專利名稱：甲醇酵母生產(chǎn)重組人白細胞介素11的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)基因工程蛋白藥物，尤其涉及甲醇酵母生產(chǎn)重組人白細胞介素11的方法。
近20年來，重組DNA技術(shù)的發(fā)展導致了一個新的行業(yè)-基因工程制藥的興起。許多具有藥用價值的人體天然蛋白因子通過重組技術(shù)大規(guī)模的生產(chǎn)。到目前為止，有近50種基因工程蛋白藥物被各國批準上市，形成了幾十億美元的市場。例如人生長激素，人胰島素，Epo，G-CSF等等，其中包括了人白細胞介素11。
人白細胞介素11(Interleukin11，IL-11)是與許多造血和非造血細胞相互作用的細胞因子，最早是從IL-1a刺激的哺乳動物骨髓細胞系PU-34的條件培養(yǎng)基中被鑒別的活性物質(zhì)，可長期維持培養(yǎng)的血細胞的生存，隨后從人胚胎成纖維細胞系中克隆到IL-11cDNA。天然的IL-11成熟蛋白含178個氨基酸，分子量19Kd；不含半胱氨酸，因而缺少二硫鍵，但蛋白的結(jié)構(gòu)卻相當穩(wěn)定；沒有糖基化修飾；富含脯氨酸(12％)，亮氨酸(23％)及正電荷殘基(14％)，等電點為11.7。
人IL-11基因定位于第19條染色體長臂19q13.3-q13.4，由5個外顯子和4個內(nèi)顯子組成，長約7000bp。
IL-11是由多種細胞產(chǎn)生并與多種細胞作用的細胞因子。IL-11是一類細胞因子家族中的一員，這類細胞因子還包括IL-6，CNTF，LIF，oncostatin M和cardiotropin-1等。他們的共同點是信號傳導受體中都包括受體亞基gp130。在體外rhIL-11可與其它因子協(xié)同作用刺激粒細胞，紅細胞及巨核細胞的前體細胞生長。在體內(nèi)rhIL-11可以刺激小鼠，大鼠，狗，豚鼠，倉鼠和非人靈長類動物巨核細胞及血小板的生成。臨床試驗表明rhIL-11可顯著恢復腫瘤病人化療引起的嚴重血小板減少癥。除了造血細胞，rhIL-11還作用于其它細胞，包括胃腸黏膜和免疫系統(tǒng)，起保護胃腸上皮和免疫調(diào)節(jié)作用。
由于IL-11具有促血小板生成活性，美國FDA已于1997年批準rhIL-11用于防止化療引起的血小板減少癥。由于IL-11具有對胃腸上皮的保護作用，rhIL-11對腫瘤化療引起的口腔黏膜炎的治療處于一期臨床階段。由于IL-11具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、保護胃腸黏膜活性，rhIL-11對節(jié)段性回腸炎的治療處于Ⅱ期臨床階段。另外，rhIL-11對炎癥性腸疾，類風濕關(guān)節(jié)炎和膿毒癥等炎癥疾病的療效也在進一步研究之中。
1997年，美國Genetic Institute公司(GI)生產(chǎn)的rhIL-11獲準上市。GI于1993年獲得IL-11基因?qū)＠?專利號US5215895)，1997年補充了該專利(專利號US5700664)，1998年獲得生產(chǎn)方法發(fā)明專利(專利號US5760189)，這些專利都在美國申請。GI采用的是大腸桿菌融合表達生產(chǎn)方法，其主要特點是將IL-11基因與大腸桿菌TrxA基因融合后轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達TrxA-IL-11融合蛋白，同時在TrxA與IL-11基因連接處引入特定的蛋白酶切序列。純化過程需要相應(yīng)識別這段序列的蛋白酶在體外切割釋放IL-11，如牛腸激酶(Enterkinase)。專業(yè)人士都知道，這樣的系統(tǒng)存在以下缺點(1)表達量不高，(2)生產(chǎn)成本過高，(3)純化難度大，關(guān)鍵是酶切條件難控制。正如專業(yè)人士所知，另外還可以采用哺乳動物細胞，果蠅細胞，昆蟲細胞等表達系統(tǒng)，但這些系統(tǒng)都表達量過低，生產(chǎn)成本高，無法達到大規(guī)模生產(chǎn)要求。酵母作為理想的基因工程生產(chǎn)用菌種，已有不少成功的例子，如人白蛋白、干擾素、PDGF、乙肝疫苗等，這里所說的酵母包括釀酒酵母、甲醇酵母、克魯士酵母等等。酵母主要的生產(chǎn)特點在于(1)易培養(yǎng)，特別適合于高密度發(fā)酵，(2)外源基因表達可調(diào)控，(3)高表達，同時能分泌表達，(4)生產(chǎn)成本低。
