專利名稱：含有戊二酰－7－氨基頭孢烷酸?；富虻墓こ叹闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及頭孢菌素酰化酶，更具體地說是涉及假單胞菌Pseudomonassp.130菌株的戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；?Glutaryl-7-Amino-Cephalosporin Acid Acylase,GL-7ACA Acylase,GL-7ACA?；?基因的全序列及其所編碼的酶蛋白，該基因克隆在大腸桿菌中的穩(wěn)定表達以及為適應(yīng)作頭孢菌素轉(zhuǎn)化而構(gòu)建的工程宿主菌E.coliMMR204的構(gòu)建。
7-ACA(7-氨基頭孢烷酸)以往主要通過頭孢菌素C(Cephalosporin C,CPC)的化學(xué)裂解進行生產(chǎn)，但其工藝條件較為苛刻，而且存在環(huán)境污染地問題。這就促使人們不斷探索用生物轉(zhuǎn)化方法來生產(chǎn)7-ACA的途徑。長期來，對頭孢菌素酰化酶的研究受到生物學(xué)家和藥學(xué)家的重視，研究結(jié)果逐漸顯示出其重要的工業(yè)價值。頭孢菌素?；钢饕呋疌PC及其它的衍生物分子中的?；鶄?cè)鏈的裂解反應(yīng)，根據(jù)酶反應(yīng)底物的性質(zhì)，這類酶又分成二種類型(1)使CPC的7-位氨基己二酰側(cè)鏈直接?；?，一步生成7-ACA，這種酶被稱作為CPC?；?；(2)以戊二酰-7ACA(Glutaryl-7-Amino-Cephalosporin Acid,GL-7ACA)為主要底物進行水解反應(yīng)得到7-ACA，此類酶稱為GL-7ACA?；?。利用頭孢菌素?；笇PC進行直接酶促轉(zhuǎn)化生成7-ACA的一步法已有報導(dǎo)，但是，CPC?；傅霓D(zhuǎn)化活力極低，尚難于進入工業(yè)應(yīng)用階段。80年代以來，一些研究結(jié)果表明CPC可被多種生物來源的D-氨基酸氧化酶(DAO)氧化脫氨基，并進一步進行脫羧反應(yīng)生成GL-7ACA。后者的7-位側(cè)鏈可被GL-7ACA?；?ACY)所水解得到7-ACA。DAO和GL-7ACA ACY催化作用下由CPC生成7-ACA的兩步酶法工藝已漸趨成熟。有關(guān)GL-7ACA?；府a(chǎn)酶菌株的分離、鑒定、酶學(xué)性質(zhì)及其在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用及近年來對酶基因的深入研究也有不少報導(dǎo)。Matsuda等對Pseudomonas SE 83菌株中為頭孢菌素?；涪窈廷蚓幋a基因作了全順序測定(Matsuda等J.Bacteriology 169:4821,1987)。Aramori等分析了Pseudomonas A-14菌株的GL-7ACA?；傅幕蛐蛄?J.Fermentation and Bioengineering 72:232-243,1991)。此外也有PseudomonasGK 16(Matsuda等J.Bacteriology 163:1222-1228,1985)和C427(Ishii Y et al.J.Ferment.Bioeng.,1994,77:591)中GL-7ACA?；富虻牟糠諨NA序列報導(dǎo)。中國專利“一步兩酶法制造7-氨基頭孢烷酸(CN 1104255A,1995年)”已對CPC的酶促轉(zhuǎn)化作了描述，但在構(gòu)建GL-7ACA?；富蚬こ叹倪^程中發(fā)現(xiàn)包含有acy基因片斷的重組質(zhì)粒pMR10在大腸桿菌A-56(E.coli A-56)宿主菌中不能穩(wěn)定保存。同時，大腸桿菌宿主細胞的染色體上存在ampC基因，該基因所編碼的β-內(nèi)酰胺酶(頭孢菌素酶)對CPC分子中β-內(nèi)酰胺環(huán)的酰胺鍵具有極強的水解活力；雖然在用整體細胞進行一步兩酶法制造7ACA的工藝時，可以通過加入β-內(nèi)酰胺酶抑制劑蘇巴坦納(Salbactam)來克服β-內(nèi)酰胺酶的破壞活性以提高7-ACA的生成產(chǎn)率，但由于生產(chǎn)成本和產(chǎn)品質(zhì)量，添加抑制劑不是理想的措施。
本發(fā)明的目的是1．對GL-7ACA?；富蛑亟M質(zhì)粒的宿主菌進行改造，提供新的基因工程宿主菌，以克服頭孢菌素酶(β-內(nèi)酰胺酶)對CPC及其衍生物的破壞。該宿主菌可一般的應(yīng)用于以處理CPC及其衍生物(如GL-7ACA和7ACA)為目的的基因工程菌的構(gòu)建。2．測定來源于Pseudomonas sp.130菌株的GL-7ACA?；富蛉蛄屑捌渌幋a的酶蛋白。3．對上述Pseudomonas sp.130菌株所攜帶GL-7ACA?；富蛑亟M質(zhì)粒pMR10進行改造，提供新的重組質(zhì)粒，以克服不穩(wěn)定性的缺點。1．pMR 24重組質(zhì)粒的構(gòu)建
本發(fā)明提供一種新的重組質(zhì)粒pMR24，它是一雙鏈環(huán)狀DNA，長度為8010bp，其主要基因型為acy,amp,par．
原有來源于Pseudomonas 130菌株的GL-7ACA?；富蛑亟M質(zhì)粒pMR10(楊蘊劉等，生物工程學(xué)報7:94-107 1991 8:15-22 1992)在E.coliA56宿主中不能穩(wěn)定保存，無選擇壓力條件下傳代，質(zhì)粒即會從宿主中丟失。當(dāng)E.coli A56(pMR10)在不加氨芐青霉素的培養(yǎng)基中經(jīng)一次轉(zhuǎn)接傳代(相當(dāng)10個世代)大部份子代菌落已檢測不出質(zhì)粒的存在。決定重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的一個因素是親代細胞發(fā)生分裂時，質(zhì)粒DNA分子細胞的分配過程中分配基因(par)具有一定作用。為提高pMR10質(zhì)粒在E.coli A56宿主中的穩(wěn)定性，按圖1程序?qū)ar基因重組到pMR10質(zhì)粒中acy基因下游。首先，pMR10質(zhì)粒以限制內(nèi)切酶HpaI酶解，并用小牛腸磷酸酯酶(CIP)處理(Sambrook等Molecular Cloning 1986)，除去5′端的磷酸基團以防止酶解的質(zhì)粒分子自身連接。由HpaⅠ酶切產(chǎn)生的片段平頭末端中pEC302為par基團的供體質(zhì)粒，該質(zhì)粒DNA經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，經(jīng)凝膠電泳和電洗脫回收0.45kb的par基因片段，為使該片段能與上述HpaⅠ酶解的pMR10進行平頭連接，用DNA聚合酶將0.45Kb par基因片段的粘性末端補平，所獲得的HpaI酶解的pMR 10與補平的0.45Kb par基因片段適量混合并用T4DNA連接酶進行連接。該連接混合物用以轉(zhuǎn)化E.coli A56感受態(tài)細胞，涂布在加50ug/ml氨芐青霉素的LB平板上，對出現(xiàn)的單菌落進行分離、純化以及質(zhì)粒DNA的快速抽提和酶切鑒定(Sambcook等Molecular cloning,1986)獲得重組質(zhì)粒pMR24。
