專利名稱：一種使用分子伴侶促進蛋白質(zhì)分泌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總地涉及利用分子伴侶與所需蛋白質(zhì)在原核生物體中的共表達，以生產(chǎn)可溶性的所需蛋白質(zhì)的方法。具體地說，本發(fā)明涉及使用可在原核生物體中分泌表達所需蛋白質(zhì)的新的重組表達載體，攜帶所說的新的重組表達載體的細菌細胞，以及利用分子伴侶與目的蛋白質(zhì)的共表達，以分泌表達形式生產(chǎn)可溶性所需蛋白質(zhì)的方法。
近年來，已對分子伴侶的作用進行了深入的研究，并已發(fā)現(xiàn)其參予不同種生物體的許多共有生物學(xué)功能，例如形成和維持蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的跨膜運送、調(diào)節(jié)細胞生長分化和生長周期以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能等(Ellis,R.J.et al,Molecular Chaperons,Annu.Rev.Biochem.,60:321-347,1991)。
生物體的大多數(shù)分泌蛋白質(zhì)，包括內(nèi)膜蛋白、外膜蛋白和周質(zhì)空間內(nèi)的蛋白質(zhì)，以及分泌到細胞外環(huán)境中的蛋白質(zhì)的N端和C端都有起分泌信號作用的特定結(jié)構(gòu)，例如分泌蛋白質(zhì)的N端都帶有長度約20至30個氨基酸信號肽序列。信號肽序列的氨基端通常為帶正電荷的氨基酸，參與前體分子與質(zhì)膜的結(jié)合。其后為高度疏水的、有高度形成α螺旋趨勢的(特別是在接近去污劑或脂質(zhì)分子的條件下)非極性氨基酸。信號肽序列的這些和其他一些結(jié)構(gòu)特征，不僅直接影響前體分子的跨膜分泌和其正確切割，而且可能有助于成熟蛋白質(zhì)的適當(dāng)構(gòu)象。另一方面，成熟的蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)對其后胞外分泌也有著重要影響(得永正雄，菱沼文男。蛋白質(zhì)核酸酵素，1992；37(3):223)。這些蛋白質(zhì)被分泌到細胞外，須借助某因子和/或酶的作用維持其特定的適于透膜分泌的構(gòu)象。
近年來的研究表明，大腸桿菌中一些與菌體中蛋白質(zhì)的分泌密切相關(guān)的分泌因子(Schatz,P.J.et al.,Annu.Rev.Genet.24:215-248,1990；Hajime Tokuda 1993，蛋白質(zhì)核酸酵素，38:947-956)，這些分泌因子與信號肽酶及其他一些已知和未知的因子相互作用，參予細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穿膜轉(zhuǎn)運和加工過程。在已確定的至少七種Sec基因中，SecB作為其家族的一個成員，在蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。
SecB是以四聚體形式存在于胞漿中，由155個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，是一種分子伴侶(Kumamoto C.A.et al.,Mol.Microbiol.,5:19-22,1991)。其可與大多數(shù)在核糖體上合成的分泌型蛋白質(zhì)結(jié)合，使之維持其松散折疊的、適于跨膜轉(zhuǎn)運的活性構(gòu)象。當(dāng)前體蛋白質(zhì)在SecB幫助下被運送到內(nèi)膜后，即與具有ATP酶結(jié)構(gòu)特征的另一個家族成員即SecA結(jié)合，并且在SecA及其他一些相關(guān)因子的幫助下完成分子的跨膜分泌過程。
在Sec家族的成員中，SecB是存在于大腸桿菌胞漿內(nèi)的唯一可溶性的，并帶有許多負電荷的分泌因子(Kumamoto C.A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:5320-5324,1989；Watanabe M.et al.,Cell,58:695-705,1989)。SecB在分泌型前體蛋白質(zhì)的肽鏈折疊過程中通過分子骨架間的β片層結(jié)構(gòu)與之相互作用(Breukink E.et al.,Eur.J.Biochem.,208:419-425,1992)。一般認為SecB分子與蛋白質(zhì)前體分子的結(jié)合部位存在著一個β片層核心，兩側(cè)則是各自的α螺旋結(jié)構(gòu)(Spurlino,J.C.,et al.,J.Biol.Chem.,266:5202-5219,1991)。
因為細菌細胞易于生長和操作，所以在基因工程領(lǐng)域中，為了以大批量和高回收率生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)，常常使用細菌細胞作為宿主。然而，在細菌細胞中，大多數(shù)外源蛋白質(zhì)都是以不溶性的和無活性的包涵體形式表達的。另外，在使用可在細菌細胞內(nèi)發(fā)揮功能的外源啟動子的情況下，被表達的蛋白質(zhì)一般都是不溶性和無活性形式的。因此，人們一直在試圖尋找改善已合成之蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運，以可溶性形式制取所需蛋白質(zhì)的途徑。利用目的蛋白質(zhì)與分子伴侶如SecB蛋白的共表達是實現(xiàn)這一目的的可能途徑之一。本發(fā)明人在以前的研究工作中發(fā)現(xiàn)，由于受細菌細胞固有SecB蛋白的含量等因素的限制，已在核糖體上大量合成的外源蛋白質(zhì)常常被積聚在細胞內(nèi)，發(fā)生前體分子的無規(guī)折疊，造成分子間聚集，致使這些前體分子不能與各種相關(guān)分子伴侶特別是SecB蛋白結(jié)合，而喪失跨膜轉(zhuǎn)送能力。