專利名稱：人血清白蛋白在畢赤酵母中的表達與純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程藥物，具體涉及高表達人血清白蛋白的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)重組細胞的構(gòu)建、表達和高度純化。
人血清白蛋白(Human Semm Albumin,HSA)是血漿中最重要的蛋白質(zhì)成分之一，其含量約占血漿總蛋白的60％，具有維持血液滲透壓和攜帶血液中多種配基(包括脂肪酸、氨基酸、類固醇、金屬離子及藥物)與組織進行交換等生理功能。臨床醫(yī)療中用于手術(shù)輸血和危重病人補液，治療創(chuàng)傷燒傷休克、發(fā)燒、水腫和大出血，又能增強人體抵抗能力，是重要的臨床藥物。但由于人血來源有限，又因愛滋病及肝炎的蔓延及檢測與技術(shù)的原因，對HSA藥物的制備提出了更高的要求，如何用基因重組細胞制備HSA取代人血源HSA，阻止愛滋病、肝炎病毒的傳染成為眾所矚目的研究方向。
八十年代以來，國際上許多公司嘗試通過基因工程開發(fā)HSA，HSA基因已被引入細菌、酵母、放線菌、植物以及動物進行表達。(Goodey,A.R.,TIBTECH 1993,8(11):430-433)大腸桿菌表達HSA的量為細胞蛋白的7％，但大分子HSA含有大量二硫鍵，使體外折疊極難完成，未能得到有生物功能的蛋白，細菌細胞壁脂多糖造成熱源反應，結(jié)果不很理想。HSA在面包酵母和工業(yè)酵母中的表達量為1％細胞總蛋白，為胞內(nèi)表達，雖無熱源物質(zhì)，但LAL(LinulusAmoebocyte Lysate)檢驗不合格。在眾多努力中發(fā)現(xiàn)HSA基因在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的表達為細胞外分泌型，人們在努力尋求高效表達及高度純化[Prevatt,W.D.et al.,1994 US Pat.5330901Ohmura,T.et.al.,1995,US Pat.5440018 Ohda,T.et.al.,1997 USPat.5612197 Sreekrishna,K.et.al.1998,US Pat.5707828]鑒于HSA需求量極大，純度要求極高，更高表達量的重組細胞的構(gòu)建和高效、簡單、大規(guī)模易工業(yè)化的純化工藝極為必要。
本發(fā)明的目的在于克服上述不足，運用所構(gòu)建的巴斯德畢赤酵母重組細胞進行高水平的外分泌表達HSA。運用所建立的高效分離純化工藝獲得高純度的HSA。
本發(fā)明所用材料及來源DNA合成試劑盒、Klenow片段多聚酶和所有使用的內(nèi)切酶均為G1BCO BRL公司產(chǎn)品。pPIC9、Pichia pastoris GS115(his4 Mut+)為Invitrogen公司產(chǎn)品，DNA序列測定試劑盒和Trizol RNA抽提試劑盒購自Promega公司，YNB(W/O amino acid)購自DIFCO公司。
本發(fā)明提供了一種高表達人血清白蛋白的巴斯德畢赤酵母重組細胞的構(gòu)建、表達和高效純化方法，該方法包括下列步驟一、中國人血清白蛋白cDNA的獲得1、人肝白細胞總RNA的抽提按照Trizol RNA抽提試劑盒推薦方法，從中國人胚肝細胞中抽提總RNA；2、pre-HSA cDNA合成和PCR體外擴增根據(jù)已知天然HSA基因5’和3’端序列，設計引物引物1:5’CGGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGC 3’引物2:5’CGGGATCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC 3’以抽取的人肝白細胞總RNA為模板，按照DNA合成試劑盒推薦的方法，通過引物1和引物2反轉(zhuǎn)錄合成人血清白蛋白pre-HSAcDNA。
3、PCR合成pre-HSA cDNA的序列驗證按照klenow聚合酶推薦使用方法，將回收的PCR產(chǎn)物用klenow片段聚合酶補平。酚/氯仿回收補平產(chǎn)物。將補平的PCR產(chǎn)物與Smal酶切的PUC19載體平端連接，所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，所得質(zhì)粒DNA用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切初步鑒定出重組質(zhì)粒PUC19-HSA。然后使用PUC19載體上引物-W40和W1，測定pre-HSA兩端序列。再根據(jù)已知正確序列設計引物測定剩余部分序列，最后得到一個序列與天然HSA基因基本一致的克隆。序列的部分核苷酸有改變，但氨基酸序列與天然HSA完全一致。pre-HSA核酸及蛋白序列見