本發(fā)明的目的是提供一種甲醇酵母生產(chǎn)重組人白細胞介素11的方法。
為了達到上述目的本發(fā)明采取下列措施甲醇酵母表達重組人白細胞介素11的生產(chǎn)方法，它包括以下步驟首先，人工合成重組人白細胞介素11的編碼基因，融合于酵母表達調(diào)控元件，構(gòu)建甲醇酵母高表達工程菌；然后，甲醇酵母工程菌高密度發(fā)酵表達；最后，采用超濾、離子交換柱層析、疏水柱層析、分子篩柱層析等純化技術(shù)的順序組合，大量純化回收重組人白細胞介素11，使其達到藥用標準。
本發(fā)明提供了一種極具商業(yè)價值，大規(guī)模生產(chǎn)制備rhIL-11的方法，其突出優(yōu)點在于1)構(gòu)建了甲醇酵母高表達rhIL-11生產(chǎn)工程菌，再結(jié)合優(yōu)化的發(fā)酵工藝，可使表達量高達0.5～5g/L。
2)后續(xù)純化工藝簡單，易放大，總收率可大于50％，精制rhIL-11的RP-HPLC純度大于97％，生物學活性達到1x107U/mg，與國際標準品一致。生產(chǎn)成本相當?shù)土?br> 下面結(jié)合附圖和實施例作詳細說明

圖1是IL-11標準基因序列與設(shè)計的rhIL-11基因序列及氨基酸序列對照圖2是設(shè)計的rhIL-11基因序列合成寡核苷酸片段序列；圖3是合成rhIL-11DNA拼接簡圖；圖4是pGENYk質(zhì)粒圖；圖5是pGENYk-11質(zhì)粒圖；圖6是工程菌發(fā)酵生長曲線和表達曲線圖；圖7是CM-FF離子交換層析圖譜；圖8是Phenyl-FF疏水層析圖譜；圖9是Sephacyl S-200脫鹽層析圖譜；圖10是12％SDS-PAGE分析圖譜。
首先針對酵母的密碼子偏愛與人不同的特性，將IL-11基因序列進行優(yōu)化設(shè)計。具體而言就是將人IL-11天然基因序列中每一個氨基酸所對應(yīng)的密碼子改造為酵母所偏愛的密碼子，同時考慮整個基因序列的G+C/A+T比例平衡，避免產(chǎn)生后續(xù)克隆操作時需要的酶切位點，再在基因5’端、3’端及中間分別引入特定的酶切位點，如XhoⅠ，EcoRⅠ，AflⅢ，以方便后續(xù)克隆、拼接。為了適合甲醇酵母分泌表達，設(shè)計的IL-11對照天然蛋白缺失N端pro殘基，總共為177個氨基酸?；诿艽a子的擺動學說，我們所指的IL-11基因序列設(shè)計還可以有許多變動延伸。而不僅限于圖一所列示的序列。然后，根據(jù)基因片段人工合成的需要，將設(shè)計的IL-11基因分段合成，體外拼接成完整的序列。拼接好的IL-11序列，以XhoⅠ、EcoRⅠ酶切產(chǎn)生粘端后，插入到同樣酶切處理的甲醇酵母表達載體pGENYk上，構(gòu)建成重組表達質(zhì)粒pGENYk-11。
本發(fā)明所指的甲醇酵母表達載體特指穿梭型質(zhì)粒，它包括以下各種元件(1)大腸桿菌來源的質(zhì)粒復制元件，如ColE1。(2)大腸桿菌篩選標記，如Ampicillin抗體基因(Ampr)。(3)甲醇酵母表達調(diào)控元件，特別是指可誘導表達調(diào)控元件。如甲醇酵母來源的AOX1基因啟動子5’AOX1、轉(zhuǎn)錄終止子(TT)3，AOX1。(4)甲醇酵母分泌表達信號肽序列。如酵母α因子(MFα)信號肽。(5)多克隆位點。(6)甲醇酵母篩選標記如酵母His4基因，Kanamycin抗性基因。(7)能在甲醇酵母染色體特異位點上重組整合的特異序列，如AOX1的5’、3’序列，His4的5’、3’序列。(8)其它來源于大腸桿菌和酵母的連接片段。
表達質(zhì)粒pGENYk轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌DH5α，篩選陽性克隆子。一方面用于保存、擴增質(zhì)粒，另一方面用于酶切、測序等分析檢測。從中篩選鑒定正確的一個重組表達質(zhì)粒pGENYk-11cl用于轉(zhuǎn)化甲醇酵母，選擇合適的酶將pGENYk-11cl質(zhì)粒體外線形化，如BglⅡ、SalⅠ、SacⅠ等，但保證IL-11基因、表達調(diào)控序列、整合序列、篩選標記等片段的完整性。