本發(fā)明人在其長期的研究實踐中發(fā)現(xiàn)并進一步證實SecB蛋白的結(jié)合位點與許多待分泌的前體蛋白質(zhì)帶凈正電荷區(qū)域有較高的親和性，因此推測有可能設(shè)計并構(gòu)建包含分泌信號肽編碼序列和待表達之結(jié)構(gòu)基因序列的融合基因，試圖通過控制所得融合基因與SecB基因的同步表達來提高外源蛋白質(zhì)的分泌效率。結(jié)果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在使用適當(dāng)合成的啟動子，例如大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動子的情況下，利用本發(fā)明的共表達系統(tǒng)，成功地實現(xiàn)了高分泌效率表達所需蛋白質(zhì)的目的，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供用于在原核細胞中表達所需蛋白質(zhì)的重組表達載體，其中所說的表達載體包含可操作地連接編碼分子伴侶的基因至第一啟動子后的位點。
根據(jù)本發(fā)明的表達載體，其中在編碼分子伴侶的DNA序列的下游有一個可操作地連接編碼所需蛋白質(zhì)之基因序列至含第二啟動子的信號肽DNA序列。
根據(jù)本發(fā)明的表達載體，其中所說的編碼分子伴侶的基因是大腸桿菌SecB基因。
根據(jù)本發(fā)明的表達載體，其中所說的第一和/或第二啟動子是大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動子，且第一和第二啟動子是相同的或是不同的。
根據(jù)本發(fā)明的表達載體，其中所說的編碼所需蛋白質(zhì)的基因是從天然來源篩選得到的野生型基因、篩選后經(jīng)過改造的突變基因或化學(xué)合成的基因。
本發(fā)明的另一個目的是提供用上述表達載體轉(zhuǎn)化的用于表達所需外源蛋白質(zhì)的原核細胞。
根據(jù)本發(fā)明的原核細胞，所說的原核細胞是大腸桿菌細胞。
本發(fā)明的再一個目的是提供利用原核細胞宿主以可溶性形式分泌表達所需蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(1)得到編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列；(2)將步驟(1)的編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列可操作地連接到編碼適當(dāng)?shù)陌閭H分子的DNA序列上，得到用于在適當(dāng)啟動子控制下共表達所需蛋白質(zhì)和分子伴侶蛋白質(zhì)的重組表達載體；(3)用步驟(2)的重組表達載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募毦拗骷毎?4)在適于以可溶的分泌形式表達所需蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)步驟(3)的宿主細胞；(5)從培養(yǎng)物中分離出不溶性部分并從可溶性部分中回收所需蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的重組表達載體還包含可操作地連接編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列上的第一啟動子序列和位于其下游的，可操作地連接到編碼分子伴侶的DNA上的第二啟動子序列。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的細菌宿主細胞是大腸桿菌細胞。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的編碼分子伴侶的DNA序列是大腸桿菌SecB基因的DNA序列。
本發(fā)明的再一個目的是提供利用原核細胞以可溶形式分泌表達所需蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(1)得到編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列，并將其可操作地連接到適于在原核宿主中表達所需蛋白質(zhì)的第一表達載體上；(2)得到編碼分子伴侶蛋白的DNA序列，并將其可操作地連接到適于在原核宿主中表達所需蛋白質(zhì)的第二表達載體上；(3)用步驟(1)和(2)的第一和第二重組表達載體共轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)脑怂拗鳎?4)在適于以可溶形式分泌表達所需蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)步驟(3)的宿主細胞；(5)從培養(yǎng)物中分離出不溶性部分并從可溶性部分中回收所需蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案，其中所說的所需蛋白質(zhì)選自包括人在內(nèi)的所有動物、植物和微生物的蛋白質(zhì)和多肽。


圖1顯示從大腸桿菌中克隆得到的SecB的DNA編碼序列。
圖2顯示從人胚肺細胞中克隆得到的人粒細胞、巨噬細胞集落刺激因子的DNA編碼序列。
圖3顯示用于克隆SecB基因的重組載體M13mp19-SecB的構(gòu)建。
圖4顯示用于表達人粒細胞、巨噬細胞集落刺激因子的重組載體pAGMT-8的構(gòu)建。
圖5顯示攜帶用于在大腸桿菌中共表達分泌信號蛋白質(zhì)SecB和人粒細胞、巨噬細胞集落刺激因子的重組載體pAGMST-8的構(gòu)建。
圖6a～6c分別顯示用質(zhì)粒pAGMST-8和對照質(zhì)粒pAGMT-8轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細胞后，不同組份的SDS-PAGE圖譜。
