專利名稱：人3－磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)移酶及其編碼序列、以及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人3-磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)移酶(簡稱為“人EPIP2”)的cDNA序列，該cDNA編碼的蛋白是3-磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)移酶在人中的同源物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.6.1.52)可專一催化磷酸絲氨酸和2-酮戊二酸與3-磷酸羥基丙酮酸和谷氨酸之間可逆的氨基轉(zhuǎn)移作用。根據(jù)其序列特征，3-磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)移酶屬于第Ⅴ類(Class Ⅴ)氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員(Yeast1994，10385-389)。
1987年，Misrahi等人在懷孕5天的母兔子宮內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)了一個受黃體酮誘導(dǎo)，并受對抗劑RU486完全抑制的新基因EPIP(endometrial progesterone-inducedprotein，EPIP)(Biochemistry1987，26(13)3975-3982)。以后，根據(jù)序列比較結(jié)果確定其為哺乳類的3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Curr.Genet.1995，27501-508)。
1999年7月，GeneBank中公布了人的EPIP cDNA序列。
研究已暗示，3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與一些疾病相關(guān)，因此，為治療目的研究和開發(fā)人3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶有重要意義。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼3-磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)移酶的一個同系物，本發(fā)明的3-磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)移酶同系物被命名為人EPIP2。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的3-磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)移酶同系物，該蛋白被命名為人EPIP2蛋白。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人EPIP2多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種人EPIP2核酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人EPIP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1155位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1155位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1155位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人EPIP2蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人EPIP2蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人EPIP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人EPIP2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1155位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人EPIP2蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人EPIP2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人EPIP2蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為1171個核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于43-1155位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人EPIP2蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人EPIP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中43-1155位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框43-1155位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中43-1155位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1155位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1155位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的人EPIP2相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5和/或3端添加數(shù)個核苷酸。本發(fā)明的編碼序列可以是DNA或RNA，可以是單鏈或雙鏈。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人EPIP2蛋白多肽”指具有天然人EPIP2蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人EPIP2蛋白相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人EPIP2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人EPIP2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人EPIP2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人EPIP2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人EPIP2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人EPIP2多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人EPIP2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人EPIP2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人EPIP2保守性變異多肽”指與SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明還包括人EPIP2多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人EPIP2的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人EPIP2多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人EPIP2的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人EPIP2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于人EPIP2多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人EPIP2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人EPIP2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人EPIP2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人EPIP2蛋白的分子，也包括那些并不影響人EPIP2蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人EPIP2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的人EPIP2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人EPIP2或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人EPIP2功能的抗體以及不影響人EPIP2功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人EPIP2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人EPIP2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E．Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人EPIP2核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明蛋白的片段，除了用重組法產(chǎn)生之外，還可用固相技術(shù)通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