外源基因轉(zhuǎn)化酵母細胞可以用電轉(zhuǎn)化方法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法等。
合適的甲醇酵母受體菌可采用GS115(his4-)，KM71(his4-AOX1ARG4)，SMD1168(pep4-his4-)。轉(zhuǎn)化后篩選表現(xiàn)型為His+Mut+和His+Mut-的重組子；再根據(jù)轉(zhuǎn)入的Kanamycin抗性標記，以G418濃度梯度0.5，1，2，4，8，16mg/ml篩選多拷貝整合重組子；最后以搖瓶表達進一步驗證并篩選最高表達量的重組工程菌。以上克隆、轉(zhuǎn)化、篩選工作都為常規(guī)分子生物學技術(shù)，具體請參閱《Molecular Cloning》J.Sambrook等著；《Short Protocols in Molecular Biology》Frederick M.Ausubel等著；以及其它分子生物學實驗技術(shù)參考書。
工程菌進行發(fā)酵生產(chǎn)。甲醇酵母為甲基營養(yǎng)型酵母，它能利用甲醇為唯一碳源。AOX1啟動子為甲醇誘導型啟動子，能被甘油、葡萄糖等優(yōu)先利用的碳源所抑制。本發(fā)明采用二步生長法發(fā)酵。第一階段，工程菌接種于甘油或葡萄糖等為碳源的半合成培養(yǎng)基(具體配方見實例)培養(yǎng)16～28小時至甘油或葡萄糖耗盡，菌密度達到大于OD600=160，此為菌種生長期。第二階段，甲醇補料到濃度0.5～5％，誘導表達，表達持續(xù)48～96小時達到平臺。其它參數(shù)選擇培養(yǎng)溫度控制為酵母生長最適的30℃；溶氧15～35％(攪拌速度相關(guān))；pH3～6，低pH可抑制酵母自身蛋白酶的活性，減少降解。
發(fā)酵結(jié)束后除去菌體，收集發(fā)酵上清。除菌可采用離心、壓濾、超濾等方法。上清經(jīng)超濾脫鹽、濃縮后即可進入后續(xù)純化工作。
本發(fā)明設(shè)計了離子交換層析，疏水層析，再經(jīng)分子篩層析順序組合的純化工藝。離子交換層析填料為CM-Sepharose Fast Flow、SP-Sepharose Fast Flow或SOURCE S等陽離子填料。rhIL-11等電點大于11.0，穩(wěn)定的pH范圍為6～10，以pH7～9的10～50mMTrisHCl緩沖液或PB緩沖液，或pH9～10的10～50mMNaOH-Gly緩沖液平衡離子交換柱，將濃縮后的上清調(diào)節(jié)pH為8～10后直接上樣，并以上述相應(yīng)平衡液加0.01-0.5N NaCl梯度進行洗脫。收集目標峰。由于發(fā)酵上清中，rhIL-11含量占上清總蛋白比例的80％以上，經(jīng)一步離子交換純化，目標峰中rhIL-11純度已大于95％以上。疏水柱填料為SOURCEISO、Phenyl-、Butyl-、Octyl-基團的填料。將離交目標峰直接補加0.5～1.8N (NH4)2SO4或NaCl后即可上樣，疏水層析平衡液為離子交換平衡液添加上述0.5～1.8N (NH4)2SO4或NaCl，而后以10～50mM PB或Tris緩沖液或水梯度洗脫，收集目標峰。此過程能將核酸、內(nèi)毒素及殘余雜蛋白充分去除，使目標峰中rhIL-11純度達到97～99％。疏水目標峰直接上樣于以5～10mM PB緩沖液平衡的Sephacryl或Superdex分子篩柱脫鹽精制。
以下實例將進一步詳細說明本發(fā)明，但不僅限于這些實例。
實施例一．rhIL-11工程菌的構(gòu)建1．IL-11基因片段的設(shè)計和合成如圖1所示，選用酵母偏愛密碼子改造IL-11的編碼基因，與天然蛋白的編碼基因相比，缺少N端第一個氨基酸脯氨酸殘基(Pro)的密碼子CCT。設(shè)計序列中第1-3位CCG為酶切位點保護；第4-15位為酵母α因子信號肽編碼基因的3’端序列，其中第4-9位為XhoⅠ酶切位點；第16-635位為改造的IL-11編碼基因序列；第537-540位為翻譯終止密碼子；第541-546位為EcoRⅠ的酶切位點。第547位為酶切保護位點。
為合成需要，以第268位AflⅢ酶切位點為中心，將IL-11設(shè)計序列分為11a，11b兩段。從11a片段再設(shè)計合成11a1，11a2，11a3，11a4，11a5，11a6六個寡核苷酸片段。從11b片段設(shè)計合成11b1，11b2，11b3，11b4，11b5，11b6六個寡核苷酸片段。具體序列見圖2。