圖7顯示發(fā)酵培養(yǎng)攜帶SecB基因，但該基因上游不帶信號SPphoA序列的工程菌株EGMST-8和不含SecB基因的EGMT-8的溶胞產(chǎn)物所作Northern印跡分析。
本發(fā)明提供了適于在原核宿主中以可溶性分泌蛋白質(zhì)的形式表達所需蛋白質(zhì)的重組表達載體，其中所說的重組表達載體包含表達所需蛋白質(zhì)的第一轉(zhuǎn)錄單位和表達分子伴侶蛋白質(zhì)的第二轉(zhuǎn)錄單位，其中所說的第一轉(zhuǎn)錄單位和第二轉(zhuǎn)錄單位可以以串聯(lián)方式存在于同一個重組表達載體，也可以分別存在于用于共轉(zhuǎn)化同一原核宿主的兩個不同重組表達載體內(nèi)。
如前所述，盡管某些原核細胞，特別是大腸桿菌常常被用于以重組DNA技術(shù)表達許多具有各種各樣生物學(xué)活性和生物學(xué)功能的不同的外源蛋白質(zhì)，但由于這些原核生物體特別是大腸桿菌的固有功能特性所決定，大多數(shù)被表達的蛋白質(zhì)均主要在細胞內(nèi)形成包涵體，并以包涵體的形式存在于細胞內(nèi)，從而給繼后分離和純化所需表達產(chǎn)物的步驟帶來很大困難，難以得到高生物活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明人在以前用重組技術(shù)分泌表達粒細胞、巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的實踐中發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌宿主內(nèi)高表達的GM-CSF蛋白質(zhì)，約80％以上被積聚在細胞內(nèi)，而存在于培養(yǎng)物上清中的表達產(chǎn)物僅10％～20％。為了解決這一問題，對改善目的蛋白質(zhì)之分泌效率的可能性進行了廣泛深入地研究，并構(gòu)建了用于分泌表達的重組載體和相應(yīng)的表達系統(tǒng)。結(jié)果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用我們構(gòu)建的合成的大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動子控制下共表達所需目的蛋白質(zhì)和分子伴侶SecB蛋白的重組表達系統(tǒng)，在搖床培養(yǎng)條件下，可使所需蛋白質(zhì)GM-CSF的分泌表達效率提高約5～6倍，進一步優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)條件可望進一步提高分泌表達效率。
本發(fā)明的重組表達載體包括可操作地連接到第一啟動子上的編碼分子伴侶的DNA序列和一個可插入第二個轉(zhuǎn)錄單位的插入位點。利用所說的插入位點，可很容易地在所說的重組表達載體中插入基本上由編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列和可操作地連接在其上游的第二啟動子組成的第二轉(zhuǎn)錄單位。在第二轉(zhuǎn)錄單位的第二啟動子與編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列之間加入一個另外的前導(dǎo)序列(信號肽序列)，并在所得融合基因的下游加入終止子。
作為啟動子序列，可使用任何一種適于在原核生物中表達所需蛋白質(zhì)和/或分子伴侶的啟動子，例如可使用細菌啟動子和噬菌體啟動子。這些啟動子例如包括但不只限于tac啟動子、lac啟動子、T7啟動子、gal啟動子和堿性磷酸酯酶(phoA)啟動子，但本發(fā)明優(yōu)選的是phoA啟動子。
作為與編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列共表達的分子伴侶基因，本發(fā)明中優(yōu)選的是具有助分泌功能的分子伴侶SecB的基因。SecB是分泌因子Sec家族中唯一的存在于胞內(nèi)的可溶性蛋白。其它分泌因子SecA、SecD、SecE、SecF、SecY等都定位于膜上。SecB可與大多數(shù)蛋白質(zhì)結(jié)合，使其維持特異的松散折疊的，宜于轉(zhuǎn)送的空間構(gòu)象。SecB將結(jié)合的蛋白質(zhì)運送至膜上，與SecA結(jié)合，在其它分泌因子的相互協(xié)助下，完成蛋白質(zhì)的跨膜過程。SecB的結(jié)合位點無需特異氨基酸序列，它結(jié)合于帶正電的并具有β折疊構(gòu)象的區(qū)域，因而能與大多數(shù)蛋白質(zhì)結(jié)合。這也是我們發(fā)明中優(yōu)選分子伴侶SecB作為與所需蛋白質(zhì)共表達的原因。
作為用來構(gòu)建本發(fā)明重組表達載體的起始載體，可使用任何一種能夠在細菌細胞中穩(wěn)定地保留并復(fù)制的載體。這樣的起始載體包括但不只限于pTZ18R、pBR322、pKK223-3、pUC18、pUC19、pUC119等，但本專利優(yōu)選的是多拷貝質(zhì)粒pTZ18R。
作為宿主，可使用任何一種適于在其中以高效率分泌表達所需蛋白質(zhì)和分子伴侶的細菌細胞，特別是大腸桿菌細胞。本發(fā)明優(yōu)選的宿主細胞是堿性磷酸酯酶基因缺失的大腸桿菌YK537。