本發(fā)明蛋白的編碼序列還可用于基因定位。例如，通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進行雜交，可以準(zhǔn)確地進行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長至約2000bp或者更長的cDNA。對于該技術(shù)，可參見Verma等人，Human ChromosomesA Manual ofBasic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位于染色體上的某個精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的，例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(可通過Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在網(wǎng)上獲得)。然后，通過連鎖分析來鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。
接著，有必要確定患病個體和健康個體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在于部分或全部患病個體但不存在于正常個體，那么該突變可能就是該疾病的致病因素。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與EPIP2發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人EPIP2蛋白為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人EPIP2蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當(dāng)本發(fā)明的人EPIP2蛋白多肽被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
由于本發(fā)明的人EPIP2具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種的同族蛋白相比，預(yù)計在施用于人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒有)。
在本發(fā)明的一個實施例中，人EPIP2的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人胎盤λgtllcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A5-TTCGGTCCTCCTTGGCTGACTC-3′為正向引物，寡核苷酸B5′-CCTGGTTAAGATGTGTTCATAGC-3為反向引物，進行PCR。對擴增產(chǎn)物進行測序后得到SEQ ID NO.3的全長cDNA序列。
本發(fā)明的人EPIP2是一種哺乳動物的3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.6.1.52)，可專一催化磷酸絲氨酸和2-酮戊二酸與3-磷酸羥基丙酮酸和谷氨酸之間可逆的氨基轉(zhuǎn)移作用，對內(nèi)源絲氨酸的生成有重要作用。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人EPIP2與兔EPIP(rbEPIP)(M17099)的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“｜”標(biāo)出，相似的氨基酸用“·”標(biāo)出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
圖2為本發(fā)明的人EPIP2與人磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(hPSA)(AF113132)的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“｜”標(biāo)出，相似的氨基酸用“·”標(biāo)出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人EPIP2的cDNA序列的克隆和測定1．引物擴增以人胎盤λgtllcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物-A5-TTCGGTCCTCCTTGGCTGACTC-3(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸B5-CCTGGTTAAGATGTGTTCATAGC-3(SEQ ID NO2)為反向引物，進行PCR。A/B的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到約1.2kp的目的片段。
2．PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑸鲜鯬CR擴增產(chǎn)物A/B與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對抽提的質(zhì)粒進行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1171bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于43-1155位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出人EPIP2的氨基酸序列，共370個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.4。
實施例2同源比較用本發(fā)明的人EPIP2的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用BLAST程序進行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們與不同來源的3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶有著顯著的同源性。用PCGENE軟件分析表明，本發(fā)明的人EPIP2蛋白與兔EPIP(M17099)編碼的蛋白的同源性為93.5％，相似性為97.1％(圖1)；與人磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶hPSA(AF113132)編碼的蛋白基本一致，只是在C端有46個氨基酸的不同(圖2)，這可能是轉(zhuǎn)錄時不同剪接方式的結(jié)果。
此外，本發(fā)明的人EPIP2蛋白含有第Ⅴ類(Class Ⅴ)氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員一致的磷酸吡哆醛結(jié)合序列[L/I/V/F/Y/C/H/T][D/G/H][L/I/V/M/F/T/A/C][L/I/V/M/F/T/A]X2[G/S/T/A/C][G/S/T/A][H/Q/R]KX4，6GX[G/S/A/T]X[L/I/V/M/F/Y/S/A/C]，其中賴氨酸直接和磷酸吡哆醛結(jié)合，序列中方括號表示所括氨基酸中的任意一種，Xn，m表示任意n或m個氨基酸，本發(fā)明中對應(yīng)的序列為191FGVIFAGAQKNVGSAGVTVV210。
本發(fā)明蛋白還并含有不同物種的3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶均含有一段特征序列LKGHRX2GGXR(Yeast1994，10385-389)，式中X2表示任意2個氨基酸，本發(fā)明中對應(yīng)的序列分別為332LKGHRSVGGIR342。因此可以確定本發(fā)明的新蛋白是人的3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，并具有3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的一般功能。
L-絲氨酸是許多重要代謝途徑的關(guān)鍵的中間產(chǎn)物。除了在甘氨酸、L-半胱氨酸的合成過程中的重要作用外，它也能轉(zhuǎn)化成L-高半胱氨酸和L-甲硫氨酸。它是許多物質(zhì)的必需的或主要的前體分子，如?；撬帷㈦琢蛎?、鞘氨醇等鞘磷脂以及復(fù)雜的鞘脂、某些種類的磷酸脂、卟啉、嘌呤、胸腺嘧啶等。盡管一碳基團可以來源于組氨酸代謝與二甲基甘氨酸和肌氨酸的氧化去甲基作用，但是最主要的一碳基團來源是絲氨酸和甘氨酸(Arch.Biochem.Biophys.1985，237(1)186-196)。