圖1(pre-HSA核酸及蛋白序列)。
4、所構(gòu)建基因5’端含一BamHⅠ位點，BamHⅠ位點與ATG之間含一Kozak序列5’-CCACC-3’，見圖2(構(gòu)建pre-HSA cDNA 5’端Kozak序列)。3’端緊接終止密碼子含一EcoRⅠ位點，參見圖3(構(gòu)建pre-HSA cDNA 3’端序列)。二、HSA在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的表達1、重組表達質(zhì)粒pPKQ-HSA的構(gòu)建將PUC19-HSA克隆載體中pre-HSA基因片段用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切下，1％瓊脂糖電泳分離，并用酚/氯仿回收。將約2Kb的pre-HSA基因回收片段，與用相同酶切的pPIC3.5K表達載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒DNA用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定出重組質(zhì)粒pPKQ-HSA。
2、表達質(zhì)粒pPIC9-HSA和pPIC9k-HSA的構(gòu)建設計引物35’CGCTCGAAAAGGGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAA 3’用引物3和引物1從PUC19-HSA上PCR擴增HSA cDNA片段，酚/氯仿抽提PCR產(chǎn)物后，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切回收。再與用相同酶切的pPIC9質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細胞。涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切初步鑒定重組質(zhì)粒pPIC9-HSA，取4個經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切初步鑒定的重組克隆，制備高純度質(zhì)粒DNA，采用5’AOX1 primer和3’AOX1 primer(Invitrogen)，測定重組質(zhì)粒HSA cDNA兩端序列。結(jié)果有三個含完全正確的閱讀框。經(jīng)測序驗證的pPIC9-HSA質(zhì)粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切并回收含HSA基因片段，與用相同酶切的pPIC9k質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，所得質(zhì)粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定得重組質(zhì)粒pPIC9k-HSA。
3、重組質(zhì)粒pPKQ-HSA轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞GS115(his4Mut+)畢赤酵母表達載體pPKQ-HSA和pPIC9k-HSA分別由pPIC3.5K和pPIC9K衍生而來，內(nèi)含G418抗性基因，為多基因拷貝載體，可以在同一酵母細胞中整合多個基因拷貝，從而提高蛋白的表達量。同一轉(zhuǎn)化細胞中整合基因的拷貝數(shù)與轉(zhuǎn)化細胞對G418的抗性成比例。因此可以通過G418抗性篩選出不同基因拷貝數(shù)的重組細胞，獲得高表達的重組菌株。將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pPKQ-HSA和pPIC9k-HSA用SalⅠ或BglⅡ酶切線性化。同時將空載pPIC3.5k和pPIC9k質(zhì)粒相同酶切線性化，酚/氯仿抽提回收并溶解于無菌水中。按照Invitrogen,Pichia Expression Kit Instruction Manual(Version E)方法電轉(zhuǎn)化GS115細胞，涂布含不同濃度G418的YPD平板，獲得不同G418抗性的陽性克隆，經(jīng)MD平板驗證his+表型獲得GS115/HSA重組克隆S1B119。