構(gòu)建本發(fā)明的重組表達載體時，可首先按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如參見J.Sambrook,E.F.Fritsck&T.Manicetis,MolecularCloning,A Laboratory Mannual,Znd ed.,Cold Spring Harbour Press,NY,1989)將啟動子導(dǎo)入起始質(zhì)粒中。然后，將編碼分子伴侶的DNA序列連接到第一啟動子的下游。在使用大腸桿菌堿性磷酸酯酶缺陷型菌株YK537的情況下，最好使用堿性磷酸酯酶啟動子(phoA)作為第一啟動子?？梢赃m當(dāng)調(diào)整第一啟動子序列與分子伴侶基因之間的距離，以獲得最佳表達活性?？梢詮囊阎拇竽c桿菌中分離并克隆已知其序列的分子伴侶序列。本發(fā)明根據(jù)SecB基因序列(465bp)，設(shè)計一對引物，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，從大腸桿菌YK537的染色體DNA中克隆出大腸桿菌SecB基因。
為了提高表達效率，必要時可在分子伴侶的下游加入一個終止子序列，但也可以在設(shè)計并克隆分子伴侶序列時加入適當(dāng)?shù)慕K止信號?？梢园凑找阎姆椒ㄍ瓿煞肿影閭H序列與終止序列間的連接。本發(fā)明中將分子伴侶基因插入在質(zhì)粒例如質(zhì)粒pAE-8或pAET-8(該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌株已于本專利申請之前按布達佩斯條約的規(guī)定保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記號為CGMCC NO.0287)的啟動子序列和終止子序列之間，以構(gòu)建含有彼此串聯(lián)的啟動子序列、分子伴侶基因和終止子序列的重組載體。如果如此得到的分子伴侶表達載體中具有適當(dāng)?shù)倪B接所需蛋白質(zhì)基因的克隆位點，該載體即可作為本發(fā)明的表達載體。如果所構(gòu)建的載體沒有適當(dāng)?shù)目寺∥稽c，則可適當(dāng)修飾序列的末端并加入克隆位點。可使用具有不同的限制性酶切位點的多接頭作為克隆位點。
可以將可操作地連接有第二啟動子的編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列導(dǎo)入上述表達載體的克隆位點中。被導(dǎo)入的與編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列可操作地連接的第二啟動子序列，可以是與上述第一啟動子相同或不同的。本發(fā)明中第一啟動子和第二啟動子兩者均為phoA啟動子。必要時可在第一轉(zhuǎn)錄單位和第二轉(zhuǎn)錄單位之間加入一個適當(dāng)長度的接頭，并可適當(dāng)調(diào)整接頭的長度，以便更有效地表達所需的蛋白質(zhì)。
應(yīng)用已知方法，用表達載體轉(zhuǎn)化宿主菌，例如CaCl2處理法將表達載體轉(zhuǎn)化到細菌細胞。培養(yǎng)并增殖細胞后，根據(jù)抗藥性來選擇被轉(zhuǎn)化的細胞，以得到為本發(fā)明目的所需的，以高產(chǎn)率分泌表達所需蛋白質(zhì)的重組體。在使用大腸桿菌宿主的情況下，最好利用藥物抗性基因作為選擇標志基因，例如可使用氨芐青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因或四環(huán)素抗性基因。
為本發(fā)明的目的，按上述方法制備的轉(zhuǎn)化體不一定包含同時攜帶分子伴侶基因和所需蛋白質(zhì)基因的同一個質(zhì)粒載體。作為一種可替代的方法，可以分別用攜帶第一啟動子和分子伴侶基因的第一個重組載體和攜帶第二啟動子和編碼所需蛋白質(zhì)之外源DNA序列的第二個重組表達載體共轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募毦拗?，以得到本發(fā)明的重組體。相對地，用于共轉(zhuǎn)化的兩個重組載體最好分別帶有其各自不同的藥物抗性選擇標志基因。
可按本領(lǐng)域已知的方法，在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化細胞。培養(yǎng)完成后，例如可通過簡單的離心方法分離培養(yǎng)物上清，并從所得培養(yǎng)物上清中分離和純化所需的蛋白質(zhì)。用于純化和回收所需蛋白質(zhì)的方法包括但不只限于硫酸銨沉淀法、超濾法、離子交換層析法、疏水層析法、凝膠過濾法、親和層析法或這些方法的組合。
可用本發(fā)明的方法以可溶形式分泌表達的蛋白質(zhì)包括但不只限于微生物蛋白質(zhì)、植物蛋白質(zhì)或動物蛋白質(zhì)，或它們的抗體或各種形式的融合蛋白質(zhì)，或這些蛋白質(zhì)的天然或人工變異體。
下列實施例旨在進一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何形式限制本發(fā)明。雖然下列實施例中是以分子伴侶SecB蛋白與目的蛋白質(zhì)GM-CSF的分泌型共表達作為具體實例來舉例描述本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，除利用分子伴侶SecB基因與GM-CSF共表達外，也可依據(jù)本發(fā)明的精神和原則，使用其他有相同或相似功能的分子伴侶，共表達與GM-CSF有相同或相似結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)。因此，在不違背本發(fā)明的基本精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何等同替代、改動或改進都將落入本發(fā)明待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。實施例1分子伴侶SecB基因的制備圖1顯示了SecB基因的核苷酸序列。為了得到用于本發(fā)明的大腸桿菌分子伴侶SecB基因，首先在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基(每升含有10g蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化鈉)中培養(yǎng)大腸桿菌YK537(由日本東京大學(xué)MAKARI YAMASAKI教授提供)，并按已知方法分離染色體DNA。