pMR24和pMR10在E.coli A56中的穩(wěn)定性的比較重組質(zhì)粒pMR 10和pMR 24均帶有抗性選擇標記amp(氨芐青霉素抗性)，因此，在含有50μg/ml氨芐青霉素的肉湯培養(yǎng)液中能正常生長，當(dāng)所用培養(yǎng)基不含抗生素時，由于質(zhì)粒不穩(wěn)定性，傳代過程中，一部分細胞會失去質(zhì)粒，這部分細胞也就喪失了在含抗生素培養(yǎng)基上的生長能力，其所占比例即代表了質(zhì)粒的穩(wěn)定性程度。對無藥培養(yǎng)液中傳代的菌落進行單菌落分離。然后將單菌落同時點種到含藥和不含藥的兩種平板上，如果兩種平板上都長出菌落，說明該細胞仍帶有質(zhì)粒；如果所點種的菌只在無藥的平板上出現(xiàn)菌落，而在含藥的平板上無生長，則表示該菌已發(fā)生質(zhì)粒的丟失。據(jù)此，對重組質(zhì)粒pMR24和pMR10的穩(wěn)定性進行了檢測。同時，也比較了培養(yǎng)物的產(chǎn)?；傅哪芰?。結(jié)果如表1所示。從表1可見帶?；富虻膒MR10質(zhì)粒在E.coli A56中相當(dāng)不穩(wěn)定，在不含抗生素的培養(yǎng)液中經(jīng)10個世代分裂繁殖，具有抗性的菌落已減少到總數(shù)的37％，20個世代后，僅保存為4％。而帶有pMR24的E.coli A56菌株的穩(wěn)定性增加，經(jīng)20個世代繁殖抗生菌落數(shù)仍保留88％。由此可見，par基因明顯改善了攜帶?；富蛑亟M質(zhì)粒的穩(wěn)定性。而且產(chǎn)?；傅姆€(wěn)定性相對提高。(表1)
表1穩(wěn)定性和酶活性相對百分數(shù)
2.來源于Pseudomonas sp.130菌株的GL-7ACA?；富虻娜蛄屑捌渌幋a的酶蛋白
來源于Pseudomonas sp.130菌株的GL-7ACA?；富騛cy為雙鏈DNA，長度為2482bp(見SEQID NO:1)。
(1)亞克隆及DNA序列測定
采用亞克隆與合成引物兩種方法，測序所用為Amersham公司的測序試劑盒。
從pMR24出發(fā)，以pBluescript SKⅡ(Stratagene公司)為載體構(gòu)建的acy基因片段的亞克隆流程圖見圖2，序列的測定見表2，SEQ ID NO:3-10給出了所用引物的序列。
表2亞克隆及其所測的序列和測序時所用的引物
(2)GL-7ACA?；窷端及C端氨基酸序列的測定及與同類酰化酶的氨基酸序列比較
一種來源于假單孢菌Pseudomonas sp.130菌株的GL-7ACA ?；赣搔?、β兩個亞基組成，酶蛋白的信號肽由33個氨基酸(MetLeuArgValLeuHisArgAlaAlaSerAlaLeuValMetAlaThrValIleGlyLeuAlaProAlaValAlaPheAlaLeuAlaGluProThrSer)或40個氨基酸(MetLeuArgValLeuHisArgAlaAlaSerAalaLeuValMetAlaThrValIleGlyLeuAlaProAlaValAlaPheAlaLeuAlaGluProThrSerThrProGlnAlaProIleAla)組成，連接肽由10個氨基酸(GlyAspProProAspLeuAlaAspGlnGly)組成，為對本發(fā)明提供的Pseudomonas sp.130 GL-7ACA?；富騛cy編碼的酶蛋白的DNA測序的結(jié)果進行驗證，對酶蛋白的α亞基的N端，C端及β亞基的N端氨基酸序列進行測序。測序結(jié)果表明本發(fā)明提供的Pseudomonassp.130 GL-7ACA酰化酶核酸序列和氨基酸序列(見SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2)與美國專利US05457032中所提供的核酸序列和氨基酸序列完全相同。與文獻報道的來源于Pseudomonas sp.GK-16和C427的GL-7-ACA?；赴被嵝蛄懈叨韧?序列比較見圖3和圖4)，從氨基酸序列比較可以看出GK-16,C427和本發(fā)明中的?；笜?gòu)成了具有GL-7ACA水解活力的?；讣易?。
酶學(xué)研究的結(jié)果表明，本發(fā)明的酰化酶的酶活(13U/mg蛋白)高于GK-16及其他類似?；傅拿富?＜10U/mg蛋白)，本發(fā)明的?；傅腒M值(0.5mM)較高于GK-16?；?0.16mM)，但低于其他類似酰化酶(＞1mM)。因此，本發(fā)明酶的結(jié)構(gòu)與催化特性與已發(fā)表的來自GK-16及C427的?；赶嗨频怯袇^(qū)別的。3．構(gòu)建E.coli MMR 204基因工程宿主菌
采用體外定區(qū)域插入突變及體內(nèi)重組技術(shù)構(gòu)建基因工程宿主菌E.coliMMR204，其主要基因型為ampC∷KAPA,ompT,recA，所用菌、噬菌體和質(zhì)粒見表3，構(gòu)建流程程序(見圖5、圖6)詳細描述如下
(1)質(zhì)粒的pZJ2,pZJ3的獲得(圖6)
以質(zhì)粒pJAC-4上的ampC基因為模板，兩對寡聚核苷酸NdeⅠ5’和EcoRⅠ3′,EcoRⅠ5′和BamHⅠ3′為引物，利用PCR技術(shù)，擴增得到ampC5′NdeⅠ/EcoRⅠ片段和ampC3’EcoRⅠ/BamHⅠ片段，再分別用EcoRⅠ酶切并連接，經(jīng)凝膠電泳分離純化，即可得到具有EcoRⅠ位點的ampC片段。將ampC EcoRⅠ片段與載體pGEM-T連接，轉(zhuǎn)化入DH10B，在LB Amp平板上，選擇lacZ的菌落，即可得到片段插入方向相反的重組質(zhì)粒pZJ2和pZJ3。
表3菌株、噬菌體和質(zhì)粒
(2)質(zhì)粒pZJ4,pZJ5的獲得(圖6)
利用EcoRⅠ酶切凝膠電泳分離與電洗脫，獲得含那霉素抗性基因的EcoRⅠ酶切DNA片段KAPA，將卡那霉素抗性基因KAPA插入經(jīng)EcoRⅠ酶切的pZJ2，轉(zhuǎn)化入DH10B，涂布于含卡那霉素的LB平板上，于37℃培養(yǎng)24小時，將得到的抗性菌落質(zhì)粒DNA用EcoRⅠ進行酶切檢查。得到片段插入方向相反的重組質(zhì)粒pZJ4和pZJ5。
(3)JC7623 ampC∷KAPA的獲得
取pZJ5 DNA，加入限制性內(nèi)切酶ScaⅠ，酶切二個半小時，然后取線性DNA轉(zhuǎn)化JC7623，選擇卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子，并篩選氨芐青霉素敏感轉(zhuǎn)化子，對氨芐青霉素敏感而抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化子即為所需的JC7623ampC∷KAPA，定名為MMR200。
(4)MMR200菌株中ampC∷KAPA突變的遺傳學(xué)與生物化學(xué)的鑒定(菌株MMR201與MMR202的獲得及其鑒定)
采用標準的P1轉(zhuǎn)導(dǎo)方法(Jeffrey H.Miller,A shout Course in BacteriaGenefics,A laboratory manual and handbook for Escherichia coli and relatedbacteria)將MMR20的P1裂解液轉(zhuǎn)導(dǎo)高表達ampC基因的大腸桿菌突變株AKK241(24μ/mg干重，表4)100％卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頭孢菌素酶活力卻下降至幾乎無法測到的低水平(＜7×10-4μ/mg干重，表4)。因為AKK241的染色體基因ampCp1與zje2241∷Tn10連鎖，因此將卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)導(dǎo)子進一步在LB四環(huán)素平板上進行進一步的篩選，得到的四環(huán)素抗性菌株定名為MMR201，四環(huán)素敏感的菌株定名為MM202，其中敏感菌株的比例為1％左右。該結(jié)果說明KAPA與zje2241∷Tn10連鎖。而四環(huán)素敏感的MM202更可以用于進一步的改造。
(5)BL21 ampC∷KAPA獲得
利用蛋白酶OmpT突變使表達在周質(zhì)空間的外源蛋白較為穩(wěn)定，用MMR202的P1裂解液轉(zhuǎn)導(dǎo)BL21(ompT缺陷)，選擇卡那霉素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)子，定名為MMR203。