合成片段拼接見圖3。以11a片段為例，將寡核苷酸片段11a3、11a4等mol比混合退火，PCR延伸并擴增合成11a34片段；再以11a34為模板，11a2、11a5為引物，第二次PCR擴增合成11a2345片段；最后以11a2345為模板，11a1、11a6為引物，第三次PCR擴增合成11a片段。同法合成11b片段。將11a，11b分別以AflⅢ酶切處理后體外連接成完整的IL-11基因。
2．重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建。
將IL-11合成基因以XhoⅠ，EcoRⅠ酶切處理，體外連接到同樣酶切處理的甲醇酵母表達質(zhì)粒pGENYk，構(gòu)建成IL-11重組表達質(zhì)粒pGENYk-11，見圖4、5。表達質(zhì)粒pGENYk為本公司自行構(gòu)建的穿梭型質(zhì)粒，包括以下組成元件E.coli的ColE1復制子；Ampici11in抗性基因；甲醇酵母AOX1基因的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子；酵母α因子信號肽編碼序列；酵母His4基因；E.coli的Kanamycin抗性基因；多克隆位點；其它來源于E.coli和酵母的連接片段。
IL-11合成基因經(jīng)純化回收，以XhoⅠ，EcoRⅠ酶切降解后再純化回收；pGENYk質(zhì)粒同樣以XhoⅠ，EcoRⅠ酶切降解，回收大片段；將回收的IL-11基因片段和載體大片段體外連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒pGENYk-11。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌DH5α(F’)，經(jīng)酶切、PCR、DNA測序等驗證過程，從中篩選一個結(jié)構(gòu)完全正確的轉(zhuǎn)化子C1，擴增并提取C1的重組質(zhì)粒pGENYk-11C1。
將5-10ugpGENYk-11C1質(zhì)粒體外以SalⅠ酶切線性化，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化甲醇酵母受體菌GS115(His4-)。用MD平板篩選His4+轉(zhuǎn)化子，從中篩選多拷貝整合轉(zhuǎn)化子；107個His+轉(zhuǎn)化子細胞分別涂板到含0.5，1，2，4，8或16mg/ml G418的YPD平板，在16mg/ml G418的平板上篩選到4個克隆JYIL1-4。搖瓶表達驗證G418上His4+轉(zhuǎn)化子的表達量JYIL1-4表達的rhIL-11量比為2，4，8mg/mlG418梯度平板上的克隆要高2倍以上；0.5，1mg/ml G418平板上的克隆表達rhIL-11量低于電泳考染檢測量。JYIL1-4克隆再以MM和MD平板驗證轉(zhuǎn)化子表型為His+Mut+。最后，確定JYIL4為生產(chǎn)用原始工程菌。
3．搖瓶表達挑取JYIL4接種于15ml試管1ml BMGY培養(yǎng)基中，30℃、200rpm培養(yǎng)至OD600=1.0。
取0.2ml培養(yǎng)菌液室溫3000g離心5min，去上清，以1ml BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，轉(zhuǎn)移到15ml試管，30℃、200rpm誘導培養(yǎng)48小時。菌液室溫12000g離心5min，取0.5ml上清加0.17ml TCA沉淀液(50％TCA，2mg/ml脫氧膽酸鈉)沉淀蛋白，冰浴15min。4℃，12000rpm離心5min回收沉淀蛋白。沉淀蛋白以20ul SDS-PAGE上樣緩沖液重溶，12％SDS-PAGE電泳驗證rhIL-11表觀分子量為23Kd。以IL-11單克隆抗體(R&D公司)做Western Blot，rhIL-11反應(yīng)陽性，表達量約100ug/ml以上。分別取12，24，48，72小時的表達上清分析，12小時后rhIL-11表達量可檢測，48小時表達達到平臺。