設(shè)計并使用DNA合成儀合成下示序列引物(1)和引物(2)引物(1):5’-GGAATTCATGTCAGAACAAAACAACAC-3’EcoRⅠ引物(2):5’-AACTGCAGTTATCAGGCATCCTGATGTTC-3’PstⅠ以YK537的染色體總DNA作為模板，在Taq聚合酶作用下，利用引物(1)和引物(2)，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴增得到兩端分別帶有EcoRⅠ和PstⅠ酶切位點的長度約480bp的DNA片段。PCR的反應(yīng)條件是94℃反應(yīng)30秒，50℃反應(yīng)60秒，最后在72℃下延伸60秒，共重復(fù)35次循環(huán)后，于72℃下反應(yīng)約600秒以完成PCR擴增。
電泳分離(1％低融點膠)PCR反應(yīng)混合物，從凝膠上切下相當(dāng)于480bp的電泳條帶并回收之。用SmaⅠ，牛小腸堿性磷酸酶(CIP)處理M13mp19，回收大片段后與上述480bp的片段在T4DNA連接酶作用下進行連接(見圖3)，篩選到正向及反向兩種連接產(chǎn)物。從噬菌體的培養(yǎng)上清中抽提單鏈DNA，按已知方法用通用引物測定正向和反向連接片段的核苷酸序列，證明所得產(chǎn)物即為編碼155個氨基酸的SecB蛋白的核苷酸序列。實施例2編碼人粒細胞、巨噬細胞集落刺激因子的cDNA的制備本實施例描述編碼人粒細胞、巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF)的cDNA的制備。
將人胚肺細胞HFL細胞株(購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所)培養(yǎng)在含20％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，待細胞生長至70％單層后，換成含TNF-α(終濃度1000U/ml)的新鮮培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)36小時后收獲細胞，并用硫氰酸胍法(Chomczynskiet al)提取總RNA。
設(shè)計并用DNA合成儀合成下示序列的引物(3)和引物(4)引物(3):5’-GCACCCGCCCGCTCGCCCAG-3’引物(4):5’-AAAGCTTATCACTCCTGGACTGGCTCCC-3’HindⅢ取2μg經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的人胚肺細胞總RNA作為模板，使用上述引物(4)作為反轉(zhuǎn)錄起始引物，于65℃變性處理15分鐘后加入1μlSuper Script(R)反轉(zhuǎn)錄酶。37℃反應(yīng)40分鐘后，升溫至95℃并保持5分鐘以終止反應(yīng)，然后以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用引物(3)和引物(4)進行PCR擴增(94℃30秒，50℃60秒，72℃60秒，重復(fù)35次循環(huán)后，于72℃反應(yīng)約600秒)。
對PCR反應(yīng)混合物進行電泳分離后，得到長度約390bp的擴增產(chǎn)物，按實施例1所述方法克隆該片段，按已知的雙鏈測序法從序列的5’端和3’端雙向測定序列。(圖2)結(jié)果可見，所測得的序列與Wong等人(Science 228:310,1985)報導(dǎo)的hGM-CSF的cDNA序列完全一致。實施例3重組載體pAGMT-8的構(gòu)建本實施例簡要描述攜帶外源GM-CSF編碼序列和分泌表達信號的重組表達載體的構(gòu)建。
使用我們以前構(gòu)建的，攜帶編碼人表皮生長因子(hEGF)的DNA序列的重組質(zhì)粒pAET-8作為本實施例的起始材料。在pAET-8中，在EGF編碼區(qū)的5’上游相繼連接有預(yù)先合成并組裝進來的大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動子序列(phoA)和信號肽序列(SPphoA)。因此，當(dāng)在這些調(diào)控元件的下游導(dǎo)入目的基因并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入適當(dāng)宿主后，即使在不含其他大腸桿菌分泌信號的情況下，其也可有效地分泌表達所需的蛋白質(zhì)。
為了構(gòu)建重組質(zhì)粒pAGMT-8，首先用EcoRⅠ酶切上述質(zhì)粒pAET-8，從酶切反應(yīng)混合物中回收大片段后用綠豆核酸酶(MungBean Nuclease)處理以形成平頭，回收大片段后再用HindⅢ將EGF基因切下，在T4DNA連接酶存在下，使之與預(yù)先用HindⅢ消化的按實施例2所述方法制備的含GM-CSF編碼序列的DNA片段相連接，即得到長度約4.1Kb定名為pAGMT-8的攜帶GM-CSF編碼序列的重組載體(圖4)。該質(zhì)粒(pAGMT-8)與pAET-8的不同之處只在于由GM-CSF的編碼序列取代了質(zhì)粒pAET-8上的編碼EGF的序列。實施例4重組載體pAGMST-8的構(gòu)建本實施例描述用于在大腸桿菌中共表達分子伴侶蛋白和人粒細胞、巨噬細胞集落刺激因子的重組載體的構(gòu)建。