(6)將MMR203改造為recA菌株
由于recA缺陷可保證質(zhì)粒的穩(wěn)定傳代及克隆基因的穩(wěn)定表達，用SP946的P1裂解液轉(zhuǎn)導(dǎo)MMR203，選擇四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)子，然后利用紫外超敏感性篩選與srl∷Tn10緊密連鎖的recA缺失突變轉(zhuǎn)導(dǎo)子，定名為MMR204。
(7)ampC∷KAPAβ-內(nèi)酰胺酶活力的測定
將染色體上整合有基因ampC∷KAPA的菌株與原菌株的β-內(nèi)酰胺酶活力進行比較(表4)。AKK241為ampCp1上升突變株，有極高的β-內(nèi)酰胺酶活力。改造后其β-內(nèi)酰胺酶活力在較苛刻的條件下仍無法測出。A56-3為我們原先采用的宿主菌，有一定的β-內(nèi)酰胺酶活力。BL21的β-內(nèi)酰胺酶活力較低，但在菌液濃縮10倍的條件下仍能測出酶活，改造后的β-內(nèi)酰胺酶活力也無法測得。表5的數(shù)據(jù)是三個平行實驗的平均值。
表4 一些E.coli菌株的β-內(nèi)酰胺酶活力
4．原工程菌A56-3/pMR24和新建工程菌MMR204/pMR24應(yīng)用于GL-7ACA到7ACA的轉(zhuǎn)化過程中對β-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞程度的比較
新建工程菌MMR204/PMR24由北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，1997年6月23日，保藏編號為CGMCC NO.0309。
將原工程菌A56-3/pMR24和新建工程菌MMR204/pMR24分別應(yīng)用于GL-7ACA到7ACA的轉(zhuǎn)化，比較它們對β-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞程度(見表5，底物GL-7ACA濃度為0.133223mg/ml)。
表5原工程菌A56-3/pMR24和新建工程菌MMR204/pMR24應(yīng)用于
GL-7ACA到7ACA的轉(zhuǎn)化過程中對β-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞程度
從表5的數(shù)據(jù)可以看出，改造后的工程菌對β-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞性大大降低，已可應(yīng)用于大規(guī)模的生產(chǎn)之中。
應(yīng)用體外重組技術(shù)構(gòu)建某一基因的突變克隆，然后通過體內(nèi)重組將突變整合入染色體以構(gòu)建該基因突變的新生物體的方法被稱為“反向遺傳學(xué)”，即為本發(fā)明所采取的方法。隨著分子生物與生物工程研究工作的發(fā)展，該方法必將日益顯示其巨大的潛力而得到廣泛的注意。本發(fā)明成功地運用了上述技術(shù)構(gòu)建了E.coli MMR204菌株，并在功能方面進行了菌株改造前后β-內(nèi)酰胺酶活力的比較，從表4的數(shù)據(jù)可以看出，凡帶有ampC∷KAPA突變的E.coli P1轉(zhuǎn)導(dǎo)子，不論其親株β-內(nèi)酰胺酶活力的高低，均完全失去合成該酶的能力。同時，在MMR204作為宿主菌直接應(yīng)用于從GL-7ACA到7ACA的轉(zhuǎn)化過程中，發(fā)現(xiàn)GL-7ACA與7ACA的β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)始終保持穩(wěn)定。因此，該宿主菌可一般地應(yīng)用于一切以處理CPC及其衍生物(如GL-7ACA或7ACA)為目的基因工程菌的構(gòu)建，即作為一種不產(chǎn)生頭孢菌素酶(即ampC缺陷)，能保持質(zhì)粒穩(wěn)定傳代、保證克隆基因穩(wěn)定表達(recA缺陷)的，周質(zhì)空間蛋白酶缺陷(ompT缺陷)的，便于進行轉(zhuǎn)化的有廣泛用途的宿主菌。
本發(fā)明優(yōu)點本發(fā)明戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；富蚣捌涔こ叹?，提供了一種新的重組質(zhì)粒pMR24，克服了原有重組質(zhì)粒pMR10的不穩(wěn)定性；測定了一種不同于已發(fā)表的Pseudomonas sp.GK-16和C427酰化酶的、來源于Pseudomonas sp.130菌株的GL-7-ACA?；富蛉蛄屑捌渌幋a的酶蛋白；并提供了一種新的基因工程宿主菌MMR204，克服了原有宿主菌的β-內(nèi)酰胺酶對CPC及其衍生物有破壞性的缺點，該宿主菌可一般的應(yīng)用于以處理CPC及其衍生物(如GL-7ACA和7ACA)為目的的基因工程菌的構(gòu)建。本發(fā)明建立了一株具有工業(yè)應(yīng)用前景的以GL-7ACA為中間體生產(chǎn)7ACA的GL-7ACA?；富蚬こ叹?。
本發(fā)明通過以下附圖和實施例作進一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。


圖1．重組質(zhì)粒pMR24的構(gòu)建。
圖2．a(chǎn)cy基因片段的亞克隆流程圖
B1=BamHⅠ1,B2=BamHⅠ2,B3=BamHⅠ3,Ev=EcoRⅤ,M=MluⅠ,P=PstⅠ,S=SalⅠ,X=XhoⅠ。
圖3．Pseudomonas sp.130 GL-7-ACA與Pseudomonas sp.GK-16酰化酶氨基酸序列的比較。
圖4．Pseudomonas sp.130 GL-7-ACA與Pseudomonas sp.C427?；赴被嵝蛄械谋容^。
圖5．E.coli MMR204菌株的構(gòu)建流程程序
pZJ2ampC EcoRⅠ與lacZ同向，pGEM-T載體
pZJ3ampC EcoRⅠ與lacZ反向，pGEM-T載體
pZJ4ampC∷KAPA,KAPA與ampC同向，pZJ2載體
pZJ5ampC∷KAPA,KAPA與ampC反向，pZJ2載體
MMR202AKK241 ampC∷KAPA
MMR203BL241 ampC∷KAPA
MMR204MMR203 recA srl∷Tn10
引物NdeⅠ5′設(shè)計5′端含有NdeⅠ單酶切位點的引5′ACCAGACCATATGTTCAAA
引物EcoRⅠ3′設(shè)計3′端含有EcoRⅠ單酶切位點的引物5′CCCAGGCGGAATTCTTTTC
引物EcoRⅠ5′設(shè)計5′端含有EcoRⅠ單酶切位點的引物5′AAAAGAATTCCGCCTGGGG
引物BamHⅠ3′設(shè)計3′端含有BamHⅠ單酶切位點的引物5′CCCAGGCGGAATTCTTTTC
ampC 5′NdeⅠ/EcoRⅠ以NdeⅠ5′和EcoRⅠ3′為引物,pJAC-4為模板，通過PCR擴增后得到的基因片段
ampC 3′EcoRⅠ/BamHⅠ以EcoRⅠ5′和BamHⅠ3′為引物,pJAC-4為模板，通過PCR擴增后得到的基因片段
ampC EcoRⅠ中間含有一EcoRⅠ單酶切位點的ampC基因片段
圖6．含有ampC∷KAPA突變的重組質(zhì)粒pZJ5的構(gòu)建流程圖。
實施例1 GL-7ACA酰化酶基因質(zhì)粒與par基因片段的重組
本實施例中涉及的分子生物學(xué)方法均參考“Molecular Cloning--A LaboratoryManual”ed.by J.Sambcook,E.F.Fritsch and T.Maniatis,1989.CSHL Press.