4、重組克隆Pichia pastoris GS115/HSA-S1B119株細胞的表達將篩選出的GS115/HSA重組細胞接種3ml YPD試管，30℃300rpm培養(yǎng)過夜，再以0.2％～0.5％接種量接種50ml BMGY,30℃,300rpm培養(yǎng)至OD600 4～7。離心收集菌體懸于15ml含甲醇的BMMY培養(yǎng)液中，置20-30℃搖床誘導培養(yǎng)，每24hr加甲醇至0.5ml/L。定時取樣，經(jīng)4℃離心，上清加入PMSF至1mM,-20℃凍存。20ml上清液經(jīng)10％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，結(jié)果顯示分子量67KDa部位有明顯條帶，如圖4．(SDS-PAGE分析HSA的表達)。(Ⅰ:24hr發(fā)酵液，Ⅱ:48hr發(fā)酵液，Ⅲ:LMW蛋白標準)Westen-blot分析證明其抗HSA抗體的免疫活性。火箭電泳測定上清液中HSA含量，如圖5．(火箭電泳測定HSA含量)(Ⅰ標準HSA＜500ug/ml,Ⅱ標準HSA300ug/ml,Ⅲ標準HSA100ug/ml,Ⅳ標準HSA50ug/ml,Ⅴ-Ⅶ:48hr發(fā)酵液)。HSA分泌曲線如圖6．(低密度誘導HSA分泌曲線)。誘導2天發(fā)酵液中HSA含量可達約140mg/L。通過改變BMMY中誘導的菌體濃度，發(fā)現(xiàn)隨菌體濃度的增加，HSA分泌量幾乎線性地增加(圖7．菌體濃度對HSA誘導的影響)。表明經(jīng)過自動發(fā)酵罐中高密度誘導可獲更高表達量。三、表達HSA的分離純化HSA的分離純化已有較多報道，但大多較為繁瑣[U.S.Pat.5440018,US Pat.5369020]。我們發(fā)現(xiàn)重組巴斯德畢赤酵母細胞所表達的產(chǎn)物溶液中雜質(zhì)較少，主要為一些毒素和色素。本發(fā)明主要采用膜分離技術(shù)，親和層析技術(shù)結(jié)合其他方法除去雜質(zhì)以高產(chǎn)率地獲得高純度HSA。
HSA分離純化流程1、中空纖維柱2L低密度誘導發(fā)酵液除去細胞后，用截留分子量10KDa-50KDa的中空纖維柱除去低于50KDa的雜質(zhì)并使?jié)饪s到0.2L濃縮液。HSA收率≥95％；2、脫色濃縮發(fā)酵液經(jīng)50℃保溫后，加入3％活性炭或732等脫色樹脂處理10分鐘后離心除去，得脫色濃縮液；3、疏水柱分離濃縮發(fā)酵液或脫色濃縮液中加入固體(NH4)2SO4直至達20％終濃度，并流過20％(NH4)2SO4平衡的Phenyl-Sepharose柱，上樣后用平衡液洗滌至流出液OD280＜0.01，再改用水洗脫。收集用水洗脫的HSA蛋白，收率≥95％；4、親和層析除去雜蛋白(1)無HSA發(fā)酵液抗血清-Sepharose的制備由1、所得濃縮發(fā)酵液流經(jīng)抗HSA抗體-Sepharose以除去HSA。流出液為無HSA發(fā)酵液，按發(fā)明人論文[徐俊等，生物工程學報1993,9(1)69-73]方法將無HSA發(fā)酵液制得的抗血清通過醛基結(jié)合于Sepharose上；(2)將疏水層析純化得到的水洗脫峰通過“無HSA發(fā)酵液的抗血清”親和柱，直接流過的蛋白峰即為HSA，回收率≥98％；5、超濾脫鹽將親和層析流出蛋白峰經(jīng)截留分子量10KDa中空纖維或超濾膜組件中脫鹽。可得純度≥99％的HSA，回收率≥98％；6、真空冷凍干燥脫鹽后的HSA溶液真空冷凍干燥得到HSA樣品。
按本發(fā)明方法制得的HSA經(jīng)10％SDS-PAGE凝膠電泳，銀染顯色掃描分析表明，純度高于99％，并且驗證不含色素，見圖8．(SDS-PAGE分析純化的HSA)。
本發(fā)明的另一目的是提供了一種用于上述方法的菌株GS115/HSA-SIB119，該菌種屬巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris，已于1998年5月5日藏于“中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心”，保藏編號為CGMCC No 0349。