如前所述，盡管我們構(gòu)建的pAGMT-8質(zhì)粒中帶有用于驅(qū)動外源基因如EGF基因表達的信號元件phoA和SPphoA，但我們將該表達系統(tǒng)用于表達GM-CSF時卻發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)后有大量的表達產(chǎn)物在宿主細胞內(nèi)堆積，而且GM-CSF產(chǎn)物堆積量似乎與分泌量成反比，因此，為解決GM-CSF的表達產(chǎn)物分泌問題，我們進一步在已有表達載體pAGMT-8的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了攜帶可操作地連接到phoA啟動子后編碼大腸桿菌SecB基因的重組載體，該基因與phoA啟動子一起作為獨立的轉(zhuǎn)錄單位，其可以串聯(lián)連接在編碼GM-CSF的轉(zhuǎn)錄單位的上游或下游，或者，亦可與編碼GM-CSF或其他目的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄單位存在于兩個分立的載體中。
如圖5所示使用M13mp19-SecB和pAGMT-8構(gòu)建帶有SecB基因的質(zhì)粒pAGMST-8。
首先用EcoRⅠ和PstⅠ消化M13mp19-SecB得到含SecB基因的DNA片段，另一方面，合成具有下示序列的引物(5)和引物(6)引物(5):5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’引物(6):5’-GGAATTCTTTATTTTCTCCATGTAC-3’EcoRⅠ以pAGMT-8為模板，使用引物(5)和引物(6)進行PCR反應(yīng)，所得片段用PstⅠ和EcoRⅠ雙酶切后最終得到含大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動子序列的DNA片段。用PstⅠ和牛小腸堿性磷酸酶(CIP)處理質(zhì)粒pAGMT-8，回收大片段以后與上述含SecB基因的DNA片段和含大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動子序列的DNA片段在T4DNA連接酶存在下進行連接，回收得到約4.7Kb的大片段后用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切篩選正向連接產(chǎn)物，即得pAGMST-8重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒具有一個串聯(lián)在控制GM-CSF基因表達之phoA啟動子上游的控制大腸桿菌分泌信號SecB基因表達的另一個phoA啟動子。兩個串聯(lián)連接的轉(zhuǎn)錄單位的區(qū)別在于，處于上游指導(dǎo)SecB基因表達的轉(zhuǎn)錄單位中沒有處于下游的指導(dǎo)GM-CSF基因表達的第二個轉(zhuǎn)錄單位中所攜帶的信號肽序列SPphoA。(該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌株已于本專利申請之前按布達佩斯條約的規(guī)定保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記號為CGMCC NO.0288)實施例5重組載體pAGMST-8的轉(zhuǎn)化和表達本實施例描述用按上述方法構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細胞，并在該宿主中以可溶性分泌形式表達具有人GM-CSF活性的蛋白質(zhì)。
將衍生于大腸桿菌K12菌株系列的，堿性磷酸酯酶缺陷型大腸桿菌菌株YK537新鮮過夜菌以1％體積轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4左右(大約培養(yǎng)3小時)。10,000rpm離心1分鐘收集菌體(均需無菌操作)，按每1.5ml菌液加入100μl預(yù)冷的鈣溶液(50mM CaCl2,10mM Tris·Cl pH8.0,15磅滅菌15分鐘，4℃保存)輕搖懸浮菌體，冰浴10分鐘，4,000rpm4℃離心10分鐘，傾去上清，加等體積保存液(100mM CaCl2,15％甘油，15磅滅菌15分鐘，4℃保存)，按200μl分裝，-80℃可存放半年。
1～10ng質(zhì)粒pAGMST-8加入100μl感受態(tài)菌液中，混勻，冰浴30分鐘，42℃熱休克90秒，加5倍體積LB于37℃恢復(fù)培養(yǎng)1小時，之后取適當(dāng)體積涂平板，于37℃倒置培養(yǎng)12小時。
篩選單克隆，培養(yǎng)并酶切鑒定最終得到相應(yīng)的工程菌。
將過夜工程菌接入200ml LB培養(yǎng)基中(氨芐青霉素的含量為100μg/ml)，于37℃培養(yǎng)18小時以誘導(dǎo)phoA啟動子驅(qū)動下的GM-CSF的DNA轉(zhuǎn)錄和表達。誘導(dǎo)后離心培養(yǎng)物并收集上清液。作為對照組，還用不帶有SecB基因的重組質(zhì)粒pAGMT-8轉(zhuǎn)化大腸桿菌YK537，并按上述同樣方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體細胞并分離培養(yǎng)物上清，然后從所得上清液中分離并純化表達產(chǎn)物hGM-CSF。實施例6對轉(zhuǎn)化細胞株發(fā)酵產(chǎn)物的分析本實施例描述使用大腸桿菌分子伴侶SecB與目的蛋白質(zhì)GM-CSF共表達，對轉(zhuǎn)化菌株發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物的各種分析結(jié)果。
分別用本發(fā)明的攜帶大腸桿菌分泌信號SecB基因的質(zhì)粒pAGMST-8和不攜帶SecB基因的對照質(zhì)粒pAGMT-8轉(zhuǎn)化大腸桿菌YK537，分別得到GM-CSF生產(chǎn)菌重組體菌株EGMST-8和EGMT-8。將如此得到的各轉(zhuǎn)化體菌株在低磷培養(yǎng)基中誘導(dǎo)目的基因的表達。將誘導(dǎo)后的菌株和上清，應(yīng)用SDS裂解液，100℃,5分鐘加熱后，進行SDS-PAGE分析，電泳后用考馬斯亮蘭(Coomassie Brilliant Blue)染色。