步驟1par基因片段分離
提取pEC302質(zhì)粒DNA,經(jīng)CsCl密度梯度超離心純化后，用BamHⅠ和EcoRⅠ完全雙酶切，在0.6％低熔點瓊脂糖凝膠上，電泳回收0.5Kb的par基因片段。
步驟2平端par基因片段的制備
取2g步驟1得到的0.5Kb par基因片段與2.5ul dNTP(2mM)混合于50ul切口緩沖液中，加入2.5u大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段，20℃保溫30分鐘，1ul 0.5 M EDTA終止反應(yīng)，在50ul的苯酚、氯仿(體積比1∶1)，50ul氯仿各抽濾一次。再用三倍體積的無水乙醇沉淀回收平端par基因片段。
步驟3經(jīng)HpaⅠ消化的pMR10 DNA的脫磷
pMR10質(zhì)粒上，?；富蛳掠蔚腍paⅠ切點可作為par基因片段的插入點，由于HpaⅠ是平端酶切，因此，可和平端的par基因片段連接，為減少自身連接，需脫去其5′端p以提高與par基因片段的連接效率。為此，取5ug HpaⅠ消化的pMR10 DNA，溶于50ul專用緩沖液中，加入0.05U牛腸磷酸酯酶，混勻，37℃反應(yīng)1小時，用300ul終止液(10mM Tris,1mM EDTA,200mM NaCl,0.5％SDS)使反應(yīng)停止，以步驟2方法純化并回收脫磷的HpaⅠ消化pMR 10DNA。
步驟4線性pMR 10DNA與par基因片段的重組
分別由步驟2和步驟3得到的脫磷HpaⅠ pMR 10DNA 300ng(10ul)與平端par基因片段150ng(3ul)混合，經(jīng)無水乙醇沉淀，溶解于10ul連接緩沖液中，加入1ul T4 DNA連接酶，15℃反應(yīng)16小時。
步驟5帶par基因重組質(zhì)粒pMR24的篩選
步驟4的連接酶混合液用于轉(zhuǎn)化E.coli A56感受態(tài)細胞并在含50ug/ml氨芐青霉素的肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨1％，酵母粉0.5％,NaCl:1％,pH:7.0)平板上獲得轉(zhuǎn)化子。進一步對12個轉(zhuǎn)化菌落進行質(zhì)粒DNA的快速抽提和酶切電泳鑒定，確定四株轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒DNA中帶有0.5Kb的外源par基因片段，該重組質(zhì)粒定名為pMR24。
實施例2 重組質(zhì)粒pMR24在宿主菌E.coli A56中的穩(wěn)定性分析(結(jié)果見表1)
步驟1:E.coli A56(pMR24)的連續(xù)傳代
由實施例1，步驟5得到的E.coli A56(pMR24)接種到3ml肉湯培養(yǎng)基(成分見實施例1，步驟5)的10×150mm的試管中，置于100轉(zhuǎn)/分鐘搖床上37℃培養(yǎng)8-12小時。取該培養(yǎng)液30 ul轉(zhuǎn)接到上述新鮮肉湯培養(yǎng)基試管中，同法培養(yǎng)并將一次傳接的生長期估算為細菌繁殖10個世代。作為對照菌株E.coli A56(pMR10)同法進行培養(yǎng)。
步驟2重組質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測
經(jīng)過步驟1中三次轉(zhuǎn)接傳代后，分別對E.coli A56(pMR10)和E.
coli A56(pMR24)的培養(yǎng)藥進行10-6,10-7,10-8稀釋，取0.1ml稀釋菌液涂布到肉湯培養(yǎng)基平板上，以得到的單菌落，進一步用無菌牙簽將單菌落同時點種到含Amp(50ug/ml)肉湯培養(yǎng)基平板和無藥肉湯培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜，記錄Amp平板上的抗性菌落數(shù)。
步驟3GL-7ACA酰化酶活力測定
E.coli A56(pMR 10)和E.coli A56(pMR 24)在經(jīng)步驟1的傳代過程中，取培養(yǎng)液0.5ml,4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清液，菌體用0.5ml磷酸緩沖液(0.1M,pH7.0)懸浮后，加入50mg/ml GL-7ACA 0.5mL,37℃水浴保溫30分鐘，用3ml[20％冰醋酸，0.05N NaOH(2∶1)]終止液終止反應(yīng)，并加入0.5ml 0.5％對甲氨基苯甲醛使反應(yīng)產(chǎn)物7ACA顯色。再次離心15分鐘，上清液于415nm處測光吸收值。1u GL-7ACA?；富盍Φ亩x在特定條件下(37℃,0.1M pH7.0磷酸緩沖液)每分鐘能轉(zhuǎn)化GL-7ACA而生成1ug7-ACA的酶量。
即酶活力(U/ml)=K×OD 415nm/(t×D)
K:7-ACA標準曲線斜率
t酶反應(yīng)時間
D反應(yīng)系統(tǒng)中加入菌液的體積
實施例3 GL-7ACA?；窷端氨基酸序列的測定(序列見SEQ IDNO:2)
(Hermann S and Gebhard VJ(1987).Anal Biochem.166:368-379)
步驟1電印跡步驟
(1) 將Hyperbond膜浸泡在甲醇中約1min，然后將膜移至含20ug/mlDTT和10％甲醇的10mM CAPS轉(zhuǎn)膜緩沖液中，保存到被使用前。
(2)純化后的GL-7-ACA酰化酶樣品參照Hermann等(1987)的方法進行TSDS-PAGE電泳(凝膠厚0.5mm)，并將電泳后的凝膠小心撥下，放入含20
ug/ml DTT的重蒸水中漂洗，然后將凝膠浸泡于含20ug/ml DTT和10％甲醇的10mM CAPS轉(zhuǎn)膜緩沖液中約10min(每隔5min更換一次緩沖液)。
(3)將凝膠和Hyperbond膜按“夾心餅”的方式固定，并放入轉(zhuǎn)膜裝置中。在4℃下，恒壓50V電轉(zhuǎn)移1h。
(4)將Hyperbond膜從轉(zhuǎn)膜裝置中取出，并放入含20ug/ml DTT的重蒸水中漂洗。
(5)將已轉(zhuǎn)移過樣品的Hyperbond膜放入用甲醇/水/乙酸=5/4/1溶解的2mg/ml考馬氏亮藍R-250溶液中染色30min，然后在甲醇/水/乙酸=5/4/1的溶液中脫色，直到背景為白色為止。
步驟2氨基酸序列分析
將準備測序的蛋白亞基從Hyperbond膜上切割下來，并放入BeckmanLF-3200蛋白多肽順序儀上測定N端氨基酸序列。
實施例4 GL-7-ACA?；甫羴喕鵆端序列的測定(序列見SEQ IDNO:2)
(1)對純化的GL-7-ACA酰化酶進行SDS-PAGE電泳。
(2)從電泳裝置上取下凝膠，置于0.25MKCl溶液中(4℃)，可以清晰的看到凝膠上分開的α與β亞基，用手術(shù)刀切下α亞基，并切成碎片。
(3)將碎片放入電洗脫裝置中，恒定電流8-10mA，洗脫8小時左右，取出含α亞基的洗脫液于eppendorf管中。
(4)加入4倍洗脫液體積的丙酮(-20℃)于上述eppendorf管中，冰浴15分鐘，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清，沉淀用蒸餾水溶解，并用蒸餾水透析三次。
(5)透析液用TEABI procise-491型蛋白質(zhì)C端測序儀測定C端序列。
實施例5 GL-7ACA酰化酶工程宿主菌MMR204的構(gòu)建(見圖5、圖6)
本實施例中，質(zhì)粒抽提、酶切、連接、轉(zhuǎn)化及PCR方法，均根據(jù)
J.Sambrook et al,Molecular Cloning。
P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，根據(jù)Jeffrey H.Miller,A shout Course in BacteriaGenetics,A laboratory manual and handbook for Escherichia coli and relatedbacteria.內(nèi)切酶為Promega公司產(chǎn)品。
培養(yǎng)基和抗菌素用量LB培養(yǎng)基，R培養(yǎng)基，R半固體培養(yǎng)基，均同Jeffrey H.Miller,A shout Course in Bacteria Genetics,A laboratory manual andhandbook for Escherichia coli and related bacteria.
氨芐青霉素100-200ug/ml；卡那霉素50-100ug/ml；四環(huán)素50ug/ml；鏈霉素50ug/ml；
步驟一運用體外重組技術(shù)得到含有ampC∷KAPA突變的重組質(zhì)粒pZJ5
1．質(zhì)粒的pZJ2,pZJ3的獲得(圖6)
(1)以質(zhì)粒pJAC-4上的ampC基因為模板，兩對寡聚核苷酸NdeⅠ5′和EcoRⅠ3′,EcoRⅠ5′和BamHⅠ3′為引物，利用PCR技術(shù)，擴增得到ampC5′NdeⅠ/EcoRⅠ片段和ampC3’EcoRⅠ/BamHⅠ片段，再分別用EcoRⅠ酶切并連接，經(jīng)凝膠電泳分離純化，即可得到具有EcoRⅠ位點的ampC片段。該片段可能會出三種情況二個ampC5′NdeⅠ/EcoRⅠ的連接產(chǎn)物Ⅰ；二個ampC 3′EcoRⅠ/BamHⅠ的連接產(chǎn)物Ⅱ；ampC5′NdeⅠ/EcoRⅠ和ampC3′EcoRⅠ/BamHⅠ的連接產(chǎn)物Ⅲ，因兩個片段ampC5′和ampC3′長度相近，凝膠電泳無法分離三種連接片段。