實施例1 pre-HSA cDNA的獲得取2克人胚肝細胞，按照Trizol RNA抽提試劑盒推薦方法，從人胚肝細胞中抽提總RNA。根據(jù)已知天然HSA基因5’和3’端序列，設計引物(Primer)如下引物1:5’CGGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGC 3’引物2:5’CGGGATCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC 3’以抽提的人胚肝細胞總RNA為模板，PCR反轉(zhuǎn)錄合成人血清白蛋白pre-HSA cDNA。PCR反應體系參照文獻(Scharf S.J.,In PCRprotocol:A Guide to Method and Application,2nd ed.New York,Academic Press,USA 1990)進行。反應條件為94℃變性45秒，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分30秒，共40個循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳初步確證后，酚/氯仿抽提回收。得5’端為BamHⅠ,3’端為EcoRⅠ的PCR產(chǎn)物。
按照klenow多聚酶推薦使用方法，將回收的PCR產(chǎn)物用klenow片段聚合酶補平。酚/氯仿回收補平產(chǎn)物。將補平的PCR產(chǎn)物與SmaⅠ酶切的PUC19載體平端連接，連接反應體系如下PUC19(SmaⅠ切) 1ul5×連接緩沖液 3ulT4 DNA連接酶(1u/ul)1.5ulSmaⅠ(1u/ul) 0.5ulPCR補平產(chǎn)物5ulH2O 4ul以上混合物21℃連接5小時。所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒DNA用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切初步鑒定出重組質(zhì)粒PUC19-HSA。
實施例2表達質(zhì)粒pPKQ-HSA的構(gòu)建將PUC19-HSA克隆載體中pre-HSA基因片段用BamHⅠ和EccRⅠ雙酶切下，1％瓊脂糖電泳，酚/氯仿回收約2Kb的pre-HSA基因片段?；厥掌闻c用相同酶切的pPIC3.5K表達載體連接，連接反應如下pPIC3.5K(BamHⅠ,EcoRⅠ切)1ul5×連接緩沖液3ulT4 DNA連接酶(1u/ul) 1.5ulpre-HSA 3ulH2O 6.5ul以上混合物21℃連接5小時。所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒DNA用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定得重組質(zhì)粒pPKQ-HSA。
實施例3表達質(zhì)粒pPIC9K-HSA的構(gòu)建設計引物如下引物3:5’CGCTCGAGAAAAGGGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAA 3’用引物3和引物1(見實施例1)從PUC19-HSA上PCR擴增HSA cDNA片段，擴增條件如同實例1。酚/氯仿抽提回收PCR產(chǎn)物，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切回收，與相同酶切的pPIC9質(zhì)粒連接，連接條件同實例2。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切初步鑒定重組質(zhì)粒pPIC9-HSA。
取4個經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切初步鑒定的重組克隆。堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，采用5’AOX1 primer和3’AOX1 primer(Invitrogen)，測定重組質(zhì)粒HSA cDNA兩端序列。測序方法按照Promega測序試劑盒推薦方法。結(jié)果有三個含完全正確的閱讀框。將測序驗證的pPIC9-HSA質(zhì)粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切并回收含HSA基因片段，與用相同酶切的pPIC9K質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定得重組質(zhì)粒pPIC9K-HSA。
