān)節(jié)鏡檢查裝置、使用本領(lǐng)域眾所周知的方法可以進行修整過程。
在無菌條件下預定形狀的孔優(yōu)選是在大塊瓊脂糖凝膠中模塑。瓊脂糖是一種可用于快速和方便地模塑預定形狀孔的經(jīng)濟、生物相容性、柔韌和可模塑性的物質(zhì)。如上所述，孔的大小可以取決于得到的所需軟骨填充物的大小。
通過將熔化的LT瓊脂糖(BioRad,Richmond,CA)熱溶液傾入含有圓筒的組織培養(yǎng)皿中可以制成預定形狀的孔。所述的圓筒具有反映所形成孔的形狀的大小?？椎拇笮『托螤钣杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員來選擇且可以取決于所修復關(guān)節(jié)軟骨缺損的形狀。一旦瓊脂糖冷卻并在圓筒周圍固化，則用鑷子將圓筒小心地取出。用熔化的瓊脂糖覆蓋經(jīng)取出圓筒而暴露的組織培養(yǎng)皿的表面。這樣可密封孔的底部并在孔的基底部產(chǎn)生細胞粘附表面。當新近添加的熔化LT瓊脂糖冷卻并固化時，所得的預定形狀的孔適合于培養(yǎng)并刺激增殖的軟骨形成細胞的再分化。然而，發(fā)現(xiàn)另一種方法可用于制備用于實施本發(fā)明的預定形狀的孔。B．軟骨膜片的生長可以將增殖的軟骨形成細胞懸浮液接種入預定形狀的孔并在其中培養(yǎng)?？梢酝ㄟ^添加細胞培養(yǎng)基而將細胞稀釋成每ml約1×105-1×109個軟骨形成細胞的細胞密度。優(yōu)選的細胞培養(yǎng)基中含有用10％胎牛血清補充了的DMEM。
在將軟骨形成細胞接種入孔的大約4小時內(nèi)，所述的細胞可以合生成細胞粘性填充物。在約4-10天后，細胞開始分泌軟骨特異性硫酸化蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白。在延長培養(yǎng)期限后，由孔中軟骨形成細胞表達的膠原蛋白主要是Ⅱ型膠原蛋白。然而，發(fā)現(xiàn)可以將4小時內(nèi)形成的細胞粘性填充物從孔中取出并以外科手術(shù)方式植入軟骨缺損處。預計未分化的軟骨形成細胞隨后可以在原位重新分化，由此形成關(guān)節(jié)內(nèi)的合成軟骨。
觀察到可以將軟骨細胞分化或刺激因子添加到預定形狀的孔中的軟骨形成細胞中以便促進或刺激關(guān)節(jié)軟骨特異性蛋白聚糖和/或膠原蛋白的產(chǎn)生(Luyten& Reddi(1992):“Biological Regulation of the Chondrocytes”,CRC Press,Boca Raton,Ann Arbor,London，和Tokyo,p.p.227-236)。優(yōu)選的生長因子包括但不限于β-轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)；胰島素樣生長因子(IGF)；血小板衍生生長因子(PDGF)；表皮生長因子(EGF)；酸性成纖維細胞生長因子(aFBF)；堿性成纖維細胞生長因子(bFBF)；肝細胞生長因子(HGF)；角膜細胞生長因子(KGF)；骨形態(tài)發(fā)生因子(BMPs)即BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5和BMP-6以及成骨蛋白(OPs)即OP-1、OP-2和0P-3。TGF-β、IGF、PDGF、EGF、aFBF、bFBF、HGF和KGF的優(yōu)選濃度在約1-100ng/ml的范圍。BMP’s和OP’s的優(yōu)選濃度在約1-約500ng/ml的范圍。
然而，這些特定的生長因子不是限定性的?？梢詫⒛軌虼碳せ蛘T導軟骨特異性蛋白聚糖和膠原蛋白的產(chǎn)生的任何多肽生長因子用于實施本發(fā)明。