(2)將(1)中所得片段與載體pGEM-T連接，轉(zhuǎn)化入DH10B，在LB Amp平板上，選擇lacZ的菌落。這些菌落所攜帶的重組質(zhì)粒可能會有三種類型。pGEM-T與片段Ⅰ連接形成的質(zhì)粒上有一個EcoRⅠ位點，無BamHⅠ位點；pGEM-T與片段Ⅱ連接形成的質(zhì)粒上有一個EcoRⅠ位點，有兩個BamHⅠ位點；pGEM-T與片段Ⅲ連接形成的質(zhì)粒上有一個EcoRⅠ位點，有一個BamHⅠ位點。因此，對菌落DNA分別進行EcoRⅠ,BamHⅠ酶切，就可區(qū)分三種類型，獲得所需的pGEM-T與片段Ⅲ的連接產(chǎn)物。
(3)將pGEM-T與片段Ⅲ重組質(zhì)粒進行進一步的酶切檢查，以確定連接產(chǎn)物ampC EcoRI的連接方向。因為質(zhì)粒pGEM-T在lacZα結(jié)構(gòu)基因上，位于插入的外源DNA5′端的多酶切位點接頭順序上有一個PstⅠ位點，而ampC EcoRI片段的靠近BamHⅠ端亦有一個PstⅠ位點，所以可根據(jù)PstⅠ酶切片段的大小，得到連接后ampC EcoRⅠ相對lacZα基因同向的質(zhì)粒pZJ2，反向的質(zhì)粒pZJ3。
2．質(zhì)粒pZJ4,pZJ5的獲得(圖6)
利用EcoRⅠ酶切凝膠電泳分離與電洗脫，獲得含那霉素抗性基因的EcoRⅠ酶切DNA片段KAPA,將卡那霉素抗性基因KAPA插入經(jīng)EcoRⅠ酶切的pZJ2，轉(zhuǎn)化入DH10B，涂布于含卡那霉素的LB平板上，于37℃培養(yǎng)24小時，將得到的抗性菌落質(zhì)粒DNA用EcoRⅠ進行酶切檢查。再將所得到的KAPA插入后的新質(zhì)粒進行進一步的酶切檢查，以確定KAPA插入的方向。因為在靠近KAPA始端處有一個XhoⅠ切點，ampC EcoRⅠ上靠近NdeⅠ端亦有一個XhoⅠ切點，而載體pGEM-T上無XhoⅠ切點，所以可根據(jù)XhoⅠ酶切片段的大小，判斷出KAPA插入的方向。
步驟二運用體內(nèi)重組技術(shù)將突變ampC∷KAPA整合入大腸桿菌染色體上的ampC基因位點，構(gòu)建含ampC∷KAPA突變的菌株
1．JC7623 ampC∷KAPA的獲得
取20μg pZJ5 DNA，加入20u ScaⅠ，酶切二個半小時，然后取10μg線性DNA轉(zhuǎn)化JC7623，選擇卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子，并篩選氨芐青霉素敏感轉(zhuǎn)化子，對氨芐青霉素敏感而抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化子即為所需的JC7623ampC∷KAPA，定名為MMR200。
2．MMR200菌株中ampC∷KAPA突變的遺傳學(xué)與生物化學(xué)的鑒定(菌
株MMR201與MMR 202的獲得及其鑒定)
采用標準的P1轉(zhuǎn)導(dǎo)方法(Jeffrey H.Miller,A shout Course in BacteriaGenefics,A laboratory manual and handbook for Escherichia coil and relatedbacteria)將MMR200的P1裂解液轉(zhuǎn)導(dǎo)高表達ampC基因的大腸桿菌突變株AKK241(24μ/mg干重，表4)100％卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頭孢菌素酶活力卻下降至幾乎無法測到的低水平((7×10-4μ/mg干重，表4)。因為AKK241的染色體基因ampCp1與zje2241∷Tn10連鎖。因此將卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)導(dǎo)子進一步在LB四環(huán)素平板上進行進一步的篩選，得到的四環(huán)素抗性菌株定名為MMR201，四環(huán)素敏感的菌株定名為M202，其中敏感菌株的比例為1％左右。該結(jié)果說明KAPA與zje2241∷Tn10連鎖。而四環(huán)素每感的MM202更可以用于進一步的改造。
步驟三最后再經(jīng)若干步的改造獲得符合工程菌需要的菌株MMR204
1．BL21ampC∷KAPA獲得
利用MMR202的P1裂解液轉(zhuǎn)導(dǎo)BL21(ompT)，選擇卡那霉素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)子，定名為MMR203。
2．將MMR203改造為recA菌株
用SP946的P1裂解液轉(zhuǎn)導(dǎo)MMR203，選擇四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)子，然后利用紫外超敏感性篩選與srl∷Tn10緊密連鎖的recA缺失突變轉(zhuǎn)導(dǎo)子，定名為MMR204。
實施例6β-內(nèi)酰胺酶活力的測定(數(shù)據(jù)見表4)
1．被測菌液的配制從LB平板上挑取一單菌落，接種于加有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，適當(dāng)稀釋(稱OD稀釋倍數(shù))后于OD600測菌濃度。(使OD值處于0.4-0.8之間)；
2．配制1mg/ml CPC-Na水溶液；
3．將被測菌液沉淀后懸浮于PH=7.6的磷酸緩沖液中(視酶活高低適當(dāng)濃縮或稀釋，稱濃縮倍數(shù)或稀釋倍數(shù))和CPC-Na溶液在恒溫水浴35℃中預(yù)熱10分鐘，然后各取等體積數(shù)混合保溫，分別于不同時間取出1ml混合液加入4ml終止液中(20％醋酸∶0.05N NaOH=2∶1)，以菌液保溫后先加終止液，后加底物為對照。反應(yīng)液和對照液離心后取上清液，以緩沖液為空白，260nm測光密度。
4．比酶活的計算比酶活(u/mg)=0.5ml菌液的酶活/0.5ml菌液含干菌量
=[ΔOD260×酶活系數(shù)×10×60min×稀釋倍數(shù)(or÷濃縮倍
數(shù))]/(OD600×干菌系數(shù)×OD稀釋倍數(shù)×0.5ml×保溫時間)
酶活系數(shù)=0.1227(CPC-Na為底物)
干菌系數(shù)=0.91(適合于OD600在0.4-0.8之間)
實施例7 原工程菌A56-3/pMR24和新建工程菌MMR204/pMR24應(yīng)用于GL-7ACA到7ACA的轉(zhuǎn)化過程中對β-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞程度的比較(數(shù)據(jù)見表5)
1．工程菌的制備從LB平板上挑取一單菌落，接種于裝有60ml LB溶液的500ml三角搖瓶中，于37℃振搖培養(yǎng)12小時后，以1％的接種量轉(zhuǎn)接于裝有60ml LB溶液的500ml三角搖瓶中，于37℃振搖培養(yǎng)40小時，離心。
2．用PH7.6的磷酸緩沖液配制0.133223mg/ml GL-7ACA溶液。
3．將離心后的工程菌與GL-7ACA溶液混勻后于28℃水浴保溫60分鐘，在此過程中，不斷用1N NaOH調(diào)整PH值，使其維持在7.6左右。
4．將反應(yīng)液離心后，取上清，用蒸餾水稀釋100倍，用高壓液相法測定GL-7ACA和7ACA的濃度。
序列表(1)一般信息(Ⅰ)申請人中國科學(xué)院上海植物生理研究所(Ⅱ)發(fā)明名稱含有戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；富虻墓こ叹?Ⅲ)序列數(shù)10(2)SEQ ID NO:1信息(Ⅰ)序列特征
(A)長度2482個堿基
(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈
(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型脫氧核糖核酸(基因)(Ⅲ)來源
(A)菌種假單孢菌(Pseudomonas)
(B)菌株sp.130(Ⅳ)特征
(A)名稱信號肽
(B)位置104-202或104-223
(C)其它信息戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；?信號肽(Ⅳ)特征
(A)名稱成熟亞基-多肽
(B)位置203-667或224-667
(C)其它信息戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；?Alpha-亞基(Ⅳ)特征
(A)名稱空間肽-多肽
(B)位置668-697
(C)其它信息戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；?空間肽(Ⅳ)特征
(A)名稱成熟亞基-多肽
(B)位置698-2263
(C)其它信息戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；?Beta-亞基(Ⅴ)序列描述SEQ ID NO:1: 1G GAT CCG TGG TTC GTA CGC GCC GCC TAC AAG TGG TGA TCT AGG GGA ACG TTC CGG GGG 58 59 CGT CGC TGC AAC GGC GCT TCC GGA TCT GGG TGA GAG GGG AAA TCC ATG CTG AGA GTT CTG 118
Met Leu Arg Val Leu
1 5119 CAC CGG GCG GCG TCC GCC TTG GTT ATG GCG ACT GTG ATC GGC CTT GCG CCC GCC GTC GCC 178