實施例4表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pPKQ-HSA和pPIC9K-HSA分別用SalⅠ或BglⅡ酶切線性化，同時將空載pPIC3.5K和pPIC9K質(zhì)粒相同酶切線性化。酚/氯仿抽提回收并溶解于無菌水中。按Invitrogen手冊介紹的方法(Invitrogen,Pichia Expression Kit InstructionManual<Version E>)制備GS115電轉(zhuǎn)化細胞。將上述約5ug線性化DNA分別與80ul GS115電轉(zhuǎn)化細胞混合，采用Bio-Rad電轉(zhuǎn)化儀電擊轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化條件為電壓1500V，電容25uF，電阻200Ω。電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)移到一無菌微量離心管中，立即加入0.50ml℃預冷1mol/L山梨醇，30℃靜置一小時，加入0.5mlYPD(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)后30℃保溫過夜。第二天快速離心去除上清，加入300ul無菌水懸浮菌體。各取100ul涂布含不同濃度G418的YPD平板(含G418各0.5mg/ml,1.0mg/ml,1.5mg/ml),30℃3～4天后將陽性克隆點接MD平板驗證his+表型，30℃2天后的陽性克隆即為Pichia pastoris GS115/HSA重組克隆，其中含G418濃度高的YPD平板上的陽性克隆整合入HSA基因的拷貝數(shù)也高。
實施例5 HSA在畢赤酵母中的表達將篩選出的GS115/HSA重組克隆S1B119細胞接種3ml YPD試管，30℃300r/min搖床中培養(yǎng)過夜，以0.2％接種量加入含50ml BMGY(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，0.1M磷酸鉀緩沖液pH6.0，13.4g/L YNB,4×10-4g/L生物素，10g/L甘油)的250ml培養(yǎng)瓶中。30℃300rpm培養(yǎng)至OD600為4～5。常溫5000rpm離心4min。收集的菌體用15ml BMMY(將BMGY中10g/L甘油改變?yōu)?ml/L甲醇)懸浮后轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶，28℃300rpm開始誘導。每24小時補加甲醇到5ml/L。并在12、24、36、48、96小時取樣。4℃15000rpm離心10min后，上清立即加入PMSF至1mM，放-20℃凍存。
實施例6表達HSA的分離純化1、抗HSA抗血清的獲得用1mg/ml的HSA(Sigma)與福氏完全佐劑乳化劑皮下多點注射免疫成熟雄兔。以后每3周用1mg/ml的HSA與福氏不完全佐劑乳化劑加強免疫。共3次加強免疫后采血，分離上清并用38％飽和度硫酸銨沉淀抗學清。
2、抗HSA-Sepharose 4B親和柱制備按文獻(徐俊，祁俊，袁中一。生物工程學報，1993,9(1):69-73)制備醛基-Sepharose4B載體。將獲得的兔抗HSA抗血清用0.1mol/L pH7.5的磷酸緩沖液透析后，用透析液稀釋到約10OD280/ml。在40g抽干的醛基-Sepharose 4B載體中加入80ml抗HSA抗血清中，置4℃冰箱攪拌過夜。凝膠用0.5mol/L NaCl洗滌3次后抽干，抗HSA-Sepharose再置于160ml含3.1mg/ml氰基硼氫化鈉的1mol/L pH7.4 Tris-HCl緩沖液中，室溫反應一小時。然后用大量水洗去未反應的氰基硼氫化鈉。所得免疫吸附劑抽干浸泡于0.02mol/L pH7.2磷酸緩沖液(含0.9％氯化鈉)備用。
3、表達rHSA的火箭電泳測定方法以2％含兔抗HSA抗血清的瓊脂糖形成電泳凝膠，點樣不同濃度標準HSA樣品(50-500ug/ml)和待測樣品各5ul,120V電泳2-3小時至沉淀峰明顯。測量沉淀峰的高度。用標準樣品峰高與HSA對應濃度關(guān)系制作標準曲線。根據(jù)標準曲線求算待測樣品的HSA含量。
4、中空纖維柱濃縮將2L誘導發(fā)酵液用孔徑(MWCO)50000道爾頓的中空纖維柱濃縮到0.2L。Folin-酚法和火箭電泳測量前后總蛋白及HSA含量，結(jié)果經(jīng)由中空纖維柱處理，可有效濃縮發(fā)酵液，HSA含量為1.33mg/ml?；厥章省?5％。
5、脫色100ml濃縮發(fā)酵液加熱至50℃后攪拌下添加3.0克活性炭。繼續(xù)攪拌10分鐘。過濾除去活性炭，得到除去色澤的濃縮液。