二．高密度發(fā)酵表達IL-11將保存的JYIL4于平板上活化，轉(zhuǎn)接于YPD液體培養(yǎng)基，30℃、300rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=20作為種子液上發(fā)酵罐。
發(fā)酵培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基，配方如下六偏磷酸鈉25g/L，CaSO4·2H2O1.176g/L，K2SO418.2g/L，MgSO47.28g/L，EDTA0.925g/L，甘油40g/L，PTM1 4.35ml/L，(NH4)2SO49g/L，泡敵0.02％。
其中PTM1的配方為CuSO4·5H2O6g/L，NaI0.08g/L，MnSO4·2H2O3g/L，Na2MoO4·2H2O0.2g/L，硼酸0.02g/L，CoCl20.5g/L，ZnCl220g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O65g/L，生物素0.2g/L，硫酸5ml。
發(fā)酵過程采用二步生長法。起始生長以甘油為碳源，溫度30℃，pH5.0，空氣流量為30L/min，溶氧40％，經(jīng)過18-24小時培養(yǎng)，菌濃度達到OD600=100，補甘油約4小時，甘油補液濃度500g/L，補液速度2ml/min，同時設(shè)定pH在4小時內(nèi)降至pH3，補料完畢菌濃度為OD600=160，此為甘油批培養(yǎng)階段。誘導表達階段，甲醇補料至濃度為0.5-5％，溶氧控制為30％，誘導至54小時以上表達到達最高峰，放罐，此時菌濃度OD600≥300，rhIL-11表達量經(jīng)SDS-PAGE分析大于0.5g/L，見圖10。
菌體生長曲線及誘導表達曲線見圖6。
三．rhIL-11的純化制備離心收集發(fā)酵上清，或以30000-50000截留量的超濾膜超濾收集發(fā)酵上清。上清經(jīng)1000-10000截留量的外壓式中空纖維柱超濾濃縮、脫鹽。濃縮上清調(diào)pH7-8后直接上CM陽離子交換柱，以pH7的50mM PB緩沖液平衡柱子，用0.01-0.5N NaCl鹽梯度洗脫，收集目標蛋白峰A，見圖7。
離交目標峰補加1.0-1.8N(NH4)2SO4溶液，上Phenyl FF疏水柱，用pH7的50mM PB緩沖液梯度洗脫，收集疏水目標峰B，見圖8。
疏水峰B過Sephacyl S-200柱脫鹽。平衡液為pH7的20mM PB，收集目標峰C，見圖9，即為精純化的高純度rhIL-11。經(jīng)RP-HPLC、SDS-PAGE分析，純度大于97％，符合藥用標準，見圖10。Western Blot，N端、C端氨基酸分析證明制備的rhIL-11的序列和結(jié)構(gòu)完全正確。
應(yīng)用7TD1、B9-11、T10等測活細胞株測定rhIL-11的體外活性，比活性大于0.5x107AU/mg，與國際對照品一致。
小鼠、猴子等動物實驗進一步證實rhIL-11能特異性促進血小板增殖，其體內(nèi)藥效與國際標準品一致。
權(quán)利要求
1．一種甲醇酵母表達重組人白細胞介素11的生產(chǎn)方法，其特征在于它包括以下步驟首先，人工合成重組人白細胞介素11的編碼基因，融合于酵母表達調(diào)控元件，構(gòu)建甲醇酵母高表達工程菌；然后，甲醇酵母工程菌高密度發(fā)酵表達；最后，采用超濾、離子交換柱層析、疏水柱層析、分子篩柱層析等純化技術(shù)的順序組合，大量純化回收重組人白細胞介素11，使其達到藥用標準。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甲醇酵母表達重組人白細胞介素11的生產(chǎn)方法，其特征在于所說的重組人白細胞介素11甲醇酵母表達工程菌構(gòu)建包括以下步驟首先，人工合成優(yōu)化的重組人白細胞介素11編碼基因；然后，構(gòu)建甲醇酵母重組表達質(zhì)粒；最后，表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化甲醇酵母，篩選多拷貝整合的重組轉(zhuǎn)化子，再篩選獲得最高表達的轉(zhuǎn)化子為原始工程菌。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甲醇酵母表達重組人白細胞介素11的生產(chǎn)方法，其特征在于所說的重組人白細胞介素11編碼基因指在人白細胞介素11天然基因序列基礎(chǔ)上，以酵母偏愛密碼子取代原密碼子設(shè)計并人工合成