His Arg Ala Ala Ser Ala Leu Val Met Ala Thr Val Ile Gly Leu Ala Pro Ala Val Ala
10 15 20 25179 TTT GCC CTG GCC GAG CCG ACC TCG ACG CCG CAG GCG CCG ATT GCG GCC TAT AAA CCG AGA 238
Phe Ala Leu Ala Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro Arg
30 35 40 45239 AGC AAT GAG ATC CTG TGG GAC GGC TAC GGC GTC CCG CAC ATC TAC GGC GTC GAC GCG CCC 298
Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr Gly Val Asp Ala Pro
50 55 60 65299 TCA GCC TTC TAC GGC TAT GGC TGG GCC CAG GCG CGC AGC CAC GGC GAC AAT ATC CTG CGC 358
Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala Arg Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg
70 75 80 85359 CTG TAT GGA GAA GCG CGG GGC AAG GGG GCC GAA TAC TGG GGC CCG GAT TAC GAA CAG ACG 418
Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly Lys Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr
90 95 100 105419 ACC GTC TGG CTG CTG ACC AAC GGC GTG CCG GAG CGC GCT CAG CAG TGG TAT GCG CAG CAG 478
Thr Val Trp Leu Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln Gln
110 115 120 125479 TCG CCT GAT TTC CGC GCC AAC CTC GAC GCC TTC GCG GCG GGC ATC AAC GCC TAT GCG CAG 538
Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile Asn Ala Tyr Ala Gln
130 135 140 145539 CAG AAC CCC GAC GAC ATC TCG CCC GAC GTG CGG CAG GTG CTG CCG GTT TCC GGC GCC GAC 598
Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Asp Val Arg Gln Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp
150 155 160 165599 GTG GTG GCC CAC GCC CAC CGC CTG ATG AAC TTC CTC TAT GTC GCG TCG CCC GGC CGC ACC 658
Val Val Ala His Ala His Arg Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr
170 175 180 185659 CTG GGC GAG GGC GAC CCG CCG GAC CTG GCC GAT CAA GGA TCC AAC TCC TGG GCG GTG GCG 718
Leu Gly Glu Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala
190 195 200 205719 CCG GGA AAG ACG GCG AAC GGG AAC GCC CTG CTG CTG CAG AAC CCG CAC CTG TCC TGG ACG 778
Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro His Leu Ser Trp Thr
210 215 220 225779 ACG GAC TAC TTC ACC TAC TAC GAG GCG CAT CTC GTC ACG CCG GAC TTC GAA ATC TAT GGC 838
Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu Val Thr Pro Asp Phe Glu Ile Tyr Gly
230 235 240 245839 GCG ACC CAG ATC GGC CTG CCG GTC ATC CGC TTC GCC TTC AAC CAG CGG ATG GGC ATC ACC 898
Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr
250 255 260 265899 AAT ACC GTC AAC GGC ATG GTG GGG GCC ACC AAC TAT CGG CTG ACG CTT CAG GAC GGC GCC 958
Asn Thr Val Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly Gly
270 275 280 285959 TAT CTG TAT GAC GGT CAG GTG CGG CCG TTC GAG CGG CGT CAG GCC TCG TAT CGC CTG CGT 1018
Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala Ser Tyr Arg Leu Arg
290 295 300 3051019 CAG GCG GAC GGG ACG ACG GTC GAC AAG CCG TTG GAG ATC CGC TCC AGC GTC CAT GGC CCG 1078
Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro
310 315 320 3251079 GTC TTC GAG CGC GCG GAC GGC ACG GCC GTC GCC GTT CGG GTC GCC GGT CTG GAC CGG CCG 1138
Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro
330 335 340 3451139 GGC ATG CTC GAG CAG TAT TTC GAC ATG ATC ACG GCG GAC AGC TTC GAC GAC TAC GAA GCC 1198
Gly Met Leu Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu Ala
350 355 360 3651199 GCT TTG GCG CGG ATG CAG GTG CCG ACC TTC AAC ATC GTC TAC GCC GAC CGC GAA GC4 ACC 1258
Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Phe Asn Ile Val Tyr Ala Asp Arg Glu Gly Thr
370 375 380 3851259 ATC AAC TAC AGC TTC AAC GGC GTG GCG CCC AAA CGG GCC GAG CGC GAC ATC GCC TTC TGG 1318
Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp
390 395 400 4051319 CAG GGG CTC GTG CCG GGC GAT TCC TCG CGT TAC CTG TGG ACC GAG ACA CAC CCG CTG GAC 1378
Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His Pro Leu Asp
410 415 420 425 1379 GAT CTG CCG CCC GTC ACC AAT CCG CCG GGC GGC TTC GTG CAG AAC TCC AAT GAT CCG CCG 1438
Asp Leu Pro Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val Gln Asn Ser Asn Asp Pro Pro
430 435 440 4451439 TGG ACG CCG ACC TGG CCC GTC ACC TAC ACG CCC AAG GAC TTC CCC TCC TAT CTG GCG CCC 1498
Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Ala Pro
450 455 460 4651499 CAG ACG CCG CAT TCC CTG CGT GCG CAA CAA AGC GTG CGT CTG ATG TCC GAG AAC GAC GAC 1558
Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp
470 475 480 4851559 CTG ACG CTG GAG CGC TTC ATG GCG CTG CAG TTG AGC CAT CGC GCC GTC ATG GCC GAC CGC 1618
Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met Ala Asp Arg
490 495 500 5051619 ACC TTG CCG GAC CTG ATC CCG GCC GCC CTG ATC GAC CCC GAT CCC GAG GTC CAG GCG GCG 1678
Thr Leu Pro Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro Glu Val Gln Ala Ala
510 515 520 5251679 GCG CGC CTG CTG GCG GCG TGG GAT CGC GAG TTC ACC AGC GAC AGC CGC GCC GCC CTG CTG 1738
Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser Arg Ala Ala Leu Leu
530 535 540 5451739 TTC GAG GAA TGG GCG CGT CTG TTC GCC GGC CAG AAT TTC GCA CGC CAG GCC GGC TTC GCC 1798
Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala
550 555 560 5651799 ACG CCC TGG TCG CTG GAT AAG CCG GTC AGC ACG CCT TAC GGC GTC CGC GAC CCC AAG GCC 1858
Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Val Arg Asp Pro Lys Ala
570 575 580 5851859 GCC GTC GAT CAA CTG CGG ACC GCC ATC GCC AAC ACC AAG CGC AAA TAC GGC GCG ATC GAC 1918
Ala Val Asp Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys Tyr Gly Ala Ile Asp
590 595 600 6051919 CGG CCG TTC GGC GAC GCC TCG CGC ATG ATC CTG AAC GAC GTG AAT GTT CCG GGC GCC GCC 1978
Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn Val Pro Gly Ala Ala
610 615 620 6251979 GGC TAC GGC AAC CTG GGT TCC TTC CGG GTC TTC ACC TGG TCC GAT CCT GAC GAA AAC GGG 2038
Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly
630 635 640 6452039 GTT CGC ACG CCC GTC CAC GGC GAG ACG TGG GTG GCG ATG ATC GAG TTC TCC ACG CCG GTG 2098
Val Arg Thr Pro Val His Gly Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser Thr Pro Val
650 655 660 6652099 CGG GCC TAT GGC CTG ATG AGC TAC GGC AAC TCT CGC CAG CCG GGC ACG ACG CAC TAC AGC 2158
Arg Ala Tyr Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly Thr Thr His Tyr Ser
670 675 680 6852159 GAT CAG ATC GAA CGC GTG TCG CGC GCC GAC TTC CGC GAA CTG TTG CTG CGG CGA GAG CAG 2218
Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu Leu Arg Arg Glu Gln
690 695 700 7052219 GTC GAG CCC GCC GTC CAG GAA CGC ACG CCC TTC AAC TTC AAG CCA TGA AAG CCC TGA CCA 2278
Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe Asn Phe Lys Pro
710 715 7202279 TGA CAC GAC GGA TTG GGT ATT CGG CGG GCG CGG CGT CTC TGG CGC TGA TGG TCG CCG CCT 23382339 CTG GAG CGG CGG CGG GCG AGC CGG CCT TCA CTT CGG TTC AGG TCG AGG GCT TTT CGG TTC 23982399 CGG GCG CTC TGT CGA ACG CCT GGG CCG ACT TCG ACA ACG ACG GCG ACC TGG ACC TGG CCG 24582459 TCT CCT GGA AGA GCG GCG AAG CTT 2482(3)SEQ ID NO:2信息(Ⅰ)序列特征
(A)長度720個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Leu Arg Val Leu His Arg Ala Ala Ser Ala Leu Val Met Ala Thr Val Ile Gly Leu
5 10 15 20Ala Pro Ala Val Ala Phe Ala Leu Ala Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala
25 30 35 40Ala Tyr Lys Pro Arg Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr
45 50 55 60Gly Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala Arg Ser His Gly
65 70 75 80Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly Lys Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro
85 90 95 100Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp Leu Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln
105 110 115 120Trp Tyr Ala Gln Gln Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile
125 130 135 140Asn Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Asp Val Arg Gln Val Leu Pro
145 150 155 160Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala
165 170 175 180Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn
185 190 195 200Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro
205 210 215 220His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu Val Thr Pro Asp
225 230 235 240Phe Glu Ile Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln
245 250 255 260Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Val Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr
265 270 275 280Leu Gln Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala
285 290 295 300Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu Glu Ile Arg Ser
305 310 315 320Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala
325 330 335 340Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe
345 350 355 360Asp Asp Tyr Glu Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Phe Asn Ile Val Tyr Ala
365 370 375 380Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys Arg Ala Glu Gly