圖6a顯示對這些轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物不同部分進行SDS-PAGE分析的結(jié)果。從圖中可以看出，用質(zhì)粒pAGMT-8轉(zhuǎn)化的對照菌株EGMT-8的培養(yǎng)物上清中含hGM-CSF量較低(泳道3和4)，而hGM-CSF主要見于不溶部分中(泳道1、2、5、6)。泳道8為分子量標準。質(zhì)粒pAGMST-8轉(zhuǎn)化的EGMST-8工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)物上清液中則可見有大量成熟hGM-CSF(圖6b中泳道2和3，泳道1為分子量標準)。
圖6c顯示EGMST-8和EGMT-8經(jīng)發(fā)酵誘導(dǎo)至表達高峰后，離心除去上清，用SDS電泳液，100℃5分鐘裂解菌體，離心后的電泳圖。EGMST-8菌株以誘導(dǎo)表達后菌體蛋白中可見較強SecB條帶，而菌內(nèi)pre-GM-CSF量很少，僅可見成熟的GM-CSF條帶(泳道1)；EGMT-8菌株經(jīng)誘導(dǎo)表達后菌體蛋白中SecB條帶很淺，但存在較強pre-GM-CSF和成熟的GM-CSF條帶(泳道2)。泳道3為分子量標準。
上述分析結(jié)果表明，在GM-CSF與分子伴侶共表達的情況下，在宿主內(nèi)表達的目的蛋白質(zhì)在與之共表達的分子伴侶即跨膜分泌蛋白質(zhì)的幫助下，以顯著增加的量被分泌到宿主細胞外，從而大大地增加了細胞分泌表達的效率。因此，預(yù)期本發(fā)明的分泌表達系統(tǒng)有可能被廣泛應(yīng)用于許多生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的分泌表達。
另外，我們還使用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)對發(fā)酵罐培養(yǎng)的工程菌株EGMT-8和EGMST-8的培養(yǎng)物各組份中的表達產(chǎn)物進行了半定量分析。應(yīng)用Amersham公司的ELISA Kit分析結(jié)果表明，在EGMT-8發(fā)酵培養(yǎng)物的溶胞產(chǎn)物(包括細胞周質(zhì)、細胞漿和包涵體)中存在大量表達產(chǎn)物GM-CSF，而在發(fā)酵液上清中的GM-CSF含量只占不溶部分的1/6。相反，EGMST-8發(fā)酵液上清中的GM-CSF含量約比前者高5～6倍。
圖7顯示發(fā)酵培養(yǎng)攜帶SecB基因，但該基因上游不帶信號SPphoA序列的工程菌株EGMST-8和不含SecB基因的EGMT-8的溶胞產(chǎn)物所作Northern印跡分析。結(jié)果可見，該工程菌在搖瓶培養(yǎng)條件下，其細胞內(nèi)存在有很濃的SecB條帶(圖6c)，而在進一步的Northern印跡分析中，使用已知序列SecB基因作探針，預(yù)雜交后用隨機引物標記，并于42℃雜交20小時，洗滌后進行放射自顯影，結(jié)果可見，有較強的SecB mRNA雜交條帶。相反，不攜帶SecB基因的EGMT-8菌株在相同發(fā)酵與檢測條件下則只見有微弱的雜交條帶。泳道2、4為EGMST-8；泳道1、3為EGMT-8。實施例7工程菌株EGMST-8的放大發(fā)酵培養(yǎng)、產(chǎn)物的分離純化和生物活性的測定取于-70℃保存的含15％甘油的EGMST-8甘油菌20μl接種于3mlLB培養(yǎng)基中(氨芐青霉素含量為100μg/ml),37℃培養(yǎng)過夜，第二天取少許菌液作適當(dāng)稀釋后涂布LB平板(氨芐青霉素濃度為100μg/ml，每升LB中含15g瓊脂)，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16小時后挑取單菌落于含3ml LB的試管中(氨芐青霉素濃度為100μg/ml)，放入37℃搖床培養(yǎng)過夜(轉(zhuǎn)速200rpm)，第二天以1％比例將過夜菌接入含200ml LB培養(yǎng)基的1升搖瓶中(氨芐青霉素濃度100μg/ml)，在37℃,200rpm的搖床中培養(yǎng)10-12小時即成種子。
將200ml種子培養(yǎng)液加入含10升發(fā)酵培養(yǎng)基(每升含蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖30g，硫酸鎂1g)的發(fā)酵罐(New BrunswickScientific公司，型號Bio Flo Ⅳ)中，于37℃通氣攪拌培養(yǎng)約18～20小時。當(dāng)培養(yǎng)物OD600值約為30～36時，GM-CSF的產(chǎn)率達到峰值約100～120mg/L。利用相同的發(fā)酵條件發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌工程菌株EGMT-8,GM-CSF的最高產(chǎn)率只有大約20mg/L。
發(fā)酵完成后，離心分離細胞沉淀物和培養(yǎng)液上清，按照常規(guī)方法，例如依次用截留量為10,000道爾頓的超濾膜(Millipore Co.)超濾、疏水層析、陰離子交換和凝膠過濾等方法來純化表達產(chǎn)物hGM-CSF。
可按照建立的標準方法，使用TF-1細胞作為靶細胞(培養(yǎng)于含10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中)，在微量滴定板中培養(yǎng)并裂解細胞后測定樣品的OD570吸光率，以回歸分析后計算樣品的活性單位。結(jié)果證明，使用本發(fā)明的分泌表達系統(tǒng)生產(chǎn)的hGM-CSF比標準樣品有較高的生物學(xué)活性。
權(quán)利要求