L-絲氨酸是一個非必需氨基酸，在許多哺乳動物組織中存在著活躍的合成途徑。盡管L-絲氨酸內(nèi)外源比例尚不清楚，但是已經(jīng)證實至少在腦部，內(nèi)源L-絲氨酸合成是必不可少的，因為血液循環(huán)不能提供足夠多的外源L-絲氨酸(J.Neurochem.1970，171461-1475)。另外，有報道說在惡性組織中L-絲氨酸合成途徑中的酶水平提高，反映了對一碳基團的高需求，以滿足其DNA合成需要(Biochem.Trans.1979，71048-1050)。L-絲氨酸可通過兩條途徑有碳水化合物合成。一條被稱為“磷酸化途徑”由葡萄糖分解生成的3-磷酸甘油酸經(jīng)脫氫后產(chǎn)生3-磷酸羥基丙酮酸，再由氨基轉(zhuǎn)移作用生成3-磷酸絲氨酸，最后水解去磷酸基團產(chǎn)生L-絲氨酸。另一條途徑稱為“非磷酸化途徑”由D-2-磷酸甘油酸經(jīng)D-甘油酸、羥基丙酮酸最后生成L-絲氨酸。在生理條件下，非磷酸化途徑一般逆向反應(yīng)，成為一條L-絲氨酸的利用途徑，而非合成途徑(Biochem.J.1980，190451-455；Arch.Biochem.Biophys.1985，237(1)186-196)。3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶只參與磷酸化途徑，對于生成絲氨酸時的氨基轉(zhuǎn)移具有重要作用。
3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.52)可專一催化磷酸絲氨酸和2-酮戊二酸與3-磷酸羥基丙酮酸和谷氨酸之間可逆的氨基轉(zhuǎn)移作用。該酶作用時依賴于輔酶磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛與轉(zhuǎn)氨酶緊密結(jié)合，是氨基的中間傳遞體(Yeast1994，10385-389)。
曾有報道哺乳動物絲氨酸合成的磷酸化途徑受類固醇激素的調(diào)控(Principles inBiochemistrygeneral aspects1983 Mc.Grow-Hill Book Co.，New York)，由此可以推斷子宮內(nèi)膜的絲氨酸生物合成對胚胎的營養(yǎng)需求是必需的。
本發(fā)明的人EPIP2除了可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人EPIP2還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人EPIP2的N端與兔EPIP的N端進行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人EPIP2的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人EPIP2核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人EPIP2的表達(dá)水平或者抑制人EPIP2的過度表達(dá)。本發(fā)明的人EPIP2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人EPIP2缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實施例3人EPIP2在大腸桿菌中的表達(dá)在該實施例中，以實施例1中PCR擴增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人EPIP2的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.5和6)進行擴增，獲得人EPIP2 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGGATCCATGGACGCCCCCAGGCAGG-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的人EPIP2編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5-TTGGGTCGACTCATAGCTGATGCATCTCC-3(SEQ ID NO.6)，該引物含有SalⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點、翻譯終止子和人EPIP2的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細(xì)菌復(fù)制起點(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(RBS)、一個6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。
用BamHⅠ和SalⅠ消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacⅠ阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗證人EPIP2的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacⅠ阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解培養(yǎng)物，收集細(xì)胞裂解液并將其稀釋于6M鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人EPIP2。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人EPIP2?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約40KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例4人EPIP2在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實施例中，以實施例1中PCR擴增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人EPIP2的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.7和8)進行擴增，獲得人EPIP2 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGGATCCATGGACGCCCCCAGGCAGG-3′(SEQ ID NO.7)該引物含有BamHⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的人EPIP2編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5-TTGGGTCGACTCATAGCTGATGCATCTCC-3(SEQ ID NO.8)該引物含有EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和人EPIP2的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復(fù)制起點(f1 ori)、一個病毒復(fù)制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用BamHⅠ和EcoRⅠ消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補加Amp(100μg／ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測序驗證人EPIP2的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進行的。轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為40KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例5制備抗體將實施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人EPIP2基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱人3-磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)移酶及其編碼序列、以及制法和用途(ⅲ)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.1TTCGGTCCTC CTTGGCTGAC TC22(2)SEQ ID NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2CCTGGTTAAG ATGTGTTCAT AGC23(2)SEQ ID NO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1171bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.31 TTCGGTCCTC CTTGGCTGAC TCACCGCCCT CGCCGCCGCA CCATGGACGC CCCCAGGCAG61 GTGGTCAACT TTGGGCCTGG TCCCGCCAAG CTGCCGCACT CAGTGTTGTT AGAGATACAA121 AAGGAATTAT TAGACTACAA AGGAGTTGGC ATTAGTGTTC TTGAAATGAG TCACAGGTCA181 TCAGATTTTG CCAAGATTAT TAACAATACA GAGAATCTTG TGCGGGAATT GCTAGCTGTT241 CCAGACAACT ATAAGGTGAT TTTTCTGCAA GGAGGTGGGT GCGGCCAGTT CAGTGCTGTC301 CCCTTAAACC TCATTGGCTT GAAAGCAGGA AGGTGTGCGG ACTATGTGGT GACAGGAGCT361 