此外，觀察到可以將抗壞血酸添加到預定形狀孔的軟骨形成細胞中以便促進或刺激軟骨特異性蛋白聚糖和膠原蛋白的產(chǎn)生。抗壞血酸的優(yōu)選濃度在約1-約1000μg/ml的范圍。實施例3關(guān)節(jié)軟骨缺損的手術(shù)修復哺乳動物中的軟骨缺損在關(guān)節(jié)鏡檢查過程中或在關(guān)節(jié)的開放式手術(shù)過程中是容易目測辨認的。理論上也可以通過使用計算機輔助斷層照相(CAT掃描)、X-射線檢查、磁共振成象(MRI)、滑液或血清標記分析或通過本領(lǐng)域中公知的任意其它方法來鑒定軟骨缺損。在關(guān)節(jié)鏡檢查或開放式手術(shù)過程中使用本文所公開的方法和組合物可以有效地治療這種缺損。
因此，一旦鑒定了這種缺損，則可以通過下列步驟來治療這種缺損(1)以手術(shù)方式在預定部位移植一片由本文所述方法制備的合成關(guān)節(jié)軟骨；并(2)使所述合成關(guān)節(jié)軟骨整合到預定部位。
合成的軟骨膜片最好具有這樣的大小和形狀，使得當將該膜片植入缺損時，植入組織的邊緣直接與缺損邊緣接觸。此外，可以將合成的軟骨膜片在手術(shù)過程中在原位固定。這可以通過用可生物降解的縫合線即(Ethicon,Johnson和Johnson)以手術(shù)方式將膜片固定入缺損、和/或通過將生物粘合劑用于接觸膜片和缺損的區(qū)域而實現(xiàn)。優(yōu)選的生物粘合劑包括但不限于類似于法國專利2,448,900、法國專利2,448,901和歐洲專利序列號(EP.S.N.)88401961.3中所述的纖維蛋白-凝血酶膠粘物以及類似于美國專利5,197,973中所述的合成生物粘合劑。然而，發(fā)現(xiàn)可以將另一種類型的縫合線和生物相容性膠粘物用于實施本發(fā)明。
在某些情況中，在移植合成軟骨膜片前可以以手術(shù)方式切下受損的關(guān)節(jié)軟骨。另外，可以通過用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理缺損部位來促進合成軟骨膜片與關(guān)節(jié)軟骨缺損的粘合(Ichinose等(1990)J.Biol.Chem.265(3):13411-13414；Najjar等(1984):“Transglutaminases”,Boston,Martinuse-Nijhoff)。最初，例如通過使用棉花樣物質(zhì)(cottonoid)將軟骨缺損干燥并充滿轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液。隨后例如通過抽吸除去該溶液，從而遺留下在軟骨上含有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的薄膜。接著通過上述方法將合成軟骨膜片植入缺損部位。
此外，可以將合成的軟骨用于修復人體關(guān)節(jié)軟骨缺損。因此，可以將軟骨形成細胞與人體脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞即人體皮下脂肪組織區(qū)分開來。
用于進行關(guān)節(jié)軟骨缺損修復的手術(shù)過程在本領(lǐng)域中是眾所周知的。參見，例如Luyten和Reddi(1992)“軟骨細胞的生物調(diào)節(jié)”，CRC出版，BocaRaton,Ann Arbor,London，和Tokyo,p.p.227-236，將該文獻的公開內(nèi)容引入本文作為參考。
上述結(jié)果證明在培養(yǎng)系統(tǒng)中，人體脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞分化成肥大軟骨細胞。由于所有成分是確定的，所以可以將該系統(tǒng)用于研究生長因子等對軟骨形成進展的作用。我們和其他人已經(jīng)使用了體外系統(tǒng)以證實這些細胞群體具有成骨和成脂肪的潛能。我們在本文中證明該群體具有軟骨形成潛能。這對于軟骨修復來說具有臨床實用性。
本發(fā)明還提供了一種用于通過將這類細胞體外與軟骨誘導劑接觸而在人體脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞中誘導軟骨形成的方法，其中所涉及的基質(zhì)細胞是三維形式。