385 390 395 400Asp Ile Ala Phe Trp Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu
405 410 415 420Thr His Pro Leu Asp Asp Leu Pro Arg Val Thr Asn ProPro Gly Gly Phe Val Gln Asn
425 430 435 440Ser Asn Asp Pro Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro
445 450 455 460Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser Val Arg Leu Met
465 470 475 480Ser Glu Asn Asp Asp Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala
485 490 495 500Val Met Ala Asp Arg Thr Leu Pro Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro
505 510 515 520Glu Val Gln Ala Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser
525 530 535 540Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln Asn Phe Ala Gly
545 550 555 560Gln Ala Gly Phe Ala Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Val
565 570 575 580Arg Asp Pro Lys Ala Ala Val Asp Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys
585 590 595 600Tyr Gly Ala Ile Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn
605 610 615 620Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe Thr Trp Ser Asp
625 630 635 640Pro Asp Glu Asn Gly Val Arg Thr Pro Val His Gly Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu
645 650 655 660Phe Ser Thr Pro Val Arg Ala Tyr Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly
665 670 675 680Thr Thr His Tyr Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu
685 690 695 700Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe Asn Phe Lys Pro
705 710 715 720(4)SEQ ID NO:3信息(Ⅰ)序列特征
(A)長度17
(B)類型核苷酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型核酸(Ⅲ)特征
(A)名稱M13
(B)其它信息測序引物(Ⅳ)序列描述SEQ ID NO:3:
GTA AAA CGA CGG CCA GT(5)SEQ ID NO:4信息(Ⅰ)序列特征
(A)長度16
(B)類型核苷酸
(C)
(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型核酸(Ⅲ)特征
(A)名稱Reverse
(B)其它信息測序引物(Ⅳ)序列描述SEQ ID NO:4:
AAC AGC TAT GAC CAT G(6)SEQ ID NO:5信息(Ⅰ)序列特征
(A)長度17
(B)類型核苷酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型核酸(Ⅲ)特征
(A)名稱KS
(B)其它信息測序引物(Ⅳ)序列描述SEQ ID NO:5:
CGA GGT CGA CGG TAT CG(7)SEQ ID NO:6信息(Ⅰ)序列特征
(A)長度17
(B)類型核苷酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型核酸(Ⅲ)特征
(A)名稱SK
(B)其它信息測序引物(Ⅳ)序列描述SEQ ID NO:6:
TCT AGA ACT AGT GGA TC(8)SEQ ID NO:7信息(Ⅰ)序列特征
(A)長度18
(B)類型核苷酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型核酸(Ⅲ)特征
(A)名稱ALPHA
(B)其它信息測序引物(Ⅳ)序列描述SEQ ID NO:7:
GCG CTG GCC GAG CCG ACC(9)SEQ ID NO:8信息(Ⅰ)序列特征
(A)長度17
(B)類型核苷酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型核酸(Ⅲ)特征
(A)名稱BETA1
(B)其它信息測序引物(Ⅳ)序列描述SEQ ID NO:8:
CTTCAGGACGCCGGCTA(10)SEQ ID NO:9信息(Ⅰ)序列特征
(A)長度17
(B)類型核苷酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型核酸(Ⅲ)特征
(A)名稱BETA3
(B)其它信息測序引物(Ⅳ)序列描述SEQ ID NO:9:
GTG CGG TCG GCC ATG AC(11)SEQ ID NO:10信息(Ⅰ)序列特征
(A)長度17
(B)類型核苷酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型核酸(Ⅲ)特征
(A)名稱BETA4
(B)其它信息測序引物(Ⅳ)序列描述SEQ ID NO:10:
GTG AGT TCA CCA GCG AC
權(quán)利要求
1．一種保藏登記號為CGMCC NO.0309的含有SEQ ID NO:1的戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶基因的工程菌MMR204/pMR24，其特征在于該工程菌是由工程宿主菌MMR204攜帶含有戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶基因的重組質(zhì)粒pMR24構(gòu)成。
2．如權(quán)利要求1所述的工程菌MMR204/pMR24，其特征在于所述重組質(zhì)粒pMR24含有的主要基因型為acy,amp,par，它是由將分配基因par重組到質(zhì)粒pMR10中acy基因的下游而得到。
3．如權(quán)利要求1所述的工程菌MMR204/pMR24，其特征在于所述工程宿主菌MMR204含有的主要基因型為ampC∷KAPA,ompT,recA。
4．如權(quán)利要求1所述的工程菌MMR204/pMR24的構(gòu)建方法，其特征在于包括
(1)、工程宿主菌MMR204的構(gòu)建首先運用體外重組技術(shù)得到含有ampC∷KAPA突變的重組質(zhì)粒pZJ5，其次運用體內(nèi)重組技術(shù)將上述突變整合入大腸桿菌染色體上的ampC基因位點，構(gòu)建含ampC∷KAPA突變的菌株，最后再經(jīng)改造，將能使表達在周質(zhì)空間的外源蛋白較為穩(wěn)定的蛋白酶OmpT突變和可保證質(zhì)粒穩(wěn)定傳代及克隆基因穩(wěn)定表達的recA缺陷引入宿主菌，獲得基因工程宿主菌MMR204；
(2)、將MMR204與上述重組質(zhì)粒pMR24構(gòu)建成MMR204/pMR24。
5．如權(quán)利要求1所述的工程菌MMR204/pMR24的應(yīng)用，其特征在于該工程菌包含的所述宿主菌MMR204可應(yīng)用于以處理CPC及其衍生物為目的的基因工程菌的構(gòu)建。
6．如權(quán)利要求5所述的工程菌MMR204/pMR24的應(yīng)用，其特征在于所述CPC衍生物是GL-7ACA和7ACA。
全文摘要
本發(fā)明測定了來源于Pseudomonas sp.130菌株的GL—7ACA酰化酶基因全序列及其所編碼的酶蛋白,并提供含有該基因的重組質(zhì)粒pMR24及構(gòu)建E.cOli MMR204基因工程宿主菌,克服了原有宿主菌的β－內(nèi)酰胺酶對CPC及其衍生物有破壞性的缺點。該宿主菌可一般地應(yīng)用于以處理CPC及其衍生物(如GL—7ACA或7ACA)為目的基因工程菌的構(gòu)建。本發(fā)明建立了一株具有工業(yè)應(yīng)用前景的以GL—7ACA為中間體生產(chǎn)7ACA的GL—7ACA?；富蚬こ叹?。
文檔編號C12N15/78GK1301813SQ9912700
公開日2001年7月4日 申請日期1999年12月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月29日
發(fā)明者楊蘊劉, 張菁, 李勇, 趙國屏, 茅翔, 何宇炯, 王恩多, 姜衛(wèi)紅, 焦瑞身 申請人:中國科學(xué)院上海植物生理研究所