TGGTCAGCTA AGGCCGCAGA AGAAGCCAAG AAGTTTGGGA CTATAAATAT CGTTCACCCT421 AAACTTGGGA GTTATACAAA AATTCCAGAT CCAAGCACCT GGAACCTCAA CCCAGATGCC481 TCCTACGTGT ATTATTGCGC AAATGAGACG GTGCATGGTG TGGAGTTTGA CTTTATACCC541 GATGTCAAGG GAGCAGTACT GGTTTGTGAC ATGTCCTCAA ACTTCCTGTC CAAGCCAGTG601 GATGTTTCCA AGTTTGGTGT GATTTTTGCT GGTGCCCAGA AGAATGTTGG CTCTGCTGGG661 GTCACCGTGG TGATTGTCCG TGATGACCTG CTGGGGTTTG CCCTCCGAGA GTGCCCCTCG721 GTCCTGGAAT ACAAGGTGCA GGCTGGAAAC AGCTCCTTGT ACAACACGCC TCCATGTTTC781 AGCATCTACG TCATGGGCTT GGTTCTGGAG TGGATTAAAA ACAATGGAGG TGCCGCGGCC841 ATGGAGAAGC TTAGCTCCAT CAAATCTCAA ACAATTTATG AGATTATTGA TAATTCTCAA901 GGATTCTACG TTTGTCCAGT GGAGCCCCAA AATAGAAGCA AGATGAATAT TCCATTCCGC961 ATTGGCAATG CCAAAGGAGA TGATGCTTTA GAAAAAAGAT TTCTTGATAA AGCTCTTGAA1021 CTCAATATGT TGTCCTTGAA AGGGCATAGG TCTGTGGGAG GCATCCGGGC CTCTCTGTAT1081 AATGCTGTCA CAATTGAAGA CGTTCAGAAG CTGGCCGCCT TCATGAAAAA ATTTTTGGAG1141 ATGCATCAGC TATGAACACA TCCTAACCAG G(2)SEQ ID NO.4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度370個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.41 Met Asp Ala Pro Arg Gln Val Val Asn Phe Gly Pro Gly Pro Ala16 Lys Leu Pro His Ser Val Leu Leu Glu Ile Gln Lys Glu Leu Leu31 Asp Tyr Lys Gly Val Gly Ile Ser Val Leu Glu Met Ser His Arg46 Ser Ser Asp Phe Ala Lys Ile Ile Asn Asn Thr Glu Asn Leu Val61 Arg Glu Leu Leu Ala Val Pro Asp Asn Tyr Lys Val Ile Phe Leu76 Gln Gly Gly Gly Cys Gly Gln Phe Ser Ala Val Pro Leu Asn Leu91 Ile Gly Leu Lys Ala Gly Arg Cys Ala Asp Tyr Val Val Thr Gly106 Ala Trp Ser Ala Lys Ala Ala Glu Glu Ala Lys Lys Phe Gly Thr121 Ile Asn Ile Val His Pro Lys Leu Gly Ser Tyr Thr Lys Ile Pro136 Asp Pro Ser Thr Trp Asn Leu Asn Pro Asp Ala Ser Tyr Val Tyr151 Tyr Cys Ala Asn Glu Thr Val His Gly Val Glu Phe Asp Phe Ile166 Pro Asp Val Lys Gly Ala Val Leu Val Cys Asp Met Ser Ser Asn181 Phe Leu Ser Lys Pro Val Asp Val Ser Lys Phe Gly Val Ile Phe196 Ala Gly Ala Gln Lys Asn Val Gly Ser Ala Gly Val Thr Val Val211 Ile Val Arg Asp Asp Leu Leu Gly Phe Ala Leu Arg Glu Cys Pro226 Ser Val Leu Glu Tyr Lys Val Gln Ala Gly Asn Ser Ser Leu Tyr241 Asn Thr Pro Pro Cys Phe Ser Ile Tyr Val Met Gly Leu Val Leu256 Glu Trp Ile Lys Asn Asn Gly Gly Ala Ala Ala Met Glu Lys Leu271 Ser Ser Ile Lys Ser Gln Thr Ile Tyr Glu Ile Ile Asp Asn Ser286 Gln Gly Phe Tyr Val Cys Pro Val Glu Pro Gln Asn Arg Ser Lys301 Met Asn Ile Pro Phe Arg Ile Gly Asn Ala Lys Gly Asp Asp Ala316 Leu Glu Lys Arg Phe Leu Asp Lys Ala Leu Glu Leu Asn Met Leu33l Ser Leu Lys Gly His Arg Ser Val Gly Gly Ile Arg Ala Ser Leu346 Tyr Asn Ala Val Thr Ile Glu Asp Val Gln Lys Leu Ala Ala Phe361 Met Lys Lys Phe Leu Glu Met His Gln Leu(2)SEQ ID NO.5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGGATCC ATGGACGCCC CCAGGCAGG29(2)SEQ ID NO.6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.6TTGGGTCGAC TCATAGCTGA TGCATCTCC29(2)SEQ ID NO.7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.7TCAGGGATCC ATGGACGCCC CCAGGCAGG29(2)SEQ ID NO.8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.8TTGGGTCGAC TCATAGCTGA TGCATCTCC29
權(quán)利要求
1．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人EPIP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1155位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1155位的核苷酸序列雜交。
2．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1155位的核苷酸序列。
4．一種分離的人EPIP2蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
5．如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6．一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7．一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8．一種產(chǎn)生具有人EPIP2蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人EPIP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人EPIP2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1155位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人EPIP2蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人EPIP2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人EPIP2蛋白活性的多肽。
9．一種能與權(quán)利要求4所述的人EPIP2蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10．一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了人3－磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)移酶(簡稱為人EPIP2)的cDNA序列,該cDNA編碼的蛋白是3－磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)移酶在人中的同源物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽;這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號C12P21/00GK1287173SQ99118820
公開日2001年3月14日 申請日期1999年9月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月7日
發(fā)明者余龍, 張宏來, 傅強, 趙勇, 趙壽元 申請人:復(fù)旦大學(xué)