本發(fā)明還提供了一種將脂肪衍生的基質(zhì)細胞的體外分化軟骨細胞用于修復包括人在內(nèi)的哺乳動物的軟骨組織的方法。
在上述方法中，優(yōu)選在以化學方式確定的環(huán)境中將基質(zhì)細胞分離、將人體脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞進行培養(yǎng)擴增，并聚集成密集的鄰近體，諸如三維細胞團例如壓緊的細胞或離心細胞沉淀的形式。此外，接觸過程優(yōu)選包括在以化學方式確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人體脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞沉淀的步驟，所述的培養(yǎng)基中包括含有10％血清、50ng/ml的抗壞血酸-2-磷酸、10-7M地塞米松的DMEM。然后將分化的細胞導入手術(shù)部位以便修復軟骨。由于該系統(tǒng)中的所有成分已經(jīng)確定，所以可以將該系統(tǒng)在包括人和馬在內(nèi)的哺乳動物中用作軟骨修復的產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1．一種用于使脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞分化成軟骨細胞的培養(yǎng)基，它包括以化學方式確定的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有下列成分或用下列成分進行了補充(ⅰ)能夠激活可產(chǎn)生成熟軟骨細胞表型的任何細胞轉(zhuǎn)導途徑的軟骨誘導劑；(ⅱ)抗菌素；(ⅲ)營養(yǎng)補充劑諸如1-20％的胎牛血清或1-20％的馬血清或任意其它生物或合成的等效蛋白質(zhì)混合物；(ⅳ)抗壞血酸或相關(guān)的維生素C類似物以及(ⅴ)糖皮質(zhì)激素或其它能夠激活細胞糖皮質(zhì)激素受體的化學劑。
2．權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中所述的軟骨誘導劑或基質(zhì)細胞促細胞分裂劑分別或以混合方式選自下列物質(zhì)組成的組糖皮質(zhì)激素；β-轉(zhuǎn)化生長因子超家族中的一個成分；膠原胞外基質(zhì)分子；和維生素A類似物。
3．權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中所述的抗菌素是青霉素。
4．權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中所述的抗菌素是鏈霉素。
5．權(quán)利要求3的培養(yǎng)基，其中所述的青霉素的濃度約為10單位/ml-約200單位/ml。
6．權(quán)利要求4的培養(yǎng)基，其中所述的鏈霉素的濃度約為10μg/ml-約200μg/ml。
7．權(quán)利要求2的培養(yǎng)基，其中所述的糖皮質(zhì)激素是氫化可的松。
8．權(quán)利要求2的培養(yǎng)基，其中所述的糖皮質(zhì)激素是地塞米松。
9．權(quán)利要求8的培養(yǎng)基，其中所述的地塞米松的濃度約為1nM-約100nM。
10．權(quán)利要求7的培養(yǎng)基，其中所述的氫化可的松的濃度約為1nM-約100nM。
11．權(quán)利要求2的培養(yǎng)基，其中所述的β-轉(zhuǎn)化生長因子選自下列物質(zhì)組成的組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、IGF、PDGF、EGF、aFBF、bFBF、HGF、KGF、抑制素A和軟骨形成刺激因子。
12．權(quán)利要求11的培養(yǎng)基，其中所述的β-轉(zhuǎn)化生長因子的濃度約為1ng/ml-約100ng/ml。
13．根據(jù)權(quán)利要求11所述的培養(yǎng)基，進一步包括約1ng/ml-約10ng/ml濃度的TGF-β1。