6、Phenyl-Sepharose疏水柱分離中空纖維柱濃縮液100ml中加入固體硫酸銨到20％終濃度。HSA/(NH4)2SO4溶液流入硫酸銨平衡的Phenyl-Sepharose柱，上樣后用2倍體積平衡液洗脫，流出液中不再有蛋白時改用雙蒸水洗脫，收集用雙蒸水洗脫HSA。含量分析表明，經(jīng)Phenyl-Sepharose處理HSA純化近10倍，回收率超過90％。
7、免疫親和層析純化疏水層析純化HSA峰20ml對0.01mol/L、pH7.2磷酸緩沖液(含0.9％氯化鈉)透析。無HSA發(fā)酵液的抗體-Sepharose 4B親和柱依序以0.1mol/L pH2.6的Gly-HCl緩沖液-3mol/L硫氰酸鉀、0.01mol/L pH7.2的磷酸緩沖液-0.9％氯化鈉洗滌。上述透析平衡的HSA溶液(約25ml)進入HSA親和柱，用透析液洗滌出單一HSA峰。此HSA溶液SDS-PAGE電泳中銀染呈現(xiàn)一條帶。親和柱先后用0.1mol/L pH2.6Gly-HCl緩沖液-3mol/L硫氰酸鉀、0.01mol/L pH7.2磷酸緩沖液-0.9％氯化鈉洗滌再生。HSA回收率98％8、超濾脫鹽親和層析漏出蛋白峰(約30ml)經(jīng)MWCO為10000道爾噸的小型超濾器脫鹽。HSA回收率≥95％。
9、真空冷凍干燥將脫鹽后的HSA溶液真空冷凍干燥得到HSA樣品。
權(quán)利要求
1.一種高表達人血清白蛋白的巴斯德畢赤酵母重組細胞的構(gòu)建表達和純化方法，其特征在于該方法包括下列步驟一、人血清白蛋白cDNA的獲得(1)人胚肝細胞總RNA的抽提按照Trizol RNA抽提試劑盒推薦方法，從中國人胚肝細胞中抽提總RNA；(2)pre-HSA cDNA合成和PCR體外擴增根據(jù)已知天然HSA基因5’和3’端序列，設計引物引物1:5’CGGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGC 3’引物2:5’CGGGATCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC 3’以抽取的人肝白細胞總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成人血清白蛋白pre-HSA cDNA，(3)所構(gòu)建的基因5’端BamH1位點與ATG之間插入了一段Kozak序列5’CCACC3’,3’端緊接基因的終止密碼含一EcoR1a位點。二、HSA在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的表達(1)重組表達質(zhì)粒pPKQ-HSA的構(gòu)建將PUC19-HSA克隆載體中pre-HSA基因片段用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切下，1％瓊脂糖電泳分離，并用酚/氯仿回收。將約2Kb的pre-HSA基因回收片段與用相同酶切的pPIC3.5K表達載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒DNA用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定出重組質(zhì)粒pPKQ-HSA。(2)表達質(zhì)粒pPIC9-HSA和pPIC9k-HSA的構(gòu)建設計引物引物35’CGCTCGAAAAGGGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAA 3’用引物3和引物1從PUC19-HSA上PCR擴增HSA cDNA片段，酚/氯仿抽提PCR產(chǎn)物后，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切回收。再與用相同酶切的pPIC9質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細胞。涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切初步鑒定重組質(zhì)粒pPIC9-HSA，取4個經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切初步鑒定的重組克隆，制備高純度質(zhì)粒DNA，采用5’AOX1 primer和3’AOX1 primer(Invitrogen)，測定重組質(zhì)粒HSA cDNA兩端序列。結(jié)果有三個含完全正確的閱讀框。