1．用于在原核細胞中分泌表達所需蛋白質(zhì)的重組表達載體，其中所說的表達載體包含可操作地將編碼分子伴侶基因插入到第一啟動子后的位點。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的表達載體，其中在編碼分子伴侶的DNA序列的下游有一個可操作地連接編碼所需蛋白質(zhì)之DNA序列至含第二啟動子的信號肽DNA序列。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的表達載體，其中所說的編碼分子伴侶的基因是大腸桿菌SecB基因。
4．根據(jù)權(quán)利要求1或2的表達載體，其中所說的第一和/或第二啟動子是大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動子，且第一和第二啟動子是相同的或是不同的。
5．根據(jù)權(quán)利要求1或2的表達載體，其中所說的編碼所需蛋白質(zhì)的基因是從天然來源篩選得到的野生型基因、篩選后經(jīng)過改造的突變基因或化學(xué)合成的基因。
6．用根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項的表達載體轉(zhuǎn)化的用于表達所需外源蛋白質(zhì)的原核細胞。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的原核細胞，所說的原核細胞是大腸桿菌細胞。
8．利用權(quán)利要求6的原核細胞宿主以可溶性形式分泌表達所需蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(1)得到編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列；(2)將步驟(1)的編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列可操作地連接到含有編碼適當(dāng)?shù)陌閭H分子的DNA序列的質(zhì)粒上，得到用于在適當(dāng)啟動子控制下共表達所需蛋白質(zhì)和分子伴侶蛋白的重組表達載體；(3)用步驟(2)的重組表達載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)脑怂拗骷毎?4)在適于以可溶的分泌形式表達所需蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)步驟(3)的宿主細胞；(5)從培養(yǎng)物中分離出不溶性部分并從可溶性部分中回收所需蛋白質(zhì)。
9． 根據(jù)權(quán)利要求8的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的重組表達載體還包含可操作地連接編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列上的第一啟動子序列和位于其下游的，可操作地連接到編碼分子伴侶的DNA上的第二啟動子序列。
10．根據(jù)權(quán)利要求8的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的細菌宿主細胞是大腸桿菌細胞。
11．根據(jù)權(quán)利要求8的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的編碼分子伴侶的DNA序列是大腸桿菌SecB基因的DNA序列。
12．利用原核細胞以可溶形式分泌表達所需蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(1)得到編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列，并將其可操作地連接到適于在原核宿主中表達所需蛋白質(zhì)的第一表達載體上；(2)得到編碼分子伴侶蛋白的DNA序列，并將其可操作地連接到適于在原核宿主細胞中表達分子伴侶蛋白的第二表達載體上；(3)用步驟(1)和(2)的第一和第二重組表達載體共轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)脑怂拗骷毎?4)在適于以可溶形式分泌表達所需蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)步驟(3)的宿主細胞；(5)從培養(yǎng)物中分離出不溶性部分并從可溶性部分中回收所需蛋白質(zhì)。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的細菌宿主細胞是大腸桿菌細胞。
14．根據(jù)權(quán)利要求12的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的編碼分子伴侶的DNA序列是大腸桿菌SecB基因的DNA序列。
15．根據(jù)權(quán)利要求8或12的方法，其中所說的所需蛋白質(zhì)選自包括人在內(nèi)的所有動物、植物和微生物的蛋白質(zhì)和多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用分子伴侶與所需蛋白質(zhì)在原核細胞特別是大腸桿菌宿主內(nèi)的共表達,以促進所需蛋白質(zhì)分泌表達的方法。具體地說,本發(fā)明涉及用于在原核細胞中分泌表達所需蛋白質(zhì)的重組表達載體,所說的表達載體含可操作地連接編碼分子伴侶的基因序列至第一啟動子后的位點。編碼分子伴侶基因序列下游有一個可操作地連接編碼所需蛋白質(zhì)基因序列到含第二個啟動子的信號肽DNA序列。
文檔編號C12N15/63GK1236011SQ98110840
公開日1999年11月24日 申請日期1998年5月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月15日
發(fā)明者甘人寶, 黃培勇, 錢悅, 林曉忠, 張倩, 姚軍, 丁紅珍, 丁晨, 李載平 申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所