14．權(quán)利要求2的培養(yǎng)基，其中所述的膠原胞外基質(zhì)分子是膠原蛋白I。
15．權(quán)利要求2的培養(yǎng)基，其中所述的維生素A類似物是視黃酸。
16．權(quán)利要求15的培養(yǎng)基，其中所述的視黃酸的濃度約為0.1ng/ml-約1μg/ml。
17．一種用于使脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞分化成軟骨細胞的方法，該方法包括下列步驟a)通過在500Xg將無菌試管內(nèi)的50,000-5百萬個細胞離心2-20分鐘來沉淀所述的基質(zhì)細胞，所述的無菌試管中含有一種培養(yǎng)基諸如Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)或α改進的極限必需培養(yǎng)基(αMEM)或Roswell ParkMemorial Institute培養(yǎng)基1640(RPMI培養(yǎng)基1640)；b)以500-20,000個細胞/cm2的密度將所分離的基質(zhì)細胞在分化培養(yǎng)基中鋪平板；c)用下列成分補充所述的培養(yǎng)基(ⅰ)能夠激活可產(chǎn)生成熟軟骨細胞表型的任何細胞信號轉(zhuǎn)導途徑的軟骨誘導劑；(ⅱ)抗菌素；(ⅲ)用1-20％的胎牛血清或1-20％的馬血清或任意其它生物或合成的等效蛋白質(zhì)混合物補充的營養(yǎng)物；(ⅳ)抗壞血酸或相關(guān)的維生素C類似物；(ⅴ)糖皮質(zhì)激素或能夠激活細胞糖皮質(zhì)激素受體的其它化學劑；以及d)在一種具有5％CO2和1％-20％氧氣的培養(yǎng)箱中將所述的細胞在約31℃-37℃下培養(yǎng)約3-4周。
18．一種用于使脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞分化成軟骨細胞的方法，該方法包括下列步驟a)在海藻酸鈣或以三維構(gòu)造支撐軟骨形成的任意其它生物相容性晶格或基質(zhì)中以50萬-1千萬個細胞/ml的濃度懸浮基質(zhì)細胞；b)將細胞轉(zhuǎn)移至35mm培養(yǎng)皿中、并以500-20,000個細胞/cm2的密度將細胞在分化培養(yǎng)基中鋪平板，該分化培養(yǎng)基中含有以化學方式確定的培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基具有下列成分或用下列成分進行了補充(ⅰ)能夠激活可產(chǎn)生成熟軟骨細胞表型的任何細胞轉(zhuǎn)導途徑的軟骨誘導劑；(ⅱ)抗菌素；(ⅲ)用1-20％的胎牛血清或1-20％的馬血清或任意其它生物或合成的等效蛋白質(zhì)混合物補充的營養(yǎng)物；(ⅳ)抗壞血酸或相關(guān)的維生素C類似物；(ⅴ)糖皮質(zhì)激素或能夠激活細胞糖皮質(zhì)激素受體的其它化學劑；以及c)在一種具有5％CO2和1％-20％氧氣的培養(yǎng)箱中將所述的細胞在約31℃-37℃下培養(yǎng)約3-4周。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于使體外培養(yǎng)的脂肪衍生的基質(zhì)細胞定向分化成軟骨細胞譜系的細胞的方法和組合物。本發(fā)明進一步提供了可以單獨或以與其它營養(yǎng)成分混合的方式用于誘導培養(yǎng)單層形式或三維構(gòu)造的生物相容性晶格或基質(zhì)形式的脂肪衍生的基質(zhì)細胞中軟骨形成的各種軟骨誘導劑。本發(fā)明還公開了分化的軟骨細胞用于治療包括體外軟骨修復在內(nèi)的大量人體疾患和疾病的用途。
文檔編號A61K35/12GK1306085SQ0012898
公開日2001年8月1日 申請日期2000年8月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月19日
發(fā)明者Y－D·C·霍爾沃森, W·O·威爾克森, J·金貝爾 申請人:澤恩比奧公司