4．根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種甲醇酵母表達重組人白細胞介素11的生產(chǎn)方法，其特征在于甲醇酵母重組表達質(zhì)粒包括以下元件甲醇酵母表達調(diào)控元件，即乙醇氧化酶1基因的啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子；分泌表達酵母α因子信號肽編碼序列；篩選標記基因，即酵母His4基因、大腸桿菌Kanamycin抗性基因。
5．根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種甲醇酵母表達重組人白細胞介素11的生產(chǎn)方法，其特征在于所指甲醇酵母為GS115(His4-)。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甲醇酵母表達重組人白細胞介素11的生產(chǎn)方法，其特征在于所說的高密度發(fā)酵采用二步生長法，即菌體生長階段，誘導表達階段。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甲醇酵母表達重組人白細胞介素11的生產(chǎn)方法，其特征在于所說的高密度發(fā)酵條件包括培養(yǎng)基、溫度、pH、溶氧濃度、誘導劑濃度，其中培養(yǎng)基是指半合成培養(yǎng)基，溫度為攝氏30度，pH為pH3-6，溶氧濃度是指溶氧15-35％，誘導劑是甲醇，濃度為0.5-5％。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甲醇酵母表達重組人白細胞介素11的生產(chǎn)方法，其特征在于所說的超濾是指截流量為3000-10000道爾頓分子量的中空纖維柱或超濾膜堆。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甲醇酵母表達重組人白細胞介素11的生產(chǎn)方法，其特征在于所說的離子交換柱填料為SP、CM、SOURCE S等陽離子交換介質(zhì)；疏水柱填料為Butyl-、Phenyl-、Octyl-或SOURCE ISO等基團的疏水介質(zhì)；分子篩柱填料為低吸附的Sephacryl或Superdex系列介質(zhì)。
10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甲醇酵母表達重組人白細胞介素11的生產(chǎn)方法，其特征在于所說的離子交換層析平衡液為10-50mM TrisHCl或PB緩沖液，pH為7.0-9.0，洗脫液為平衡液加0.01-0.5N NaCl梯度；疏水層析平衡液為添加0.5-1.8N(NH4)2SO4或NaCl的10-50mM TrisHCl或PB緩沖液，pH為7.0-9.0，洗脫液為10-50mM TrisHCl或PB緩沖液，pH為7.0-9.0，或水；分子篩層析平衡液為5-20mM PB緩沖液，pH6.0-8.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甲醇酵母表達重組人白細胞介素11的生產(chǎn)方法包括以下步驟:首先,人工合成rhIL－11的編碼基因,融合于酵母表達調(diào)控元件,構(gòu)建甲醇酵母高表達工程菌:然后,甲醇酵母工程菌高密度發(fā)酵表達;最后,采用超濾、離子交換柱層析、疏水柱層析、分子篩柱層析等純化技術(shù)的順序組合,大量純化回收rhIL－11,使其達到藥用標準。本發(fā)明可使表達量高達0.5～5g/l,后續(xù)純化工藝簡單,易放大,總收率可大于50%,生產(chǎn)成本低廉。
文檔編號C12N15/09GK1288062SQ99118279
公開日2001年3月21日 申請日期1999年9月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月13日
發(fā)明者裘霽宛, 王同映, 劉國安, 朱化星, 黃巖山, 李輝, 鐘英, 柯傳奎 申請人:杭州九源基因工程有限公司