經(jīng)測序驗證的pPIC9-HSA質(zhì)粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切并回收含HSA基因片段，與相同酶切的pPIC9-HSA質(zhì)粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切并回收含HSA基因片段，與用相同酶切的pPIC9k質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，所得質(zhì)粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定得重組質(zhì)粒pPIC9k-HSA。(3)重組質(zhì)粒pPKQ-HSA轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞GS115(his4Mut+)將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pPKQ-HSA和pPIC9k-HSA用SalⅠ或BglⅡ酶切線性化。同時將空載pPIC3.5k和pPIC9k質(zhì)粒相同酶切線性化，酚/氯仿抽提回收并溶解于無菌水中。按照Invitrogen,PichiaExpression Kit Instruction Manual(Version E)方法電轉(zhuǎn)化GS115細胞，涂布含不同濃度G418的YPD平板，獲得不同G418抗性的陽性克隆，經(jīng)MD平板驗證his+表型獲得GS115/HSA重組克隆S1B119。(4)重組克隆pichia pastoris GS115/HSA S1B119株細胞的表達將篩選出的GS115/HSA重組細胞接種3ml YPD試管，30℃300rpm培養(yǎng)過夜，再以0.2％～0.5％接種量接種50ml BMGY,30℃、300rpm培養(yǎng)至OD6004～7。離心收集菌體懸于15ml含甲醇的BMMY培養(yǎng)液中，置20-30℃搖床誘導培養(yǎng)，每24hr加甲醇到0.5ml/L。定時取樣，經(jīng)4℃離心，上清加入PMSF至1mM,-20℃凍存；三、表達HSA的分離純化(1)中空纖維柱將2L低密度誘導發(fā)酵液除細胞后用截留分子量10KDa-50KDa的中空纖維柱除去低于50KDa的雜質(zhì)并使?jié)饪s到0.2L濃縮液。HSA收率為95％；(2)脫色濃縮發(fā)酵液經(jīng)50℃保溫后，加入3％活性炭或732等脫色樹脂處理10分鐘后離心除去，得脫色濃縮液；(3)pharose疏水柱分離濃縮發(fā)酵液或脫色濃縮液中加入固體(NH4)2SO4至20％并流過(NH4)2SO4平衡的Phenyl-Sepharose柱，上樣后用平衡液洗滌至流出液OD280＜0.01后改用水洗脫，收集用水洗脫的HSA蛋白，收率為95％；(4)親和層析除雜蛋白①無HSA發(fā)酵液抗血清-Sepharose制備由1所得濃縮發(fā)酵流經(jīng)抗HSA抗體-Sepharose除去HSA。流出液為無HSA發(fā)酵液，按發(fā)明人論文[徐俊等，生物工程學報1993,9(1)69-73]方法將無HSA發(fā)酵液制得的抗血清，通過醛基結(jié)合于Sepharose；②疏水層析純化得到的水洗脫峰通過“無HSA發(fā)酵液的抗血清”親和柱，收集未吸附的蛋白峰為HSA，回收率≥98％；(5)超濾脫鹽將親和層析漏出蛋白峰經(jīng)截留分子量10KDa中空纖維或超濾膜組件中脫鹽?？傻眉兌取?9％的HSA，回收率≥98％；(6)真空冷凍干燥將脫鹽后的HSA溶液真空冷凍干燥得到HSA樣品。
2.一種用于權(quán)利要求1所述方法的菌種CGMCC No 0349。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人血清白蛋白在畢赤氏酵母(Pichia pastors)中的表達與純化方法。本發(fā)明的方法特征在于重組表達質(zhì)粒pPKQ－HSA的構(gòu)建和表達HSA的高效分離純化。用該方法獲得的樣品純度高于99%。
文檔編號C12N1/19GK1235981SQ9811084
公開日1999年11月24日 申請日期1998年5月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月15日
發(fā)明者袁中一, 邱榮德, 吳祥甫, 李士云, 夏其昌, 儲瑞藹 申請人:中國科學院上海生物化學研究所, 上海第一生化藥業(yè)公司